A vírusok osztályozása - tankonyvtar.hu · Created by XMLmind XSL-FO Converter. Növényvírusok és virológiai vizsgálati módszerek dr. Horváth, József Ez a könyv a Földművelésügyi

Created by XMLmind XSL-FO Converter.

A vírusok osztályozása

dr. Horváth, József

Created by XMLmind XSL-FO Converter.

Növényvírusok és virológiai vizsgálati módszerek dr. Horváth, József

Ez a könyv a Földművelésügyi és Vidékfejlesztési Minisztérium támogatásával, az Intézményközi

Tankönyvkiadási Szakmai Bizottsága jóváhagyásával készült. Szerzői jog © 1999 dr. Horváth József - dr. Gáborjányi Richard

Minden jog fenntartva. Bármilyen másolás, sokszorosítás, illetve adatfeldolgozó rendszerben való tárolás a kiadó előzetes írásbeli hozzájárulásához van kötve.

iii Created by XMLmind XSL-FO Converter.

Tartalom

1. Előszó ............................................................................................................................................. 1 2. Bevezetés a virológiába .................................................................................................................. 2

1. A vírusok jelentősége ............................................................................................................ 2 2. A vírusok morfológiája és felépítése ..................................................................................... 2 3. A vírusok replikációja ........................................................................................................... 2 4. A vírusos betegségek kialakulása és a tünetek (szimptómák) ............................................... 3 5. A vírusok átvitele, terjedése .................................................................................................. 3 6. A vírusok diagnosztikája ....................................................................................................... 4 7. A vírusok elleni védekezés .................................................................................................... 4 8. A vírusok eredete .................................................................................................................. 5

3. A vírusok osztályozása és rendszertana .......................................................................................... 6 1. .............................................................................................................................................. 8

1.1. .................................................................................................................................. 8 1.1.1. ..................................................................................................................... 8

2. A víruscsaládok és nemzetségeik általános jellemzése ......................................................... 9 3. A vírusnemzetségek általános jellemzése ........................................................................... 23 4. Új rendszertani javaslatok ................................................................................................... 35

4.1. Aktuális vírusrendszer: a növénypatogén vírusnemzetségek és típus vírusfajok fontosabb

tulajdonságai .................................................................................................................. 35 4.2. Rendszertanilag nem besorolható vírusok .............................................................. 45

4. A vírusok adatbázisa ..................................................................................................................... 46 1. Az adatbázis szerepe a vírusidentifikálásban ...................................................................... 46

1.1. Az adatbázis elvi szempontjai ................................................................................ 46 1.2. Az adatbázis gyakorlati szempontjai ...................................................................... 46 1.3. A vírusidentifikálás stratégiája ............................................................................... 47 1.4. Adatbázis-karakterek (jellemzők) ........................................................................... 47

5. A növényvírusok hivatalos elnevezése és akronímjai ................................................................... 52 6. A növényvirológiában használt fontosabb növények kódjai ........................................................ 66 7. A vírusátvitel módszerei ............................................................................................................... 68

1. Állatvektor nélküli vírusátvitel ............................................................................................ 68 1.1. Oltással történő átvitel ............................................................................................ 68 1.2. Mechanikai átvitel .................................................................................................. 69

1.2.1. ................................................................................................................... 70 1.3. Vegetatív szaporítószervekkel történő vírusátvitel ................................................. 71 1.4. Maggal és pollennel történő átvitel ......................................................................... 71 1.5. Vírusátvitel a talajban ............................................................................................. 72

1.5.1. Gyökérrel történő átvitel ............................................................................ 72 1.5.2. Alacsonyabb rendű gombákkal történő átvitel ........................................... 73

1.6. Vírusátvitel Cuscuta fajokkal ................................................................................. 73 1.7. Vízzel történő vírusátvitel ....................................................................................... 74

2. Állatvektorokkal történő vírusátvitel ................................................................................... 74 2.1. Levéltetvek ............................................................................................................. 75

2.1.1. ................................................................................................................... 75 2.2. Kabócák .................................................................................................................. 76 2.3. Nematódák (fonálférgek) ........................................................................................ 77 2.4. Atkák ...................................................................................................................... 77 2.5. Tripszek .................................................................................................................. 78 2.6. Poloskák ................................................................................................................. 79 2.7. Molytetvek (fehérlegyek, liszteskék) ...................................................................... 80 2.8. Pajzstetvek .............................................................................................................. 81 2.9. Levélbolhák ............................................................................................................ 81 2.10. Aknázólegyek ....................................................................................................... 81 2.11. Bogarak ................................................................................................................. 81 2.12. Sáskák ................................................................................................................... 81 2.13. Lepkék .................................................................................................................. 82 2.14. Ászkák .................................................................................................................. 82


iv Created by XMLmind XSL-FO Converter.

2.15. Fülbemászók ......................................................................................................... 82 2.16. Csigák ................................................................................................................... 82

3. A vírusátvitel módszertana .................................................................................................. 82 3.1. Vírusátvitel levéltetvekkel ...................................................................................... 82

3.1.1. ................................................................................................................... 82 3.2. Vírus-, illetve fitoplazma-átvitel kabócákkal .......................................................... 91

3.2.1. ................................................................................................................... 91 3.3. Vírusátvitel nematódákkal (fonálférgekkel) ........................................................... 92

3.3.1. ................................................................................................................... 92 3.4. Vírusátvitel talajlakó gombákkal ............................................................................ 98 3.5. Vírusátvitel Cuscuta fajokkal ................................................................................. 99

4. Rovarokkal történő vírusátvitel molekuláris aspektusai ...................................................... 99 4.1. Köpenyfehérje (CP) ................................................................................................ 99 4.2. Helper komponens (HC) ....................................................................................... 101

5. Fonálférgekkel történő vírusátvitel molekuláris aspektusai .............................................. 101 8. A biotesztek virológiai alkalmazása ........................................................................................... 104

1. A növény–vírus kapcsolat típusai ..................................................................................... 104 1.1. .............................................................................................................................. 104

1.1.1. ................................................................................................................. 104 2. A vírusfertőzés tünetei (szimptomatológia) ...................................................................... 105

2.1. .............................................................................................................................. 105 2.1.1. ................................................................................................................. 105

3. A vírusfertőzés mértékének meghatározása ...................................................................... 111 4. Fizikai tulajdonságok vizsgálati módszerei ....................................................................... 112 5. A vírusok differenciálása tesztnövényekkel ...................................................................... 113 6. A vírusok fenntartása tesztnövényeken ............................................................................. 115 7. Gazdanövénykörök ........................................................................................................... 118 8. A fás szárú növények virológiai ellenőrzése ..................................................................... 118

8.1. A szőlő virológiai ellenőrzésének rendszere ......................................................... 118 8.1.1. A szőlő üvegházi tesztelése ...................................................................... 119 8.1.2. A szőlő szabadföldi tesztelése .................................................................. 120

8.2. A gyümölcsfajok virológiai ellenőrzésének rendszere ......................................... 121 8.2.1. A gyümölcsfajok üvegházi, lágy szárú biológiai tesztelése ..................... 122 8.2.2. A gyümölcsfajok üvegházi, fás szárú tesztelése ....................................... 122 8.2.3. A gyümölcsfajok szabadföldi, fás szárú tesztelése ................................... 125

9. Szántóföldi növények virológiai ellenőrzése .................................................................... 126 9.1. A burgonya virológiai ellenőrzésének általános szempontjai ............................... 126

9.1.1. A burgonya vírusellenőrzésének rendszere .............................................. 127 9. Elektronmikroszkópos módszerek .............................................................................................. 128

1. Negatív festéses módszer .................................................................................................. 128 2. Immuno-elektronmikroszkópos módszer .......................................................................... 130 3. Dekorációs módszer .......................................................................................................... 131 4. Kicsapásos (precipitációs) módszer .................................................................................. 132 5. Finomszerkezeti vizsgálatok módszerei ............................................................................ 132 6. Citokémiai vizsgálatok ...................................................................................................... 134 7. Immunokémiai vizsgálatok ............................................................................................... 134

10. A vírusfertőzött növényi sejtek finomszerkezete ...................................................................... 135 1. Sejtek és sejtalkotók .......................................................................................................... 135 2. Zárványok ......................................................................................................................... 138

2.1. Kristályos citoplazmatikus zárványok .................................................................. 138 2.2. Amorf citoplazmatikus zárványok ........................................................................ 139 2.3. Hengeres citoplazmatikus, forgókerékszerű (pinwheel) zárványok ..................... 140 2.4. Kristályos sejtmagzárvány .................................................................................... 141

11. Fénymikroszkópos festéses módszerek .................................................................................... 142 1. Calcomine orange–Luxol brilliant green bl festés (o–g festés) ......................................... 143 2. Nukleoproteidek azúrkék festése ...................................................................................... 143

2.1. .............................................................................................................................. 144 2.1.1. ................................................................................................................. 144

12. A vírusok izolálása és tisztítása ................................................................................................ 145 1. A virionok tisztítása fertőzött növényekből ...................................................................... 145


v Created by XMLmind XSL-FO Converter.

1.1. A vírusok biológiai tisztasága ............................................................................... 145 1.2. A vírusok felszaporítása fogékony növényben ..................................................... 145 1.3. A feltárás és kivonás körülményei ........................................................................ 146 1.4. A vírusoldat szűrése .............................................................................................. 147 1.5. A vírusok elválasztása más sejtalkotórészektől .................................................... 147 1.6. A növényi fehérjék elkülönítése ........................................................................... 147 1.7. A virionok elkülönítése és a vírusoldat töményítése ............................................ 147 1.8. A tisztított vírusoldat minőségi ellenőrzése, eltartása ........................................... 148

2. A vírusfehérjék izolálása és tisztítása ................................................................................ 153 3. A vírusnukleinsavak kivonása és tisztítása ....................................................................... 154

3.1. RNS-kivonás tisztított vírusszuszpenzióból ......................................................... 154 3.1.1. ................................................................................................................. 154

3.2. Vírus-DNS kivonása ............................................................................................. 156 3.3. Kettős szálú rns-ek kivonása a fertőzött növényekből .......................................... 156

13. A vírusgenom szerveződése és a vírusok replikációja .............................................................. 159 1. A vírusreplikáció alapvető vizsgálati módszerei ............................................................... 159

1.1. Restrikciós enzimek és a vírusok elsődleges szerkezetvizsgálata ......................... 159 1.2. Kettős szálú nukleinsavmásolatok (cDNS) készítése egyszálú RNS-ből ............. 159 1.3. A protoplasztok virológiai alkalmazása ................................................................ 160 1.4. A sejtmentes, in vitro fehérjeszintetizáló rendszerek ............................................ 160

2. A vírusgenom szerveződésének alaptípusai ...................................................................... 160 2.1. A nukleinsavak jellemző végei ............................................................................. 161 2.2. Nyitott leolvasási szakaszok, fehérjetermékek ..................................................... 161 2.3. A vírusnukleinsav-replikáció általános menete .................................................... 161 2.4. A génkifejeződés általános módjai ....................................................................... 162

3. A génkifejeződés stratégiái a különböző vírusnemzetségekben ........................................ 163 3.1. A potyvirusok replikációja: poliprotein szintézise és transzláció utáni hasadási termékek

163 3.2. A tehénborsó mozaik vírus (cowpea mosaic comovirus) replikációja: osztott genom és

poliproteinek ............................................................................................................... 164 3.3. A rozsnok mozaik vírus (brome mosaic bromovirus) replikációja: osztott genom és

szubgenomi RNS ......................................................................................................... 165 3.4. A dohány mozaik vírus (tobacco mosaic tobamovirus) replikációja: átolvasott fehérje és

szubgenomi RNS-ek ................................................................................................... 166 3.5. A pararetrovirusok replikációja: fordított transzkripció ....................................... 167 3.6. Geminivirusok: kétirányú transzkripciós stratégia ............................................... 168 3.7. A paradicsom bronzfoltosság vírus (tomato spotted wilt tospovirus) replikációja: negatív

és ambiszensz nukleinsavak transzlációja ................................................................... 169 3.8. A vírusok parazitái: a szatellit vírusok és a szatellit RNS-ek replikációja ............ 170 3.9. Defektív interferáló RNS-ek: a vírusreplikáció hibás termékei ............................ 171

4. A vírusok rokonsága, a vírusok törzsfejlődése .................................................................. 171 4.1. Vírus-„szupercsaládok” ........................................................................................ 171 4.2. Feltételezések a vírusok törzsfejlődéséről ............................................................ 173

14. Szerológiai vizsgálati módszerek .............................................................................................. 176 1. Immunológiai alapfogalmak ............................................................................................. 176

1.1. Az immunválasz ................................................................................................... 176 1.2. A vírus-köpenyfehérje felépítése és antigén tulajdonságai ................................... 177 1.3. Az antitest (immunoglobulin) felépítése és típusai ............................................... 177 1.4. Antigén–antitest kölcsönhatások .......................................................................... 178

2. Poliklón antitestek előállítása ............................................................................................ 178 2.1. A kísérleti állat kiválasztása ................................................................................. 179 2.2. Az immunizálás .................................................................................................... 179 2.3. Injektálási módszerek ........................................................................................... 179 2.4. Vérvétel és szérumnyerés ..................................................................................... 180 2.5. Az IgG tisztítása az antiszérumból ....................................................................... 180

3. Monoklón antitestek előállítása ......................................................................................... 180 3.1. A monoklón antitestek alkalmazásának lehetőségei ............................................. 182

4. A szerológiai reakciók alaptípusai .................................................................................... 184 4.1. Precipitáció ........................................................................................................... 184 4.2. Agglutináció ......................................................................................................... 185


vi Created by XMLmind XSL-FO Converter.

4.3. Immunodiffúziós tesztek ...................................................................................... 186 4.4. Immunoelektroforézis ........................................................................................... 187 4.5. ELISA-módszerek ................................................................................................ 188 4.6. Radioimmuno-vizsgálat (RIA) ............................................................................. 192 4.7. Immunoblotting .................................................................................................... 192

5. A különböző szerológiai eljárások alkalmazása a vírusdiagnosztikában .......................... 194 15. A nukleinsavak jellemzésének módszerei ................................................................................ 195

1. Gél-elektroforézis .............................................................................................................. 195 2. Nukleinsav-hibridizáció .................................................................................................... 196

2.1. Dot-blot hibridizáció ............................................................................................. 197 2.2. Southern-hibridizáció ........................................................................................... 198 2.3. Northern-hibridizáció ........................................................................................... 199 2.4. Szendvics-hibridizáció .......................................................................................... 200 2.5. Próbakészítés ........................................................................................................ 200

3. Nukleinsav-szekvencia meghatározása ............................................................................. 202 4. Polimeráz láncreakció (pcr) .............................................................................................. 203

16. Növényi vírusbetegségek és növekedést szabályozó anyagok .................................................. 207 1. A növényi hormonok jellemzése ....................................................................................... 207

1.1. Juvenilhormonok .................................................................................................. 207 1.2. Szeneszcenciahormonok ....................................................................................... 209

2. A vírusfertőzött növények hormonváltozásai .................................................................... 210 3. A növényi hormonok meghatározása ................................................................................ 211

3.1. Az auxin (indol-3-ecetsav) meghatározása ........................................................... 213 3.2. A gibberellinek meghatározása ............................................................................. 218 3.3. A citokininek meghatározása ................................................................................ 221 3.4. Az etilén meghatározása ....................................................................................... 226 3.5. Az abszcisszinsav meghatározása ......................................................................... 228

17. Aktív oxigénformák és antioxidáns enzimrendszerek .............................................................. 232 1. Az aktív oxigénformák ...................................................................................................... 233

1.1. Szuperoxid gyök (•O2–) .......................................................................................... 233

1.2. Hidrogén-peroxid (H2O2) ...................................................................................... 234 1.3. Hidroxil gyök (•OH) .............................................................................................. 235 1.4. Egyéb aktív oxigénformák .................................................................................... 235

2. Antioxidáns folyamatok, enzimek, enzimrendszerek és nem enzimatikus antioxidánsok 236 2.1. Szuperoxid-dizmutáz (SOD) ................................................................................ 236 2.2. Aszkorbát .............................................................................................................. 236 2.3. Glutation, α-tokoferol, flavonoidok ...................................................................... 237 2.4. Kataláz .................................................................................................................. 237

3. Az aktív oxigénformák lehetséges keletkezési helye és módja ......................................... 237 4. Az aktív oxigénformák kórfolyamatban betöltött szerepe ................................................ 240

4.1. Antimikrobiális aktivitás ...................................................................................... 240 4.2. Fitoalexinek termelődése ...................................................................................... 240 4.3. Hiperszenzitív reakció .......................................................................................... 240 4.4. Szisztemikus szerzett rezisztencia ........................................................................ 240 4.5. Indukált sejtfal-megszilárdítás .............................................................................. 240

5. Mérési módszerek és értékelésük ...................................................................................... 241 5.1. KJ / keményítő módszer ....................................................................................... 242 5.2. CeCl3 módszer ...................................................................................................... 244 5.3. Ti(IV)Cl4 módszer ................................................................................................ 245 5.4. 4-nitro-tetrazóliumkék (NBT) módszer ................................................................ 246 5.5. Diaminobenzidin (DAB) módszer ........................................................................ 246 5.6. Kemilumineszcenciás módszer ............................................................................. 247 5.7. Egyéb mérési módszerek ...................................................................................... 247

18. A vírus-ellenállóságra nemesítés hagyományos módszerei ...................................................... 251 1. A rezisztenciára nemesítés fő irányai ................................................................................ 251

1.1. .............................................................................................................................. 251 1.1.1. ................................................................................................................. 251

2. A rezisztenciagének működése egyes növényfajokban ..................................................... 252 2.1. .............................................................................................................................. 257

2.1.1. ................................................................................................................. 257


vii Created by XMLmind XSL-FO Converter.

3. Az extrém rezisztencia kialakítása és ellenőrzési módszerei ............................................ 261 3.1. .............................................................................................................................. 262

3.1.1. ................................................................................................................. 262 19. A vírus-ellenállóságra nemesítés biotechnológiai módszerei ................................................... 266

1. Szomatikus hibridizáció .................................................................................................... 266 1.1. .............................................................................................................................. 266

1.1.1. ................................................................................................................. 266 1.2. A burgonya és a Solanum brevidens szomatikus hibridjeinek sajátosságai .......... 269

2. Molekuláris genetikai módszerek ...................................................................................... 269 2.1. Védekezés növényi eredetű rezisztenciagének beépítésével ................................. 270

2.1.1. Transzpozon mutagenezisen alapuló génizolálás ..................................... 270 2.1.2. Térképezésen alapuló génizolálás ............................................................ 271

2.2. A kórokozótól származtatott rezisztencia ............................................................. 273 2.2.1. A köpenyfehérjegénnel indukált vírusrezisztencia ................................... 273 2.2.2. A replikáz génnel indukált rezisztencia .................................................... 277 2.2.3. A mozgásfehérjegénnel indukált rezisztencia .......................................... 277 2.2.4. A szatellit RNS (sat-RNS) által közvetített rezisztencia .......................... 278 2.2.5. A defektív interferáló (DI) RNS által közvetített rezisztencia ................. 278 2.2.6. A köpenyfehérje által közvetített rezisztencia mechanizmusa ................. 278 2.2.7. Az RNS által közvetített rezisztencia mechanizmusa .............................. 279

2.3. Egyéb rezisztenciagének ....................................................................................... 280 2.3.1. ................................................................................................................. 280

3. A rezisztenciagének beépítése a növényi genomba ........................................................... 281 3.1. Az agrobaktériumos transzformálás ..................................................................... 281 3.2. DNS-bevitel polietilén-glikollal (PEG) és elektromos impulzussal ..................... 284 3.3. Génátvitel biolisztikus módszerrel ........................................................................ 284

3.3.1. ................................................................................................................. 284 20. Függelék ................................................................................................................................... 285

1. A vírusok, a vírusszerű organizmusok és a viroidok nemzetközi forgalmának (terjedésének)

ellenőrzése és megakadályozása ........................................................................................... 285 1.1. Vírusokra és vírusszerű kórokozókra vonatkozó növény-egészségügyi határozatok 285

1.1.1. ................................................................................................................. 285 1.1.2. Az Európai Közösségben (EU) elő nem forduló, és az EU-ra nézve fontos

vírusok, vírusszerű kórokozók és viroidok ......................................................... 286 1.1.3. Az Európai Közösségben (EU) előforduló és az EU-ra nézve fontos fitoplazma

kórokozók .......................................................................................................... 288 1.1.4. Kórokozók, amelyeknek a behurcolása és terjedése a meghatározott védett

zónákban tilos .................................................................................................... 288 1.1.5. Kórokozók, amelyeknek a behurcolása és terjedése valamennyi tagországban

tilos, ha azok egyes növényeken és növényi termékeken előfordulnak ............. 288 1.1.6. Az Európai közösségben (EU) előforduló és az EU-ra nézve fontos vírus,

vírusszerű, viroid és spiroplaza kórokozók ........................................................ 289 1.2. Egyéb határozatok ................................................................................................ 291

2. Karantén és veszélyes vírusok, vírusszerű organizmusok és viroidok Európában ............ 291 3. Az ábrák eredete ................................................................................................................ 294

Irodalom ......................................................................................................................................... 297

viii Created by XMLmind XSL-FO Converter.

Az ábrák listája

1. A vírusok sematikus ábrázolása. A: helikális dohány mozaik vírus (tobacco mosaic tobamovirus); B:

izometrikus, kubikális szimmetriájú tarlórépa sárga mozaik vírus (turnip yellow mosaic tymovirus); C:

bakteriofág (Echerichia coli T2-fágja) ................................................................................................. 2 2. A: dohány mozaik vírussal (tobacco mosaic tobamovirus) fertőzött Nicotiana tabacum cv. Samsun

mozaikos levelei; B: tünetek a karfiol mozaik vírussal (cauliflower mosaic caulimovirus) inokulált

Brassica rapa var. rapa levelén ........................................................................................................... 6 3. Növénypatogén vírusok családjainak és nemzetségeinek vázlatos ábrázolása. dsDNA = kettős szálú

dezoxiribonukleinsav, ssDNA = egyszálú dezoxiribonukleinsav, dsRNA = kettős szálú ribonukleinsav,

ssRNA = egyszálú ribonukleinsav, (–) = negatív szálú vírus, (+) = pozitív szálú vírus. Méretjelző = 100

nm [Murphy et al., 1995 után] ............................................................................................................ 7 4. A: az uborka mozaik vírus (cucumber mosaic cucumovirus) elektronmikroszkópos képe (29 nm, 127

000-szeres nagyítás); B: az uborka mozaik vírus szisztemikus tünete Nicotiana tabacum cv. Xanthi-nc

növényen; C: Cucumis sativus növény levelén ................................................................................ 11 5. A paradicsom bronzfoltosság vírus (tomato spotted wilt tospovirus) partikulumainak

elektronmikroszkópos képe [D. Peters szívessége folytán] .............................................................. 12 6. A répa sárgaság vírus [beet yellows closterovirus (1250 nm × 10 nm)]flexibilis partikulumai [J. Brandes

szívessége folytán] ............................................................................................................................ 14 7. A: a burgonya Y-vírus (potato Y potyvirus) elektronmikroszkópos képe (730 nm x 11 nm); B: a rizs

törpülés vírus (rice dwarf phytoreovirus) kabócavektora (Nephotettix cincticeps); C: a rizs törpülés vírus

tünete rizsnövény levelén [F. Nakasuyi szívessége folytán] ............................................................. 17 8. A: Pittosporum érsárgulás vírussal (Pittosporum vein yellowing nucleorhabdovirus) természetes úton

fertőződött Pittosporum tobira növény levele; B: egészséges növény .............................................. 19 9. A csorbóka sárgaerűség vírus (sowthistle yellow vein nucleorhabdovirus) lövedékszerű partikulumai

(230 nm × 100 nm) [D. Peters szívessége folytán] ........................................................................... 20 10. A paszternák sárga foltosság vírus (parsnip yellow fleck sequivirus) izometrikus partikulumai (31 nm)

[A.F. Murant szívessége folytán] ...................................................................................................... 21 11. A dohány nekrózis vírus (tobacco necrosis necrovirus) helyi (lokális) nekrózisokat idéz elő a

növényeken; A: Nicotiana glutinosa; B: Datura innoxia; C: Solanum ochroleucum; D: Ocimum

gratissimum ...................................................................................................................................... 23 12. A karfiol mozaik vírus (cauliflower mosaic caulimovirus) virionjai (A) és szisztemikus tünetei

Brassica rapa var. rapa (B), valamint Crambe strigosa (C) növényeken .......................................... 24 13. Carlavirusok virionjai. A: burgonya M-vírus (potato M carlavirus, 650 nm × 12 nm); B: burgonya S-

vírus (potato S carlavirus, 650 nm × 12 nm); C: vöröshere érmozaik vírus (red clover vein mosaic

carlavirus, 600-700 nm × 12 nm) [B és C: J. Brandes szívessége folytán] ....................................... 25 14. A: a burgonya X-vírus (potato X potexvirus) virionjai (515 nm × 13 nm) [J. Brandes szívessége

folytán]; B: a burgonya X-vírus (potato X potexvirus) lokális léziókat mutató gazdanövényének

(Gomphrena globosa) levele ............................................................................................................. 29 15. A, B, C: a Chenopodium mozaik vírus (sowbane mosaic sobemovirus, 26-28 nm) részecskéinek

elektronmikroszkópos képe. A: 1%-os formalinnal fixált, urániummal árnyékolt víruspreparátum; B: a

vírusrészecskék hexagonális elrendeződése ún. negatív festéses („negativ staining”) módszerrel végzett

vizsgálat alapján; C: a formalinnal és a negatív festéses módszerrel fixált virionok; D: a csomós ebír

foltosság vírus (cocksfoot mottle sobemovirus) szférikus részecskéi (30 nm) [A-C: C.I. Kado, D: A.J.

Gibbs szívessége folytán] ................................................................................................................. 31 16. A: a dohány mozaik vírus (tobacco mosaic tobamovirus) pálcika alakú virionjai (300 nm × 18 nm); B:

dohány mozaik vírussal inokulált Nicotiana tabacum cv. Samsun növény mozaikos és deformált levelei

32 17. A dohány rattle vírus (tobacco rattle tobravirus) hosszú (A) (180–215 nm) és rövid (B) (46–115 nm)

partikulumai [B.D. Harrison szívessége folytán];C: Solanum capsicastrum a vírus nekrotikus tünetekkel

reagáló diagnosztikai növénye .......................................................................................................... 32 18. A: Brassica chinensis a tarlórépa mozaik vírus (turnip yellow mosaic tymovirus) propagatív

gazdanövénye [D. Mamula szívessége folytán];B: burgonya andeszi látens vírus (potato Andean latent

tymovirus) szférikus partikulumai (30 nm) [A.J. Gibbs szívessége folytán] .................................... 33 19. A burgonya T-vírus (potato T vitivirus) flexibilis virionjai (637 nm × 12 nm) [L.F. Salazar szívessége

folytán] ............................................................................................................................................. 35 20. A víruskapcsolatok és specifitások identifikálásának stratégiai diagramja. GVL = gazda–vírus lista,

VCsA = víruscsoport-adatok, VA = vírusadatok [Brunt et al., 1990 után] ....................................... 47


ix Created by XMLmind XSL-FO Converter.

21. A virológiában alkalmazott fontosabb oltási módszerek. A: zöldoltás hasítékba; B: párosítás; C: héj alá

oltás; D: érintkezéses oltás; E: palackoltás; F: hagymaoltás; G: szemzés; H: szemlapozás (chipszemzés); I:

gumóba oltás; J: heteroplasztikus oltás (zöld hajtás fás részbe oltása); K: levéloltás kétszikűek esetében; L:

levéloltás az egyszikű Liliaceae családba tartozó növényeknél [Schmelzer, 1980 után] .................. 68 22. A: dohány mozaik vírus (tobacco mosaic tobamovirus) tünetei Nicotiana tabacum cv. Samsun és B: N.

tabacum cv. Érdi dohánynövények levelein [Horváth József szívessége folytán] ............................ 69 23. A vírusok mechanikai átviteléhez használatos eszközök. A: orsóprés [J.A. de Bokx szívessége

folytán]; B: 1 = gömblombik; 2 = dörzsmozsarak; 3 = üvegspatulák; 4 = desztillált víz; 5 = műanyag jelfa;

6 = pufferoldat; 7 = mérőhenger; 8 = karborundumszóró [Horváth József szívessége folytán] ....... 70 24. A: a dohány mozaik vírus (tobacco mosaic tobamovirus) tünetei a fertőzött paradicsommaggal történő

átvitel után Lycopersicon esculentum növények levelein; B: bab sárga mozaik vírus (bean yellow mosaic

potyvirus) tünetei Phaseolus vulgaris cv. Red Kidney növényen [Horváth József szívessége folytán] 71 25. Az Olpidium brassicae gombavektor zoosporangiumai. A: saláta törzs (lettuce strain) vektora; B:

káposzta törzs (cabbage strain) nem vektor; C: az Olpidium spp. zoospórái [Teakle, 1967 után] ... 73 26. A: az uborka zöldfoltosság mozaik vírus (cucumber green mottle mosaic tobamovirus) tünetei

Cucumis sativus cv. Delicatess uborkanövényen; B: az uborka mozaik vírus (cucumber mosaic

cucumovirus) tünetei Nicotiana tabacum cv. Xanthi-nc dohányon [Horváth József szívessége folytán]

74 27. Levéltetűvel történő árpa sárga törpülés vírus (barley yellow dwarf luteovirus) átvitel sematikus

ábrázolása. A nyilak a cirkulatív vírusátvitel útját jelzik. JNyM: járulékos nyálmirigy, EnyM: elsődleges

nyálmirigy, KB: középbél, UB: utóbél [A. Miller szívessége folytán] ............................................. 75 28. Az őszirózsa sárgaság fitoplazma (aster yellows phytoplasma) kabócavektorai A-B: Macrosteles

fascifrons; C-D: Elymana virescens. Balról hátoldali, jobbról hasi helyzetben lévő nőnemű egyedek [L.N.

Chiykowski szívessége folytán] ....................................................................................................... 77 29. A: kifejlett Aceria tulipae atkavektor sematikus rajza az emésztőcsatornával és a petefészekkel. Fg =

előbél, Mg = középbél, Hg = utóbél, Ct = fejtor, Fl = mellső lábak, Hl = hátsó lábak, Go = ivarszerv

nyílása, E = tojás, Oc = érett petesejt, Hs = utóbél végbélszerű zsákja, As = anális tapadókorong [Paliwal

és Slykhuis, 1967 után]; B: búza csíkos mozaik vírussal (wheat streak mosaic tritimovirus) fertőződött

búza levelei a fertőzöttség súlyossága sorrendjében (alulról felfelé) [J.T. Slykhuis szívessége folytán]

78 30. Thrips tabaci, a tospovirusok vektora [K.M. Smith szívessége folytán] ..................................... 79 31. Piesma quadratum a répa levélgöndörödés vírus (beet leaf curl ? rhabdovirus) levélpoloska-vektora

[G. Proeseler szívessége folytán] ...................................................................................................... 79 32. A crinivirusok átvitelében szerepet játszó molytetvek (Trialeurodes vaporariorum) populációja

dohánylevélen [Szalay-Marzsó László szívessége folytán] .............................................................. 80 33. Retek mozaik vírussal (radish mosaic comovirus) fertőzött Brassica campestris növény levele

[Horváth József szívessége folytán] ................................................................................................. 81 34. A–C: szövethálóval és üvegajtóval ellátott inszektáriumok; D–F: miniatűr levéltetű-inszektáriumok,

amelyeket csíptetővel lehet a növények levelére, egy meghatározott helyre elhelyezni [Horváth József

szívessége folytán] ............................................................................................................................ 83 35. A membránhártyák elkészítésének folyamata. 1. a gyűrű oldalról, ill. felülről; 2. a gyűrűre ráfeszítjük

az első parafilmet (P1); 3–4. a kifeszített hártyára rácseppentjük a táplálékot; 5. kifeszítjük a második

parafilmet (P2); 6. a P2 parafilmet ráhelyezzük az első parafilm tetejére; 7–8. a két filmet összeszorítjuk és

széleiket feltekerjük; 9. az elkészült membránhártya [Kunkel, 1977 után] ...................................... 86 36. A gyűrűk összeállításának módozatai (a 35. ábra folytatása). 9. az elkészült membránhártya; 10. a

gyűrű oldalról, ill. felülről; 11. gyűrű a hártyával. Az egyszerű gyűrűk (12–13.) és a választásos kamrák

(15–16.) alja nejlon fátyolszövet, amelyet mikroszkóp tárgylemezéhez erősített parafadugóhoz ragasztunk.

A választásos kamra keresztirányú darabja (14.) üveglapból van kivágva és parafilmmel beragasztva

[Kunkel, 1977 után] .......................................................................................................................... 86 37. A kifejlett kabócák gyűjtésére alkalmas szívókészülék [Washio et al., 1968 után módosítva Noordam

(1973) után] ...................................................................................................................................... 92 38. A Trichodorus fajok izolálásához szükséges, ún. Baerman-féle tölcsér [Noordam, 1973 után] . 94 39. A Trichodorus fajok izolálásának következő lépése [Noordam, 1973 után] .............................. 94 40. A: szűrő (0,05 mm) a Petri-csészében az állványon; B: doboz a bevésett négyzetráccsal: 1. fogantyú,

2. emelt szegély; C: disznószőr vékony fadarabra ragasztva [Noordam, 1973 után] ........................ 95 41. Talajból izolálható nematódafajok. 1. Tylenchorhynchus dubius. 2. Rhabditid. 3.*Longidorus

elongatus. 4. Dorilaimid. 5. Rotylenchus uniformis. 6.*Xiphinema diversicaudatum. 7. Tylolaimophorus.

8. Diphtherophora. 9. Trichodorus. A *-gal jelölt fajok vírusátvitelre alkalmasak [J. Seinhorst rajza alapján

Noordam, 1973 után] ........................................................................................................................ 95


x Created by XMLmind XSL-FO Converter.

42. A vírus megőrzésének speciális helyei a vektor fonálférgekben. A vírus kapcsolatban van a

tápcsatorna falával a jelzett területeken [Taylor és Robertson, 1975 után] ...................................... 96 43. Javított standard módszerrel végzett vírusátvitel fonálférgekkel[R. Fritzsche szívessége folytán] 97 44. A burgonya szártörpülés vírus (potato mop-top pomovirus) lokális tünetei Chenopodium

amaranticolor diagnosztikai tesztnövényen, 27 nappal az inokulálás után [Horváth József szívessége

folytán] ............................................................................................................................................. 98 45. A: Vicia faba hiperszenzitív reakciója a bab sárga mozaik vírussal (bean yellow mosaic potyvirus) és

B: Melandrium sárgafoltosság vírussal (Melandrium yellow fleck bromovirus) szemben [Horváth József

szívessége folytán] .......................................................................................................................... 104 46. Lokális szimptómák Datura stramonium (A) és D. gigantea (B) inokulált levelein. A: klorotikus léziók

belladonna foltosság vírussal (belladonna mottle tymovirus) fertőzött növény levelén; B: nekrotikus léziók

dohány gyűrűsfoltosság vírussal (tobacco ringspot nepovirus) inokulált növény levelén [Horváth József

szívessége folytán] .......................................................................................................................... 106 47. Szisztemikus szimptómák. A: lucerna mozaik vírussal (alfalfa mosaic alfamovirus) inokulált Solanum

marginatum mozaikos levele; B: paradicsom magtalanság vírussal (tomato aspermy cucumovirus)

inokulált Nicotiana glutinosa deformált levele; C: burgonya Y-vírussal (potato Y potyvirus) inokulált

burgonya (Solanum tuberosum) levele; D: dohány mozaik vírussal (tobacco mosaic tobamovirus) fertőzött

Petunia atkinsiana páfránylevelűsége [Horváth József szívessége folytán] .................................... 108 48. A: burgonya Y-vírussal (potato Y potyvirus) fertőzött Nicotiana tabacum szárnekrózisa; B: nekrotikus

léziók a burgonya Y-vírus NTN-törzsével fertőzött burgonya (Solanum tuberosum) bogyóin; C:

nekrotikus léziók a burgonya Y-vírus NTN törzsével fertőződött burgonyagumókon; D: tarlórépa mozaik

vírussal (turnip mosaic potyvirus) fertőződött Matthiola incana virágának színtörése (flower breaking) [A

és D: Horváth József szívessége folytán; B és C: Pintér Csaba szívessége folytán] ....................... 108 49. A: dohány rattle vírus (tobacco rattle tobravirus) által előidézett tünetek Libertas burgonyafajta

gumószöveteiben; B: répa nekrotikus sárgaerűség vírus (beet necrotic yellow vein benyvirus) által

előidézett gyökérproliferáció (szakállasodás) cukorrépán [Horváth József szívessége folytán] .... 109 50. A: Chenopodium amaranticolor a polifág uborka mozaik vírus (cucumber mosaic cucumovirus) és B:

burgonya Y-vírus (potato Y potyvirus) virofil gazdája [Horváth József szívessége folytán] ......... 114 51. A szőlő virológiai ellenőrzésének rendszere [Lázár János szívessége folytán] ........................ 119 52. Különböző morfológiájú növénypatogén vírusok. A: pálcika alakú dohány mozaik vírus (tobacco

mosaic tobamovirus); B: fonál alakú saláta mozaik vírus (lettuce mosaic potyvirus); C: szférikus

belladonna foltosság vírus (belladonna mottle tymovirus) [Horváth József szívessége folytán] .... 128 53. BSMV: árpa csíkos mozaik vírus (barley stripe mosaic hordeivirus) és LRSV: Lychnis

gyűrűsfoltosság vírus (Lychnis ringspot hordeivirus) részecske-hosszúság eloszlása. A sötét oszlopok a

mért virionok eloszlását mutatják, míg a vonaldiagram a három csoport folyamatos összegezésével kapott

eredményt ábrázolja. ⇓ : normál hosszúság; ↓: látszólagos hosszúság [Gibbs et al., 1963 után] .... 130 54. Vírusfelhalmozódás a kloroplasztiszban. Két vírushalmaz dohány mozaik vírussal (tobacco mosaic

tobamovirus) fertőzött dohány (Nicotiana tabacum) mezofillum sejtjének kloroplasztiszában. Az alsó

szétnyomja a gránumokat, a felső halmaz kidomborítja a kloroplasztiszt határoló kettős membránt. GR =

gránum, V = vírushalmaz, VA = központi sejtüreg, W = sejtfal. 30 000-szeres nagyítás [Esau, 1968 után]

135 55. A: tarlórépa sárga mozaik vírussal (turnip yellow mosaic tymovirus) fertőzött kínai kel (Brassica

pekinensis) levél mezofillumsejtjének kloroplasztiszai. Jellegzetes széli vezikulumok (V) a

kloroplasztiszban, és virionok felhalmozódása a két kloroplasztisz közötti citoplazmában. B: széli

vezikulumok kinagyított képe. Nyilak jelzik a kettős membránnal borított hólyagocskák nyaki részét,

amely a citoplazmába nyílik. Az alsó vonalak mérete = 100 nm [Francki et al., 1985 után] ......... 136 56. A kloroplasztiszok kóros eltérései paradicsom bronzfoltosság vírussal (tomato spotted wilt tospovirus)

fertőzött Nicotiana benthamiana növények levelének mezofillumsejtjeiben A: a megnagyobbodott

keményítőszemcsék (nyíllal jelölve) szétnyomják a tilakoidmembránokat; B: a kloroplasztiszok alakja

megváltozott, a belső membránrendszer fellazult. A tilakoidok (T), a plasztoglobulusok (P) és a

kloroplasztiszban található vezikulumok nyíllal jelölve; C: az erősen duzzadt kloroplasztiszban

plasztoglobulusok halmozódtak fel (nyíl jelzi); D: a fertőzés utolsó szakaszában a külső burokkal

rendelkező virionok az egész citoplazmában megtalálhatók, de sohasem fordulnak elő a

kloroplasztiszokon belül. A nyíllal jelzett virionok hármas-négyes csoportokban, vagy többesével láthatók

egy közös membránban .................................................................................................................. 137 57. Kristályos citoplazmatikus zárvány, dohány mozaik vírussal (tobacco mosaic tobamovirus) fertőzött

dohány (Nicotiana tabacum) parenhimasejtjében. A pálcika alakú virionok egymással párhuzamosan,

sorokba rendeződve, számos réteget képeznek. 26 000-szeres nagyítás. CH = kloroplasztisz, VA =

központi vakuólum, W = sejtfal [Esau, 1968 után] ........................................................................ 139


xi Created by XMLmind XSL-FO Converter.

58. Amorf citoplazmatikus zárvány (X-test) dohány mozaik vírussal (tobacco mosaic tobamovirus)

fertőzött Nicotiana tabacum levelének parenhimasejtjében. A tubulusok (csövecskék) kis csoportokban, a

nyalábok egymással szöget bezárva rendeződtek. RB = riboszómák, ER = endoplazmatikus retikulum, VA

= üregek, V = virionok [Esau, 1968 után] ...................................................................................... 140 59. Potyvirusokra jellemző forgókerékszerű (pinwheel) zárványok (A, B, C). C: Malva érkivilágosodás

vírus (Malva vein clearing potyvirus) forgókerékszerű zárványai. 80 000-szeres nagyítás. La = lemezes

aggregátumok, P = plasztid (kloroplasztisz), M = mitokondrium, Pw = forgókerékszerű (pinwheel)

zárvány [Horváth József szívessége folytán] .................................................................................. 140 60. Sejtmagzárványok dohány karcolatos vírussal (tobacco etch potyvirus) fertőzött dohánylevél

(Nicotiana tabacum) sejtjeiben. A: a metszés síkja merőleges a zárvány síkjára; B: a metszet egy

bipiramidális zárvány lemezének síkjában készült. Az ábrák bal alsó sarkában a vonal 500 nm-nek felel

meg. Nu = nucleolus (sejtmagvacska) [Francki et al., 1985 után] .................................................. 141 61. A: Malva érkivilágosodás vírus (Malva vein clearing potyvirus) fénymikroszkópos zárványai; B: retek

mozaik vírus (radish mosaic comovirus) zárványai. 800-szoros nagyítás; C: karfiol mozaik vírus

(cauliflower mosaic caulimovirus) zárványai. 450-szeres nagyítás; IB = zárványtestek (inclusions), N =

sejtmag, P = plasztid, CN = kristályos, tűszerű zárványok, V = vakuolum [Horváth József szívessége

folytán] ........................................................................................................................................... 142 62. A dohány nekrózis vírus (tobacco necrosis necrovirus) lokális tünetei Nicotiana knightiana (A) és

Solanum capsicastrum (B) növények levelein [Horváth József szívessége folytán] ...................... 146 63. A burgonya X-vírus (potato X potexvirus) és a belőle izolált fehérje és nukleinsav abszorpciós

spektruma [Francki és McLean, 1968 után] ................................................................................... 149 64. A lucerna mozaik vírus (alfalfa mosaic alfamovirus) szisztemikus tünetei néhány gazdanövényen. A:

Ocimum viridae; B: Solanum marginatum; C: Viburnum opulus [Horváth József szívessége folytán] 154 65. Dohány gyűrűsfoltosság vírus (tobacco ringspot nepovirus) tünetei. A: lokális tünetek Datura gigantea

növény levelén; B: szisztemikus szimptómák Tropaeolum peregrinum növény levelén [Horváth József

szívessége folytán] .......................................................................................................................... 155 66. Dohány-mezofillumból izolált protoplasztok ........................................................................... 160 67. A dohány mozaik vírus (tobacco mosaic tobamovirus) replikáció szakaszai a növényi sejtben. A:

fertőzés, B: az RNS kiszabadulása, C: kötődés a riboszómákhoz, D: vírusreplikáz (vagy egy része), E: a

replikatív forma keletkezése, F: replikatív intermedierek keletkezése, G: replikatív komplex, H:

összeépülés, I: kész virionok, RF: replikatív forma, RI: replikatív intermedier, sRNS: kis (szubgenomi)

RNS [Érsek és Gáborjányi, 1998 után] ........................................................................................... 162 68. A potyvirusok [szilva himlő vírus (plum pox potyvirus)] géntérképe. P1(Pro) = P1 fehérje

proteázaktivitással, HC-Pro = segítő (helper) komponens, P3 = P3 fehérje, 6K1 = 6K1 fehérje, CI (Hel) =

citoplazmikus zárványfehérje helikázaktivitással, 6K2 = 6K2 fehérje, NIa = sejtmagfehérje, NIb (Rep) =

sejtmagfehérje replikázaktivitással, CP = köpenyfehérje, poli (A) = poliadenilsav. Magyarázat a

szövegben [Riechmann et al., 1991 után] ....................................................................................... 163 69. A tehénborsó mozaik vírus (cowpea mosaic comovirus) géntérképe és a transzláció utáni hasadás

termékei: poli(A) = poliadenilsav farok, ORF = nyílt leolvasási szakasz, nt = nukleotid, kD = kilodalton.

Magyarázat a szövegben [Matthews, 1991 után] ............................................................................ 164 70. A rozsnok mozaik vírus génszerveződése. cap = sapka, tRNS = transzfer RNS-szerű vég, ORF = nyílt

leolvasási szakasz, nt = nukleotid, kD = kilodalton [Matthews, 1991 után] ................................... 165 74. A geminivirusok génszerveződése és lehetséges géntermékei. Magyarázat a szövegben [Mullineaux et

al., 1984 után] ................................................................................................................................. 168 75. A paradicsom bronzfoltosság vírus (tomato spotted wilt tospovirus) osztott genomja és

génkifejeződése. mRNS = messenger RNS, vRNS = vírus-RNS, p = fehérje (protein), kD = kilodalton.

Magyarázat a szövegben [German et al., 1992 után] ...................................................................... 169 76. A tehénborsó mozaik vírus (cowpea mosaic comovirus) és a poliovirusok fehérjegénjeinek hasonló

elrendeződése és konzervált szekvenciái. CPMV = tehénborsó mozaik vírus (cowpea mosaic comovirus).

VP = vírusprotein, VPg = vírusgenomhoz kötött fehérje. A pontozott részek a homológ szekvenciákat

jelölik [Matthews, 1985 után] ......................................................................................................... 171 77. A lucerna mozaik vírus (alfalfa mosaic alfamovirus), a rozsnok mozaik vírus (brome mosaic

bromovirus) és a dohány mozaik vírus (tobacco mosaic tobamovirus) genomszerveződésének hasonlósága

a szekvenciában homológ szakaszokkal. AMV = lucerna mozaik vírus, BMV = rozsnok mozaik vírus,

TMV = dohány mozaik vírus, CP = köpenyfehérje. A vonalazott részek a megfelelő konzervált szakaszok

[Matthews, 1985 után] .................................................................................................................... 172 78. Az antigén, az antigént megjelenítő sejt, a T és a B nyiroksejtek közötti kölcsönhatás [Hampton et al.,

1990 után] ....................................................................................................................................... 176 79. Az immunoglobulin- (IgG) molekulák felépítése és típusai enzimes hasítás után [Hampton et al., 1990

után] ................................................................................................................................................ 178


xii Created by XMLmind XSL-FO Converter.

80. A monoklón antitest előállításának folyamatábrája; A: az egér immunizálása, B: a myeloma- és a

légsejtek fúzióra történő előkészítése;C: sejtfúzió; D: a sejthibridek szelekciója, szaporítása,

krioprezerválása és klónozása; E: a hibridómák szkrínelése; F: monoklón antitest termeltetése és tisztítása

[Hampton et al., 1990 után] ............................................................................................................ 181 81. A kettős géldiffúzió precipitációs íveinek értelmezése. Magyarázat a szövegben [Hampton et al., 1990

után] ................................................................................................................................................ 186 82. A különböző ELISA-eljárások sematikus ábrázolása. A: Y = IgG, • = vírus, YE = IgG-enzim

konjugátum; B: V = F (ab‟)2, • = vírus, Y = IgG, EA = Protein A-enzim konjugátum; C: Y = IgG, • = vírus,

Y = IgG, A-E = anti-IgG-enzim konjugátum; D: A = Protein A, Y = IgG, • = vírus, EA = Protein A-enzim

konjugátum; E: • = vírus, YE = IgG-enzim konjugátum; F: • = vírus, Y = IgG, A-E = anti-IgG-enzim

konjugátum [Hampton et al., 1990 után] ........................................................................................ 188 83. A gél-elektroforézis vázlata [Brown, 1990 után] ...................................................................... 196 84. A Southern-hibridizáció vázlata [Sain és Erdei, 1985 után] ..................................................... 198 85. A blottolás [Sambrook et al., 1989 után] .................................................................................. 199 86. A szendvics-hibridizáció vázlata [Molnár János szívessége folytán] ....................................... 200 87. A cDNS-készítés folyamata [Brown, 1990 után] ...................................................................... 200 88. Próbakészítés nick-transzlációval. ↓: Eredeti nick pozíció, ⇓ : Végső nick pozíció, →→→→ : Jelölt

szál [Brown, 1990 után] .................................................................................................................. 201 89. A biotinálás vázlata [Molnár, 1991 után] ................................................................................. 202 90. A polimeráz láncreakció. A és B: az eredeti DNS-szálak, A‟ és B‟: a két oligonukleotid primer. A

szaggatott vonal az in vitro szintetizált DNS-t jelöli [McInnes és Symons, 1991 után] ................. 203 91. Az RNS-vírusok detektálása RT-PCR reakcióval. Elsőszál komplementer DNS (cDNS) készítése

reverz transzkripcióval (RT) RNS templátról, majd a cDNS felszaporítása polimeráz láncreakcióval (PCR)

[McInnes és Symons, 1991 után] .................................................................................................... 205 92. Az indol-3-ecetsav szerkezeti képlete ....................................................................................... 207 93. A G3 gibberellinsav szerkezeti képlete ..................................................................................... 208 94. A: a citokininbázisok, B: nukleozidok és C: nukleotidok általános szerkezeti képlete ............ 208 95. Az etilén szerkezeti képlete ...................................................................................................... 209 96. Az abszcisszinsav szerkezeti képlete ........................................................................................ 210 97. A zeatin (Z) elektronütköztetéses tömegspektruma (a spektrumban csak a legjellegzetesebb

fragmentumok szerepelnek). Bi+ = bázision; Mi+ = molekulaion; R.I. = relatív intenzitás; m/z =

tömeg/töltés arány ........................................................................................................................... 223 98. A növényeket befolyásoló hét „stresszhatás” [Schlee, 1992 után] ........................................... 232 99. Az aktív oxigénformák szerepe a növényben lejátszódó folyamatok aktiválásában. RP =

receptormolekulák, G = G-protein, SA = szalicilsav, SA• = szalicilát gyök, BA2H = benzoesav-2-

hidroxiláz, + = pozitív hatás, – = negatív hatás [Hammond-Kosack és Jones, 1996 után módosítva] 237 100. Az aktív oxigénformák kétfázisú termelődése kórokozó–növény kapcsolatban [Baker és Orlandi,

1995 után] ....................................................................................................................................... 238 101. Az AOF termelődése (A, B) és sejthalál (C, D) a P.s. tabaci (Pseudomonas syringae pv. tabaci) és

P.s. gly. (Pseudomonas syringae pv. glycinea) 4-es és 6-os rasszával fertőzött dohány- és szója-

sejtkultúrákban. Inkompatibilis (teli szimbólumok) és kompatibilis (üres szimbólumok) gazda–parazita

kapcsolatok [Baker és Orlandi, 1995 után] ..................................................................................... 239 102. A H2O2 kimutatása agarlemezes módszerrel. A: gyökereken a baloldali növény a kontroll, B és C:

burgonya-levélkorongokon felül a kontroll látható mindkét esetben [Wu et al., 1995 után] .......... 242 103. H2O2 szöveti meghatározása csíranövényből szövetlenyomatok készítésével [Schopfer, 1994 után]

244 104. Nekrotikus léziók körül keletkező szuperoxid és a NBT reakciója során keletkező formazán

elszíneződése, dohány mozaik vírussal (tobacco mosaic tobamovirus) inokulált Nicotiana tabacum cv.

Samsun NN dohány levélkorongjain [Doke és Ohashi, 1988 után] ................................................ 246 105. Nicotiana tabacum cv. Xanthi-nc (A), Nicotiana suaveolens (balról fertőzött, jobbról egészséges,

kontroll növény) (B) és Datura stramonium (C) hiperszenzitív rezisztenciája a dohány mozaik vírussal

(tobacco mosaic tobamovirus) szemben. Burgonya Y-vírussal (potato Y potyvirus) fertőzött Capsicum

annuum cv. Bogyiszlói szisztemikus tünetei (D) ............................................................................ 252 106. A: a burgonya Y-vírussal (potato Y potyvirus) szembeni hiperszenzitív reakció (az inokulált

leveleken kialakuló nekrotikus léziók) Solanum tuberosum növényen. B: Solanum venturi (BGRC 8237)

vad faj reakciója (szisztemikus mozaik) a burgonya X-vírussal (potato X potexvirus) szemben ... 259 107. A transzpozon nyomon követés lépései. Az első lépésben a domináns rezisztenciagént (R gén)

homozigóta formában tartalmazó, nem-autonóm transzpozont hordozó növényt olyan növénnyel

keresztezik, amely a transzpozon autonóm párját tartalmazza. A nem-autonóm elem az „A” marker gént

hordozza annak érdekében, hogy biztosítsák jelenlétét a növényekben. Az F1 hibridben a nem-autonóm


xiii Created by XMLmind XSL-FO Converter.

elem transzlokációját a „B” marker gén meginduló expressziója jelzi. Ezután további keresztezésekkel

eliminálják a riporter gént és az autonóm elemet tartalmazó kromoszómarészt, illetve szelektálják a

mutáns, vírusfogékony növényeket. P = promóter régió ................................................................ 270 108. Rezisztenciagén-izolálás molekuláris térképezés segítségével. A: majdnem izogén vonalak analízise

(Nearly Isogenic Lines – NIL). A domináns rezisztenciagént hordozó, vírusellenálló növényt (P1)

keresztezik a fogékony fenotípusú fajtával (P2). A heterozigóta F1 hibridet a fogékony (P2) szülővel

visszakeresztezik. Az utódnövények közül kiválogatják a rezisztens fenotípusúakat (heterozigóták), majd

azokat újból a homozigóta recesszív (P2) szülővel keresztezik. Ezt a visszakeresztezést több generáción

keresztül ismétlik, és mindig a domináns, vírusellenálló fenotípusra szelektálnak. A kromoszómapárok

rekombinációja („crossing over”) következtében a hetedik nemzedékben szinte a teljes genom – a

rezisztenciagént tartalmazó szűk régió kivételével – a fogékony szülőtől (P2) származik. Ezek tehát

majdnem tökéletesen izogén vonalak. B: hasadópopuláció-analízis (Bulked Segregant Analyzis – BSA). A

domináns (rezisztens), illetve recesszív (fogékony) homozigóta szülők keresztezéséből származó F1

hibridet önmagával keresztezik. A hasadó F2 nemzedék egyedeit fenotípusuk alapján két csoportra

osztják. A kromoszómapárok rekombinációja („crossing over”) következtében a rezisztenciagénnel

azonos kromoszómán lévő molekuláris markerek átrendeződnek. C: a molekuláris markereket

(polimorfizmusokat) összehasonlítják a hibrid vonalak fenotípusával, és megkeresik a rezisztenciával

együtt hasadó markereket. Ezek a keresett lókusz közvetlen környezetéből származó szekvenciarészletek,

amelyek segítségével a genomi könyvtárból izolálhatók a rezisztenciagének ................................ 272 109. A növény idegen génnel történő transzformálásának főbb lépései [Salazar, 1996 után] ........ 281 110. A pGA 482 alapú plazmid. Az uborka mozaik vírus (cucumber mosaic cucumovirus – CMV) Trk7-es

törzse cDNS klónjáról származó, 1200 bázispár hosszúságú régiót, mely a vírus köpenyfehérje génjét (CP)

hordozza, az ábrán jelölt XbaI helyre klónozták 35S promóter és NOS transzkripciós terminál régió közé.

BR = (right border) a T-DNS jobb oldali határszekvenciája; BL = (left border) a T-DNS bal oldali

határszekvenciája; NptII = neomicin-foszfotranszferáz II NOS promóter és terminál régió között; Tet =

tetraciklin-rezisztenciagén baktériumpromóter mögött .................................................................. 282

xiv Created by XMLmind XSL-FO Converter.

A táblázatok listája

1. Növénypatogén víruscsaládok és nemzetségeik száma ................................................................ 10 2. Tospovirusok átvitelében szerepet játszó vektorok ...................................................................... 12 3. A Nemzetközi Vírustaxonómiai Bizottság által újonnan jóváhagyott vírusrendszer .................... 35 4. Növenypatogen vírusnemzetségek és típustagjainak fontosabb tulajdonságai ............................. 38 5. A növénypatogén vírusnemzetségek típus vírusfajainak összefoglaló tulajdonságai1 ................. 44 6. A vírusok magyar és angol nevei, valamint akronímjai1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 ...................................... 52 7. A növényvirológiában használt fontosabb kísérleti növények kódjai1 ......................................... 66 8. A burgonya Y-vírus (potato Y potyvirus) átvitele levéltetvekkel (Govier és Kassanis, 1974 után) 87 9. Burgonya Y-vírus (potato Y potyvirus) és helper komponens átvitelek levéltetvekkel (Govier és

Kassanis, 1974 után) ......................................................................................................................... 88 10. Lokális növény-vírus kapcsolatok ............................................................................................ 106 11. Szisztemikus növény-vírus kapcsolatok ................................................................................... 107 12. Lokálislézió-számlálás latin négyzet módszerrel ...................................................................... 111 13. Lokálislézió-számlálás féllevél és latin négyzet módszerrel .................................................... 112 14. A dohány mozaik vírus és a paradicsom mozaik vírus szétválasztása differenciáló tesztnövényekkel

(Horváth, 1993a után) ..................................................................................................................... 114 15. Vírusok fenntartására alkalmas tesztnövények és azok inokulációjának optimális ideje (Noordam,

1973 után) ....................................................................................................................................... 115 16. Néhány vírus fenn tarthatósága gazdanövény ékben ................................................................ 116 17. A magyar vírusellenőrzési rendszerben használt fás szárú indikátorokkal kimutatható szőlőpatogén

vírusok1 .......................................................................................................................................... 120 18. Gyümölcsfajok üvegházi fás szárú biológiai tesztelése (Bach és Szőnyegi, 1996 után)1 ........ 123 19. A citoplazmatikus és a normális sejtalkotórészek elszíneződése különböző festések alkalmazásakor

(Dijkstra és De Jager, 1998 után) .................................................................................................... 142 20. Növényvírusok, amelyekkel szemben monoklón antitesteket állítottak elő (van Regenmortel és Dubs,

1993 után módosítva) ..................................................................................................................... 182 21. Az indol-3-ecetsavnak és különböző származékainak tömegspektrumában előforduló jellegzetes

ioncsúcsok m/z értékei és a bázisionhoz viszonyított relatív intenzitásuk (zárójelben). IES = = indol-3-

ecetsav, Me = metil, TMS = trimetil-szilil, Mi+(Mi-) = molekulaion, Bi+(Bi-) = bázision. .......... 216 22. Citokininvegyületek és származékaik elektronütköztetéses tömegspektrumát alkotó fontosabb

ioncsúcsok m/z értékei és relatív intenzitásuk a bázision százalékában (zárójelben). iP = izopentenil-

adenin, [9R]iP = izopentenil-adenin-ribozid, Z = zeatin, [9R]Z = zeatin-ribozid, TMS = trimetil-szilil,

perMe = permetil, Mi+ = molekulaion, Bi+ = bázision. ................................................................. 224 23. Az AOF mérési módszereinek összefoglalása (Schroeder et al., 1996 után módosítva) .......... 241 24. Nicotiana tabacum fajták és törzsek vírusrezisztenciája ........................................................... 253 25. A paradicsom vírusrezisztenciája (Spaar és Kleinhempel, 1985 után módosítva) .................... 254 26. A Capsicum genotípusok rezisztenciája és a tobamovirus patotípusok közötti kapcsolat (Boukema,

1984 után) ....................................................................................................................................... 255 27. A paprika komplex vírusrezisztenciája (Spaar és Kleinhempel, 1985 után) ............................. 256 28. Paprikafajták tobamovirus-ellenállósága .................................................................................. 257 29. A genetikai bázis (Solanum fajok) vírusrezisztenciája (Horváth, 1988 után) 1, 2, 3 ................ 258 30. Fontosabb rezisztenciaszabályozó gének (Foxe, 1992 után) .................................................... 259 31. A burgonya X-vírus (potato X potexvirus) törzsek csoportosítása (Foxe, 1992 után) .............. 260 32. Új burgonyafajták nemesítésének vázlata (Ross, 1986 után módosítva) .................................. 263 33. Protoplaszt-tenyésztés és a növényregenerálás körülményei .................................................... 268 34. A köpenyfehérjegénnel indukált vírusrezisztencia a transzgénikus növényekben (Miller és Hemenway,

1998) ............................................................................................................................................... 274 35. Az Európai Közösségben elő nem forduló kórokozók1 ........................................................... 286 36. Az Európai Közösségben elő nem forduló, de az Európai Közösségre nézve fontos vírus, vírusszerű és

viroid kórokozók ............................................................................................................................. 288 37. Az Európai Közösségben előforduló és az Európai Közösségre nézve fontos károsítók ......... 289 38. Európai karantén károsítók (vírusok, vírusszerű kórokozók és viroidok) az EPPO-régióban (Smith et

al., 1997 után) ................................................................................................................................. 292

1 Created by XMLmind XSL-FO Converter.

1. fejezet - Előszó

A Növényvírusok és virológiai vizsgálati módszerek c. egyetemi tan- és kézikönyv megírását az tette

szükségessé, hogy a Pannon Agrártudományi Egyetem Georgikon Mezőgazdaságtudományi Karának

(Keszthely) Növényvédelmi Intézete elnyerte az Országos Akkreditációs Bizottsághoz benyújtott pályázatát

„Növényvirológiai Iskola” (Ph.D.-képzés) megteremtésére. Tekintettel arra, hogy magyar nyelvű

vírusmódszertani kiadvány – eltekintve a korábbi években megjelent növényvirológiai könyvekben és

folyóiratokban közzétett szűkebb körű ismeretektől – nem áll korszerű formában rendelkezésre a Ph.D.

hallgatók számára, ezért nélkülözhetetlennek tartottuk ennek a könyvnek a kiadását. Úgy gondoljuk, hogy Ph.D.

hallgatóinkon kívül az agrármérnök, az agrárkémikus agrármérnök, a növényvédelmi szakmérnök és a

növényorvosi szak hallgatóinak régi kívánsága teljesül azzal, hogy a Növényvírusok és virológiai vizsgálati

módszerek c. tankönyv megjelenik. Reméljük, hogy ezt a könyvet nemcsak az agráregyetemi és főiskolai

képzésben, hanem a biológusképzésben részt vevő hallgatók is örömmel fogadják.

Az egyetemi tankönyvet „kigondoló” szerkesztők részéről talán merész vállalkozásnak tűnhet, hogy a

módszertani könyv megírását nagyobb részben virológus Ph.D. hallgatóinkra bíztuk. Ezzel azt kívántuk elérni,

hogy saját tudományterületük témáiban minél jobban elmélyedjenek, megismerjék a legalapvetőbb

módszereket, és azokat úgy írják meg, ahogyan megálmodták egy hazai, „még nem létező” tankönyvben. Az

egyes fejezetek végén megtalálható Irodalom az ismeretek szélesebb körű elsajátításában kí-ván segítséget

nyújtani.

A szerkesztők és a szerzők köszönetüket fejezik ki mindazoknak, akik a könyv kéziratának elkészülte során

hasznos észrevételeket tettek. A kézirat előkészítésében, szerkesztésében nyújtott technikai segítségért hálás

köszönetünket fejezzük ki Hun Lajosné, Ihász Zoltánné és Molnár Katalin munkatársainknak. Messzemenő

köszönetünket fejezzük ki Balázs Ervin, Barna Balázs, Király Zoltán és Klement Zoltán professzor uraknak

azért, hogy a Pannon Agrártudományi Egyetem Virológiai Doktori Iskola munkájában közreműködtek és

segítették a virológus doktorjelöltek tudományos tevékenységét és e tankönyvben való közreműködését.

Köszönetet mondunk azoknak a hazai és külföldi kollégáinknak és kiadóknak, akik eredeti és már megjelent

értékes ábráikat rendelkezésünkre bocsátották. Nem utolsó sorban köszönetettel tartozunk a könyv lektorainak,

akik észrevételeikkel és tanácsaikkal gazdagították a könyvet. Köszönet illeti a Mezőgazda Kiadót és minden

pártfogó támogatót, hogy e könyv megjelentetését elősegítették.

A Növényvírusok és virológiai vizsgálati módszerek c. egyetemi tankönyvet azzal a gondolattal bocsátjuk útjára,

hogy felhívjuk vele a figyelmet a rohamosan fejlődő növényvirológia fontosságára és elősegítjük az egyetemi

hallgatóknak és a Doktori Iskola Ph.D. hallgatóinak munkáját, ismereteik gyarapodását, továbbá a tudományba

vetett hitük megőrzését és továbbadását.

Keszthely–Budapest, 1998 novemberében

Horváth József Gáborjányi Richard

intézetigazgató egyetemi tanár, egyetemi magántanár,

az MTA lev. tagja az MTA doktora

Pannon Agrártudományi

Egyetem Magyar Tudományos Akadémia

Növényvédelmi Intézet, Növényvédelmi Kutatóintézete,

Keszthely Budapest


2. fejezet - Bevezetés a virológiába

1. A vírusok jelentősége

A vírusok az élővilág olyan parazitái, amelyek növényekben, emberekben, állatokban, rovarokban és különböző

mikroorganizmusokban többnyire súlyos megbetegedéseket idéznek elő. A vírusbetegségek (himlő, veszettség,

sárgaláz, sertéspestis, Eupatorium sárgalevelűség, tulipán színtörés) hosszú idők óta ismertek, bár etiológiai

kutatásuk és fertőzőképességük bizonyítása csak a XIX. század végén kezdődött el. Finlay 1881-ben igazolta a

sárgaláz víruskórokozójának átvitelét Aedes aegypti csípőszúnyoggal, Mayer 1886-ban a dohány mozaik

betegséget okozó vírus átvitelét fertőző dohánynövény szövetnedvével, Loeffler és Frosch pedig 1898-ban

bizonyította a szarvasmarhák száj- és körömfájás-betegség víruskórokozójának szűrhetőségét. Jelenlegi

ismereteink szerint a vírusok a Földön mindenütt előfordulnak. Csupán Európában mintegy ezer növényi

vírusbetegség ismert; a szilva himlő vírus (plum pox potyvirus) a volt Jugoszlávia területén mintegy 16 millió

szilvafát betegített meg és pusztított el. A növényvírusok által előidézett termésveszteségekre vonatkozóan (több

mint 30 vírus esetében) Pennazio et al. (1996) közölt legújabban összefoglaló tanulmányt. Az ember- és

állatpatogén influenzavírusok (A és B típus) 8–10 évenként igen jelentős epidémiákat, néha pandémiákat

okoznak. A XX. században három, nagy morbiditással és gyors terjedéssel járó vírus-influenzapandémiát

figyeltek meg. Az első az ún. „spanyolnátha” volt, amely 1918 áprilisában lépett fel, és mintegy 20 millió ember

halálát okozta. A második, az ún. „ázsiaiinfluenza”-járvány 1957-ben alakult ki (Bakács és Farkas, 1965). A

harmadik járványt – amely 1968/1969-ben az Amerikai Egyesült Államokban lépett fel – az influenzavírus ún.

„Hongkong” típusa idézte elő.

2. A vírusok morfológiája és felépítése

A vírusok olyan fertőzőképes, szubmikroszkopikus obligát sejtparaziták, amelyeknek szférikus (izometrikus)

formái 20–200 nm átmérőjűek, megnyúlt pálcika, ill. fonál alakú formái 100–2000 nm hosszúságúak és 10–20

nm átmérőjűek. A vírusok nagyobb része helikális szimmetriájú; egyes baktériumvírusok (bakteriofágok)

binálisak (1. ábra). A geminivirusoknak iker virionjaik vannak. A vírusok a genetikai információt hordozó

egyszálú, kétszálú, lineáris vagy cirkuláris ribonukleinsavból (RNS) vagy dezoxiribonukleinsavból (DNS) és a

nukleinsav védelmi funkcióját ellátó fehérjeburokból (kapszid) állnak. A nukleinsav és a kapszid együttesen

alkotja a nukleokapszidot. Az ilyen összetételű vírusokat burok nélküli (non-enveloped) vírusoknak nevezzük

[pl. dohány mozaik vírus (tobacco mosaic tobamovirus), rovarpatogén iridovirus stb.]. A vírusok egy másik

részénél a nukleokapszidot még egy külső glükoproteid burok (peplon) veszi körül [pl. paradicsom

bronzfoltosság vírus (tomato spotted wilt tospovirus), valamint néhány növény- és rovarpatogén rhabdovirus].

Egyes vírusok még különböző mértékben lipideket, cukrot és nyomokban poliaminokat is tartalmaznak.

1. ábra - A vírusok sematikus ábrázolása. A: helikális dohány mozaik vírus (tobacco

mosaic tobamovirus); B: izometrikus, kubikális szimmetriájú tarlórépa sárga mozaik

vírus (turnip yellow mosaic tymovirus); C: bakteriofág (Echerichia coli T2-fágja)

3. A vírusok replikációja

Bevezetés a virológiába


A vírusok saját anyagcserével nem rendelkeznek, replikációjukhoz a gazdasejt fehérje- és nukleinsav-

szintetizáló képességét használják fel. A replikáció során a gazdasejt tevékenységét úgy programozzák át, hogy

a sejt saját anyagai elősegítsék új virionok bioszintézisét (produktív infekció). Bizonyos ember-, ill. állatpatogén

vírusok képesek a gazdasejt rosszindulatú átalakítására is (malignus transzformáció); ebben az esetben a sejtek a

rákos sejtekhez válnak hasonlóvá. Produktív infekció esetén a vírusok replikációja hat szakaszra osztható: (1)

adszorpció, (2) penetráció, (3) dekapszidáció, (4) eklipszis, (5) maturáció, (6) kiszabadulás. Az adszorpciós

fázisban a sejt felszíne és a virion között stabil kötődés jön létre. A penetráció során a virion különböző

mechanizmusokkal (növényvírusoknál vektorok segítségével, állatpatogén vírusoknál fagocitózis-szerű

folyamattal, baktériumvírusok esetében nukleinsav-„belövéssel”) jut be a sejtbe. A penetráció után a virion

dekapszidálódik. E folyamatban egyes vírusoknál ún. kapszid fehérjéket bontó enzim vesz részt, más vírusoknál

(pl. influenzavírus) pedig a peplon egyesül a sejtmembránnal és a citoplazmába csak a nukleokapszid hatol be.

Az eklipszis szakaszban a vegetatív vírus nukleinsavban tárolt információi nukleinsav-polimerázok segítségével

új nukleinsavak képződését eredményezik (replikáció). Hasonlóan fontos a nukleinsavat bontó nukleázoknak

(RNázok, DNázok) és a nukleinsavtöréseket összekapcsoló, valamint a vírusnukleinsavnak a sejtgenomba

történő beépítését végző ligázoknak a szerepe. A vírusnukleinsav replikációjával párhuzamosan kezdődik a

vírusfehérjék szintézise. A maturációs (érési) szakaszban a szintetizálódott nukleinsav-, a fehérje- és az egyéb

komponensek érett, fertőző vírusokká egyesülnek. Az összeépülés az izometrikus RNS-tartalmú vírusoknál a

nukleinsav- és a fehérjealegységek fizikokémiai konfigurációjából adódóan csak egyféle virion kialakulásához

vezethet. Más vírusok spontán is aggregálódhatnak, de ismertek olyanok is (pl. adenovirusok), amelyeknek az

alkotórészei nem tudnak minden esetben komplett virionná összeépülni, és ún. „üres” köpenyfehérje-burkok

jönnek létre. A vírusok replikációjáról A vírusgenom szerveződése és a vírusok replikációja című fejezetben

találhatók részletes ismeretek.

4. A vírusos betegségek kialakulása és a tünetek (szimptómák)

A vírussal fertőzött gazdaszervezetben morfológiai, citológiai, fiziológiai stb. elváltozások figyelhetők meg,

amelyek külső és belső tünetekben nyilvánulnak meg. A növényvírusok a fertőzött sejtek plazmodezmáin

keresztül hatolva fertőzik meg a szomszédos sejteket (4–80 µm/óra terjedési sebesség), majd a

szállítószövetekben, a floemben és a xylemben 0,1–1,8 cm/óra sebességgel képesek terjedni. A hiperszenzitíven

reagáló növényi szövetekben a vírusok terjedése a nekrotizálódó sejtek miatt megáll. Az állatpatogén vírusok a

nyirok- és véredényekben vagy az idegpályákon keresztül terjednek. A rovarpatogén vírusok orális felvételt

követően a gyomorba jutva lokalizálódhatnak, vagy a hemolimfán keresztül más szövetbe (zsírszövet,

szaporítószervek, idegrendszer) jutnak. A tünetek a fertőzést követő néhány nap múlva megjelenhetnek

(növény-, ember- és állatpatogén vírusok), míg a bakteriofágok esetében néhány perc alatt. Ismeretesek ún.

„lassú” vírusok is, amelyek néhány hónap (veszettség vírus), ill. 1–2 év alatt (fás szárú növények vírusai)

manifesztálódnak. A növényvírusok külső tünetei szín- és formaelváltozásokban jutnak kifejezésre (abnormális

kalluszképződés, sejtfalvastagodás, amorf és kristályos zárványok). Az ember- és állatpatogén vírusok által

előidézett betegségtünetek (láz, fej- és izomfájás, étvágytalanság, fokozott váladékképződés), hasonlóan a

növényvírusok tüneteihez, nem specifikusak. A legfontosabb betegségszindrómák az alábbi csoportokba

sorolhatók: idegrendszeri, légúti, légzőszervi, bőr- és nyálkahártya-, szem-, máj-, emésztőszervi, nyirok- és lázas

betegségek.

5. A vírusok átvitele, terjedése

Minden növényvírus átvihető fogékony gazdanövényére kertészeti oltással, de természetes terjedésük főképpen

vektorokkal (levéltetvek, kabócák, fonálférgek, talajban élő gombák) és parazita növényekkel (Cuscuta spp.)

történik. A vektormentes átvitelen kívül a vegetatív szaporítószervekkel (gumó, hagyma, rizóma), a generatív

szaporítószervekkel (mag, pollen) és a mechanikai úton történő terjedésnek van jelentősége. Az ember- és

állatpatogén vírusok terjedésében a kontakt átvitelnek, a csepp- és bőrfertőzésnek, a transzplantációnak és a

passzázsnak (tojás, anyatej) van jelentősége. A vírusok igen széles körű elterjedése, tág gazdaköre, valamint a

kedvező ökológiai körülmények sok esetben időben és térben egybeeső epidémiák kialakulását, vagy olyan

pandémiák kialakulását eredményezi, amelyek kiterjedése és időtartama határtalan. Az epidémiák és pandemiák

kialakulásában az ember direkt és indirekt szerepén kívül igen fontos szerepet játszik a növények esetében a

rezisztencia hiánya, a megnövekedett nemzetközi forgalom stb. Az ember- és állatpatogén vírusoknál az

ökoszisztémában bekövetkezett változások, a széles körben elterjedt háziállat–ember kapcsolattal együttjáró víz-

és táplálékkontaminációk, valamint a vektorpopulációk által terjesztett számos vírus olyan betegségek

epidémiáját és pandemiáját képes előidézni, mint pl. a veszettség, influenza stb.



6. A vírusok diagnosztikája

Vírusbetegségnek csak az tekinthető, aminek víruskórokozóját sikerül izolálni, antigénjeit a gazdaszervezetben

kimutatni és/vagy a betegséget mesterséges inokulációval reprodukálni. A vírusfertőzés következtében fellépő

tünetek (szimptómák) alapján bizonyos vírusokra lehet következtetni, de a gazda–vírus reakciókat befolyásoló

környezeti tényezők jelentős volta, továbbá a számos látens és lassú fertőzés (slow vírusok) miatt a

szimptomatológia egyedül igen megbízhatatlan a vírusok diagnosztikájában. A vírusok mesterséges átvitele

tesztnövényekre, tesztállatokra, valamint olyan objektív diagnosztikai eljárások, mint pl. az ELISA-módszer, a

komplementkötési reakció, a hemaglutináció, a neutralizáció, az elektronmikroszkópia, az immuno-

elektronmikroszkópia, az RNS-DNS hibridizáció, a polimeráz láncreakció (PCR) stb. jelentős szerepet játszanak

a vírusok azonosításában. A vírusok fizikai tulajdonságain (hőinaktiválási pont, in vitro eltarthatóság,

hígíthatóság stb.) alapuló diagnosztika megbízhatatlan.

7. A vírusok elleni védekezés

A vírusokkal mint fertőző betegségekkel szembeni védekezés két csoportba osztható: (1) megelőzés (profilaxis)

és (2) gyógyítás (terápia). A növényvírusokkal szembeni preventív eljárások közül a rezisztenciára nemesítésnek

(rezisztens fajták előállításának), a vírusmentes szaporítóanyagok használatának, a fertőzési források

(gyomnövények), a vírusátvitelben szerepet játszó vektorok elpusztításának és a karantén rendszabályok

betartásának a legnagyobb a jelentősége. Újabban eredményeket értek el a gyenge vagy gyengített vírustörzsek

preimmunizálásával kapcsolatban. A keresztvédettség (cross protection) jelenség néven ismertté vált biológiai

védekezés lényege az, hogy egy vírus gyenge, enyhe megbetegedést okozó törzse védelmet nyújt ugyanazon

vírus súlyos betegséget előidéző törzsének fertőzésével szemben, és ez utóbbi vírus szaporodása is jelentősen

csökken. A biotechnológiai módszerek közül figyelmet érdemel a köpenyfehérjegénnel, a szatellit RNS-sel, az

értelmetlen (antiszensz) nukleinsavval és a defektív interferáló molekulákkal kialakított indukált rezisztencia. A

biotechnológiai módszerek alkalmazását a növényvírusok ellen azok az elmúlt években történt biológiai,

biokémiai és molekuláris biológiai felfedezések tették lehetővé, amelyekkel ismertté vált az egyes szervezetek

működését ellenőrző gének megismerése és megváltoztatása. A génsebészeti, ill. a génátültetési módszerek

felhasználásával forradalmi változások következtek be a mezőgazdaságban és a növényvédelemben. Egyes

vélemények szerint 1–2 évtized múlva a világ élelmezésében szerepet játszó 29 fő tápnövény 80%-a

genetikailag módosított, azaz transzgénikus növény lesz. A transzgénikus növények előállításával kapcsolatban

részletes adatok találhatók A vírus-ellenállóságra nemesítés biotechnológiai módszerei c. fejezetben.

A terápiai eljárások közül főképpen a hőterápiának és a regenerációs terápiának (merisztéma kultúra) van

jelentősége. A növényvírusok – és általában a vírusok – elleni kemoterápiát (vírusellenes anyagok) igen nagy

mértékben hátráltatja az a tény, hogy a vírusoknak nincs önálló anyagcseréjük, ezért az in vivo végzett

kemoterápikumok nemcsak a kórokozót, hanem a gazdasejtet is károsítják. Ennek ellenére egyes vírusellenes

szerek (pl. Ribavirin, Tiazofurin, Pyrazofurin) tápoldatba adásával sikerült egyes vírusok [pl. burgonya X-vírus

(potato X potexvirus), burgonya S-vírus (potato S carlavirus)] szaporodását merisztéma kultúrában gátolni,

vagy megszüntetni. Újabban metil-benzimidazol-2il-karbamát tartalmú gombaölő szerekkel is (pl. Benlate,

Bartstin) sikerült mérsékelni egyes növényvírusok tünettani hatását.

A növényvírusok elleni védekezéssel kapcsolatos antivirális, kémiai anyagokról Gáborjányi és Tóbiás

(1986a,b), Hansen (1988, 1989), Schuster (1988), Kluge et al. (1990), Tallóczy és Gáborjányi (1990),

Yordanova et al. (1996), valamint Horváth (1999) munkái adnak összefoglaló áttekintést.

Az ember- és állatpatogén vírusok elleni preventív védekezésben az a lényeges különbség, hogy a

gerincesekben, beleértve az embert is, a vírusfertőzésre immunreakció lép fel, amelyet igen hatásosan lehet

felhasználni. A preventív védekezés a vírus terjedésének megakadályozására (hygiene, fertőtlenítő

rendszabályok betartása, vektorok elleni védekezés, az emberre veszélyes állati gazdák eliminálása),

védőoltásokra, premunizálásra és a karantén-rendszabályok betartására terjed ki, míg a terápia (gyógyítás) a

tüneti kezelésre és a kémiai gyógyításra szorítkozik. Az aktív immunizálás (védőoltás) humorális immunitást és

a celluláris immunreakció aktiválását indukálja, ezáltal a legfontosabb profilaktikus eljárás. Ilyen pl. az

influenza elleni védőoltás (kisgyermekeknek, 65 év feletti és veszélyeztetett személyeknek), amely 1 évig, vagy

a sárgaláz elleni védőoltás (fertőzött területekre utazóknak), amely 10 évig jelent védettséget. A járványos

gyermekbénulás ellen az 1970-es években bevezetett „Kiterjesztett Immunizációs Program” (Expanded

Programme on Immunization = EPI) eredményeként a WHO becslése szerint több mint 400 ezer gyermeket

sikerült megmenteni attól, hogy nyomorékká váljon, és remélhetőleg ez a járványos betegség az ezredfordulóra

megszűnik. A premunizálás (nem specifikus védelmi szisztéma) mind profilaktikusan, mind terápikusan rövid



idejű védelmet jelent az emberre és az állatra egyaránt. Ezt igazolják az interferonnal végzett kutatási

eredmények, amelyeket a különböző daganatokat előidéző vírusok ellen használnak. Az interferon nincs

hatással a vironra; hatását úgy fejti ki, hogy egy másik mRNS transzkripcióját depresszálja. Ez a mRNS a

riboszómákban egy sejtfehérjének (antivirális protein, AVP) a transzlációját segíti elő, ami gátolja a

vírusfehérjék transzlációját úgy, hogy a vírus-mRNS-t nem engedi a riboszómákhoz kötődni. Széles körű

használatának gátat szab a toxikusság, a toleranciafázis és a szelektivitás (arra a szervezetre hat, amely

termelte). A tüneti kezelésre irányuló terápia a betegség klinikai megjelenését (pl. láz, vérnyomásváltozás) veszi

figyelembe, noha jól ismert, hogy vírusellenes szer nem áll rendelkezésre. Krónikus és látens vírusfertőzések

egyáltalán nem befolyásolhatók, mivel nem ismeretes, hogy a vírust, ill. a vírusgenomot a sejtből hogyan lehet

eltávolítani.

Ennél sokkal fontosabb és egyben igen veszélyes probléma az, hogy az antivirális anyagok gyakran rezisztens

vírusmutánsok kialakulásához vezetnek. Az antivirális terápia megválasztásánál fontos szempont a fertőzési

stádiumnak és a replikáció stádiumának megfelelő antivirális anyagok kiválasztása. A penetrációs szakaszban a

fehérje kapszid gátlására influenza A-vírus esetén ciklikus aminok használata javasolt. Az orthomyxo- és

togavirusok penetrációs folyamatát gátolja pl. az amantadin, amelynek sósavas sója Viregyt néven ismert

Magyarországon. A ciklikus aminok (pl. Amantadin) gátolják az influenza A-vírust a korai fertőzési szakaszban,

és emellett jó profilaktikus hatásuk is van. A transzkripciót gátló szerek közül ismert a Rifampicin, amely a

mRNS átírásához szükséges polimeráz enzimeket gátolja. A transzlációt gátló kemoterapikumok közül

legismertebb a Marboran, amely főleg az adeno- és herpesvírusok ellen hatásos. A nukleinsav-szintézis gátlására

alkalmasak a polimeráz enzimek szintézisére ható moroxidinszármazékok és a Virazol, amely kísérleti

állatokban gátolja a herpesvírus és több influenzavírus szaporodását. A pirimidin-analógok a purinanalógokkal

ellentétben toxikus mellékhatást eredményeznek, noha egyes vírusfertőzések (pl. herpes simplex) ellen

hatásosak. A purinanalógok (Acyclovir) hatásosak a herpesvírusok ellen és kevésbé toxikusak.

A növényvírusok (vírusbetegségek) elleni védekezési lehetőségeket Hadidi et al. (1998) legújabb kézikönyve

tárgyalja.

8. A vírusok eredete

A vírusok eredete extrém alkalmazkodóképességük és gyors változékonyságuk miatt ma még ismeretlen, de

számos lehetséges teória van arra vonatkozóan, hogy a növény- és állatvírusok közös eredetűek (Goldbach,

1986; Roossinck, 1997). Tekintettel arra, hogy a vírusok obligát sejtparaziták, létezésük csak a sejtes élőlények

megjelenésével együtt vagy azok megjelenését követően képzelhető el, és mint genetikai szintű paraziták, csak

az élettel párhuzamos evolúciós múltra tekinthetnek vissza. Ezt bizonyítja az a tény is, hogy a jelenleg ismert

növényvírus-nemzetségből 52-nek (több mint 80%) a genomja RNS, és leginkább (46) egyszálú RNS. Egyre

több bizonyíték van arra, hogy a vírusok vagy azok egy része a sejtből alakult ki úgy, hogy a sejtek hosszú időn

át, egymást követő mutációk eredményeképpen elvesztették enzimrendszereiket és emiatt függő viszonyba

kerültek egy másik sejttel szemben, amelynek enzimjeit a reprodukcióhoz felhasználhatta. A sejtből származás

elvét támogatja az, hogy például egyes pozitív szálú RNS-vírusok és az RNS-tartalmú bakteriofágok

nukleinsava inkább hasonlít a gazdasejthez, mint egymáshoz. Ismert az is, hogy a gazdasejtben szaporodó vírus-

RNS molekulák és a gazdasejt nukleinsava között a riboszómakötő helyek számát tekintve hasonlóság van. A

szomszédos nukleotid párok gyakoriságának vizsgálata során összefüggések mutathatók ki a vírus-DNS és a

sejt-DNS szerkezete között.

A vírusokban és a különböző élőlényekben a nukleinsavak kapcsolatai és kölcsönhatásai igen szorosak és

sokrétűek. A vírusok evolúciójában a kapszidnak alapvető jelentősége van, ui. a fertőzés természetes

körülmények között csakis a védett génállományú virion útján lehetséges. A vírusok evolúciója tehát az élet

evolúciójával párhuzamos genetikai információ-evolúciónak az eredménye. Érdemes megjegyezni, hogy

morfológia, replikációs stratégia és vektortípusok alapján történő víruscsoportosítás valószínűleg tükrözi

evolúciós kapcsolataikat, mivel a közös jegyek (tulajdonságok) azok, amelyeket a közös „őstől” örököltek. Az a

tény, hogy kevés víruscsoportnak (nemzetségnek) van hasonló tulajdonság-együttese, arra utal, hogy a

különböző csoportoknak (nemzetségeknek) különböző az eredete. Ez azt jelenti, hogy a vírusok polifiletikus

eredetűek. Az a tény, hogy az egyes víruscsoportok tagjai különböznek egymástól a gazdanövénykörben és a

vektorokban arra utal, hogy a növényi vírusfajok létrejöttének oka (vagy eredménye) az új gazda-, ill.

vektorfajok megszerzése.

A vírusok evolúciójában kétséget kizáróan a mutáció, a rekombináció és a gének újrarendeződése

(génkicserélődés) játszotta a legfontosabb szerepet (Chenault és Melcher, 1994; White et al., 1995; Hu és

Ghabriel, 1996; Roossinck, 1997).


3. fejezet - A vírusok osztályozása és rendszertana

A vírusok fejlődéstörténeti rokonsága még nem tisztázott, csak egyes részletei ismertek, ezért egységes

osztályozásuk nehézségekbe ütközik. Tekintettel arra, hogy a vírusok egy része (pl. rhabdovirusok)

növényekben és rovarokban is szaporodik, ezért a gazdák szerinti osztályozás tudományos szempontból nem

elfogadható. Ennek ellenére a könnyebb áttekinthetőség, valamint számos alapvető ismeret hiánya miatt a

vírusokat gyakorlati szempontból a következők szerint csoportosíthatjuk: (1) növény-, (2) ember-, (3) állat-, (4)

rovar-, (5) baktérium-, (6) gomba-, (7) alga- és (8) fitoplazmavírusok.

A vírusokkal kapcsolatos kezdeti kutatások során megállapítást nyert, hogy a virionok fénymikroszkóppal nem

láthatók, táptalajon nem tenyészthetők és nem szűrhetők. A szűrhetőség volt az egyetlen olyan fiziko-kémiai

tulajdonság, amelyből következtetni lehetett a vírus méretére. A legtöbb tanulmány ebben az időben a vírusok

fertőzőképességével foglalkozott. Ezért a vírusok osztályozásának kezdeti próbálkozásai az általános patogén

tulajdonságokat, ökológiai tulajdonságokat és az átvitel lehetőségeit vették figyelembe. A vírusokat a

növényvírusok által előidézett tünetek (szimptómák) alapján csoportosították (vulgáris nevezéktan). Az azonos

tüneteket mutató vírusokat egy csoportba sorolták („mozaik vírusok”), ahova olyan vírusok tartoztak (pl. dohány

mozaik vírus = tobacco mosaic tobamovirus, karfiol mozaik vírus = cauliflower mosaic caulimovirus) (2. ábra),

amelyekről ma már tudjuk, hogy tulajdonságaikban teljesen eltérnek egymástól.

2. ábra - A: dohány mozaik vírussal (tobacco mosaic tobamovirus) fertőzött Nicotiana

tabacum cv. Samsun mozaikos levelei; B: tünetek a karfiol mozaik vírussal (cauliflower

mosaic caulimovirus) inokulált Brassica rapa var. rapa levelén

A vulgáris nevezéktant később az ún. számkatalogizáló nevezéktan váltotta fel. A számkatalogizáló nevezéktan

sem vitte előbbre a fejlődést, és lényegében alig jelentett változást a vulgáris nevezéktanhoz képest. A

számkatalogizáló nevezéktanra jellemző, hogy a vírust a fő gazdanövény vulgáris (pl. tobacco = dohány), vagy

latin genusznevével (pl. Nicotiana) és a vírus szóhoz csatolt számmal jelölte (pl. tobacco virus 1 vagy Nicotiana

virus 1).

A számkatalogizáló nevezéktant később egy újabb nómenklatúra-rendszer váltotta fel, illetve egészítette ki. Ez

az új nevezéktan csak annyiban tért el a számkatalogizáló nevezéktantól, hogy azt még a vírus egy speciális

tulajdonságával egészítette ki. Így pl. a tobacco virus 1, illetve Nicotiana virus 1 az új nevezéktan alapján

nagyfokú hőtoleranciája miatt a Nicotiana virus altathernus nevet kapta.

Az 1930-as évek végén Holmes (1939) egy újabb rendszert dolgozott ki. A kettős nevezéktan vagy binominális

nómenklatúra az élő szervezetek elnevezéséhez hasonlóan nemzetség- és fajnevet használ. Az elnevezések

alapját azonban ebben a rendszerben is a fő gazdanövényeken okozott tünetek képviselik. A mozaik típusú

betegségeket a binominális rendszer pl. „Marmor” néven csoportosította, és a tobacco mosaic virust Marmor

tabaci névvel jelölte.

A növénypatogén vírusoknak a fenti elvek alapján történt elnevezése egyre inkább tarthatatlanná vált.

Bebizonyosodott ti., hogy a vírusok által előidézett szimptómák még ugyanabban a gazdanövényben is eltérőek

lehetnek, amelyet a külső környezeti feltételek is lényegesen befolyásolhatnak, továbbá ugyanahhoz a

A vírusok osztályozása és

rendszertana


vírusfajhoz tartozó különböző törzsek szimptomatológiailag ugyanabban a gazdanövényben eltérően

viselkedhetnek. A fő szimptómákra alapozott vírusnevezéktan tehát nem bizonyulhatott véglegesnek. Először

Bawden (1950) vetette fel, hogy a vírusok csoportosítására a virion tulajdonságai a legalkalmasabbak. Ennek

figyelembevétele alapján született meg a növénypatogén vírusok újabb csoportosítása, amelynek alapját a

pálcika alakú vírusok (rod-shaped viruses), ill. a fonal alakú vírusok (filamentous viruses) képezték (Brandes és

Bercks, 1965). A pálcika, ill. a fonal alakú vírusokat hat csoportba sorolták, és mindegyik csoportot egy-egy jól

ismert, reprezentatív vírusról nevezték el: (1) tobacco rattle virus csoport, (2) tobacco mosaic virus csoport, (3)

potato virus X csoport, (4) potato virus S csoport, (5) potato virus Y csoport és (6) beet yellows virus csoport.

Lwoff et al. (1962), Lwoff és Tournier (1966) véleménye szerint a virion szerkezetére vonatkozó négy jellemző

tulajdonság alapján is lehetőség van a vírusok osztályozására. Ez a „lényeges integránsnak” nevezett négy

jellemző tulajdonság a következő: (1) genetikai anyag, DNS vagy RNS, (2) virion-szimmetria, (3)

nukleokapszid: csupasz vagy burkolt és (4) mennyiségi adatok (a nukleokapszid átmérője, a kapszomérek

száma).

Az Ideiglenes Vírus Nómenklatúra Bizottság (Provisional Committee of Nomenclature of Viruses, P.C.N.V.)

1966-ban újabb ajánlatokat terjesztett elő, amelyet Pereira (1966) a következőkben körvonalazott: a) az állatok,

növények és baktériumok vírusait egyetlen törzsben (Vira) kell csoportosítani, b) a törzset altörzsekbe,

osztályokba, rendekbe, családokba, nemzetségekbe és fajokba kell beosztani, c) a nemzetségeknek latin vagy

latinos nevet kell adni „virus” szóvégződéssel. Mindegyik nemzetséget egy jól ismert, autentikus fajjal kell

tipizálni. A típusfajt nemzetközi kultúra-kollekcióban kell fenntartani, d) minden családot egy típusnemzetségről

kell elnevezni, amelyhez az „idae” toldalékszócskát kell csatolni, e) a kódban ne legyen elsőbbségi jog, f) a

P.C.N.V. elé olyan hagyományos névjegyzéket kell terjeszteni, amelyben fenntartják a közhasználatban levő

vírusneveket, g) személyek neveivel, anagrammákkal, betűjelzésekkel, hibridnevekkel vagy értelmetlen

nevekkel megjelölt taxonok nem fogadhatók el, és h) az elfogadható új neveket jogi bizottság útján a

Nemzetközi Nómenklatúra Bizottság (International Committee of Nomenclature, I.C.N.) elé kell terjeszteni.

A Gibbs et al. (1966), Gibbs (1969) által előterjesztett alternatív rendszer nem kísérli meg a vírusoknak mint

konvencionális organizmusoknak a kezelését. Rendszerük az ún. Adanson-féle elveken alapszik, azaz az

organizmusok csoportosításának olyan módszerén, amely a legtöbb közös vonást veszi figyelembe. Gibbs és

munkatársai (1966) azzal indokolják elképzelésüket, hogy jelenleg nem ismerik eléggé az egyes tulajdonságok

relatív fontosságát, ezért valamennyi jellegzetesség egyformán fontos. Gibbs et al. (loc. cit.) szerint a vírusokat

népnyelvi, triviális nevekkel és az egyes ismert és még nem ismert tulajdonságokat tartalmazó kriptogrammal

kell megjelölni.

A Vírusok Nemzetközi Nómenklatúra Bizottsága (ICNV) 1973-ban Vírustaxonómiai Nemzetközi Bizottsággá

(International Committee on Taxonomy of Viruses, ICTV) alakult. Az ICTV jelenleg 6 albizottságból, 45

csoportból és mintegy 400 virológusból áll. Az ICTV mexikói értekezletén két víruscsalád és 24 vírusnemzetség

elnevezését fogadta el (Wildy, 1971). Ezt követően az ICTV 1971 és 1991 között öt jelentést állított össze,

amelyben megtalálhatóak azok az újabb eredmények, amelyek a vírusok osztályozásával és elnevezésével

kapcsolatosak (Wildy, 1971; Francki et al., 1991). Az ICTV hatodik jelentésében már 164 nemzetségbe és 24

nem végleges nemzetségbe tartozó, több mint 3600 vírusfajról számol be (Murphy et al., 1995).

A jelenlegi univerzális vírustaxonómiai rendszer az alábbi négy kritériumra épül: (1) a vírusgenom típusa, (2) a

vírusgenom egy- vagy kétszálúsága, (3) a fordított transzkripció (átírás) lehetősége, (4) a vírusgenom polaritása

(Murphy et al., 1995; Mayo, 1996; Pringle, 1998; Mayo és Pringle, 1998).

A legújabb vírustaxonómiai kiadvány (Murphy et al., 1995) vázlatosan, diagramokban szemlélteti a

víruscsaládokat és nemzetségeket, a vírus fő gazdája (primer gazda) szerint. A növényeket (primer gazdákat)

fertőző vírusok kettős szálú dezoxiribonukleinsav-tartalmú vírusokra (dsDNA) és egyszálú

dezoxiribonukleinsav-tartalmú vírusokra (ssDNA), valamint egyszálú ribonukleinsav-tartalmú (ssRNA) és

kettős szálú ribonukleinsav-tartalmú vírusokra (dsRNA) csoportosíthatók (3. ábra).

3. ábra - Növénypatogén vírusok családjainak és nemzetségeinek vázlatos ábrázolása.

dsDNA = kettős szálú dezoxiribonukleinsav, ssDNA = egyszálú dezoxiribonukleinsav,

dsRNA = kettős szálú ribonukleinsav, ssRNA = egyszálú ribonukleinsav, (–) = negatív

szálú vírus, (+) = pozitív szálú vírus. Méretjelző = 100 nm [Murphy et al., 1995 után]


rendszertana


Az egyszálú RNS-vírusok (ssRNA) tovább csoportosíthatók negatív (–) értelmű [ssRNA(–)] és pozitív (+)

értelmű [ssRNA(+)] vírusokra. A negatív (–) jelölés azt fejezi ki, hogy a negatív szálú vírusok esetében szükség

van egy kiegészítő szál szintézisére is, mielőtt a transzláció megindulna. A pozitív (+) jelölés azt fejezi ki, hogy

a vírus-RNS hírvivő (messenger) RNS-ként viselkedik, ami arra utal, hogy sejtmentes transzlációs

rendszerekben közvetlenül képes fehérjék átírására.

1.

1.1.

1.1.1.

1.1.1.1.

1.1.1.1.1. Vírusrendek

A vírusrend a víruscsaládok csoportjából áll. A vírusrendeket a -virales képző (rag) fejezi ki. A növénypatogén

vírusok jelenlegi ismereteink szerint két rendbe (Mononegavirales, Nidovirales) sorolhatók (Pringle, 1998).

1.1.1.1.2. Víruscsaládok és alcsaládok

A víruscsaládok a vírusnemzetségek csoportjából állnak; közös tulajdonságokkal rendelkeznek és

megkülönböztethetők más víruscsaládok tagjaitól. A víruscsaládokat a -viridae képző (rag) fejezi ki, pl.

Potyviridae, ahova több vírusfaj is tartozik (burgonya Y-vírus = potato Y potyvirus). A víruscsaládok nagy része

különbözik a virion morfológiájában, a genomstruktúrában, a replikációs stratégiában stb. Négy családban

(Poxviridae, Herpesviridae, Parvoviridae és Paramyxoviridae) ún. alcsaládok bevezetésére került sor, amelyek

jelölésére a -virinae képzőt használják, pl. Alphaherpesvirinae.

1.1.1.1.3. Vírusnemzetségek

A vírusnemzetségek a vírusfajok csoportjából állnak; közös tulajdonságaik vannak, és különböznek más

nemzetségek vírustagjaitól. A vírusnemzetségeket a -virus képző (rag) fejezi ki, pl. Potyvirus.

A vírusnemzetségek vírusfajaira egyaránt az alábbiak jellemzőek: a) a vírusrészecskék szerkezete azonos,

összetételük nagyon hasonló, b) a genom stratégiája hasonló, c) ökológiai életciklusuk hasonló, d) eltérnek

természetes és mesterséges gazdanövénykörükben, e) eltérnek a gazdanövényeiken okozott tünetekben

(szimptómákban), f) eltérnek vektoraikban.

1.1.1.1.4. Vírusfajok

Az osztályozásban a legfontosabb hierarchikus szint a vírusfaj, amelyet 1991-ben az ICTV elfogadott (Francki

et al., 1991; Van Regenmortel, 1991, 1997).

1.1.1.1.5. Vírustörzsek


rendszertana


A gazdanövénykör és a tünetek nem taxonómiai értékűek. Ennek ellenére, ha két vírusfaj virulenciában

különbözik egymástól, de gazdanövénykör tekintetében nem, akkor azok minden valószínűséggel ugyanazon

vírus különböző törzseinek tekintendők.

1.1.1.1.6. Vírusizolátumok

Egy vírusfaj gazdanövényköre és a gazdanövényeken létrehozott tünetek a vírusok igen változó

tulajdonságainak tekintendők. Ugyanis ismert, hogy akár egyetlen nukleotid megváltozása (mutáció)

megváltoztathatja az izolátum virulenciáját. Tehát ha két vírusizolátumnak ugyanaz a gazdanövényköre és

azokon ugyanazokat a tüneteket idézik elő, akkor feltehetően ugyanannak a vírusnak az izolátumairól van szó.

Ez a következtetés annál meggyőzőbb, minél több gazdanövényre terjed ki a fenti megállapítás.

A vírusok tulajdonságainak felhasználása a taxonómiában

A laboratóriumi technika tökéletesedése következtében a vírusok jellemzése gyors előrehaladást és ugyanakkor

a taxonómiában is változásokat idézett elő. A vírustaxonómia jelenleg a következő tulajdonságokat veszi

figyelembe:

Morfológia (a virion alakja és mérete, a peplomérek megléte vagy hiánya, a peplomérek természete, a burok

jelenléte vagy hiánya, a kapszid szimmetriája és struktúrája).

Fizikokémiai és fizikai tulajdonságok [a virion molekulatömege, a virionsűrűség (céziumkloridban,

cukoroldatban), a virion ülepedési állandója, a pH-tűrés, a hőtűrés, a kationtűrés, az oldhatósági stabilitás, a

detergens ellenállóság, a besugárzási stabilitás, a nukleinsav típusa (RNS vagy DNS), a genom mérete, a

nukleinsavszálak (egyszálú, kétszálú), a nukleinsav térbeli szerkezete (lineáris vagy cirkuláris), a nukleinsav

polaritása (pozitív, negatív vagy ambiszenz), a szegmentek száma és mérete, a nukleinsav-szekvencia, ismétlődő

szekvenciák jelenléte, az izomerizáció megléte, a G+C arány, az 5‟-végi szekvencia jellege, az 5‟-véghez

kovalens kötéssel kapcsolódó genomhoz kötött fehérje megléte vagy hiánya, a 3‟-vég poli-adenilált farok

megléte vagy hiánya].

Fehérjék (a strukturális fehérjék száma, mérete és működése, a nem strukturális fehérjék száma, mérete és

működése, az enzimfehérjék működése, mint pl. a transzkriptáz, reverz transzkriptáz működése stb.).

Lipidek.

Szénhidrátok.

Antigén tulajdonságok.

Biológiai tulajdonságok [a természetes gazdakör, az átvitel módja a természetben, a vektorkapcsolatok, a

földrajzi elterjedés, a patogenitás, a betegséggel való kapcsolat, a szövetek tropizmusa, a patológia, a

szövetpatológia, a genomszerveződés és -replikáció, -replikációs stratégia, a nyitott olvasási keret (open reading

frame, ORF) helyzete és száma, a transzkripciós sajátosságok, a transzlációs sajátosságok, a poszt-transzlációs

folyamatok, a virion proteinek felhalmozódási helye, a virion összeépülésének helye, a virion kialakulásának és

kiszabadulásának helye és természete].

2. A víruscsaládok és nemzetségeik általános jellemzése

A növénypatogén vírusok 12 jól definiált víruscsaládba tartoznak (Murphy et al., 1995). E családokba 51

vírusnemzetség tartozik; a növényvírusok azonban csak 34 nemzetségre terjednek ki (1. táblázat). Az egyes

víruscsaládok, nemzetségeik és típus vírusfajaik tulajdonságairól – kiemelve a növénypatogén vírusokat – az

alábbiakban számolunk be.

Bromoviridae család

Alfamovirus nemzetség

Bromovirus nemzetség

Cucumovirus nemzetség


rendszertana


Ilarvirus nemzetség

Oleavirus nemzetség

1. táblázat - Növénypatogén víruscsaládok és nemzetségeik száma

Víruscsalád

neve1,2 Vírusnemzetségek

száma3

Bromoviridae 5/5

Bunyaviridae 5/1

Closteroviridae 2/2

Comoviridae 3/3

Geminiviridae 3/3

Luteoviridae4 3/3

Partitiviridae 4/2

Potyviridae 5/3

Reoviridae 9/3

Rhabdoviridae 5/2

Sequiviridae 2/2

Tombusviridae 5/5

Összesen: 12 51/34

1 A Bunyaviridae, a Reoviridae és a Rhabdoviridae családokban a növénypatogén vírusokon kívül gerinceseket

és gerincteleneket fertőző, a Partitiviridae családban növénypatogén vírusokon kívül gombákat fertőző vírusok

is vannak.

2 Újabban – a könyv kéziratának elkészülte után – lényeges változások következtek be egyrészt a már ismert

víruscsaládokba (Geminiviridae, Tombusviridae) sorolt vírusnemzetségek nevét és számát, másrészt új

víruscsaládok (Arenaviridae, Barnaviridae, Caulimoviridae, Luteoviridae, Partitiviridae) és vírusnemzetségek

elnevezését illetően (pl. Begomovirus, Benyvirus, Crinivirus, Curtovirus, Enamovirus, Mastrevirus,

Polerovirus). A könyv Új rendszertani javaslatok c. fejezete tájékoztat a növénypatogén vírusok

rendszertanában bekövetkezett változásokról, amelyek részletesen a 11. Nemzetközi Virológiai Kongresszust

(Sydney, Ausztrália, 1999) követően, az ICTV hetedik jelentésében, várhatóan 2000-ben látnak napvilágot.

3 A számlálóban a víruscsalád összes nemzetségének száma, a nevezőben a növénypatogén nemzetségek száma

van feltüntetve.

4 Új víruscsalád (vö.: Smith és Baker, 1999)

A Bromovirus, Cucumovirus és Ilarvirus nemzetségbe tartozó izometrikus vírusok virionjai 26–35 nm

átmérőjűek, ikozaéder szimmetriájúak. A virionok belsejében három genomi és egy szubgenomi egyszálú RNS

molekula van. A cucumovirusoknál legalább két szubgenomi RNS van. Az RNS1 és RNS2 külön

partikulumokban, az RNS3 és RNS4 (szubgenomi) egy víruspartikulumban található. Az Alfamovirus

nemzetség (részben az Ilarvirus nemzetség is) virionjai többnyire bacilus formájúak, 30–57 nm hosszúságúak és


rendszertana


18 nm átmérőjűek. A virion RNS-tartalma 14–15%, a köpenyfehérje molekulatömege 20–26 × 103. A

köpenyfehérje gyengén immunogén. A nemzetségek között szerológiai rokonság nincs.

A Bromovirus és a Cucumovirus nemzetségekbe tartozó vírusok szűk gazdanövénykörrel rendelkeznek [kivételt

képez a Cucumovirus nemzetségbe tartozó uborka mozaik vírus (cucumber mosaic cucumovirus)], ezek

gazdanövényei több mint ezer növényfajra terjednek ki. Az Alfamovirus gazdanövényköre tág, az ilarvirusok

főleg a fás növényekre patogének.

A Bromoviridae család tagjai mechanikailag átvihetők. A Cucumovirus és Alfamovirus nemzetség fajai nem-

perzisztens módon levéltetvekkel terjednek. Az ilarvirusok számos gazdanövény magjával és pollennel, a

bromovirusok közül egyesek bogárvektorokkal, mások levéltetvekkel és fonálférgekkel terjednek. A

Bromoviridae családba és az egyes nemzetségekbe tartozó legismertebb és legjelentősebb növénypatogén

vírusok az alábbiak: lucerna mozaik vírus (alfalfa mosaic alfamovirus), dohány csíkosság vírus (tobacco streak

ilarvirus), uborka mozaik vírus (cucumber mosaic cucumovirus) (4. ábra).

4. ábra - A: az uborka mozaik vírus (cucumber mosaic cucumovirus)

elektronmikroszkópos képe (29 nm, 127 000-szeres nagyítás); B: az uborka mozaik

vírus szisztemikus tünete Nicotiana tabacum cv. Xanthi-nc növényen; C: Cucumis

sativus növény levelén

Az Oleavirus nemzetség a Bromoviridae család újabb nemzetségeként vált ismertté (Martelli és Grieco, 1997).

A monotípusos nemzetség tagja az olajfa látens vírus 2 (olive latent 2 oleavirus), amely korábban az Ourmia

nemzetség tagjaként volt ismert. A vírus mechanikailag könnyen átvihető, de levéltetvekkel nem terjed. Az

izometrikus, ill. bacillus alakú virionok mérete 37–55 × 18 nm. A vírus 19% egyszálú RNS-t és 81% fehérjét

tartalmaz. A Chenopodium quinoa és a Gomphrena globosa diagnosztikailag a legismertebb növény a vírus

kimutatására. A vírus fenntartására legalkalmasabb növény a Nicotiana benthamiana.

Bunyaviridae család

Bunyavirus nemzetség


rendszertana


Hantavirus nemzetség

Nairovirus nemzetség

Phlebovirus nemzetség

Tospovirus nemzetség

A virionok morfológiai tulajdonságai eltérőek az öt nemzetségben, de általában izometrikusak (vagy változó

alakúak) és 80–120 nm nagyságúak. A virion molekulatömege 300–400 × 106. A virionok magas

hőmérséklettel, detergensekkel és formaldehiddel szemben igen érzékenyek. A virionban negatív vagy

ambiszensz jellegű egyszálú RNS-ek vannak. A családba tartozó összes vírus négy strukturális fehérjét

tartalmaz [2 külső glikoprotein (G1 és G2), nukleokapszid protein (N) és egy nagy transzkriptáz protein (L)].

A Bunyaviridae családban gerinceseket, gerincteleneket és növényeket fertőző vírusok egyaránt megtalálhatók.

A Bunyavirus, Hantavirus, Nairovirus és Phlebovirus nemzetségekben növénypatogén vírus nem ismert. A

Tospovirus nemzetségbe tartozó vírusok növényekben is szaporodnak. A Tospovirus nemzetségbe tartozó típus

vírus a paradicsom bronzfoltosság vírus [syn.: paradicsom bronzfoltosság vírus (tomato spotted wilt tospovirus)]

(5. ábra), amelynek mintegy 82 növénycsaládba tartozó 800 gazdanövénye ismert. A Tospovirus nemzetségbe

tartozó vírusok (12 vírusfaj) nyolc tripszfajjal terjednek (2. táblázat).

5. ábra - A paradicsom bronzfoltosság vírus (tomato spotted wilt tospovirus)

partikulumainak elektronmikroszkópos képe [D. Peters szívessége folytán]

2. táblázat - Tospovirusok átvitelében szerepet játszó vektorok


rendszertana


Tospovirusok Vektorok1

A B C D E F G H

Paradicsom bronzfoltosság

(tomato spotted wilt) + + + + + +

Paradicsom klorotikus

foltosság (tomato chlorotic

spot) + +

+

Földimogyoró

gyűrűsfoltosság (groundnut

ringspot) + +

Impatiens nekrotikus

foltosság (Impatiens

necrotic spot) +

+

Földimogyoró

rügynekrózis (groundnut

bud necrosis)

+

Görögdinnye

ezüstfoltosság (watermelon

silver mottle)

+

Dinnye foltos hervadás

(melon spotted wilt)

+

Chrysanthemum

szárnekrózis

(Chrysanthemum stem

necrosis)

ni ni ni ni ni ni ni ni

Cukkini letális klorózis

(zucchini lethal chlorosis) ni ni ni ni ni ni ni ni

Iris sárga foltosság

(Iris yellow spot) +

+

Földimogyoró klorotikus

foltosság (peanut chlorotic

fan-spot)

+

Görögdinnye rügynekrózis

(watermelon bud necrosis) ni ni ni ni ni ni ni ni

1 A = Frankliniella occidentalis, B = F. schulzei, C = F. fusca, D = F. intonsa, E = Thrips tabaci, F = T. setosus,

G = T. palmi, H = Scirtothrips dorsalis, ni = nem ismert (vö.: Brunt et al., 1996a; Peters és Goldbach 1998).


rendszertana


Feltehetően a Bunyaviridae családba tartozik még hét csoportba tartozó 19 vírus és 22, csoportba nem sorolható

vírus; ezek pontos rendszertani helye még nem ismert.

Closteroviridae család

Closterovirus nemzetség

Crinivirus nemzetség

A Closteroviridae családra vonatkozó ismeretek az elmúlt néhány évben jelentősen megszaporodtak. A családba

tartozó tipikus vírusokra általában jellemző, hogy az erősen flexibilis, helikális szimmetriájú virionok mérete

extrém nagy (1200–2000 nm × 12 nm) és levéltetvekkel átvihetők (Agranovsky, 1996). Ismert poloskákkal

terjedő closterovirus [cukornád enyhe mozaik vírus (sugarcane mild mosaic closterovirus)] is (Murphy et al.,

1995). A virion lineáris, egyszálú RNS-t tartalmaz, amely a virion tömegének 5–6%-a, a köpenyfehérje

molekulatömege 23–28 × 103. A virion mérsékelten immunogén. Az újabb kutatások során vált ismertté, hogy a

Closteroviridae családba tartozó atipikus vírusok a floemben lokalizálódnak, rövid virionokkal (700–800 nm)

rendelkeznek és molytetvekkel (liszteskékkel) terjednek (Agranovsky, 1996). Az említett tulajdonságok alapján

a Closteroviridae család két nemzetségbe (Closterovirus, Crinivirus) sorolható (Dolja et al., 1994; Wisler et al.,

1998a).

A Closterovirus nemzetségbe tartozó vírusok egykomponensűek és levéltetvekkel terjednek. A Closterovirus

nemzetség típustagja a répa sárgaság vírus (beet yellows closterovirus), amely a levéltetűvel történő átvitelen

kívül mechanikailag nehezen, maggal és pollennel pedig nem terjed. A flexibilis virionok mérete 1250 × 10 nm

(6. ábra). A virion 5% egyszálú RNS-t tartalmaz. A vírus gazdanövényköre szűk. Diagnosztikai növénye a

Chenopodium quinoa. A vírus fenntartására legalkalmasabb növény a Beta vulgaris. A Closterovirus

nemzetségbe feltételesen tartozó, levéltetvekkel terjedő vírusok a következők: citrus tristeza vírus (citrus tristeza

closterovirus), a Dendrobium érnekrózis vírus (Dendrobium vein necrosis closterovirus?) és a Heracleum vírus

6 (Heracleum 6 closterovirus?) (Murphy et al., 1995).

6. ábra - A répa sárgaság vírus [beet yellows closterovirus (1250 nm × 10 nm)]flexibilis

partikulumai [J. Brandes szívessége folytán]

A Crinivirus nemzetségbe tartozó vírusok kétkomponensűek és molytetvekkel terjednek. A Crinivirus

nemzetség legjobban ismert tagja (típustag) a saláta fertőző sárgaság vírus (lettuce infectious yellows

crinivirus), amely széles gazdanövénykörrel (15 növénycsalád 45 faja) rendelkezik és Bemisia tabaci

molytetvekkel (A-biotípus) szemiperzisztens módon terjed (Duffus et al., 1986). Diagnosztikai és propagatív


rendszertana


gazdanövényei közül legismertebb a saláta (Lactuca sativa) és a Nicotiana clevelandii. A flexibilis virionok

egyszálú RNS-t tartalmaznak. A vírus gazdasági jelentősége igen nagy. Az Amerikai Egyesült Államok dél-

nyugati területein salátában, uborkában és cukorrépában okozott évi termésveszteség 20 millió dollárra

becsülhető (Duffus et al., 1986). A Crinivirus nemzetségbe – ismereteink szerint – a típustagon kívül még 6

rendes tag [répa álsárgaság vírus (beet pseudo yellows crinivirus), uborka klorotikus foltosság vírus (cucumber

chlorotic spot crinivirus), tök sárga törpülés rendellenesség vírus (cucurbit yellow stunting disorder crinivirus),

saláta klorózis vírus (lettuce chlorosis crinivirus), paradicsom fertőző klorózis vírus (tomato infectious chlorosis

crinivirus), paradicsom klorózis vírus (tomato chlorosis crinivirus)] és 4 feltételezett tag [édesburgonya

klorotikus törpülés vírus (sweet potato chlorotic stunt ? crinivirus), Abutilon sárgaság vírus (Abutilon yellows ?

crinivirus), uborka sárgaság vírus (cucumber yellows ? crinivirus), Diodia érklorózis vírus (Diodia vein

chlorosis ? crinivirus), sárgadinnye sárgaság vírus (muskmelon yellows ? crinivirus)] tartozik. A paradicsom

fertőző klorózis vírus és a legújabban leírt paradicsom klorózis vírus sok tulajdonságban hasonlít egymáshoz (a

virionok hosszúsága 800–850 nm, a virionok a floem szövetekben helyezkednek el, citoplazmahólyagocskák

képződése, a két nem homológ RNS enkapszidációja, szekvencia-azonosság), de a vektorfajok tekintetében

eltérések vannak közöttük (Wisler et al., 1998b). A paradicsom fertőző klorózis vírus csak a Trialeurodes

vaporariorummal, a paradicsom klorózis vírus pedig 4 molytetűfajjal vihető át: Trialeurodes vaporariorum, T.

abutilonea, Bemisia tabaci (A és B biotípus = ? B. argentifolii).

1991 óta nyolc újabb, molytetvekkel terjedő vírust írtak le, ami feltehetően arra vezethető vissza, hogy pl.

Kaliforniában 1970–1990 között a Bemisia tabaci populációja az 1600-szorosára növekedett. Ennek oka

ismeretlen, de feltételezhetően a globális felmelegedésre, a szintetikus, szerves inszekticidek használata

következtében fellépő vegyszer-rezisztenciára és a nemzetközi szaporítóanyag-csere megnövekedésére

vezethető vissza (Cohen et al., 1992; Wisler et al., 1998a).

Comoviridae család

Comovirus nemzetség

Fabavirus nemzetség

Nepovirus nemzetség

A burok nélküli virionok átmérője 28–30 nm. A hőstabil virionok szerves oldószerekkel szemben is ellenállóak.

A vírusrészecskék molekulatömege 3,2–3,8 × 106. A genom a lineáris, pozitív egyszálú RNS két típusát

tartalmazza. Mindkét RNS-re szükség van a fertőzés létrejöttében. Az RNS-ek mérete eltér az egyes

nemzetségekben. A Nepovirus RNS1 = 7,2–8,4 kb, RNS2 = 3,9–7,2 kb, Fabavirus és Comovirus RNS1 = 5,9–

7,2 kb, RNS2 = 3,5–4,5 kb. A Comovirus és Fabavirus nemzetség fajai két köpenyfehérjét (molekulatömege =

40–43 × 103 és 22–27 × 103), a Nepovirus nemzetség tagjai egyféle köpenyfehérjét tartalmaznak (55–60 × 103).

A Comovirus nemzetség tagjai jó immunogének. A nemzetségen belül az egyes tagok szerológiailag gyakran

távoli rokonságot mutatnak. A Comovirus nemzetség tagjainak gazdanövényköre szűk, míg a Fabavirus és

Nepovirus nemzetség fajai tág gazdanövénykörrel rendelkeznek. A Comoviridae család nemzetségeinek eltérő

vektoraik vannak: a Comovirus nemzetség tagjai bogárvektorokkal [Ceratoma spp., Diabrotica spp.: tehénborsó

mozaik vírus (cowpea mosaic comovirus)], a Fabavirus nemzetség tagjai levéltetvekkel [Aphis spp., Myzus spp.:

lóbab hervadás vírus (broad bean wilt fabavirus)], a Nepovirus nemzetség több tagja fonálférgekkel [Longidorus

spp., Xiphinema spp.: dohány gyűrűsfoltosság vírus (tobacco ringspot nepovirus)] és pollennel terjednek.

A Comovirus nemzetség típustagja a tehénborsó mozaik vírus, amelyhez még 15 állandó vírusfaj tartozik. A

Fabavirus nemzetség típustagja a lóbab hervadás vírus. A nemzetségbe 3 további rendes vírusfaj tartozik. A

Nepovirus nemzetség típustagja a dohány gyűrűsfoltosság vírus. Ide tartozik még 28 állandó és 8 feltételezett

vírusfaj.

Geminiviridae család

Bigeminivirus nemzetség (újabb neve: Begomovirus nemzetség)

Hybrigeminivirus nemzetség (újabb neve: Curtovirus nemzetség)

Monogeminivirus nemzetség (újabb neve: Mastrevirus nemzetség)

Ikerpartikulumú virionokkal (18 × 30 nm) rendelkeznek, amelyekben a genom cirkuláris (kör alakú), egyszálú

DNS molekulákból áll. A családon belüli felosztás alapja az, hogy az ikervirionok egyféle (Monogeminivirus),


rendszertana


két különböző (Bigeminivirus) vagy két egymáshoz hasonló (Hybrigeminivirus) szekvenciájú DNS-t

tartalmaznak. A virion egyszerű strukturális fehérjeköpenyt tartalmaz (molekulatömege 28–34 × 103). A

Geminiviridae családba tartozó vírusnemzetségek elnevezésében jelentős változások történtek az utóbbi évben

(Pringle, 1998).

A Bigeminivirus (újabban Begomovirus) nemzetségbe 49 állandó vírusfaj [típustag = bab aranysárga mozaik

vírus (bean golden mosaic begomovirus)] és 9 feltételezett vírusfaj tartozik (Murphy et al., 1995; Polston és

Anderson, 1997). A fehérlegyekkel átvihető begomovirusok cirkuláris, egyszálú, egykomponensű vagy

kétkomponensű DNS-ből állnak. A nemzetségbe tartozó vírusfajok szerológiailag viszonylag szoros

kapcsolatban vannak. A Begomovirus nemzetség fajai szűk gazdanövénykörrel rendelkeznek és kétszikű

növényeket fertőznek. A vírusok Bemisia tabaci vektorokkal terjednek. Néhány vírus mechanikailag is átvihető

[pl. bab törpülés mozaik vírus (bean dwarf mosaic begomovirus)]. A Begomovirus nemzetség új tagja a

fehérlegyekkel (Bemisia tabaci, A-biotípus) perzisztens módon terjedő, Mexikóban (Sinaloa) izolált Sinaloa

paradicsom levélgöndörödés vírus (Sinaloa tomato leaf curl begomovirus) (Brown et al., 1993; Idris és Brown,

1998). A Solanaceae és Malvaceae családba tartozó néhány növényfajban mutatták ki. A vírus mechanikailag

nehezen átvihető Nicotiana benthamiana növényre. A paradicsom levélgöndörödés vírus (tomato leaf curl

bigeminivirus) – amely újabb nemzetségnéven (Begomovirus) vált ismertté – jelenleg a kutatások középpontjába

került azáltal, hogy vele kapcsolatban először sikerült szatellit DNS-t (sat-DNS; 682 nt cirkuláris DNS)

kimutatni (Dry et. al., 1998).

A Hybrigemini (újabban Curtovirus) nemzetségbe egy állandó vírusfaj [típustag = répa levélcsúcs fodrosodás

vírus (beet curly top curtovirus)] és két feltételezett növénypatogén vírus tartozik. A répa levélcsúcs fodrosodás

vírus gazdanövényköre széles (44 növénycsalád 300 faja). A nemzetségbe tartozó fajok viszonylag szoros

szerológiai rokonságot mutatnak. A répa levélcsúcs fodrosodás vírus terjedése Circulifer spp. kabócafajokkal, a

paradicsom ál-levélgöndörödés vírus (tomato pseudo-curly top hybrigeminivirus) terjedése Micrutalis

kabócafajokkal történik.

A Monogeminivirus (újabban Mastrevirus) nemzetségbe tartozó típustag [kukorica csíkosság vírus (maize streak

mastrevirus)] szűk gazdanövénykörrel rendelkezik, ami a Gramineae családba tartozó növényekre terjed ki. A

vírus kabócákkal (Cicadulina spp.), cirkulatív, nem propagatív módon terjed. E nemzetségbe tartozó

növénypatogén vírusok mechanikailag nem vihetők át.

Luteoviridae család

Luteovirus nemzetség

Polerovirus nemzetség

Enamovirus nemzetség

A luteovirusok osztályozásával Smith és Baker (1999), valamint Mayo és D‟Arcy (1999) legújabb munkái

foglalkoznak. Ezek a tanulmányok a könyv kéziratának leadása után jelentek meg és a Luteoviridae új

víruscsalád tulajdonságait és rendszerbe foglalását tartalmazzák. E könyvben a luteovirusokkal a Luteovirus

nemzetség ismertetésénél foglalkozunk.

Partitiviridae család

Alphacryptovirus nemzetség

Betacryptovirus nemzetség

Chrysovirus nemzetség

Partitivirus nemzetség

Az izometrikus virionok 30–40 nm átmérőjűek. A virionok butanolban és kloroformban stabilak. A virionok

két, nem hasonló, lineáris, kétszálú RNS-t tartalmaznak. A virionok jó antigén tulajdonsággal rendelkeznek.

A Partitiviridae családba tartozó vírusok között gombákat és növényeket fertőző vírusok vannak. A Partitivirus

és a Chrysovirus nemzetségbe tartozó vírusok gombapatogének. Az Alphacryptovirus és Betacryptovirus

nemzetségbe tartozó vírusok növényekre patogének. Az Alphacryptovirus nemzetség típustagja a fehérhere

rejtett vírus 1 (white clover 1 alphacryptovirus), amely mechanikailag, maggal és pollennel terjed. A


rendszertana


vírusnemzetségbe 16 állandó és 10 feltételezett vírusfaj tartozik. A Betacryptrovirus nemzetség típustagja a

fehérhere rejtett vírus 2 (white clover 2 betacryptovirus), amely mechanikailag nem, de maggal átvihető. A

vírusnemzetségbe 4 állandó vírusfaj és 1 feltételezett vírusfaj tartozik.

Potyviridae család

Bymovirus nemzetség

Potyvirus nemzetség

Rymovirus nemzetség

Ipomovirus feltételezett nemzetség

Macluravirus feltételezett nemzetség

A családra jellemző hajlékony fonál alakú virionok 11–15 nm átmérőjűek, hosszúságuk az egyes

nemzetségekben azonban eltérő. Az Ipomovirus, Potyvirus, Rymovirus és Macluravirus nemzetségbe tartozó

vírusfajok hosszúsága 900, 750, 700, ill. 650 nm. A Bymovirus nemzetség osztott virionjainak hosszúsága 250–

300, ill. 500–600 nm. A Potyvirus és Rymovirus nemzetség vírusfajai egyszálú, lineáris RNS-t tartalmaznak,

míg a Bymovirus nemzetség tagjainak genomja két egyszálú RNS-ből áll. A virion köpenyfehérje-

molekulatömege 30–40 × 103. A virionok 5% nukleinsavat és 95% fehérjét tartalmaznak. A család tagjai

mérsékelten immunogének, és szerológiailag rokonság van a tagok között. A Potyviridae család tagjaira

jellemző, hogy a fertőzött növényekben intracelluláris, hengeres, forgókerék, ill. szélkerék formájú zárványokat

(pinwheels) képeznek. A gazdanövénykörök nagysága tekintetében eltérések vannak az egyes vírusfajok között.

Mechanikailag könnyen átvihetők, egyes vírusok maggal is terjednek. A Potyvirus nemzetség fajai nem

perzisztens módon levéltetvekkel (pl. Myzus persicae), a Rymovirus nemzetség fajai levélatkákkal (pl. Abacarus

hystrix), a Bymovirus nemzetség fajai gombával (Polymyxa graminis) terjednek.

A Potyviridae család két feltételezett nemzetsége közül az Ipomovirus nemzetség két tagja [édesburgonya enyhe

foltosság vírus (sweet potato mild mottle ipomovirus) és édesburgonya sárga törpülés vírus (sweet potato yellow

dwarf ipomovirus)] molytetvekkel terjed. A feltételezett Macluravirus nemzetség tagjai [Maclura mozaik vírus

(Maclura mosaic macluravirus) és a Narcissus látens vírus (Narcissus latent macluravirus)] nem perzisztens

módon levéltetvekkel terjednek.

A Potyviridae családba mintegy 184 vírusfaj tartozik, amelyből 85 vírusfaj állandó tag és 99 feltételezett tag

(Potyvirus 75/93, Rymovirus 5/2, Bymovirus 5/0, Ipomovirus 2/0, Macluravirus 2/0). Az egyes nemzetségek

típustagjai az alábbiak: Potyvirus nemzetség [burgonya Y-vírus (potato Y potyvirus) (7A ábra), Rymovirus

nemzetség [angolperje mozaik vírus (ryegrass mosaic rymovirus), Bymovirus nemzetség [árpa sárga mozaik

vírus (barley yellow mosaic bymovirus)], feltételezett Ipomovirus nemzetség [édesburgonya enyhe foltosság

vírus (sweet potato mild mottle ipomovirus)], feltételezett Macluravirus nemzetség [Maclura mozaik vírus

(Maclura mosaic macluravirus)].

7. ábra - A: a burgonya Y-vírus (potato Y potyvirus) elektronmikroszkópos képe (730

nm x 11 nm); B: a rizs törpülés vírus (rice dwarf phytoreovirus) kabócavektora

(Nephotettix cincticeps); C: a rizs törpülés vírus tünete rizsnövény levelén [F. Nakasuyi

szívessége folytán]


rendszertana


Stenger et al. (1998), valamint Choi et al. (1999) újabb molekuláris és filogenetikai analízis vizsgálatai alapján a

búza csíkos mozaik vírus (wheat streak mosaic rymovirus) és a rozsnok csíkos mozaik vírus (brome streak

mosaic rymovirus) nem a Potyviridae család Rymovirus nemzetségébe, hanem egy újonnan javasolt

nemzetségbe, a Tritimovirus nemzetségbe sorolandó.

Reoviridae család

Aquareovirus nemzetség

Coltivirus nemzetség

Cypovirus nemzetség

Fijivirus nemzetség

Orbivirus nemzetség

Orthoreovirus nemzetség

Oryzavirus nemzetség

Phytoreovirus nemzetség

Rotavirus nemzetség

A virionok felépítése ikozaéder, alakjuk szférikus. Általában 60–80 nm átmérőjűek és kettős fehérjeburokkal

rendelkeznek. A virion molekulatömege 120 × 106. Lineáris, kétszálú RNS-t tartalmaznak. A virion 15–20%-a

RNS, 80–85%-a fehérje. A vírusok antigén tulajdonsága csoportspecifikus. Az egyes nemzetségek között nincs

szerológiai rokonság. A gazdafogékonyság tekintetében különbség van a nemzetségek között. Egyes vírusok

(orthoreovirusok, rotavirusok) csak gerincesekben, mások ízeltlábúakban és gerincesekben is szaporodnak

(orbivirusok, coltivirusok). A Cypovirus nemzetségbe rovarpatogén vírusok, az Aquareovirus nemzetségbe

főleg édes- és tengervízi halakat fertőző vírusok tartoznak. A növénypatogén vírusok (Fijivirus, Oryzavirus,

Phytoreovirus) növényekben és ízeltlábúakban szaporodnak.

A Fijivirus nemzetség típus tagja a Fiji betegség vírus (Fiji disease fijivirus), amely mechanikailag nehezen, de

kabócákkal (Laodelphax spp., Javasella spp., Sogatella spp.) könnyen átvihető; áttelelése a diapauzában levő

kabócákban és néhány vad növényfajban történik. A nemzetségbe 5 állandó vírusfaj tartozik.

Az Oryzavirus nemzetség típustagja a rizs érdes törpülés vírus (rice ragged stunt oryzavirus), amely a

Gramineae növényekre patogén, és kabócákkal (pl. Nilaparvata lugens) terjed. A nemzetségbe két rendes

vírusfaj tartozik.

A Phytoreovirus nemzetség típustagja a here seb tumor vírus (clover wound tumor phytoreovirus). A vírus

mindenekelőtt a kétszikű növényekre patogén, és kabócákkal (Agallia spp., Agalliopsis spp., Nephotettix spp.)

terjed. A vírus mechanikailag nem vihető át. A nemzetségbe két vírusfaj tartozik [pl. rizs törpülés vírus (rice

dwarf phytoreovirus)] (7B,C ábra). A vírus beteg növények magjával nem terjed.

Rhabdoviridae család

Cytorhabdovirus nemzetség

Ephemerovirus nemzetség

Lyssavirus nemzetség

Nucleorhabdovirus nemzetség

Vesiculovirus nemzetség

A virionok mérete 100–430 nm hosszúságú és 45–100 nm átmérőjű. A defektív vírusrészecskék mérete

arányosan kisebb lehet. A Vesiculovirus nemzetségbe tartozó vírusfajok állatpatogének (emlősök, halak,

rovarok). Ide tartozik az egyik legrégebb óta ismert sertés vírusbetegség, a hólyagos szájgyulladás vírus

(vesicular stomatitis vesiculovirus). A Lyssavirus nemzetség vírusfajai szintén állatokra patogének.


rendszertana


Legismertebbek a nyulakat megbetegítő vírus (rabies lyssavirus) és az európai denevér vírus (European bat

lyssavirus). Ezek az állatok jelentős szerepet játszanak a fertőző nyállal háziállatokra (kutya) és vadon élő

állatokra terjedő lyssavirusok átvitelében. Az Ephemerovirus nemzetségbe tartozó vírusok állatpatogének

(viziló, szarvasmarha). Főleg a trópusokon és szubtropikus övezetekben fordulnak elő. A vírusok átvitelében

(terjedésében) az ízeltlábúak játszanak fontos szerepet; a vírusokat szúnyogokból is sikerült izolálni.

A Rhabdoviridae család két nemzetsége (Cytorhabdovirus, Nucleorhabdovirus) növénypatogén. Elnevezésüket

a vírus kialakulási helye szerint különböztették meg. A citoplazmában kialakuló Cytorhabdovirus nemzetség

típustagja a saláta nekrotikus sárgaság vírus (lettuce necrotic yellows cytorhabdovirus). Ide tartozik még 8

állandó vírusfaj. Általában levéltetvekkel (pl. Hyperomyzus lactucae) terjednek (pl. saláta nekrotikus sárgaság

vírus), de ismertek kabócákkal (pl. Laodelphax striatellus) terjedő vírusok is [árpa sárga csíkos mozaik vírus

(barley yellow striate mosaic cytorhabdovirus)].

A sejtmagban replikálódó növénypatogén vírusnemzetség a Nucleorhabdovirus nemzetség. Típustagja a

burgonya sárga törpülés vírus (potato yellow dwarf nucleorhabdovirus). Ide tartozik a Pittosporum érsárgulás

vírus (Pittosporum vein yellowing nucleorhabdovirus) (8. ábra) és még 6 állandó vírusfaj. Ismertek közöttük

levéltetvekkel terjedők [csorbóka sárgaerűség vírus (sowthistle yellow vein nucleorhabdovirus) (9. ábra), és

kabócákkal terjedők (burgonya sárga törpülés vírus)]. A Rhabdoviridae családba tartozik még mintegy 60

rovarpatogén és 61 növénypatogén rhabdovirus; ezek pontos rendszertani helye azonban még nem ismert.

Sequiviridae család

Sequivirus nemzetség

Waikavirus nemzetség

8. ábra - A: Pittosporum érsárgulás vírussal (Pittosporum vein yellowing

nucleorhabdovirus) természetes úton fertőződött Pittosporum tobira növény levele; B:

egészséges növény


rendszertana


9. ábra - A csorbóka sárgaerűség vírus (sowthistle yellow vein nucleorhabdovirus)

lövedékszerű partikulumai (230 nm × 100 nm) [D. Peters szívessége folytán]


rendszertana


A virion izometrikus, 30 nm átmérőjű. A virion 40% pozitív, egyszálú RNS-t és három fő fehérjét tartalmaz

(CP1, 32 × 103; CP2, 26 × 103; CP3, 23 × 103). Jó immunogén, a poliklón antiszérum tartalmazza az összes

ellenanyagot a virion proteinjeivel szemben. A családba tartozó növénypatogén vírusok gazdanövényköre szűk.

A vírusok szemiperzisztens módon levéltetvekkel (Sequivirus nemzetség vírusfajai) vagy kabócákkal terjednek

(Waikavirus nemzetség vírusfajai). A vírusátvitelhez ún. segítő (helper) proteinre (Waikavirus), vagy a segítő,

helper vírus (Sequivirus) átkódolására van szükség. Mechanikailag, maggal és pollennel nem terjednek. A

Sequivirus nemzetség típustagja a paszternák sárga foltosság vírus (parsnip yellow fleck sequivirus), amely

mechanikailag és levéltetvekkel (Cavariella spp.) szemiperzisztens módon átvihető (10. ábra). A nemzetségbe

három állandó vírusfaj tartozik. A Waikavirus nemzetség típustagja a rizs tungro szférikus vírus (rice tungro

spherical waikavirus), amely szemiperzisztens módon kabócákkal (pl. Nephotettix virescens) terjed. Segítő

(helper) vírus [rizs tungro bacilus alakú vírus (rice tungro bacilliform badnavirus)] a vírusátvitelt megkönnyíti

(Druka és Hull, 1998). A Waikavirus nemzetségbe három állandó vírusfaj tartozik.

10. ábra - A paszternák sárga foltosság vírus (parsnip yellow fleck sequivirus)

izometrikus partikulumai (31 nm) [A.F. Murant szívessége folytán]


rendszertana


A kukorica klorotikus törpülés vírus (maize chlorotic dwarf waikavirus) szekvenciaanalízise alapján

hasonlóságot mutat a Sesquiviridae, Comoviridae és Potyviridae családok néhány vírusfajával. A

genomszerveződés alapján a vírus a Sesquiviridae család Waikavirus nemzetségébe tartozik (Reddick és Habera,

1997).

Tombusviridae család

Carmovirus nemzetség

Dianthovirus nemzetség (újabb nemzetség)

Machlomovirus nemzetség

Necrovirus nemzetség

Tombusvirus nemzetség

A Tombusviridae családba tartozó vírusfajok virionjai ikozaéder szimmetriájúak, 180 fehérjealegységből állnak

és 30 nm átmérőjűek. A virionok hőstabilak (a hőinaktiválási pont 80 °C felett van). A virion molekulatömege

8,2–8,9 × 106. A virion pozitív, lineáris, egyszálú, 4,7 kb nagyságú RNS-t tartalmaz. A fertőzött sejtekben a

genomi RNS-en kívül két kisebb, ún. szubgenomi RNS van jelen. Defektív interferáló (DI) és szatellit RNS-ek

előfordulása ismert. A DI RNS erősen gátolja a helper vírus (segítő vírus) replikációját a növényben, aminek

jelentős tünetcsökkentő hatása van. A DI és a szatellit RNS-ek csak helper vírus jelenlétében képesek

replikációra.

Az egyes vírusfajok természetes gazdanövényköre viszonylag szűk, és főleg a kétszikű növényekre terjed ki. A

mesterséges gazdanövények köre kiterjedt. A Tombusviridae családba tartozó vírusfajok mechanikailag

könnyen átvihetők, egyesek közülük maggal is terjednek. A vektorok között megtalálható az Olpidium spp.

gomba [uborka levélfoltosság vírus (cucumber leaf spot carmovirus)] és bogárvektor (Diabrotica spp.) is [bab

enyhe mozaik vírus (bean mild mosaic carmovirus). Természetes vizekből is kimutathatók [paradicsom bokros

törpülés vírus (tomato bushy stunt tombusvirus)].

A Carmovirus nemzetség típustagja a szegfű foltosság vírus (carnation mottle carmovirus). Vektora nem ismert.

Az állandó tagok száma 12, a feltételezett tagok száma 7. A Tombusvirus nemzetség típustagja a paradicsom

bokros törpülés vírus. Az állandó tagok száma 13; feltételezett tag nem ismert.


rendszertana


A Tombusviridae családba a korábban ismert két nemzetségen (Carmovirus, Tombusvirus) kívül három újabb

nemzetséget (Dianthovirus, Machlomovirus, Necrovirus) soroltak. A Dianthovirus nemzetség típustagja a

szegfű gyűrűsfoltosság vírus (carnation ringspot dianthovirus). A Machlomovirus nemzetségnek egyetlen tagja

ismert [kukorica klorotikus foltosság vírus (maize chlorotic mottle machlomovirus)]. Az ikozaéder típusú virion

30 nm átmérőjű, részletes struktúrája nem ismert. A virion lineáris, pozitív, egyszálú RNS. A fehérje

molekulatömege 25,1 × 103. A virion 18% nukleinsavat és 82% fehérjét tartalmaz. Mechanikailag és maggal

terjed. A vírus ún. Kansas- és Nebraska-izolátumai bogárvektorokkal (Diabrotica spp.) kísérleti úton átvihetőek.

A Hawai-izolátum tripszekkel terjed. A vírus természetes gazdája a Zea mays L. Kísérleti gazdanövényei között

a Zea mays (hibridek) és a Triticum aestivum a legjelentősebb. Hasonlóság figyelhető meg a Tombusviridae

családba tartozó nemzetségek (Machlomovirus, Necrovirus, Luteovirus, valamint a Sobemovirus) között

(Lesemann, 1998). A Necrovirus nemzetségbe tartozó vírusok ikozaéder szimmetriájúak és megközelítőleg 28

nm átmérőjűek. A virionnal kapcsolatos szatellit vírus 16,8 nm átmérőjű. A virion molekulatömege 7,6 × 106

(szatellit vírus, 1,64 × 106). A virion lineáris, pozitív egyszálú RNS. A köpenyfehérje molekulatömege 29–30 ×

103.

A Necrovirus nemzetség tagjai mérsékelten immunogének, széles gazdanövénykörrel rendelkeznek, az egy- és

kétszikű növényekre egyaránt kiterjednek. Mechanikailag és talajban élő gombával (Olpidium brassicae)

terjednek.

A Necrovirus nemzetség típustagja a dohány nekrózis vírus (tobacco necrosis necrovirus) (Pringle, 1998). A

vírus (tobacco necrosis necrovirus) 19% nukleinsavat és 81% fehérjét tartalmaz. Gazdanövényköre közepesen

kiterjedt. Természetes fertőzések során a gazdanövények gyökérrendszerét károsítja. Kísérleti gazdanövényein

(Phaseolus vulgaris, Vigna spp., Nicotiana spp., Solanum spp., Datura spp., Ocimum spp.) nekrotikus léziókat

okoz (11. ábra). Szisztemikus fertőzés igen ritkán fordul elő [kivételt képez a vírus ún. bab rajzos mintázatú

törzse (bean stipple streak strain)].

11. ábra - A dohány nekrózis vírus (tobacco necrosis necrovirus) helyi (lokális)

nekrózisokat idéz elő a növényeken; A: Nicotiana glutinosa; B: Datura innoxia; C:

Solanum ochroleucum; D: Ocimum gratissimum

A Necrovirus nemzetségbe három rendes és két feltételezett vírusfaj tartozik. A 30 nm átmérőjű, RNS-tartalmú,

3662 nukleotidát és öt nyitott olvasási keretet (open reading frame, ORF) tartalmazó, mechanikailag átvihető,

szűk gazdanövénykörrel rendelkező póréhagyma fehér csíkos vírus (leek white stipe necrovirus) a Necrovirus

nemzetség legújabban leírt tagja (Lot et al., 1996). A polimerázok (ORF I, ORF II) a szekvenciahasonlóság

magas fokát mutatják a Tombusviridae család nemzetségeinek (Necrovirus, Tombusvirus, Carmovirus,

Dianthovirus, Machlomovirus) vírusfajaival.

A Tombusviridae család eddig ismert öt nemzetségét újabban kiegészítették egy 6. nemzetséggel is, amelyet

Auereusvirus nemzetségnek neveztek el (Martelli et al., 1998). Ide tartozik a Pothos látens vírus (Pothos latent

aureusvirus) és a korábban Carmovirus nemzetségbe sorolt uborka levélfoltosság vírus (cucumber leaf spot

aureusvirus).

3. A vírusnemzetségek általános jellemzése

Eddigi ismereteink szerint 34 olyan növénypatogén vírusnemzetség van, amely víruscsaládokba sorolható.

Ezekről a vírusnemzetségekről az előzőekben A víruscsaládok és nemzetségeik általános jellemzése című


rendszertana


fejezetben számoltunk be. Ismert 24 olyan vírusnemzetség is, amelynek tagjai növényekre patogének;

víruscsaládokba történő besorolásuk folyamatban van. Ezekről a nemzetségekről és típus vírusfajaik

tulajdonságairól az alábbiakban számolunk be.

Badnavirus nemzetség

A virionok bacilus alakúak, párhuzamos oldalakkal és lekerekített végekkel. Általában 130 nm hosszúak és 30

nm szélesek, de a vírusrészecskék hosszúsága 60–900 nm között váltakozhat. A virion kétszálú DNS-t és fő

szerkezeti fehérjét (35–37 × 103) tartalmaz. A virionok közepesen antigének. A poliklón antiszérum-titer elérheti

az 1/128–1/512 értéket. A nemzetségbe tartozó vírusoknak általában szűk gazdanövénykörük van. Elsősorban

vegetatív úton terjednek; egyes vírusok átvitelében a poloskáknak [Planococcoides spp., kakaó duzzadt hajtás

vírus (cacao swollen shoot badnavirus)], a kabócáknak [Nephotettix spp., rizs tungro bacilus alakú vírus (rice

tungro bacilliform badnavirus)] és a levéltetveknek [Aphis fabae, Myzus persicae, Dioscorea bacilus alakú vírus

(Dioscorea bacilliform badnavirus)] van szerepe. Ismertek maggal és/vagy pollennel terjedő badnavirusok is.

A Badnavirus nemzetség típustagja a Commelina sárga foltosság vírus (Commelina yellow mottle badnavirus),

amely kertészeti oltással vihető át, mechanikailag nem terjed. A bacilus alakú virion 133 nm hosszú és 24 nm

széles. A nemzetségbe 10 állandó vírusfaj és 4 feltételezett faj tartozik. A badnavirusok hasonlítanak a genom

típusában (kétszálú DNS) a caulimovirusokhoz, de a genom méretében, a virion morfológiájában, a vektorokban

és a hisztopatológiában különböznek egymástól.

A Badnavirus nemzetséget újabban a Caulimoviridae új víruscsaládba sorolták (Pringle, 1998).

Caulimovirus nemzetség

A burok nélküli izometrikus vírusok mérete 50 nm. A virion kétszálú DNS-t tartalmaz. A burokfehérje a

negyedik nyitott olvasási keretből (open reading frame, ORF IV) íródik át és szerveződik köpenyfehérjévé (57 ×

103). Az ORF I leolvasási szakasz felelős a vírus sejtről sejtre történő terjedéséért, az ORF II pedig a levéltetű-

átvitelt segítő faktort kódolja. A vírus immunogén, az egyes vírusfajok között szerológiai rokonság van. A

vírusok gazdanövényköre szűk. Mechanikailag átvihetők, levéltetvekkel szemiperzisztens vagy nem perzisztens

(stylet-borne) módon terjednek.

A Caulimovirus nemzetség típustagja a karfiol mozaik vírus (cauliflower mosaic caulimovirus) (12A ábra),

amely a mechanikai átvitelen kívül mintegy 25 levéltetű fajjal nem perzisztens módon terjed. A vírus

diagnosztikai és propagatív gazdája a Brassica campestris, a Brassica rapa var. rapa és a Crambe strigosa (12B,

C ábra). A nemzetségbe 11 állandó és 6 feltételezett vírusfaj tartozik. A Caulimovirus – hasonlóan a

Badnavirushoz – olyan vírusnemzetség (2 ilyen növénypatogén vírusnemzetség ismert), amelynek tagjai ún.

fordított transzkripcióval valósítják meg a nukleinsavak szintézisét. A m-RNS-DNS átírását a reverz

transzkriptáz (reserve transcriptase) enzim végzi. A két nemzetség azonban a virion morfológiájában, a

genomszerveződésben, a gazdanövénykörben és a vektorokban különbözik egymástól.

12. ábra - A karfiol mozaik vírus (cauliflower mosaic caulimovirus) virionjai (A) és

szisztemikus tünetei Brassica rapa var. rapa (B), valamint Crambe strigosa (C)

növényeken

A Caulimovirus nemzetséget újabban a Caulimoviridae új víruscsaládba sorolták (Pringle, 1998).

Capillovirus nemzetség


rendszertana


A flexibilis virionok mérete 640 × 12 nm. A virion lineáris, pozitív értelmű, egyszálú RNS, amely a virion

súlyának 5%-a. A virionok közepes antigén tulajdonsággal rendelkeznek. A vírusok gazdanövényköre általában

szűk. Rovarvektorok nem ismertek. Egyes vírusok maggal [alma törzsbarázdáltság vírus (apple stem grooving

capillovirus)], mások oltással [Nandina szár himlő vírus (Nandina stem pitting capillovirus)] vihetők át.

A Capillovirus nemzetség típus vírusfaja a hajlékony (flexibilis), 600–700 nm hoszszúságú és 12 nm szélességű

alma törzsbarázdáltság vírus. Mechanikailag, oltással és maggal terjed. Gazdanövényköre szűk-közepes (kilenc

növénycsalád 20 faja). A vírus izolálására és fenntartására a legjobb növény a Chenopodium quinoa. A

Capillovirus nemzetségbe 3 állandó és 1 feltételezett vírusfaj tartozik. Ezek a vírusok morfológiailag és

aminosav-szekvenciájukban hasonlítanak a closterovirusokhoz és a trichovirusokhoz, de a

genomszerveződésben és a replikációs stratégiájukban eltérnek egymástól.

A Capillovirus nemzetséget újabban a Nidovirales rend Barnaviridae új víruscsaládjába sorolták (Pringle, 1998).

Carlavirus nemzetség

A flexibilis virionok mérete 610–700 nm × 12–15 nm. A virionok lineáris, egyszálú RNS-ből és egyszerű

polipeptidből (31–36 × 103) állnak. A vírusoknak erős immunogén tulajdonsága van. Egyes vírusok szűk, más

vírusok széles gazdanövénykörrel rendelkeznek. A nemzetségbe tartozó vírusok mechanikailag átvihetők.

Általában nem perzisztens módon, levéltetvekkel [burgonya M-vírus (potato M carlavirus), burgonya S-vírus

(potato S carlavirus), vöröshere érmozaik vírus (red clover vein mosaic carlavirus)] (13. ábra) terjednek. Két

feltételezett vírusfaj [cassava barna csíkossággal társult vírus (cassava brown streak-associated carlavirus),

tehénborsó enyhe foltosság vírus (cowpea mild mottle carlavirus)] molytetvekkel (liszteskékkel) terjed (Bemisia

tabaci).

13. ábra - Carlavirusok virionjai. A: burgonya M-vírus (potato M carlavirus, 650 nm ×

12 nm); B: burgonya S-vírus (potato S carlavirus, 650 nm × 12 nm); C: vöröshere

érmozaik vírus (red clover vein mosaic carlavirus, 600-700 nm × 12 nm) [B és C: J.

Brandes szívessége folytán]

A Carlavirus nemzetség típustagja a szegfű látens vírus (carnation latent carlavirus), amely levéltetvekkel

(Myzus persicae) nem perzisztens módon terjed. Mechanikailag átvihető, de maggal nem terjed. A vírus lokális-

léziós gazdája (assay host) a Chenopodium quinoa. A vírus fenntartására legalkalmasabb növény a Dianthus

barbatus. A Carlavirus nemzetségbe 29 állandó vírusfaj és 29 levéltetvekkel, valamint 2 fehérlegyekkel terjedő

feltételezett vírusfaj tartozik.

A Carlavirus nemzetséget újabban a Nidovirales rend Barnaviridae új víruscsaládjába sorolták (Pringle, 1998).


rendszertana


A carlavirusok vírusreplikációs génje szekvenciahasonlóságot mutat az alphamovirusokhoz, tobamovirusokhoz,

tobravirusokhoz és a furovirusokhoz, de szorosabb homológiát mutat a potex-, a tymo- és a closterovirusokkal

is. A flexibilis Narcissus látens vírust (Narcissus latent macluravirus) korábban a Carlavirus nemzetségbe

sorolták. Újabban kimutatott intracelluláris zárványai (pinwheels), valamint a 103 molekulatömegű

köpenyfehérjéje alapján a Maclura mozaik vírussal (Maclura mosaic macluravirus) mutatott szerológiai

rokonsága miatt a Potyviridae család feltételezett Macluravirus nemzetségébe sorolandó.

Enamovirus nemzetség

A poliéder alakú virionok két különböző méretben (25 nm és 28 nm) fordulnak elő. A vírus két típusú lineáris,

pozitív értelmű RNS-t tartalmaz (RNS1, RNS2). Egyes vírustörzsekben egy harmadik típusú RNS is található

(RNS3). A strukturális fehérjéket az RNS1 típusú nukleinsav kódolja. Az egyes izolátumokban lévő kis fehérjék

(minor protein) – amelyeknek molekulatömege 54 × 103 – összefüggésben vannak a vírus levéltetű-

átvihetőségével. A vírusok közepesen immunogének.

A nemzetségbe tartozó eddig ismert egyetlen vírus (típustag), a borsó enációs mozaik vírus (pea enation mosaic

enamovirus) 28% lineáris, egyszálú RNS-t és 72% fehérjét tartalmaz. Gazdanövényköre főleg a Leguminosae

családra terjed ki. A vírus mechanikailag és perzisztens, nem propagatív módon levéltetvekkel terjed.

Figyelemre méltó, hogy a vírus levéltetvekkel történő átvihetősége a mechanikai sorozat-passzázsok

következtében megszűnik. A vektorátvitel hatékonysága egyéb vírus [bab sárga érszalagosodás vírus (bean

yellow vein banding umbravirus)] jelenlétében fokozódik. A vírus legjelentősebb diagnosztikai növénye a

Nicotiana clevelandii. Propagatív gazdája a Pisum sativum, lokális-léziós gazdanövénye a Chenopodium

quinoa.

Az Enamovirus nemzetségnek – amely újabban a Nidovirales rend Barnaviridae új víruscsaládjába tartozik

(Pringle, 1998) – eddig egyetlen tagja ismert.

Dianthovirus nemzetség

Az ikozaéder szimmetriájú virionok átmérője 32–35 nm. A virionok teljes (részletes) struktúrája még nem

ismert. A virion pozitív, egyszálú RNS. Molekulatömege 8,6 × 106. A köpenyfehérje molekulatömege 37 × 103.

A nemzetségbe tartozó vírusok mérsékelten immunogének. Természetes gazdanövénykörük közepes, főleg a

kétszikű növényekre terjed ki. Mesterséges gazdanövénykörük széles, főképpen a Solanaceae, a Leguminosae, a

Cucurbitaceae és a Compositae családokat foglalja magában. A Dianthovirus nemzetségbe tartozó vírusok

mechanikailag könnyen átvihetők, maggal, rovarokkal és talajban élő gombákkal nem terjednek. Fonálférgekkel

történő terjedésük kérdéses.

A Dianthovirus nemzetség típustagja a szegfű gyűrűsfoltosság vírus (carnation ringspot dianthovirus), amely

20,5% nukleinsavat és 79,5% fehérjét tartalmaz. A vírus diagnosztikai és propagatív növénye a Phaseolus

vulgaris, Gomphrena globosa, lokális-léziós gazdája a Chenopodium quinoa. A nemzetségbe két rendes és egy

feltételezett vírusfaj tartozik.

A Dianthovirus nemzetséget újabban a Tombusviridae családba sorolták (Pringle, 1998).

A Dianthovirus nemzetségbe tartozó vírusok köpenyfehérje-szekvenciája hasonlóságot mutat a Tombusviridae

Necrovirus és Machlomovirus, valamint a Barnaviridae család Luteovirus nemzetségébe tartozó vírusfajaival.

Furovirus nemzetség

A pálcika alakú virionok általában kétféle méretűek; 92–160 nm, ill. 250–300 nm hoszszúak és 20 nm

átmérőjűek. A nemzetség két feltételes vírusfaja 380–390 nm hosszú. A multikomponensű virionok általában

két lineáris, pozitív, egyszálú RNS-t (RNS1, RNS2) tartalmaznak. Kivételt képez a négy RNS-t tartalmazó répa

nekrotikus sárgaerűség vírus (beet necrotic yellow vein furovirus). Az egyszerű burokfehérje molekulatömege

19,7–23,0 × 103. A nemzetségbe tartozó legtöbb vírusfaj jó immunogén. A természetes gazdanövénykör nagyon

szűk. A vírusok mechanikailag és talajban élő gombákkal (Polymyxa graminis, P. betae, Spongospora

subterranea) terjednek.

A Furovirus nemzetség típustagja a búza talajlakó mozaik vírus (wheat soil-borne mosaic furovirus), amely 5%

RNS-t és 95% fehérjét tartalmaz. A vírus lokális-léziós gazdája a Chenopodium quinoa. A diagnosztikai és

propagatív gazdák közül jelentősek a Triticum-fajok. A furovirusok szerológiailag különbözőek, ugyanakkor

szerológiailag rokonságot mutatnak a dohány mozaik vírussal (tobacco mosaic tobamovirus). A Furovirus

nemzetség jelenlegi ismereteink szerint öt állandó vírusfajból és öt feltételezett vírusfajból áll.


rendszertana


A Furovirus nemzetséget újabban a Nidovirales rend Barnaviridae új víruscsaládjába sorolták (Pringle, 1998).

Megemlítjük, hogy a legújabb molekuláris eredmények (nukleotid szekvenciaanalízis, génszerveződés,

fehérjeburok-kompozíció stb.) alapján a Furovirus nemzetségen belüli osztályozásában feltehetően változások

következnek be (Torrance és Mayo, 1997). Javaslat született arra, hogy a búza talajlakó mozaik vírus, a zab

arany csíkos vírus (oat golden stripe furovirus) és a Sorghum klorotikus foltosság vírus (Sorghum chlorotic spot

furovirus) képezze változatlanul a Furovirus nemzetséget. A burgonya szártörpülés vírus (potato mop-top

pomovirus), a répa talajlakó vírus (beet soil-borne furovirus) és a lóbab nekrózis vírus (broad bean necrosis

furovirus) kerüljön át az újonnan javasolt Pomovirus nemzetségbe. A földimogyoró bokrosodás vírus (peanut

clump virus) és az indiai földimogyoró bokrosodás vírus (Indian peanut clump virus) tartozzon az új Pecluvirus

nemzetségbe. A répa nekrotikus sárgaerűség vírus és a búza talajlakó mozaik vírus az új Benyvirus, az árpa

csíkos mozaik vírus (barley stripe mosaic virus) pedig a már ismert Hordeivirus nemzetségbe tartozzon.

Javaslat született arra is, hogy a pálcika alakú vírusokat hét nemzetségbe (Pomovirus, Pecluvirus, Benyvirus,

Hordeivirus, Furovirus, Tobravirus és Tobamovirus) és a nemzetségeket összefoglaló új Barnaviridae családba

sorolják. Az új javaslatot a Nemzetközi Vírusnomenklatúra és Taxonomiai Bizottság 1996-ban beterjesztette, és

1997-ben elfogadta (Pringle, 1998).

Hordeivirus nemzetség

A helikális szimmetriájú pálcika alakú multikomponensű virionok mérete 110–150 nm × × 20 nm. A stabil

virionok növényi szövetnedvben néhány napig, esetleg néhány hétig is megőrzik fertőzőképességüket. A virion

pozitív, három egyszálú RNS-t tartalmaz, amely 3,8 kb (RNSα), 3,3 kb (RNSβ) és 3,2 vagy 2,8 kb (RNSγ). Egy

negyedik RNS (2,5 kb) az árpa csíkos mozaik vírus (barley stripe mosaic hordeivirus) argentínai izolátumában

fordul elő. A vírus RNSα és RNSγ 70 nukleotidája közötti szoros szekvenciaazonosság arra mutat, hogy az

RNS-rekombináció szignifikáns szerepet játszott az árpa csíkos mozaik vírus evolúciójában. A köpenyfehérje-

alegységek molekulatömege 22 × 103. A Hordeivirus nemzetségbe tartozó vírusok jó immunogének, egymás

között távoli szerológiai rokonságot mutatnak.

A nemzetség típustagja az árpa csíkos mozaik vírus, amelynek természetes gazdanövényköre – az

Anthoxanthum látens halvány vírussal (Anthoxanthum latent blanching hordeivirus) és a Poa szemilátens

vírussal (Poa semilatent hordeivirus) együtt – a Gramineae családba tartozó fűfélékre terjed ki. A Hordeivirus

nemzetségbe tartozó negyedik vírus [Lychnis gyűrűsfoltosság vírus (Lychnis ringspot hordeivirus)] gazdái a

Caryophyllaceae és a Labiatae családban találhatók meg. A nemzetség típustagja, az árpa csíkos mozaik vírus

3,8–4% nukleinsavat és 96% fehérjét tartalmaz. A vírus mechanikailag átvihető; terjedésében a maggal történő

átvitel (90–100%) igen jelentős. A vírus diagnosztikai és propagatív gazdája a Triticum aestivum, Hordeum

vulgare, lokális-léziós gazdája pedig a Chenopodium quinoa.

A Hordeivirus nemzetséget újabban a Nidovirales rend Barnaviridae új víruscsaládjába sorolták (Pringle, 1998).

Idaeovirus nemzetség

A nemzetségbe tartozó egyetlen izometrikus vírus [málna bokros törpülés vírus (raspberry bushy dwarf

idaeovirus)] mérete 33 nm. A virion három lineáris, pozitív RNS-t tartalmaz. Az RNS1 5,4 kb, az RNS2 2,2 kb,

az RNS3 1,0 kb. A köpenyfehérje molekulatömege 30 × 103. A virion 24% nukleinsavat és 76% fehérjét

tartalmaz. A vírus közepesen immunogén. Átvitelében vektoroknak nincs szerepe. A mechanikai terjedésen

kívül fontos szerepe van a magátvitelnek (70%), és feltehetően pollennel is terjed. Természetes gazdanövénye a

Rubus fajokra terjed ki. Kísérleti gazdanövényei között fon-tos szerepe van a Chenopodium amaranticolor,

valamint a C. quinoa fajoknak. Az inokulált növények lokálisan (klorotikus léziók) és szisztemikusan is

fogékonyak (klorotikus gyűrűk).

Az Ideovirus nemzetséget újabban a Nidovirales rend Barnaviridae új víruscsaládba sorolták (Pringle, 1998).

Luteovirus nemzetség

Az izometrikus virionok mérete 25–30 nm. A virionok pozitív értelmű egyszálú RNS-t tartalmaznak, amelyben

28% a nukleinsav és 72% a fehérje. A fehérjék funkciója részben ismeretlen, részben tartalmazzák a

köpenyfehérjét és részben szerepet játszanak a vírus levéltetű-átvitelében. A nemzetségbe tartozó vírusok erősen

immunogének. A luteovirusok nagyobb részének gazdanövényköre szűk: csupán egyetlen növénycsaládra terjed

ki. Átvitelük mechanikailag, maggal és pollennel nem lehetséges. Cirkulatív, nem propagatív módon

törzsspecifikus levéltetűfajokkal terjednek.


rendszertana


A nemzetség típustagja az árpa sárga törpülés vírus (barley yellow dwarf luteovirus), amelynek kísérleti

gazdanövényköre szűk. A diagnosztikai és propagatív gazdák között legnagyobb az Avena sativa és a Hordeum

vulgare fajok jelentősége.

A Luteovirus nemzetségbe 11 állandó vírusfaj (és több vektorspecifikus vírustörzs), valamint 14 feltételezett

vírusfaj tartozik.

A Luteovirus nemzetség újabban a Nidovirales rend Barnaviridae új víruscsaládjába tartozik (Pringle, 1998).

A borsó enációs mozaik vírus (pea enation mosaic enamovirus) nukleinsav- (RNS1-) molekulaszerveződése

hasonlít a Luteovirus nemzetségbe tartozó árpa sárga törpülés vírus II. alcsoportjába tartozó vírusokhoz. A borsó

enációs mozaik vírus RNS2-szerveződése pedig emlékeztet az árpa sárga törpülés vírus I. alcsoportjába tartozó

vírusokhoz. A Luteovirus nemzetségbe tartozó vírusok fejlődéstani rokonságot mutatnak a Sobemovirus és

Carmovirus nemzetségbe tartozó vírusokkal.

D‟Arcy és Mayo (1997) a Cirencesterben (Nagy-Britannia) megtartott Luteovirus Konferencián a

luteovirusokkal kapcsolatos legújabb taxonómiai és osztályozási javaslatokról számolt be. Tekintettel arra, hogy

a luteovirusok két különböző polimeráz génnel rendelkeznek (Mayo és Ziegler-Graf, 1996), az eredeti

Luteovirus nemzetséget három nemzetségre kívánják osztani. Az eredeti Luteovirus nemzetséget típustagként

képviselné az árpa sárga törpülés vírus MAV-törzse (barley yellow dwarf luteovirus MAV strain = BYDV-

MAV). A másik nemzetség elnevezésére javasolják a Betaluteovirus nemzetségnevet. Ebbe a nemzetségbe

tartozna a répa nyugati sárgaság vírus (beet western yellows betaluteovirus), amely az új nemzetség típustagja.

A harmadik javasolt nemzetség neve a Polerovirus vagy Potleavirus nemzetség, ahova a burgonya

levélsodródás vírus (potato leafroll polerovirus) mint típustag tartozna. A luteovirusok taxonómiájára

vonatkozóan rövidesen újabb határozatok születnek (lásd D‟Arcy és Mayo, 1997). A luteovirusokról –

könyvünk kéziratának leadása után – megjelent mű (Smith és Baker, 1999) Luteoviridae családot különített el,

amelybe három nemzetség tartozik (Luteovirus, Polerovirus, Enamovirus). Ezek típustagjai az árpa sárga

törpülés vírus (barley yellow dwarf luteovirus), a burgonya levélsodródás vírus (potato leafroll polerovirus) és a

borsó enációs mozaik vírus (pea enation mosaic enamovirus) (Mayo és D‟Arcy, 1999).

Macluravirus nemzetség

A flexibilis virionok mérete 657–664,5–672 nm × 13–13,7 nm. A virionok 3–4,25% nukleinsavat és 95–97%

fehérjét tartalmaznak. Az RNS egyszálú. A Macluravirus nemzetségbe tartozó Maclura mozaik vírus (Maclura

mosaic macluravirus) levéltetvekkel nem perzisztens módon és mechanikailag átvihető. A Maclura mozaik

vírus (típustag) természetes gazdája a Maclura pomifera. A kísérleti gazdanövények közül legjelentősebb a

Chenopodium album (klorotikus lokális léziók) és a Nicotiana clevelandii (szisztemikus mozaik).

A Maclura mozaik vírus szerológiai rokonságban van a bab sárga mozaik vírussal (bean yellow mosaic

potyvirus), a Narcissus látens vírus pedig a liliom tünetmentes vírussal (lily symptomless carlavirus).

Marafivirus nemzetség

Az ikozaéder virion 28–32 nm. A virion lineáris, egyszálú RNS-t tartalmaz, amelynek molekulatömege 2,0–2,4

× 106. A köpenyfehérje molekulatömege 27 × 103–22 × 103. A nemzetségbe tartozó vírusok szűk

gazdanövénykörrel (Gramineae család) rendelkeznek [kivételt képez a kétszikű növényeket is fertőző zab kék

törpülés vírus (oat blue dwarf marafivirus), és közepesen immunogének.

A Marafivirus nemzetség típustagja a kukorica finom csíkozottság vírus (maize rayado fino marafivirus), amely

33% nukleinsavat és 67% fehérjét tartalmaz. A vírus kabócákkal (Dalbulus spp.) vihető át perzisztens módon;

mechanikailag és maggal nem terjed. Gazdanövényköre szűk, természetes és kísérleti gazdanövénye a Zea

mays. A vírus a legtöbb esetben fitoplazmával és spiroplazmával együtt fordul elő. A Marafivirus nemzetségbe

három állandó vírusfaj tartozik.

A Marafivirus nemzetséget újabban a Nidovirales rend Barnaviridae új víruscsaládjába sorolták (Pringle, 1998).

Nanavirus nemzetség

Az izometrikus vírusok mérete 17–26 nm. A vírus-nukleinsav egyszálú, cirkuláris DNS. A virionok 16-17%

nukleinsavat és 83-84% fehérjét tartalmaznak. Levéltetvekkel szemiperzisztens vagy perzisztens módon vihetők

át. A vírusok mechanikailag, maggal és pollennel nem terjednek. Gazdanövénykörük szűk.


rendszertana


A Nanavirus nemzetségbe öt rendes vírusfaj tartozik: banán csúcscsokrosodás vírus (banana bunchy top

nanavirus), kókusz hajtás leromlás vírus (coconut foliar decay nanavirus), lóbab nekrotikus sárgaság vírus (faba

bean necrotic yellows nanavirus), baktövis (Astragalus) törpeség vírus (milk vetch dwarf nanavirus), here

földalatti törpülés vírus (subterranean clover stunt nanavirus).

Ourmiavirus nemzetség

A bacilus alakú virionok mérete 24–41,6–76 nm × 18–21,1–26 nm. A virionok 15–25% nukleinsavat (egyszálú,

lineáris RNS) és 75–85% fehérjét tartalmaznak. A nemzetségbe tartozó vírusok mechanikailag átvihetők. A

Pelargonium foltosság vírus (Pelargonium zonale spot ourmiavirus) maggal, pollennel és tripszekkel is átvihető.

Az Ourmiavirus nemzetségbe négy állandó vírus [manioka Ivoriai bacilus formájú vírus (cassava ivorian

bacilliform ourmiavirus), epirusz cseresznye vírus (epirus cherry ourmiavirus), ourmia dinnye vírus (ourmia

melon ourmiavirus), Pelargonium foltosság vírus] tartozik. A nevezett vírusok gazdanövényköre közepesen

nagy. A nemzetségbe tartozó vírusok legjobb diagnosztikai és propagatív növényei közé tartozik a

Chenopodium quinoa, a Gomphrena globosa, a Nicotiana glutinosa és a N. clevelandii.

Potexvirus nemzetség

A fonál alakú virionok mérete 470–580 nm × 13 nm. A genom lineáris, egyszálú RNS, molekulatömege 3,5 ×

106. A virion fehérjeburka 1000–1500 fehérjealegységből áll, amelynek molekulatömege 18–27 × 103. A

köpenyfehérje erősen immunogén, számos, a nemzetségbe tartozó vírusfaj között szerológiai rokonság van. A

vírusok gazdanövényköre kiterjedt. Mechanikailag könnyen átvihetők, vektorok nem ismertek.

A Potexvirus nemzetségbe 20 állandó és 21 feltételezett vírusfaj tartozik. A Potexvirus nemzetség típustagja a

burgonya X-vírus (potato X potexvirus), amely 515 nm hosszú és 13 nm átmérőjű (14. ábra). A virion 6%

nukleinsavat és 94% fehérjét tartalmaz. Diagnosztikai növényei közül a Nicotiana tabacum, Datura stramonium

és a Gomphrena globosa a legismertebb (14. ábra).

14. ábra - A: a burgonya X-vírus (potato X potexvirus) virionjai (515 nm × 13 nm) [J.

Brandes szívessége folytán]; B: a burgonya X-vírus (potato X potexvirus) lokális

léziókat mutató gazdanövényének (Gomphrena globosa) levele


rendszertana


A Potexvirus nemzetséget újabban a Nidovirales rend Barnaviridae új víruscsaládba sorolták (Pringle, 1998).

Sobemovirus nemzetség

Az ikozaéder szimmetriájú virion 30 nm átmérőjű. A virionok 180 alegységből állnak, molekulatömegük 6,6 ×

106. A vírusrészecskék pozitív, lineáris egyszálú RNS-t tartalmaznak. A köpenyfehérje molekulatömege 30 ×

103. A fehérje jó immunogén. Az egyes vírusok törzsei között és a nemzetség néhány vírusfaja között

szerológiai rokonság van.

A Sobemovirus nemzetségbe tartozó vírusok gazdanövényköre viszonylag szűk. A vírusok mechanikailag

könnyen átvihetők. Egyes vírusok [Solanum nodiflorum foltosság vírus (Solanum nodiflorum mottle

sobemovirus)] átvitelében a bogaraknak (Epilachna spp.) vagy egyéb rovaroknak (Cyrtopeltis nicotianae) van

jelentősége [bársonyos dohány foltosság vírus (velvet tobacco mottle sobemovirus)].

A Sobemovirus nemzetségbe 10 állandó és 5 feltételezett vírusfaj tartozik. A nemzetség típustagja a bab déli

mozaik vírus (bean southern mosaic sobemovirus), amely 21% nukleinsavat és 79% fehérjét tartalmaz. A vírus

bogárvektorokkal (Ceratoma spp.) szemiperzisztens módon, valamint maggal és pollennel terjed.

Gazdanövényköre szűk. Diagnosztikai és propagatív növényei között a Phaseolus és Vigna fajoknak van a

legnagyobb jelentőségük. A vírus egyes törzsei gazdaspecifikusságot mutatnak. A vírus típus „babtörzse”

megfertőzi a Phaseolus vulgaris fajtákat, de apatogén a Vigna sinensis növényre. A vírus ún. „tehénborsó”

(cowpea) törzse megbetegíti a legtöbb Vigna fajtát, de nem képes megbetegíteni a Phaseolus vulgaris fajtákat. A


rendszertana


Sobemovirus nemzetségbe tartozik a Chenopodium mozaik vírus (sowbane mosaic sobemovirus) és a csomós

ebír foltosság vírus (cocksfoot mottle sobemovirus) (15. ábra).

15. ábra - A, B, C: a Chenopodium mozaik vírus (sowbane mosaic sobemovirus, 26-28

nm) részecskéinek elektronmikroszkópos képe. A: 1%-os formalinnal fixált,

urániummal árnyékolt víruspreparátum; B: a vírusrészecskék hexagonális

elrendeződése ún. negatív festéses („negativ staining”) módszerrel végzett vizsgálat

alapján; C: a formalinnal és a negatív festéses módszerrel fixált virionok; D: a csomós

ebír foltosság vírus (cocksfoot mottle sobemovirus) szférikus részecskéi (30 nm) [A-C:

C.I. Kado, D: A.J. Gibbs szívessége folytán]

A Sobemovirus nemzetséget újabban a Nidovirales rend Barnaviridae új víruscsaládjába sorolták (Pringle,

1998).

A Sobemovirus nemzetség vírusfajaihoz hasonlóságot (morfológiai, az egyszálú genomikus RNS

enkapszidációja stb.) mutatnak a Tombusviridae család Tombusvirus és Carmovirus nemzetségeibe tartozó

vírusok. Ugyanakkor a sobemovirusok köpenyfehérjéjének molekulatömege és genomszerveződése eltér a fenti

nemzetségek vírusfajaitól.

Tenuivirus nemzetség

A virionok vékonyak, fonál alakúak, 3–10 nm szélesek és spirálisak. A virion egyszálú, osztott RNS-t tartalmaz,

amelynek négy típusa ismert. A kukorica sávos mozaik vírusnak (maize stripe mosaic tenuivirus) öt típusú

RNS-e van. A nukleokapszidban levő fehérje molekulatömege 31–34 × 103, a beteg növényekben és

kabócavektorokban kimutatott, nem strukturális protein molekulatömege 20 × 103. A nemzetségbe tartozó

vírusok immunogének, de a tagok között csak a rizs csíkosság vírus (rice stripe tenuivirus) és a kukorica sávos

mozaik vírus között van szerológiai rokonság. A Tenuivirus nemzetség vírusainak gazdanövényköre szűk, és

csupán a Gramineae növénycsalád néhány fajára terjed ki. A vírusok mechanikai átvitele nehéz, kabócákkal

perzisztens módon terjednek.

A Tenuivirus nemzetségbe 4 állandó és 3 feltételezett vírusfaj tartozik. A nemzetség típustagja a rizs csíkosság

vírus, amely 12% RNS-t és 88% fehérjét tartalmaz. A vírus átvitelében a Laodelphax striatellus kabóca játssza a

legfontosabb szerepet. Az átvitel perzisztens módon történik, a vírus a vektorban szaporodik (propagatív vírus).

A vírus diagnosztikai és propagatív növénye az Oryza sativa, a Zea mays és a Triticum aestivum.

A Tenuivirus nemzetséget újabban a Mononegavirales rend Arenaviridae új víruscsaládjába sorolták (Pringle,

1998).


rendszertana


Tobamovirus nemzetség

A merev, pálcika alakú, helikális szimmetriájú virionok [pl. dohány mozaik vírus (tobacco mosaic

tobamovirus)] mérete 300 nm × 18 nm (16A ábra). A virion pozitív, lineáris, egyszálú RNS, molekulatömege 2

× 106. A köpenyfehérje molekulatömege 17–18 × 103. Az e nemzetségbe tartozó vírusok erősen immunogének.

A legtöbb fajnak korlátozott gazdanövényköre van, vektor nélkül, mechanikailag terjednek, egyes vírusfajok

terjedésében fontos szerepe van a maggal történő vírusátvitelnek.

16. ábra - A: a dohány mozaik vírus (tobacco mosaic tobamovirus) pálcika alakú

virionjai (300 nm × 18 nm); B: dohány mozaik vírussal inokulált Nicotiana tabacum cv.

Samsun növény mozaikos és deformált levelei

A Tobamovirus nemzetségbe 13 állandó vírusfaj és 2 feltételezett vírusfaj tartozik. A nemzetség típustagja a

dohány mozaik vírus (tobacco mosaic tobamovirus), amely 5% nukleinsavat és 95% fehérjét tartalmaz. A vírus

mechanikailag és maggal átvihető, de pollennel nem. Gazdanövényköre igen kiterjedt. Diagnosztikai, propagatív

és lokális-léziós gazdanövényei közül a Nicotiana tabacum cvs Samsun (16B ábra), Xanthi-nc, a N. glutinosa és

a Chenopodium quinoa a legjelentősebb.

A nemzetség összes tagja szerológiailag különböző mértékben rokon.

A Tobamovirus nemzetséget újabban a Nidovirales rend Barnaviridae új víruscsaládjába sorolták (Pringle,

1998).

Tobravirus nemzetség

A cső alakú, merev, helikális szimmetriájú virionok alapvetően – az egyes izolátumoktól függően – nagy (180–

215 nm) és kis partikulumokban (46–115 nm) nyilvánulnak meg (17A, B ábra). A virionok 21,3–23,1 nm

átmérőjűek, amelyben a központi üreg átmérője 4–5 nm. A nagy virionok molekulatömege 48–50 × 106, a kis

virionok molekulatömege 11–29 × 106. A virionok a különböző pH-értékekkel, szerves oldószerekkel szemben

igen ellenállóak, de EDTA-kezeléssel szemben igen érzékenyek. A genom osztott, két lineáris, pozitív, egyszálú

RNS-molekulát (RNS1, RNS2) tartalmaz. A strukturális fehérje molekulatömege 22–24 × 103. A Tobravirus

nemzetségbe tartozó vírusok mérsékelten immunogének. Szerológiai rokonság a nemzetség tagjai között nincs,

vagy ha van, igen kis mértékű. A gazdanövénykör mind az egyszikű, mind a kétszikű növényekre igen kiterjedt.

Mechanikailag átvihetők, fonálférgekkel (Trichodorus spp., Paratrichodorus spp.) terjednek. A vírusok

replikációja a vektor fonálférgekben nem bizonyított.

17. ábra - A dohány rattle vírus (tobacco rattle tobravirus) hosszú (A) (180–215 nm) és

rövid (B) (46–115 nm) partikulumai [B.D. Harrison szívessége folytán];C: Solanum

capsicastrum a vírus nekrotikus tünetekkel reagáló diagnosztikai növénye


rendszertana


A Tobravirus nemzetségbe 3 állandó vírusfaj tartozik. A nemzetség típustagja a dohány rattle vírus (tobacco

rattle tobravirus), amely 5% nukleinsavat és 95% fehérjét tartalmaz. A vírus gazdanövényköre kiterjedt,

mechanikailag, fonálférgekkel és néhány növény magjával (Viola arvensis, Capsella bursa-pastoris, Solanum

tuberosum) kis mértékben átvihető. Diagnosztikai, propagatív és lokális-léziós növényei közül jelentős a

Chenopodium quinoa, a Nicotiana clevelandii, a Phaseolus vulgaris, a Solanum capsicastrum (17C ábra).

A Tobravirus nemzetséget újabban a Nidovirales rend Barnaviridae családjába sorolták (Pringle, 1998).

Trichovirus nemzetség

A helikális szimmetriájú, fonál alakú virionok mérete 640–800 nm × 12 nm. A virionok mérsékelten toleránsak

a hőmérséklettel (55–60 °C) és a szerves oldószerekkel szemben. A virion lineáris, pozitív, egyszálú RNS. A

köpenyfehérje molekulasúlya 22–27 × 103.

A Trichovirus nemzetségbe tartozó vírusok gyengén vagy mérsékelten immunogének. Gazdanövénykörük szűk,

mechanikailag általában átvihetők.

A Trichovirus nemzetség típustagja az alma klorotikus levélfoltosság vírus (apple chlorotic leaf spot

trichovirus).

A Trichovirus nemzetséget újabban a Nidovirales rend Barnaviridae új víruscsaládjába sorolták (Pringler, 1998).

Tymovirus nemzetség

Az ikozaéder szimmetriájú, burok nélküli vírusok átmérője 30 nm. A virion lineáris, pozitív, egyszálú RNS-t

tartalmaz, amely éterrel, kloroformmal és butanollal szemben stabil. A vírus közepesen immunogén; a

nemzetség tagjai között részben szoros vagy távoli rokonság van, egyes vírusok között pedig szerológiai

kapcsolat nem mutatható ki.

A Tymovirus nemzetség tagjainak gazdái a kétszikű növényekre terjednek ki. A viszonylag szűk

gazdanövénykör magyarázatul szolgálhat a tymovirusok korlátozott elterjedéséhez. Mechanikailag és

bogárvektorokkal terjednek (Phyllotreta spp., Psylloides spp., Phaedon cochleariae).

A Tymovirus nemzetségbe 17 állandó és 1 feltételezett vírusfaj tartozik. A nemzetség típustagja a tarlórépa sárga

mozaik vírus (turnip yellow mosaic tymovirus), amely 37% nukleinsavat és 63% fehérjét tartalmaz. A vírus

gazdanövényköre szűk, mechanikailag, bogárvektorokkal és maggal (Camelina sativa) terjed. A Brassica

chinensis (18A ábra), a B. rapa var. rapa és a Raphanus sativus a vírus diagnosztikai és propagatív gazdái. Ebbe

a nemzetségbe tartozik a burgonya andeszi látens vírus (potato Andean latent tymovirus), amely Dél- és Közép-

Amerikában igen elterjedt burgonyapatogén vírus (18B ábra).

18. ábra - A: Brassica chinensis a tarlórépa mozaik vírus (turnip yellow mosaic

tymovirus) propagatív gazdanövénye [D. Mamula szívessége folytán];B: burgonya


rendszertana


andeszi látens vírus (potato Andean latent tymovirus) szférikus partikulumai (30 nm)

[A.J. Gibbs szívessége folytán]

A Tymovirus nemzetséget újabban a Nidovirales rend Barnaviridae családjába sorolták (Pringle, 1998). A

nemzetség tagjai morfológiailag hasonlítanak a Marafivirus nemzetség (Tymoviridae család) tagjaihoz. Ez

utóbbi nemzetség tagjai azonban – ellentétben a tymovirusokkal – mechanikailag nem, csak kabócákkal vihetők

át.

Umbravirus nemzetség

Burokkal határolt, 52 nm átmérőjű vírusrészecskéket sikerült eddig kimutatni a nemzetségbe tartozó sárgarépa

foltosság vírussal (carrot mottle umbravirus) fertőzött növényi sejtek vakuoláiban. A fertőző nukleinsav

egyszálú RNS, és feltehetően nem poliadenilált. Lipid előfordulása nem kizárt. A vírusok antigén tulajdonságai

nem ismertek.

Az egyes umbravirusok természetes gazdái csak néhány növényre terjednek ki. A kísérleti gazdanövénykör

szélesebb, de mindenképpen szűk. A vírusok mechanikai átvitele nehéz, de specifikus segítő vírus (helper vírus)

jelenlétében [levéltetvekkel nem perzisztens módon terjedő sárgarépa vörös levelűség vírus (carrot red leaf

luteovirus)] az átvihetőség biztosított.

Az Umbravirus nemzetségbe 5 állandó és 4 feltételezett vírusfaj tartozik. A nemzetség típustagja a sárgarépa

foltosság vírus levéltetvekkel (Cavariella aegopodii) perzisztens módon terjed. Mechanikailag igen, de maggal

és pollennel nem átvihető. A diagnosztikai, propagatív és lokális-léziós gazdanövények közül legjelentősebb a

Chenopodium quinoa, a Nicotiana clevelandii és a Phaseolus vulgaris.

A legújabb aminosav-szekvencia vizsgálatok hasonlóságot állapítottak meg az Umbravirus nemzetség, valamint

a Carmo, a Tombus és a Luteovirus nemzetségek között. Az Umbravirus nemzetséget újabban a Nidovirales

rend Barnaviridae családjába sorolták (Pringle, 1998).

Varicosavirus nemzetség

A pálcika alakú, burok nélküli vírusok mérete 120–268,3–300 nm × 18–22–30 nm. A genom kettősszálú RNS.

A nemzetségbe tartozó vírusok talajban élő gombával (Olpidium brassicae) terjednek. A nemzetségbe tartozó

állandó vírusfajok közül a Freesia levél nekrózis vírus (Freesia leaf necrosis varicosavirus) mechanikailag

nehezen, a saláta érvastagodás vírus (lettuce big-vein varicosavirus) és a dohány satnyulás vírus (tobacco stunt

varicosavirus) mechanikailag könnyen átvihető.

A Varicosavirus nemzetségbe 3 állandó tag és 1 feltételezett tag [Camellia sárga foltosság vírus (Camellia

yellow mottle ? varicosavirus)] tartozik.

Vitivirus nemzetség

A Vitivirus nemzetség (Nidovirales rend, Barnaviridae család) egy újabban ismertté vált vírusnemzetség

(Martelli et al., 1997), amelynek típustagja a szőlő A-vírus (grapevine A vitivirus). Ide tartozik a burgonya T-

vírus (potato T vitivirus) (19. ábra), amely korában a morfológiailag és fizikokémiailag hasonló Trichovirus

nemzetségbe volt sorolva (Murphy et al., 1995). E vírusfajok újabb nemzetségbe sorolását és a trichovirusoktól

történő elválasztását a legújabban megismert tropizmus, a génszerveződés és az epidemiológiai különbségek

indokolják, amelyek között a legnagyobb jelentőségű volt a vitivirusokra jellemző két extra cisztron kódolta


rendszertana


polipeptid. A fent említett két vitivirus természetes gazdanövényköre egy-egy fajra korlátozódik. Mindkét vírus

mechanikailag átvihető. A burgonya T-vírus maggal is terjed. A diagnosztikai és a propagatív gazdanövények

közül legjelentősebb a Chenopodium quinoa, valamint a Phaseolus vulgaris.

19. ábra - A burgonya T-vírus (potato T vitivirus) flexibilis virionjai (637 nm × 12 nm)

[L.F. Salazar szívessége folytán]

4. Új rendszertani javaslatok

4.1. Aktuális vírusrendszer: a növénypatogén vírusnemzetségek és típus vírusfajok fontosabb tulajdonságai

Az ICTV (Nemzetközi Vírustaxonómiai Bizottság) 6. jelentését (vö. Murphy et al., 1995) követően több javaslat

született a vírusok taxonómiájával kapcsolatban. Ezek közül az ICTV plenáris ülése a 10. Nemzetközi

Virológiai Kongresszuson (Jeruzsálem, 1996) és az ICTV Végrehajtó Bizottsági Ülésén (Strasbourg, 1997)

számos új javaslatot fogadott el (Pringle, 1998). Az elfogadott új javaslatokat (vírusrendek, víruscsaládok,

vírusnemzetségek és típus vírusfajok) és a jelenleg érvényben lévő vírusrendszert a 3. táblázatban foglaljuk

össze (Pringle, 1998; de Kochko et al., 1988; Smith és Baker, 1999).

3. táblázat - A Nemzetközi Vírustaxonómiai Bizottság által újonnan jóváhagyott

vírusrendszer

Vírusrend Víruscsalád1 Vírusnemzetség Típustag angol (magyar) neve

Egyszálú

DNS vírusok

Geminiviridae Begomovirus

Curtovirus

Beán golden mosaic begomovirus

(Bab aranysárga mozaik vírus)


rendszertana


Mastrevirus Béét curly top curtovirus

(Répa levélcsúcs fodrosodás vírus)

Maize streak mastrevirus

(Kukorica csíkosság vírus)

DNS és RNS

fordított transz-

kripciójú

vírusok

Caulimoviridae Badnavirus

Caulimovirus

„Cassava vein mottle-

like

viruses "

„Legume-infecting

viruses"

„Rice tungro

bacilliform-

like viruses "

Commelina yellow mottle

badnavirus

(Commelina sárga foltosság vírus)

Cauliflower mosaic caulimovirus

(Karfiol mozaik vírus)

Cassava vein mosaic virus

(Cassava érmozaik vírus)

Soybean chlorotic mottle virus

(Szójabab klorotikus foltosság

vírus)

Rice tungro bacilliform badnavirus

(Rizs tungro bacilus alakú vírus)

Kétszálú RNS

vírusok

Reoviridae Fijivirus

Oryzavirus

Phytoreovirus

Fiji disease/i/i'vi'nw

(Fiji betegség vírus)

Rice ragged stunt oryzavirus

(Rizs érdes törpülés vírus)

Clover wound tumor phytoreovirus

(Here seb tumor vírus)

Parti ti viridae Alphacrypto-

virus

Betacrypto-

virus

White clover cryptic

alphacryptovirus

[=White clover 1 alphacryptovirus

(Fehérhere rejtett vírus 1)]

White clover cryptic

betacryptovirus

[= White clover 2 betacryptovirus

(Fehérhere rejtett vírus 2]

Negatív szálú

RNS vírusok

Mono-

negavirales

Rhabdoviridae Cytorhabdo-

virus

Nucleorhabdo-

Lettuce necrotic yellows

cytorhabdo-

virus (Saláta nekrotikus sárgaság

vírus)


rendszertana


virus Potato yellow dwarf

nucleorhabdovirus

(Burgonya sárga törpülés vírus)

Arenaviridae Tenuivirus Rice stripe tenuivirus

(Rizs csíkosság vírus)

Bunyaviridae Tospovirus Tomato spotted wilt tospovirus

(Paradicsom bronzfoltosság vírus)

Pozitív szálú

RNS vírusok Nidovirales Barnaviridae Benyvirus

Capillovirus

Carlavirus

Furovirus

Hordeivirus

Idaeovirus

Marafivirus

Pecluvirus

Pomovirus

Potexvirus

Sobemovirus

Tobamovirus

Tobravirus

Trichovirus

Tymovirus

Umbravirus

Vitivirus

Beet necrotic yellow vein

benyvirus (Répa nekrotikus

sárgaerűség vírus)

Apple stem grooving capillovirus

(Alma törzsbarázdáltság vírus)

Carnation latent carlavirus

(Szegfű látens vírus)

Wheat soil-borne mosaic furovirus

(Búza talaj lakó mozaik vírus)

Barley stripe mosaic hordeivirus

(Árpa csíkos mozaik vírus)

Raspbery bushy dwarf idaeovirus

(Málna bokros törpülés vírus)

Maize rayado fino marafivirus

(Kukorica finom csíkozottság

vírus)

Peanut clump pecluvirus

(Földimogyoró bokrosodás vírus)

Potato mop-topjromovi'nw

(Burgonya szártörpülés vírus)

Potato Xpotexvirus (Burgonya X-

vírus)

Beán southern mosaic sobemovirus

(Bab déli mozaik vírus)

Tobacco mosaic tobamovirus

(Dohány mozaik vírus)

Tobacco rattle tobravirus


rendszertana


(Dohány rattle vírus)

Apple chlorotic leaf spot

trichovirus (Alma klorotikus

levélfoltosság vírus)

Turnip yellow mosaic tymovirus

(Tarlórépa sárga mozaik vírus)

Carrot mottle umbravirus

(Sárgarépa foltosság vírus)

Grapevine A vitivirus (Szőlő A-

vírus)

Bromoviridae Alfamovirus

Bromovirus

Cucumovirus

Ilarvirus

Oleavirus

Alfalfa mosaic alfamovirus

(Lucerna mozaik vírus)

Brome mosaic bromovirus

(Rozsnok mozaik vírus)

Cucumber mosaic cucumovirus

(Uborka mozaik vírus)

Tobacco streak ilarvirus

(Dohány csíkosság vírus)

Olive latent oleavirus [Olive latent

2 oleavirus (Olajfa látens vírus 2)]

1 A Tombusviridae családba egy újabb vírusnemzetséget (Aureusvirus) soroltak, amelybe a Pothos látens vírus

(Pothos latent aureusvirus) tartozik (Martelli et al., 1998).

A vírusok jelenlegi ismereteink szerint 189 nemzetségbe sorolhatók. Ezek közül 166 nemzetség 55

víruscsaládba tartozik. A maradék 23 vírusnemzetség családi hovatartozása még nem nyert megállapítást. A

növénypatogén vírusok a legújabb vírusrendszer alapján (3. táblázat) 16 családba tartoznak (Pringle, 1998). A

növénypatogén vírusnemzetségek száma jelenlegi ismereteink szerint 57 (61). Minden nemzetséget egyetlen

típus vírusfaj (tag) képvisel. A vírusnemzetségekre és típus vírusfajokra vonatkozó fontosabb adatok a 4.

táblázatban találhatók meg. A 4. táblázat adatai alapján látható, hogy a nukleinsav típusában, a morfológiában,

a vektorokban és a vírusátviteli lehetőségekben igen jelentős eltérések vannak a vírusnemzetségek és a típus

vírusfajok között.

4. táblázat - Növenypatogen vírusnemzetségek és típustagjainak fontosabb

tulajdonságai

Vírusnemzetsé Nukleinsav1'2 Morfológia Vektor/átvitel3 Típustag magyar (angol) neve4


rendszertana


gek

típus konfigur

áció

Alfamovirus ssRNS lineáris bacilus A/Me,S,P Lucerna mozaik vírus

(Alfalfa mosaic alfamovirus)

Alphacryptovi

rus dsRNS lineáris izometrikus Nk,?/Me,S Fehérhererejtettvírus 1

(White clover cryptic 1

alphacryptovirus)

Badnavirus dsDNS cirkuláris bacilus M,LH,?/- Commelina sárga foltosság

vírus

(Commelina yellow mottle

badnavirus)

Begomovirus ssDNS cirkuláris izometrikus

(gemini) T/Me(?) Bab aranysárga mozaik vírus

(Beán golden mosaic

begomovirus)

Benyvirus ssRNS lineáris pálcika F/Me Répa nekrotikus sárgaerűség

vírus

(Beet necrotic yellow vein

benyvirus)

Betacryptovir

us dsRNS lineáris izometrikus Nk,?/S Fehérhere rejtett vírus 2

(White clover cryptic 2

betacryptovirus)

Bromovirus ssRNS lineáris izometrikus A(?),N(?)/Me Rozsnok mozaik vírus

(Brome mosaic bromovirus)

Bymovirus ssRNS lineáris fonál F/Me Árpa sárga mozaik vírus

(Barley yellow mosaic

bymovirus)

Capillovirus ssRNS lineáris fonál Nk,?/Me,S Alma törzsbarázdáltság vírus

(Apple stem grooving

capillovirus)

Carlavirus ssRNS lineáris pálcika A/Me(?) Szegfű látens vírus

(Carnation latent carlavirus)

Carmovirus ssRNS lineáris izometrikus F,B,?/Me Szegfű foltosság vírus

(Carnation mottle carmovirus)

„Cassava vein dsDNS cirkuláris izometrikus -/Me Cassava érmozaik vírus


rendszertana


mottle-like

viruses" (Cassava vein mosaic virus)

Caulimovirus dsDNS cirkuláris izometrikus A/Me Karfiol mozaik vírus

(Cauliflower mosaic

caulimovirus)

Closterovirus ssRNS lineáris fonál A,M/Me(?) Répa sárgaság vírus

(Beet yellows closterovirus)

Comovirus ssRNS lineáris izometrikus B/Me,S Tehénborsó mozaik vírus

(Cowpea mosaic comovirus)

Crinivirus ssRNS lineáris fonál W/Me(?) Saláta fertőző sárgaság vírus

(Lettuce infectious yellows

crinivirus)

Cucumovirus ssRNS lineáris izometrikus A/Me,S Uborka mozaik vírus

(Cucumber mosaic

cucumovirus)

Curtovirus ssDNS cirkuláris izometrikus

(gemini) LH/Me(?),Cu(

?)_ Répa levélcsúcs fodrosodás

vírus

(Beet curly top curtovirus)

Cytorhabdovir

us ssRNS lineáris lövedék A,LH/Me Saláta nekrotikus sárgaság

vírus

(Lettuce necrotic yellows

virus)

Dianthovirus ssRNS lineáris izometrikus N(?)/Me Szegfű gyűrűsfoltosság vírus

(Carnation ringspot

dianthovirus)

Enamovirus ssRNS lineáris izometrikus A/Me,S(?) Borsó enációs mozaik vírus

(Pea enation mosaic

enamovirus)

Fabavirus ssRNS lineáris izometrikus A/Me Lóbab hervadás vírus

(Broad bean vfütfabavirus)

Fijivirus dsRNS lineáris izometrikus LH/Me(?) Fiji betegség vírus (Fiji

disease/i/mmj)

Furovirus ssRNS lineáris pálcika F/Me Búza talaj lakó mozaik vírus

(Wheat soil-borne mosaic

furovirus)


rendszertana


Hordeivirus ssRNS lineáris pálcika Nk,?/Me,S,P Árpa csíkos mozaik vírus

(Barley stripe mosaic

hordeivirus)

Idaeovirus ssRNS lineáris izometrikus NK,?/Me,S,P(

?) Málna bokros törpülés vírus

(Raspberry bushy dwarf

idaeovirus)

Ilarvirus ssRNS lineáris izometrikus

(bacilus) T/Me,S,P Dohány csíkosság vírus

(Tobacco streak ilarvirus)

„ Legume-

infecüng

viruses "

dsDNS cirkuláris izometrikus -/Me Szójabab klorotikus foltosság

vírus

(Soybean chlorotic mottle

virus)

Luteovirus ssRNS lineáris izometrikus A/- Árpa sárga törpülés vírus

(Barley yellow dwarf

luteovirus)

Machlomoviru

s ssRNS lineáris izometrikus B,T/Me,S Kukorica klorotikus foltosság

vírus

(Maize chlorotic mottle

machlomovirus)

Macluravirus ssRNS lineáris fonál A/Me Maclura mozaik vírus

(Maclura mosaic

macluravirus)

Maraflvirus ssRNS lineáris izometrikus LH/- Kukorica finom csíkozottság

vírus

(Maize rayado fino

marqflvirus)

Mastrevirus ssDNS cirkuláris izometrikus

(gemini) LH/- Kukorica csíkosság vírus

(Maize streak mastrevirus)

Nanavirus ssDNS cirkuláris izometrikus A/- Lóbab nekrotikus sárgaság

vírus

(Fába bean necrotic yellows

nanavirus)

Necrovirus ssRNS lineáris izometrikus F/Me Dohány nekrózis vírus

(Tobacco necrosis necrovirus)

Nepovirus ssRNS lineáris izometrikus N,A(?)T(?)/M

e,S,P Dohány gyűrűsfoltosság vírus


rendszertana


(Tobacco ringspot nepovirus)

Nucleorhabdo

virus ssRNS lineáris bacilus

(lövedék) A,LH/Me, Tu Burgonya sárga törpülés vírus

(Potato yellow dwarf

nucleorhabdovirus)

Oleavirus ssRNS lineáris izometrikus ?/Me Olajfa látens vírus 2

(Olive latent 2 oleavirus)

Oryzavirus dsRNS lineáris izometrikus LH/- Rizs érdes törpülés vírus

(Rice ragged stunt oryzavirus)

Ourmiavirus ssRNS lineáris bacilus Nk,?/Me,S,P Dinnye ourmia vírus

(Melón ourmia ourmiavirus)

Pecluvirus ssRNS lineáris pálcika F/Me,S Földimogyoró bokrosodás

vírus

(Peanut clump pecluvirus)

Phytoreovirus dsRNS lineáris izometrikus LH/- Here seb tumor vírus

(Clover wound tumor

phytoreovirus)

Polerovirus ssRNS lineáris izometrikus A/Tu Burgonya levélsodródás vírus

(Potato \eafro\\polerovirus)

Pomovirus ssRNS lineáris pálcika F/Me, Tu Burgonya szártörpülés vírus

(Potato mop-top pomovirus)

Potexvirus ssRNS lineáris fonál Mi,A,?/Me,

Tu Burgonya X- vírus (Potato X

potexvirus)

Potyvirus ssRNS lineáris fonál A/Me, Tu Burgonya Y- vírus (Potato Y

potyvirus)

Rymovirus ssRNS lineáris fonál Mi/Me Angolperje mozaik vírus

(Ryegrass mosaic rymovirus)

„Rice tungro

bacilli-form-

like viruses "

dsDNS cirkuláris bacilus LH/- Rizs tungro bacilus alakú

vírus

(Rice tungro bacilliform

badnavirus)

Sequivirus ssRNS lineáris izometrikus A/Me Paszternák sárga foltosság

vírus

(Parsnip yellow fleck

sequivirus)


rendszertana


Sobemovirus ssRNS lineáris izometrikus A,LH,B/Me,S,

P Bab déli mozaik vírus

(Beán southern mosaic

sobemovirus)

Tenuivirus ssRNS lineáris amorf LH/Me(?) Rizs csíkosság vírus

(Rice stripe tenuivirus)

Tobamovirus ssRNS lineáris pálcika NK,?/Me,S Dohány mozaik vírus

(Tobacco mosaic

tobamovirus)

Tobravirus ssRNS lineáris pálcika N/Me,S Dohány rattle vírus

(Tobacco rattle tobravirus)

Tombusvirus ssRNS lineáris izometrikus F,B,?/Me,S(?),

P(?) Paradicsom bokros törpülés

vírus (Tomato bushy stunt

tombusvirus)

Trichovirus ssRNS lineáris fonál M/Me(?) Alma klorotikus levélfoltosság

vírus (Apple chlorotic leaf

spot trichovirus)

Tospovirus ssRNS lineáris izometrikus T/Me Paradicsom foltos hervadás

vírus [syn.: paradicsom

bronzfoltosság vírus

(Tomato spotted wilt

tospovirus)]

Tymovirus ssRNS lineáris izometrikus B/Me,S Tarlórépa sárga mozaik vírus

(Turnip yellow mosaic

tymovirus)

Umbravirus ssRNS lineáris nem ismert A/Me Sárgarépa foltosság vírus

(Carrot mottle umbravirus)

Varicosavirus dsRNS lineáris pálcika F/Me Dohány satnyulás vírus

(Tobacco stunt varicosavirus)

Vitivirus ssRNS lineáris fonál M/Me Szőlő A-vírus (Grapevine A

vitivirus)

Waikavirus ssRNS lineáris izometrikus LH/- Rizs tungro szférikus vírus

(Rice tungro spherical

waikavirus)

1 ss = single stranded (egyszálú).

2 ds = double stranded (kétszálú).


rendszertana


3 A számlálóban a vektorra, a nevezőben az egyéb átviteli lehetőségekre (különös tekintettel a típus vírusfajra)

vonatkozó adatok vannak feltüntetve. Számlálóban: A = aphids (leveltetvek), B = beetles (bogarak), F = fungus

(gombák), LH = leafhoppers (kabócák), M = mealybugs (vandorpajzstetvek), Mi = mites (atkák), N =

nematodes (fonálférgek), Nk = nőt known (nem ismert), T = thrips (tripszek), W = whiteflies (molytetvek), - = a

típus vírusfaj vektora (aláhúzva), 2 = a típus vírusfaj vektora ismeretlen (aláhúzva), (?) = a vektor bizonytalan,

vagy a vektorral és egyéb átviteli módszerrel történő terjedés bizonytalan (esetleg csak speciális eljárással

lehetséges). Nevezőben: Cu = Cuscuta spp., Me = mechanical transmission (mechanikai átvitel), P = pollen

(virágpor), S = seeds (magvak),Tu = tuber (burgonyagumó), -= az oltással történő átvitelen kívül egyéb terjedés

nem ismert.

4 A Nanavirus nemzetség típustagja nincs definiálva. A lóbab nekrotikus sárgaság vírus (fába bean necrotic

yellows nanavirus) az öt nanavirus egyik tagja (Brunt ét ál., 1996a,b).

Az összefoglaló áttekintés alapján megállapítható, hogy a 61 növénypatogén vírusnemzetségből 52 RNS-t és 9

DNS-t tartalmaz (5. táblázat). Az 5. táblázatban jelentős többségben vannak az izometrikus vírusok (34), a

levéltetvekkel átvihető vírusok (18), valamint a mechanikailag átvihető vírusok (50). A típus vírusfajok között

vannak fonál, pálcika, bacilus, amorf és lövedék alakú vírusok is. Egyetlen vírusnak [sárgarépa foltosság vírus

(carrot mottle umbravirus)] ismeretlen egyelőre a pontos morfológiája. A típus vírusfajok egy része

levéltetűvektorokon kívül még kabócákkal, bogarakkal, fonálférgekkel, atkákkal, tripszekkel és fehérlegyekkel

(liszteskékkel), valamint gombavektorokkal és maggal, továbbá pollennel is átvihetőek (4. és 5. táblázatok).

5. táblázat - A növénypatogén vírusnemzetségek típus vírusfajainak összefoglaló

tulajdonságai1

Tulajdonságok A típus vírusfajok száma Tulajdonságok A típus vírusfajok száma

Nukleinsav:

ssRNS

dsRNS

ssDNS

dsDNS

46

6

4

5

Vektor (állati):

levéltetvek

kabócák

bogarak

fonálférgek

atkák

tripszek

fehérlegyek

vándorpajzstetvek

18

11

6

3

o

5

2

1

Morfológia:

izometrikus

fonál

pálcika

bacilus

izometrikus (gemini)

izometrikus (bacilus)

amorf

lövedék

bacilus lövedék

nem ismert

30

10

9

4

3

1

1

1

1

1

1 A táblázatban csak azokat az ismereteket tettük közzé, amelyek az egyes típus vírusfajok esetében bizonyítást

nyertek. Tehát az olyan adatok, mint pl. a Cuscuta-fajokkal bizonytalanul, vagy nem igazolhatóan átvihető vírus


rendszertana


[répa levélcsúcs fodrosodás vírus (béét curly top curtovirus)], vagy a mechanikailag nehezen átvihető vírus [bab

aranysárga mozaik vírus (bean golden mosaic begomovirus)] nem szerepel a táblázatban.

4.2. Rendszertanilag nem besorolható vírusok

A vírusok egy része – tulajdonságaik ismeretének hiányos volta miatt – családokba, nemzetségekbe még nem

sorolható. Murphy et al. (1995) legújabb vírustaxonómiai munkája 24 olyan növény-, állat-, gomba- és

rovarpatogén vírust ismertet, amelyek rendszertanilag még nem sorolhatók be. Ebben a kiadványban 11

rendszertanilag nem ismert növénypatogén vírus van, amelyek között mind RNS-, mind DNS-tartalmú vírusok

megtalálhatók. A molekuláris virológiai és biológiai kutatások intenzitását jellemzi, hogy Brunt et al. (1996a) –

az előző kiadványt követő egy év múlva – a korábban rendszertanilag nem ismert vírusból nyolcat

rendszertanilag besorolt legalapvetőbb tulajdonságaik megismerése után.

Jelenlegi ismereteink szerint az egyszálú RNS-növényvírusok közül a kukorica fehérvonalas vírus (maize white

line mosaic virus, MWLMV) és a szőlő foltosodás vírus (grapevine fleck virus, GFkV) rendszertani helye nem

ismert (de Zoten és Reddick, 1984; Boulila et al., 1990). A kétszálú DNS-növényvírusok közül az uborka

érsárgulás vírus (cucumber vein yellowing virus, CVYV) rendszertani besorolásra vár (Sela et al., 1980).

Milne et al. (1996) az Ophiovirus csoport (nemzetség) elfogadását javasolja. Ennek a javasolt új nemzetségnek

(csoportnak) a tagjai a tulipán enyhe foltosság vírus (tulip mild mottle ? ophiovirus), a Ranunculus 3 vírus

(Ranunculus 3 ? ophiovirus), a citrus sömör-gyűrűsfoltosság vírus (citrus psorosis-ringspot ? ophiovirus)

hasonlítanak a Tenuivirus nemzetség tagjaihoz, de gazdanövényei a Gramineae családba nem tartoznak.

Mindhárom vírusfaj egyszálú RNS-t tartalmaz, a fehéjeburok 42–50 kD, mechanikailag kétszikű növényekre

vihetők át. A virionok nemcsak a floemben, hanem a parenhimasejtekben is megtalálhatók. A fenti három vírus

szerológiailag nem rokon. Kígyószerű (snaky) virionjaik és fenti tulajdonságaik alapján Milne et al. (1996)

szerint ophiovirusnak tekintendők.


4. fejezet - A vírusok adatbázisa

Az újabb és újabb gazda–vírus kapcsolatok megállapításával lényegesen kiszélesedett a vírusok földrajzi

elterjedése is. A vírusdiagnosztikai technikák és a molekuláris virológiai vizsgálatok egyre biztonságosabbá

váltak. Az ICTV 50 víruscsaládot, 9 alcsaládot, 164 nemzetséget és több mint 3600 vírusfajt regisztrál, és

jelentősen több a vírustörzsek, altípusok és a kellőképpen nem identifikált vírusok száma. Megállapítható, hogy

jelenleg a világ víruslaboratóriumaiban mintegy 30 000 víruskultúrát tartanak nyilván. A vírusok adatbázisa

mintegy 500–1000 tulajdonságot vesz figyelembe (cf. Boswell et al., 1986). Ezeket a tulajdonságokat az

Univerzális Vírus Adatbank az ICTVDB (International Committee on Taxonomy on Viruses Database) őrzi. A

növényvírusok adatbázisát (VIDE Project = Virus Identification Data Exchange) az Ausztráliai Nemzeti

Egyetem (Australian National University, Canberra, Australia) az angol Nemzetközi Kertészeti Kutatási

Központtal (Horticulture Research International, Littlehampton, UK) és a Mezőgazdasági és Élettudományi

Nemzetközi Központtal (Centre for Agriculture and Biosciences International, Wallingford, UK) együtt kezeli.

A VIDE adatbázis jelenleg 55 nemzetségbe tartozó, több mint 890 vírusfaj 569 jellemzőjét tartalmazza (Boswell

et al., 1986; Brunt et al., 1990; Brunt et al., 1996b).

1. Az adatbázis szerepe a vírusidentifikálásban

1.1. Az adatbázis elvi szempontjai

A vírusokat – mint obligát sejtparazitákat – két, nem összefüggő fázisból álló biokémiai életciklus különbözteti

meg a mikroorganizmusoktól. A diszperzív fázisban (1) a vírusok olyan részecskék, amelyek a genomot egy

fehérjeburokban (köpenyfehérje) tartalmazzák. Egyes vírusok virionjai még enzimeket is tartalmaznak, gyakran

vírus-transzkriptázokat, de sohasem katabolikus enzimeket vagy transzfer-RNS-t (t-RNS). A reproduktív

fázisban (2) a vírus a fogékony gazdanövénybe kerül és ott szétbomlik. Ekkor a vírusgének metabolikusan

aktívvá válnak, megváltoztatják a gazdanövény anyagcseréjét úgy, hogy az lemásolja a vírusgenomot és

vírusfehérjéket hoz létre. Ezt követően az „utód” genomok és a vírusfehérjék egyesülnek, virionokat hoznak

létre. A fentiekre tekintettel tehát a vírusok életciklusában metabolikusan inaktív virionok és reprodukálódó

vírus-makromolekulák váltakoznak. Mindkét fázis (diszperzív és reproduktív) olyan információkat szolgáltat,

amelyek a vírusok (egy új vírus) meghatározásához és jellemzéséhez feltétlen szükségesek. A diszperzív

fázisban lévő virionok biokémiailag jellemezhetők, a reproduktív fázis pedig információt nyújt a vírus

gazdanövénykörére, a tünetekre és a replikációs stratégiára (Boswell és Gibbs, 1983).

1.2. Az adatbázis gyakorlati szempontjai

Egy új vírus identifikálása abból áll, hogy megállapítjuk az ismeretlen vírus tulajdonságait és azokat

összehasonlítjuk a már ismert vírusok tulajdonságaival; ennek alapján eldönthető, hogy az „ismeretlen” vírust

korábban leírták-e. A korábban leírt vírusok nagy része megfelelően jellemzett, és ezek a jellemzők

(specifitások) az ún. „Adatbázis”-ban vannak tárolva (Boswell és Gibbs, 1983; Boswell et al., 1986; Brunt et al.,

1990, 1996). Az „Adatbázis”-ban tárolt vírus-jellemzők összehasonlíthatók az „ismeretlen” vírusról szerzett

információkkal. Ennek alapján kerülhet meghatározásra az a víruscsoport, ahova az „ismeretlen vírusfaj”

tartozik. A víruscsoportnak és a vírusfajnak azonban nincsenek abszolút kritériumai, csupán a célszerűség miatt

került sor ilyen taxonok megállapítására. A vírusnemzetség (csoport) olyan vírusok kollekciója, amelyeknek

közös tulajdonságaik vannak; egy ilyen csoportosítás már nagymértékben segíti az „ismeretlen” vírus

meghatározását.

Az egyes vírusnemzetségeket az alábbi közös tulajdonságok jellemzik: (1) a víruspartikulumok azonos

szerkezete és csaknem azonos összetétele, (2) hasonló genomstratégia, (3) hasonló ökológiai életciklus, (4)

hasonló természetes és mesterséges gazdanövénykör, (5) azonos növényfajokon okozott azonos tünetek, (6)

azonos vektorfajok. A víruspartikulumok azonos szerkezetére (összetételére), a hasonló genomstratégiára és a

hasonló ökológiai életciklusra vonatkozó adatok igen hasznosak az „ismeretlen” vírus faji hovatartozásának az

előrejelzésére; ezek a tulajdonságok azért is fontosak, mert tükrözik evolúciós kapcsolatukat, azokat a

tulajdonságokat, amelyeket a közös őstől örököltek.

A természetes és mesterséges gazdanövénykörre, a tünetekre és a vektorokra vonatkozó adatok egymagukban

nem adnak elégséges információt az identifikáláshoz. Az „Adatbázis” kétharmada mégis a gazdanövények

vírusfogékonyságára vonatkozó ismereteket tartalmazza annak ellenére, hogy minden virológus egyetért

Hamilton et al. (1981) véleményével, mely szerint a tesztnövények és a tünetek a vírusidentifikálásban nem a

A vírusok adatbázisa


legfontosabbak, de a vírusok standardizálásában nélkülözhetetlenek. Ezt bizonyítja az a tény, hogy a tünetek,

amelyeket az „ismeretlen” vírus egy standard indikátornövény-soron létrehoz, feltehetően a leghasznosabb

információk arra vonatkozóan, hogy az adott vírus nem tagja-e egy bizonyos víruscsoportnak.

1.3. A vírusidentifikálás stratégiája

Egy „ismeretlen” vírus identifikálása során a diagnosztikai stratégiának három követelményt kell kielégítenie:

(1) a víruspartikulumok szerkezete, összetétele, a genomstratégia és az ökológiai életciklus alapján

megállapítani, hogy az „ismeretlen” vírus melyik vírusnemzetségbe (csoportba) tartozik, (2) a

gazdanövénykörökben, a tünetekben és a vektorokban megnyilvánuló eltérések alapján különbséget kell tenni az

egyes vírusfajok között, (3) a provizórikus diagnózist specifikus vírusdiagnosztikai módszerek-kel (szerológia,

nukleinsav-hibridizáció, nukleotid- vagy aminosav-sorrend, immuno-elektronmikroszkópos vizsgálat stb.) kell

kiegészíteni.

Egy ismeretlen vírus identifikálása során a vírust jellemző tulajdonságok megállapításán kívül szükség van a

korábban leírt vírusokról szerzett információkra is, amelyeket az „Adatbázis” tartalmaz. A pragmatikus, vagy

logikai identifikációs stratégia a különböző forrásokból szerzett információkra épül (20. ábra). A pragmatikus

stratégia azon a tényen alapul, hogy mindegyik vírus egy meghatározott gazdanövénykörrel rendelkezik, ami

kiterjed egynéhány vagy több növénycsaládra, és ezeket a növényeket könynyebb identifikálni, mint a vírusokat.

Először a vírus természetes gazdájának meghatározására kerül sor, majd ezt követően meg kell állapítani, hogy

az adott gazdanövényből korábban milyen vírust vagy vírusokat izoláltak, és ezeknek a vírusoknak a

tulajdonságait össze kell hasonlítani az ismeretlen vírus tulajdonságaival. Bizonytalan esetekben szerológiai és

nukleinsav-hibridizációs vizsgálatot kell végezni. A fentiekre tekintettel az identifikációs stratégia iránya a 20.

ábra felső részén kezdődik, és folytatódik a specifikus összehasonlító tesztekkel. A logikai identifikációs

stratégia első lépése annak a megállapítása, hogy az ismeretlen vírus melyik víruscsoport csoportspecifikus

tulajdonságaihoz (víruspartikulumok alakja és mérete) hasonlít. Ezt követik a specifikus identifikálási

módszerek (lásd 20. ábra).

20. ábra - A víruskapcsolatok és specifitások identifikálásának stratégiai diagramja.

GVL = gazda–vírus lista, VCsA = víruscsoport-adatok, VA = vírusadatok [Brunt et al.,

1990 után]

1.4. Adatbázis-karakterek (jellemzők)

Az individuális vírusok „Adatbázisa” 18 fő szempontra van tekintettel, ezen belül pedig több mint 500

tulajdonságkaraktert foglal magában. A 18 fő szempont a következő: (1) a vírus neve, (2) bevezetés, (3)

természetes gazdanövénykör és tünetek, (4) átvitel és ökológia, (5) geográfia és elterjedés, (6) kísérleti

gazdanövénykör, (7) a víruspartikulum stabilitása és koncentrációja növényi szövetnedvben, (8) vírustisztítás,

(9) morfológia, (10) fizikai tulajdonságok, (11) kémiai összetétel, (12) replikáció, (13) citopatológia, (14)

szerológia, (15) rokonsági kapcsolatok, (16) diagnózis, (17) irodalom, (18) megjegyzés (ha van). A fő

szempontokon belül több mint 500 ismert karaktert tárol az „Adatbázis”. A „Vírusátvitel és ökológia” című pont

a fő szemponton belül pl. a következő karaktereket (jellemzőket) is tartalmazza:

A vírus terjedése a természetben:

1. Vektorral?



2. Vektor nélkül?

3. Egyéb módszerrel? Ha igen, megnevezni!

Ha a vírus vektorral átvihető:

Vektorok:

1. A vektorok rovarok?

2. A vektorok atkák?

3. A vektorok fonálférgek?

4. A vektorok gombák?

5. A vektorok egyéb organizmusok?

A vektorok hova tartoznak?

1. Aleyrodidae?

2. Aphididae?

3. Cicadellidae?

4. Delphacidae?

5. Gymnocerata?

6. Psyllidae?

7. Membracidae?

8. Pseudococcidae?

9. Coleoptera?

10. Thysanoptera?

11. Eryophidae?

12. Tetranychidae?

13. Dorylamidae?

14. Trichodoridae?

15. Plasmodiophorales?

16. Chytridiales?

17. Egyéb? Ha igen, megnevezni!

Ha a vektor rovar, milyen kapcsolata van a vírussal?

1. Nem perzisztens?

2. Szemiperzisztens?

3. Perzisztens (cirkulatív)?

A vírust:



1. Megőrzi a vektor, ha vedlik?

2. Elveszíti a vektor, ha vedlik?

A vírus:

1. Szaporodik a vektorban?

2. Nem szaporodik a vektorban?

A vírus:

1. Átvihető az utódokkal (pl. tojás)?

2. Nem vihető át az utódokkal?

Szükség van, vagy nincs szükség helper (segítő) komponensre az átvitelnél?

1. Szükséges helper vírus a vektorátvitelnél?

2. Nem szükséges helper vírus a vektorátvitelnél?

3. Szükséges helper komponens a vektorátvitelnél?

4. Nem szükséges helper komponens a vektorátvitelnél?

Ha a vírus nem vektorral vihető át, akkor:

A vírus:

1. Mechanikailag terjed?

2. Nem terjed mechanikailag?

A vírus:

1. Oltással vihető át?

2. Nem vihető át oltással?

A vírus:

1. Átvihető kontaktérintkezéssel?

2. Nem vihető át kontaktérintkezéssel?

A vírus:

1. Átvihető maggal?

2. Nem vihető át maggal?

A vírus:

1. Átvihető pollennel és maggal?

2. Átvihető pollennel történő beporzással?

3. Nem vihető át pollennel?

A „Morfológia” című, 9. pontba tartozó fő szemponton belül pl. a következő karakterek vannak:

A víruspartikulumok:



1. Izometrikusak?

2. Ikerpartikulumok (gemini)?

3. Bacilus formájúak?

4. Pálcika vagy fonál alakúak?

5. Rhabdovirus-szerűek?

6. Szokatlan alakúak? Megnevezni!

A vírus:

1. Rendelkezik lipid burokkal?

2. Nem rendelkezik lipid burokkal?

Izometrikus, kvázi-izometrikus, gemini vagy bacilus formájú víruspartikulumok:

Víruspartikulumok:

1. Mekkora az átmérő nm-ben?

2. Mi a hosszúsága a bacilus formájú víruspartikulumoknak, vagy mi a tengelyhosszúsága az

ikerpartikulumoknak nm-ben?

Profil:

1. Lekerekített?

2. Angularis (szögletes)?

3. Átmeneti?

Kapszomer elrendeződés:

1. Jól látható?

2. Nem látható jól?

Pálcika alakú, fonál alakú vagy rhabdovirus alakú víruspartikulumok:

Partikulumok:

1. Pálcika?

2. Fonál?

Partikulumok:

1. Hosszúsága tisztán látható?

2. Hosszúsága nem látható tisztán?

Partikulumok:

1. Mekkora a tiszta hosszúság nm-ben?

2. Mekkora az átmérő nm-ben?

Axiális csatorna:

1. Látható?



2. Homályos?

Mekkora az axiális csatorna átmérője nm-ben?

A vírusrészecske fő spirálja:

1. Látható?

2. Homályos?

Mekkora a fő spirál emelkedése nm-ben?

A nukleotidák/köpenyfehérje-alegységek száma?

Fehérjealegységek/spirál fordulatszáma?

Minden partikulumtípusra vonatkozóan:

A fertőzött növény szövetnedve:

1. Kevés partikulumot (kevesebb mint 10 partikulum/látómező, 20 000-szeres nagyításnál) tartalmaz?

2. Sok partikulumot (több mint 10 partikulum/látómező, 20 000 szeres nagyításnál) tartalmaz?

Szükséges-e fixálni a víruspartikulumokat a negatív festés előtt?

A 18 fő szempontot és több mint 500 tulajdonságot magában foglaló „Adatbázis” több szempontból is igen

jelentős: a) „ismeretlen” vírusok tulajdonságainak egzakt megállapításánál nélkülözhetetlen, b) új vírusok

elismertetése összehasonlító tulajdonságok nélkül nem lehetséges, c) a víruskutatásban és a vírusok egyetemi

oktatásában nélkülözhetetlen.


5. fejezet - A növényvírusok hivatalos elnevezése és akronímjai

A vírusok elnevezése és a vírusnevek gyakran pontatlan használata számos problémát és félreértést okozott. Az

idegen nyelvekből magyarra fordított vírusnevek a hazai irodalomban sem egységesek, és sok esetben hibásak.

Több hazai virológus megkísérelte közreadni a vírusok magyar neveit azzal a céllal, hogy a hazai nómenklatúra

egységes legyen. Az első ilyen összefoglaló munka Horváth (1972) nevéhez fűződik. Ebben a munkában

mintegy 700 növényvírus javasolt magyar neve található meg. Ezt követte V. Németh (1979) munkája, amely

elsősorban a gyümölcsfapatogén vírusok magyar neveit adta közre. Ez a két kézikönyv a növényvírusok magyar

neveit illetően ma is alapműnek tekinthető. Tekintettel azonban arra, hogy az egyes nyelvek (többek között a

magyar) nem tudják minden esetben pontosan visszaadni az eredetileg legtöbbször angol nyelven leírt vírusok

nevét, a növényvirológiában a vírusnevek írását illetően az angol nómenklatúra az elfogadott, amely minden

nemzet virológusai számára azonos értelmű és kötelező.

A növényvírusok nevei többnyire három [dohány mozaik vírus (tobacco mosaic tobamovirus)] vagy négy szóból

állnak [Dandelion sárga mozaik vírus (Dandelion yellow mosaic sequivirus)], de ismertek öt szóból álló

vírusnevek is [uborka zöldfoltosság mozaik vírus (cucumber green mottle mosaic tobamovirus)]. Ezek írása,

esetleg többször ismétlése egy tanulmányon belül szükségessé tette olyan betűszavak (akronímok) használatát,

amelyekkel a vírusok nevei lerövidíthetőek. Az akronímoktól elvárandó követelmények a következők: legyenek

egyszerűek, kerüljék az ismétléseket és a vírus szót, ill. nemzetségnevet „V” betűvel fejezzék ki (a viroidoknál

ez „Vd”). A vírusok standard akronímjairól elsőként Hull et al. (1991) közölt listát. Ebben a listában több mint

500 növényvírus akronímja található meg. Az akronímok fellelhetők még Matthews (1991), Horváth (1993a, b,

c) és Brunt et al. (1996a, b) összefoglaló munkáiban.

Az e könyvben előforduló vírusok magyar és angol hivatalos neveit, valamint akronímjait a 6. táblázat

tartalmazza.

6. táblázat - A vírusok magyar és angol nevei, valamint akronímjai1, 2, 3, 4, 5, 6, 7

Magyar név Angol név Akroním

Abutilon sárgaság vírus Abutilon yellows ? crinivirus* AYV

Alma 227 epinasztia és

pusztulás vírus Apple spy 227 epinasty and

decline virus (syn.: Quince sooty

ring spot virus); (syn.: Apple stem

pitting virus)

ASEDV

Alma klorotikus levélfoltosság

vírus Apple chlorotic leaf spot

trichovirus** ACLSV

Alma mozaik vírus Apple mosaic ilarvirus ApMV

Alma törzsgöndörödés vírus Apple stem pitting virus****** ASPV

Alma törzsbarázdáltság vírus Apple stem grooving capillovirus ASGV

Ananász klorotikus

levélcsíkosság vírus Pineapple chlorotic leaf streak ?

nucleorhabdovirus PCLSV

Angolperje mozaik vírus Ryegrass mosaic rymovirus RGMV

Anthoxanthum látens halvány

vírus Anthoxanthum latent blanching

hordeivirus ALBV

A növényvírusok hivatalos

elnevezése és akronímjai


Arabis mozaik vírus Arabis mosaic nepovirus ArMV

Arracacha B-vírus Arracacha B ? nepovirus AVB

Articsóka tarka fodrosodás

vírus Artichoke mottled crinkle

tombusvirus AMCV

Áfonya levélfoltosság vírus Blueberry leaf mottle nepovirus BLMV

Árpa csíkos mozaik vírus Barley stripe mosaic hordeivirus BSMV

Árpa sárga csíkos mozaik

vírus Barley yellow striate mosaic

cytorhabdovirus BYSMV

Árpa sárga mozaik vírus Barley yellow mosaic bymovirus BaYMV

Árpa sárga törpülés vírus Barley yellow dwarf luteovirus BYDV

Árpa sárga törpülés vírus

MAV törzs Barley yellow dwarf luteovirus

(MAV strain)*** BYDV-

MAV

Bab aranysárga mozaik vírus Bean golden mosaic

begomovirus** BGMV

Bab déli mozaik vírus Bean southern mosaic

sobemovirus SBMV

Bab enyhe mozaik vírus Bean mild mosaic carmovirus BMMV

Babhüvely foltosság vírus Bean pod mottle comovirus BPMV

Bab közönséges mozaik vírus Bean common mosaic potyvirus BCMV

Bab sárga érszalagosodás

vírus Bean yellow vein banding

umbravirus BYVBV

Bab sárga mozaik vírus Bean yellow mosaic potyvirus BYMV

Bab törpülés mozaik vírus Bean dwarf mosaic begomovirus BDMV

Baktövis (Astragalus)

törpeség vírus Milk vetch dwarf nanavirus MVDV

Banán csúcscsokrosodás vírus Banana bunchy top nanavirus BBTV

Bársonyos dohány foltosság

vírus Velvet tobacco mottle

sobemovirus VTMoV

Beléndek mozaik vírus Henbane mosaic potyvirus HMV

Borsó ál-levélsodródás vírus Pea false leaf roll virus PFLV*

Borsó enációs mozaik vírus Pea enation mosaic enamovirus PEMV




Borsó korai barnulás vírus Pea early browning tobravirus PEBV

Borsó súlyos mozaik vírus Pea severe mosaic potyvirus PeSMV

Burgonya andeszi foltosság

vírus Potato Andean mottle comovirus APMoV

Burgonya andeszi látens vírus Potato Andean latent tymovirus APLV

Burgonya A-vírus Potato A potyvirus PVA

Burgonya fekete

gyűrűsfoltosság vírus Potato black ringspot nepovirus PBRSV

Burgonya levélsodródás vírus Potato leafroll luteovirus PLRV

Burgonya levélsodródás vírus Potato leafroll polerovirus PLRV

Burgonya M-vírus Potato M carlavirus PVM

Burgonya sárgaság vírus Potato yellowing alfamovirus PYV

Burgonya S-vírus Potato S carlavirus PVS

Burgonya sárga törpülés vírus Potato yellow dwarf

nucleorhabdovirus PYDV

Burgonya szártarkulás vírus Tobacco rattle tobravirus TRV

Burgonya szártörpülés vírus Potato mop-top pomovirus** PMTV

Burgonya T-vírus Potato T vitivirus** PVT

Burgonya X-vírus Potato X potexvirus PVX

Burgonya Y-vírus Potato Y potyvirus PVY

Burgonya V-vírus Potato V potyvirus PVV

Búza csíkos mozaik vírus Wheat streak mosaic

tritimovirus*** WSMV

Búza talajlakó mozaik vírus Wheat soil-borne mosaic

furovirus SBWMV

Búza törpülés vírus Wheat dwarf monogeminivirus WDV

Camellia sárga foltosság vírus Camellia yellow mottle ?

varicosavirus CYMV

Cassava afrikai mozaik vírus Cassava African mosaic

bigeminivirus ACMV

Cassava barna csíkossággal- Cassava brown streak-associated CBSaV




társult vírus carlavirus

Cassava érmozaik vírus Cassava vein mosaic virus CsVMV

Chenopodium mozaik vírus Sowbane mosaic sobemovirus SoMV

Chrysanthemum szárnekrózis

vírus Chrysanthemum stem necrosis

tospovirus CSNV*

Citrus ér-enációs vírus Citrus vein enation virus CVEV

Citrus gyűrűsfoltosság vírus Citrus ringspot virus CRSV

Citrus leprózis vírus Citrus leprosis ? rhabdovirus CiLV

Citrus mozaik vírus Citrus mosaic badnavirus CiMV

Citrus psorozis vírus Citrus psorosis virus CiPV

Citrus rongyoslevelűség vírus Citrus tatter leaf capillovirus CTLV

Citrus sömör-gyűrűsfoltosság

vírus Citrus psorosis-ringspot ?

ophiovirus CPsRSV

Citrus tarkaság vírus Citrus variegation ilarvirus CVV

Citrus tristeza vírus Citrus tristeza closterovirus CTV

Commelina sárga foltosság

vírus Commelina yellow mottle

badnavirus ComYMV

Cukkini letális klorózis vírus Zucchini lethal chlorosis

tospovirus ZLCV*

Cukkini sárga mozaik vírus Zucchini yellow mosaic potyvirus ZYMV

Cukornád enyhe mozaik vírus Sugarcane mild mosaic

closterovirus SMMV

Cymbidium gyűrűsfoltosság

vírus Cymbidium ringspot tombusvirus CymRSV

Cseresznye aprógyümölcsűség

vírus Cherry little cherry virus CLCV

Cseresznye érdeslevelűség

vírus Cherry rasp leaf nepovirus CRLV

Cseresznye levélsodródás

vírus Cherry leafroll nepovirus CLRV

Csomós ebír foltosság vírus Cocksfoot mottle sobemovirus CoMV

Csorbóka sárgaerűség vírus Sowthistle yellow vein

nucleorhabdovirus SYVV




Dandelion sárga mozaik vírus Dandelion yellow mosaic

sequivirus DYMV

Dália mozaik vírus Dahlia mosaic caulimovirus DMV

Dendrobium érnekrózis vírus Dendrobium vein necrosis ?

closterovirus DVNV

Dinnye foltos hervadás vírus Melon spotted wilt tospovirus* MSWV

Dinnye ourmia vírus Melon ourmia ourmiavirus OuMV

Diodia érklorózis vírus Diodia vein chlorosis ? crinivirus DVCV

Dioscorea bacilus alakú vírus Dioscorea bacilliform badnavirus DBV

Dohány csíkosság vírus Tobacco streak ilarvirus TSV

Dohány enyhe zöld mozaik

vírus Tobacco mild green mosaic

tobamovirus TMGMV

Dohány érfoltosság vírus Tobacco vein mottling potyvirus TVMV

Dohány gyűrűsfoltosság vírus Tobacco ringspot nepovirus TRSV

Dohány karcolatos vírus Tobacco etch potyvirus TEV

Dohány mozaik vírus Tobacco mosaic tobamovirus TMV

Dohány nekrotikus törpülés

vírus Tobacco necrotic dwarf luteovirus TNDV

Dohány nekrózis vírus Tobacco necrosis necrovirus TNV

Dohány rattle vírus Tobacco rattle tobravirus TRV

Dohány sárga törpülés vírus Tobacco yellow dwarf

monogeminivirus TYDV

Dohány satnyulás vírus Tobacco stunt varicosavirus TStV

Édesburgonya enyhe foltosság

vírus Sweet potato mild mottle

ipomovirus SPFMV

Édesburgonya klorotikus

törpülés vírus Sweet potato chlorotic stunt ?

crinivirus SPVSV

Édesburgonya sárga törpülés

vírus Sweet potato yellow dwarf

ipomovirus SPMMV

Epirusz cseresznye vírus Epirus cherry ourmiavirus EpCV

Euphorbia mozaik vírus Euphorbia mosaic bigeminivirus EuMV




Fehérhere mozaik vírus White clover mosaic potexvirus WClMV

Fehérhere rejtett vírus 1 White clover cryptic

alphacryptovirus WCCV-1

Fehérhere rejtett vírus 2 White clover cryptic

betacryptovirus WCCV-2

Fekete málna látens vírus Black raspberry latent ilarvirus BRLV

Fiji betegség vírus Fiji disease fijivirus FDV

Földieper enyhe sárga

levélszélűség Strawberry mild yellow edge ?

potexvirus vírus SMYEaV

Földieper érszalagosodás vírus Strawberry vein banding ?

caulimovirus******* SVBV

Földieper göndörödés vírus Strawberry crinkle

cytorhabdovirus SCrV

Földieper látens C-vírus Strawberry latent C ? rhabdovirus SLV

Földieper látens

gyűrűsfoltosság vírus Strawberry latent ringspot ?

nepovirus SLRSV

Földimogyoró bokrosodás

vírus Peanut clump pecluvirus** PCV

Földimogyoró foltosság vírus Peanut mottle potyvirus PeMoV

Földimogyoró gyűrűsfoltosság

vírus Groundnut ringspot tospovirus GRSV*

Földimogyoró klorotikus

legyező-foltosság vírus Peanut chlorotic fan-spot

tospovirus PCSV

Földimogyoró rügynekrózis

vírus Groundnut bud necrosis

tospovirus* GBNV

Földimogyoró satnyulás vírus Peanut stunt cucumovirus PSV

Freesia levél nekrózis vírus Freesia leaf necrosis

varicosavirus FLNV*

Görögdinnye ezüstfoltosság

vírus Watermelon silver mottle

tospovirus* WSMV

Görögdinnye mozaik vírus Watermelon mosaic potyvirus WMV

Görögdinnye mozaik 2-vírus Watermelon mosaic 2 potyvirus WMV-2

Görögdinnye rügynekrózis

vírus Watermelon bud necrosis

tospovirus WBNV*




Heracleum látens vírus Heracleum latent ? trichovirus HLV

Heracleum vírus 6 Heracleum 6 ? closterovirus HV-6*

Here földalatti törpülés vírus Subterranean clover stunt

nanavirus SCSV

Here nekrotikus mozaik vírus Sweet clover necrotic mosaic

dianthovirus SCNMV

Here sárga erűség vírus Clover yellow vein potyvirus ClYMV

Here seb tumor vírus Clover wound tumor

phytoreovirus WTV

Impatiens nekrotikus foltosság

vírus Impatiens necrotic spot tospovirus INSV*

Indiai földimogyoró

bokrosodás virus Indian peanut clump pecluvirus** IPCV*

Iris sárga foltosság vírus Iris yellow spot tospovirus IYSV*

Kakaó duzzadt hajtás vírus Cacao swollen shoot badnavirus CSSV

Karfiol mozaik vírus Cauliflower mosaic caulimovirus CaMV

Kókusz hajtás leromlás vírus Coconut foliar decay nanavirus CFDV

Körte érsárgulás vírus Pear vein yellows virus (syn.:

Apple stem pitting virus) ASPV

Körte kövecsesedés vírus Pear stony pit virus PSPV*

Kukorica csíkos mozaik vírus Maize dwarf mosaic potyvirus

(syn.: Kukorica törpe mozaik

vírus)

MDMV

Kukorica csíkosság vírus Maize streak mastrevirus** MSV

Kukorica fehérvonalas mozaik

vírus Maize white line mosaic virus MWLMV

Kukorica finom csíkozottság

vírus Maize rayado fino marafivirus MRFV

Kukorica klorotikus foltosság

vírus Maize chlorotic mottle

machlomovirus MCMV

Kukorica klorotikus törpülés

vírus Maize chlorotic dwarf waikavirus MCDV

Kukorica sávos mozaik vírus Maize stripe mosaic tenuivirus MSpV




Kukorica finom csíkozottság

vírus Maize rayado fino marafivirus MRFV

Liliom tünetmentes vírus Lily symptomless carlavirus LSV

Lóbab enyhe foltosság vírus Broad bean mild mottle

bromovirus BBMMV

Lóbab foltosság vírus Broad bean mottle bromovirus BBMV

Lóbab hervadás vírus Broad bean wilt fabavirus BBWV

Lóbab nekrotikus sárgaság

vírus Faba bean necrotic yellows

nanavirus FBNYV*

Lóbab nekrózis vírus Broad bean necrosis furovirus BBNV

Lóbab tarkulás vírus Broad bean mottle bromovirus BBMV

Lucerna látens vírus Alfalfa latent carlavirus ALV

Lucerna mozaik vírus Alfalfa mosaic alfamovirus AMV

Lychnis gyűrűsfoltosság vírus Lychnis ringspot hordeivirus LRSV

Maclura mozaik vírus Maclura mosaic macluravirus MacMV

Manióka afrikai mozaik vírus Cassava African mosaic

bigeminivirus ACMV

Manioka Ivoriai bacilus

formájú vírus Cassava Ivorian bacilliform

ourmiavirus CIBV*

Málna bokros törpülés vírus Raspberry bushy dwarf

idaeovirus RBDV

Málna levélgöndörödés vírus

(amerikai) Raspberry leaf curl ? luteovirus RLCV

Málna gyűrűsfoltosság vírus Raspberry ringspot nepovirus RpRSV

Melandrium sárga foltosság

vírus Melandrium yellow fleck

bromovirus MYFV

Nandina szár himlő vírus Nandina stem pitting capillovirus NSPV

Narcissus látens vírus Narcissus latent macluravirus NLV

Odontoglossum

gyűrűsfoltosság vírus Odontoglossum ringspot

tobamovirus ORSV

Olajfa látens vírus 2 Olive latent 2 oleavirus** OLV-2

Ourmia dinnye vírus Ourmia melon ourmiavirus OuMV




Őszibarack (amerikai) mozaik

vírus Peach (American) mosaic vírus PAMV

Őszibarack rozettás mozaik

vírus Peach rosette mosaic nepovirus PRMV

Papaya gyűrűsfoltosság vírus Papaya ringspot potyvirus PRSV

Paprika enyhe foltosság vírus Paprika mild mottle tobamovirus PaMMV

Paprika enyhe „tigré” vírus Pepper mild tigré ? bigeminivirus PepMTV

Paprika érfoltosság vírus Pepper veinal mottle potyvirus PVMV

Paprika érszalagosodás vírus Pepper vein banding virus PVBV*

Paprika foltosság vírus Pepper mottle potyvirus PepMoV

Paradicsom ál-

levélgöndörödés vírus Tomato pseudo-curly top hybri-

geminivirus RPCTV

Paradicsom bokros törpülés

vírus Tomato bushy stunt tombusvirus TBSV

Paradicsom bronzfoltosság

vírus Tomato spotted wilt tospovirus TSWV

Paradicsom fekete gyűrűs

vírus Tomato black ring nepovirus TBRV

Paradicsom fertőző klorózis

vírus Tomato infectious chlorosis

crinivirus TICV*

Paradicsom Florida vírus Tomato Florida virus* ToFV

Paradicsom foltos hervadás

vírus Tomato spotted wilt tospovirus

(syn.: Paradicsom bronzfoltosság

vírus)

TSWV

Paradicsom foltosság vírus Tomato mottle bigeminivirus ToMoV

Paradicsom gyűrűsfoltosság

vírus Tomato ringspot nepovirus ToRSV

Paradicsom klorotikus

foltosság vírus Tomato chlorotic spot tospovirus TCSV*

Paradicsom klorózis vírus Tomato chlorosis crinivirus ToCV*

Paradicsom levélgöndörödés

vírus Tomato leaf curl bigeminivirus

(-begomovirus)

TLCV

Paradicsom levélráncosodás

vírus Tomato leaf crumple

bigeminivirus TLCV




Paradicsom magtalanság vírus Tomato aspermy cucumovirus TAV

Paradicsom mozaik vírus Tomato mosaic tobamovirus ToMV

Paradicsom sárga

levélgöndörödés vírus Tomato yellow leaf curl

bigeminivirus TYLCV

Paszternák sárga foltosság

vírus Parsnip yellow fleck sequivirus PYFV

Pelargonium foltosság vírus Pelargonium zonale spot

ourmiavirus PZSV

Pittosporum érsárgulás vírus Pittosporum vein yellowing

nucleorhabdovirus PVYV

Poa szemilátens vírus Poa semilatent hordeivirus PSLV

Póréhagyma fehér csíkos vírus Leek white stripe necrovirus LWSV*

Pothos látens vírus Pothos latent aureovirus* PoLV

Prunus nekrotikus

gyűrűsfoltosság vírus Prunus necrotic ringspot ilarvirus PNRSV

Ranunculus 3 vírus Ranunculus 3 ? ophiovirus RnV3*

Retek mozaik vírus Radish mosaic comovirus RaMV

Répa álsárgaság vírus Beet pseudo yellows crinivirus* BPYV

Répa levélcsúcs fodrosodás

vírus Beet curly top curtovirus** BCTV

Répa levélgöndörödés vírus Beet leaf curl ? rhabdovirus BLCV

Répa nekrotikus sárgaerűség

vírus Beet necrotic yellow vein

benyvirus**** BNYVV

Répa nyugati sárgaság vírus Beet western yellows ?

betaluteovirus*** BWYV

Répa nyugati sárgaság vírus Beet western yellows luteovirus BWYV

Répa sárgaság vírus Beet yellows closterovirus BYV

Répa talajlakó vírus Beet soil-borne furovirus BSBV

Rizs csíkosság vírus Rice stripe tenuivirus RSV

Rizs érdes törpülés vírus Rice ragged stunt oryzavirus RRSV

Rizs törpülés vírus Rice dwarf phytoreovirus RDV




Rizs tungro bacilus alakú vírus Rice tungro bacilliform

badnavirus RTBV

Rizs tungro szférikus vírus Rice tungro spherical waikavirus RTSV

Rozsnok csíkos mozaik vírus Brome streak mosaic

tritimovirus*** BrSMV*

Rozsnok mozaik vírus Brome mosaic bromovirus BMV

Saláta érvastagodás vírus Lettuce big-vein varicosavirus LBVV

Saláta fertőző sárgaság vírus Lettuce infectious yellows

crinivirus** LIYV

Saláta klorózis vírus Lettuce chlorosis crinivirus LCV*

Saláta mozaik vírus Lettuce mosaic potyvirus LMV

Saláta nekrotikus sárgaság

vírus Lettuce necrotic yellows

cytorhabdovirus LNYV

Satsuma törpülés vírus Satsuma dwarf ? nepovirus SDV

Sárgadinnye sárgaság vírus Muskmelon yellows ? crinivirus MYV

Sárgarépa foltosság vírus Carrot mottle umbravirus CMoV

Sárgarépa vörös levelűség

vírus Carrot red leaf luteovirus CRLV

Seb tumor vírus Wound tumor phytoreovirus WTV

Sinaloa paradicsom

levélgöndörödés Sinaloa tomato leaf curl

begomovirus vírus STLCV

Solanum nodiflorum foltosság

vírus Solanum nodiflorum mottle

sobemovirus SNMV

Sorghum klorotikus foltosság

vírus Sorghum chlorotic spot furovirus SgCSV

Szatellit dohány nekrózis vírus Tobacco necrosis satellivirus satTNV

Szatellit köles mozaik vírus Panicum mosaic satellivirus PMV

Szegfű foltosság vírus Carnation mottle carmovirus CarMV*

Szegfű gyűrűsfoltosság vírus Carnation ringspot dianthovirus CRSV

Szegfű karcolatos gyűrűs vírus Carnation etched ring

caulimovirus CERV

Szegfű látens vírus Carnation latent carlavirus CLV




Szegfű nekrotikus foltosság

vírus Carnation necrotic fleck

closterovirus CNFV

Szegfű vírus 1 Carnation 1 alphacryptovirus CCV-1

Szilva (amerikai) vonalas

mintázottság Plum (American) line pattern

ilarvirus vírus APLPV

Szilva himlő vírus Plum pox potyvirus PPV

Szilva törpülés vírus Prune dwarf ilarvirus PDV

Szójabab klorotikus foltosság

vírus Soybean chlorotic mottle virus SbCMV

Szójabab mozaik vírus Soybean mosaic potyvirus SMV

Szójabab törpülés vírus Soybean dwarf luteovirus SbDV

Szőlő A-vírus Grapevine A vitivirus** GAV

Szőlő bulgáriai látens vírus Grapevine Bulgarian latent

nepovirus GBLV

Szőlő enációs vírus Grapevine enation virus* GEnV

Szőlő érmenti mozaik vírus Grapevine veinal mosaic virus* GVMV

Szőlő érnekrózis vírus Grapevine veinal necrosis virus* GVNV

Szőlő faszöveti barázdáltság

vírus Grapevine stem pitting

closterovirus GSPV

Szőlő fertőző leromlás vírus Grapevine fanleaf nepovirus

(syn.: Szőlő páfránylevelűség

vírus)

GFLV

Szőlő foltosodás vírus Grapevine fleck virus GFkV

Szőlő króm mozaik vírus Grapevine chrome mosaic

nepovirus GCMV

Szőlő parakérgűség vírus Grapevine corky bark-associated

? closterovirus* GCBaV

Szőlő páfránylevelűség vírus Grapevine fanleaf nepovirus

(syn.: Szőlő leromlás vírus) GFLV

Szőlő vonalas mintázottság

vírus Grapevine line pattern ? ilarvirus GLPV

Tarlórépa göndörödés vírus Turnip crinkle carmovirus TCV

Tarlórépa mozaik vírus Turnip yellow mosaic tymovirus TYMV




Tarlórépa rozettás vírus Turnip rosette sobemovirus TRoV

Tarlórépa sárga mozaik vírus Turnip yellow mosaic tymovirus TYMV

Tehénborsó enyhe foltosság

vírus Cowpea mild mottle carlavirus CPMMV

Tehénborsó klorotikus

foltosság vírus Cowpea chlorotic mottle

bromovirus CCMV

Tehénborsó mozaik vírus Cowpea mosaic comovirus CPMV

Tehénborsó súlyos mozaik

vírus Cowpea severe mosaic comovirus CPSMV

Tök levélgöndörödés vírus Squash leaf curl bigeminivirus SLCV

Tök mozaik vírus Squash mosaic comovirus SqMV

Tök sárga törpülés

rendellenesség vírus Cucurbit yellow stunting disorder

crinivirus CYSDV*

Tulipán enyhe foltosság vírus Tulip mild mottle ? ophiovirus TMMV*

Tulipán színtörés vírus Tulip breaking potyvirus TBV

Uborka érsárgulás vírus Cucumber vein yellowing virus CVYV

Uborka klorotikus foltosság

vírus Cucumber chlorotic spot

crinivirus** CCSV

Uborka levélfoltosság vírus Cucumber leaf spot

carmovirus***** CLSV

Uborka mozaik vírus Cucumber mosaic cucumovirus CMV

Uborka nekrózis vírus Cucumber necrosis tombusvirus CuNV

Uborka sárgaság vírus Cucumber yellows ? crinivirus CuYV

Uborka zöldfoltosság mozaik

vírus Cucumber green mottle mosaic

tobamovirus CGMMV

Vad uborka mozaik vírus Wild cucumber mosaic tymovirus WCMV

Vöröshere érmozaik vírus Red clover vein mosaic carlavirus RCVMV

Vöröshere tarkulás vírus Red clover mottle comovirus RCMV

Vöröshere vírus 2 Red clover 2 betacryptovirus RCCV-2

Zab arany csíkos vírus Oat golden stripe furovirus OGSV

Zab kék törpülés vírus Oat blue dwarf marafivirus OBDV




1 E helyen azoknak a vírusoknak a felsorolása található, amelyek a könyvben előfordulnak. Részletesebb adatok

Hull et al. (1991), Matthews (1991), Horváth (1993a,b,c), Brunt et al. (1996a,b) és Pringle (1998) munkáiban

találhatók.

2 A *-gal megjelölt vírusok akronímjai Brunt et al. (1996a,b) munkájában nem szerepelnek.

3 A ?-lel megjelölt vírusok taxonómiai helye még bizonytalan.

4 A **-gal jelölt vírusok új taxonómiai helye.

5 A ***-gal nevezett vírusok újabban javasolt taxonómiai helye.

6 A ****-gal jelölt vírus [répa nekrotikus sárgaerűség vírus (beet necrotic yellow vein virus)] újabban a

Benyvirus nemzetségbe tartozik.

7 A *****-gal jelölt vírus [uborka levélfoltosság vírus (cucumber leaf spot carmovirus)] újabb taxonómiai helye

a Tombusviridae család Aureusvirus nemzetségben van; újabb tudományos neve: cucumber leaf spot

aureusvirus (Martelli et al., 1998).

8 A ******-gal elölt vírus [alma törzsgöndörödés vírus (apple stem pitting virus)] a legújabb vizsgálatok szerint

a Foveavirus nemzetségbe tartozik (Martelli és Jelkmann, 1998).

9 A *******-gal jelölt vírus földieper érszalagosodás vírus (strawberry vein banding ? caulimovirus)], a

Caulimovirus nemzetség definitív tagja (Petrzik et al., 1998).


6. fejezet - A növényvirológiában használt fontosabb növények kódjai

Néhány évvel korábban javaslatot tettünk a növényvirológiában használt diagnosztikai, propagatív, általános

próbanövények (assay host), lokális gazdanövények (local assay host) és szisztemikus gazdanövények (systemic

assay host), valamint a nem gazdanövények (non-hosts) kódjaira vonatkozóan (Horváth, 1993a, b, c). A

kódrendszert az Amerikai és Japán Gyomnövénykutató Társaság (Weed Science Society of America, WSSA,

Weed Science Society of Japan, WSSJ) javasolt komputerkódjainak adaptálásával és kiterjesztésével készítettük

el. Tekintettel arra, hogy ezek a komputerkódok nem terjedtek ki a növényfajták és hibridek neveire, valamint a

gazdanövények legfontosabb tulajdonságaira (diagnosztikai, propagatív és assay-növények) – holott ezeknek a

növényvirológiában igen nagy a jelentőségük –, ezekre vonatkozóan is javaslatot tettünk.

A növények kódja öt betűből áll. Az első három betű a növény nemzetségnevét (LAC = Lactuca), az utolsó két

betű pedig a fajnevet (SA = sativa) fejezi ki; Lactuca sativa = LACSA. Ha a fajnév nincs megjelölve, akkor az

ismeretlen fajnév jelölésére az SS kódot kell használni (pl. Lactuca species = LACSS).

A növényfajták és -hibridek nevének rövidítésére olyan három betűt javasolunk, amely a szó, ill. a szavak

összetételében a legkönnyebben kiejthető, és amelyet kötőjellel elválasztva adunk meg. A saláta (Lactuca sativa

= LACSA) Valmaine fajta (VAL) kódja a következő: LACSA-VAL.

A növények családi hovatartozására – amelynek ismerete nagyon fontos a virológiában – hárombetűs kódot

ajánlunk, amelyet kötőjel választ el a faj, ill. a fajta vagy hibrid nevétől: Compositae család = COM. Az említett

példa alapján a családba tartozó Lactuca sativa Valmaine fajta kódja a következő: LACSA-VAL-COM

(Horváth, 1993c).

A gazdanövények a virológiában lényeges tulajdonságaik alapján öt csoportba sorolhatók: (1) általános próba-

(assay-) növények, (2) lokális próbanövények, (3) szisztemikus próbanövények, (4) diagnosztikai növények, (5)

propagatív növények. A gazdanövényeknek eme tulajdonságai igen fontosak, ezért a fenti tulajdonságok

kódjaira a következő 2–4 betűs kódot javasoljuk: AH = általános próbanövény, AHL = lokális próbanövény,

AHLS = lokális és szisztemikus próbanövény, AHL(S) = lokális próbanövény, de egyes vírustörzsekre

szisztemikus is, AHS = szisztemikus próbanövény, DH = diagnosztikai gazda, PH = propagatív gazda (Horváth,

1993c).

A fentiek alapján a növényvirológiában előforduló fontosabb növények kódrendszerét a 7. táblázatban közöljük.

7. táblázat - A növényvirológiában használt fontosabb kísérleti növények kódjai1

A növény latin neve Növénykód

Fajta-

vagy

hibridkó

d

Családk

ód2

Gazdatulajdons

ág

kódja3

Ammi majus AMINA UMB DH, PH

Beta vulgaris cv. Monobusch BEAVA MOB CHE PH

Brassica campestris cv. Just Right BRSCA JTR CRU PH

Chenopodium quinoa CHEQU CHE AHL, AHS

Cucumis melo CUMME CUC DH, PH

C. sativus cv. Delicatess CUMSA DEL CUC DH, PH

Datura metel DATME SOL DH, PH

A növényvirológiában használt

fontosabb növények kódjai


D. stramonium DATST SOL AHL

Gomphrena globosa GOMGL AMA DH, PH, AHL

Lactuca sativa cv. Valmaire LACSA VAL COM DH, PH

Lycium spp. LYUSS SOL AHL, DH

Lycopersicon esculentum LYPES SOL PH

Nicotiana benthamiana NIOBE SOL DH, PH

N. clevelandii NIOCL SOL DH, PH

N. glutinosa NIOGT SOL AHL, DH, PH

N. tabacum cv. Samsun NIOTA SAM SOL DH, PH

N. tabacum cv. White Burley NIOTA WHB SOL DH, PH

N. tabacum cv. Xanthi-nc NIOTA XNC SOL AHL, DH, PH

Petunia hybrida PEUHY SOL DH, PH

Phaseolus vulgaris cv. Pinto PHSVX PIN LEG AHL, DH, PH

P. vulgaris cv. Red Kidney PHSVX RKY LEG DH, PH

Physalis floridana PHYFL SOL DH, PH

Pisum sativum PIBSA LEG DH, PH

Solanum demissum x S. tuberosum

„A6‟ SOLHY TUA SOL AH. AHL, DH

Tetragonia expansa TEATE AIZ DH, PH

Tropaeolum majus TOPMA TRP PH

Vigna sinensis VIGSI LEG DH, PH

Zinnia elegans ZITEL COM PH

1 Részletesebb adatok találhatók Horváth (1993a, b) munkáiban.

2 AIZ, Aizoaceae; AMA, Amaranthaceae; CHE, Chenopodiacea; COM, Compositae; CRU, Cruciferae; CUC,

Cucurbitaceae; LEG, Leguminosae; SOL, Solanaceae; TRP, Tropaeolaceae; UMB, Umbelliferae.

3 AH, kvantitatív vizsgálatokra alkalmas lokális gazda; AHL, lokális gazda; AHS, kvantitatív vizsgálatokra

alkalmas szisztemikus gazda; AHLS, lokális és szisztemikus kvantitatív vizsgálatokra alkalmas növény; DH,

diagnosztikai célokra alkalmas növény; PH, a vírus felszaporítására alkalmas gazdanövény. A növények eme

tulajdonságai gazda–vírus kapcsolatok szerint váltakoznak.


7. fejezet - A vírusátvitel módszerei

A vírusok átvihetőségének (terjedésének) ismerete – a betegségeket kiváltó egyéb kórokozókhoz hasonlóan –

alapvető jelentőségű. A vírusok élő szervezetbe jutása passzív folyamat. A vírusoknak ui. nincsenek olyan

enzimei, amelyek lehetővé tehetnék a növényi sejtekbe történő aktív bejutását. Az átvitel többnyire külső

segítséggel történik. A vírusátvitel lehetőségei alapvetően két nagy csoportba sorolhatóak: (1) állatvektor nélküli

vírusátvitel és (2) állatvektorokkal történő vírusátvitel. Az egyes terjedési, vírusátviteli módok vírusoktól

függően eltérőek lehetnek, de az egyes átviteli lehetőségek kombinálódhatnak is egymással (Horváth, 1972;

Fritzsche et al., 1972; Schmelzer, 1980; Jones, 1993a,b; Dijkstra és De Jager, 1998; Horváth, 1999).

1. Állatvektor nélküli vírusátvitel

1.1. Oltással történő átvitel

Alapvetően minden növényvírus oltással átvihető; ennek feltétele, hogy a vírus szisztemikus megbetegedést

legyen képes kiváltani, és hogy a vírusbeteg, valamint egészséges növények között szöveti kompatibilitás

legyen. Az oltás, a szemzés, a dugvá-nyozás igen kiterjedt módszere a vírusátvitelnek. Az alany vagy az

oltóvessző fertőzöttsége az egész növényre egyaránt átterjed. Az oltás különböző módjait a 21. ábra szemlélteti.

21. ábra - A virológiában alkalmazott fontosabb oltási módszerek. A: zöldoltás

hasítékba; B: párosítás; C: héj alá oltás; D: érintkezéses oltás; E: palackoltás; F:

hagymaoltás; G: szemzés; H: szemlapozás (chipszemzés); I: gumóba oltás; J:

heteroplasztikus oltás (zöld hajtás fás részbe oltása); K: levéloltás kétszikűek esetében;

L: levéloltás az egyszikű Liliaceae családba tartozó növényeknél [Schmelzer, 1980 után]

Az oltás módszere (Noordam, 1973)

a. Egy vízszintesen félbevágott Nicotiana tabacum növény szárán tegyünk kb. 3 cm mély metszést. Ez képezi

majd az oltás alapját, és ez akadályozza meg az oltóág és az alany elmozdulását egymástól.

b. Vágjuk le egy N. glutinosa növény hajtását. Távolítsunk el róla 1–2 alsó levelet, ezzel megelőzhetjük az

oltóvessző elhervadását. Túl sok levelet nem érdemes eltávolítani, mert ez megakadályozhatja a további

növekedést. Nyessük meg a szár végét úgy, hogy kb. 2 cm hosszú ék keletkezzen rajta.

c. Helyezzük a N. glutinosa szárának ék alakú végét a N. tabacum bevágott szárába. Tekerjük körbe rafiával

vagy kötözőhánccsal, amelyet előzőleg vízzel hajlékonnyá tettünk. A kötözéshez használhatunk gumiszalagot

vagy parafilmet is.

d. Címkézzük fel a cserepeket és különítsük el a növényt a többitől.

e. Ugyanilyen módszerrel helyezzünk el három N. tabacum alanyra egy N. glutinosa és két N. tabacum hajtást.

Hagyjunk meg két N. glutinosa és két N. tabacum növényt teljesen sértetlenül. Valamennyi dohánynövényt

helyezzük biztonságba, páradús helyre.

A vírusátvitel módszerei


f. Egy hét elteltével inokuláljuk az alanyon lévő leveleket 5 mg/l dohány mozaik vírussal (tobacco mosaic

tobamovirus) és ugyanígy a kontrollnövények alsó leveleit.

g. Szellőztessük a növényeket, óvjuk őket a befülledéstől. Először három nap múlva, majd rövid

periódusonként, később rendszeresen, hosszabb időközönként szellőztessünk.

h. Távolítsuk el az alsó levelek új hajtásait.

i. Ellenőrizzük a vírusátvitel eredményességét.

A Nicotiana tabacum cv. Samsun növények levelein (akár alany volt akár nem) egy hét után érkivilágosodás

vagy mozaik jelenik meg. A N. glutinosa növények inokulált alsó levelein két nap múlva lokális léziók tűnnek

fel. A N. glutinosa oltóvesszők csúcsi levelein nekrózisok fejlődnek ki, míg a kifejlett levelek tünetmentesek

maradnak. Ebből arra következtethetünk, hogy a vírustranszport a floemen keresztül valósul meg, valamint

láthatóvá válnak a rezisztenciában megmutatkozó különbségek is.

1.2. Mechanikai átvitel

A mechanikai átvitel a vírusok legegyszerűbb terjedési módja, amely sebzéseken keresztül történik.

Eredményessége függ a vírus környezeti hatásokkal szembeni ellenállóságától, a vírusgazdanövény adottságaitól

(inhibitorok) és a fertőzendő tesztnövény fogékonyságától. Ez utóbbit befolyásolják a külső környezeti

feltételek, a növény kora és fiziológiai állapota (Schmelzer et al., 1980; Gáborjányi, 1991; Horváth, 1993 a, b;

Jones, 1993 a, b). A növény inhibitorai a fertőzés során általában csak ahhoz a családhoz tartozó növények

esetében hatnak, amelyekhez maga az inhibitort tartalmazó növény is tartozik. Ezért ezek a gátló anyagok

inkább gazda-, mint vírusspecifikusak. A mesterséges mechanikai átvitel (inokulálás) előnye, hogy kis

koncentrációban előforduló vírusok is átvihetők a beteg növény szövetnedvével és általában könnyen

felismerhető tüneteket okoznak a tesztnövényeken. A természetes mechanikai átvitelre klasszikus példa a

dohány mozaik vírus (tobacco mosaic tobamovirus), amely a szomszédos növények leveleinek érintkezésével is

terjed. A talajművelés, ill. a növényápolás is gyakran elősegíti a vírusok terjesztését (traktorok, kaszálógépek).

Nicotiana tabacum cv. Xanthi-nc dohánynövények mechanikai inokulálása dohány mozaik vírussal

(tobacco mosaic tobamovirus)

A dohány mozaik vírus fogékony gazdanövényen (Nicotiana tabacum cv. Samsun) mozaikfoltokat, míg

rezisztens növényen (Nicotiana tabacum cv. Érdi) lokális léziókat okoz (22. ábra).

a. A mozaiktüneteket mutató N. tabacum cv. Samsun legfelső leveleiből egy gramm mennyiséget helyezzünk

dörzsmozsárba, és adjunk hozzá 2,5 ml 0,1 M Sörensen foszfát-puffert (pH 7,0). Alaposan dörzsöljük el.

b. Szórjuk be finoman karborundumporral (500 mesh = 50 µm) egy egészséges N. tabacum cv. Xanthi-nc

fertőzni kívánt leveleit. Legegyszerűbb, ha a műveletet lakkfújóval végezzük. A karborundumpor helyett

használhatunk Cellitet (kovaföld) is. Ezek az úgynevezett abrazívumok olyan szemcsés anyagok, amelyek

segítik a levélfelület felsértését. A levélfelületen keletkezett mikrosérüléseken keresztül jutnak a virionok a

levél epidermiszsejtjeibe.

c. Egyik kezünket helyezzük a levél alá, a másikba fogjunk egy sterilezett spatulát. Az üvegspatula segítségével

a levél csúcsától az alap felé közepes erősséggel, körkörös mozdulatokkal vigyük fel a vírusos szövetnedvet.

A kezünk és a levél közé helyezhetünk kivágott szűrőpapír-darabkákat is. Érdemes az inokulált leveleket

megjelölni (pl. steril műanyag szívószállal kis lyukat fúrunk a levél csúcsába).

d. Az inokulálást követő 2–3 nap múlva lokális, nekrotikus léziók jelennek meg a megjelölt leveleken.

22. ábra - A: dohány mozaik vírus (tobacco mosaic tobamovirus) tünetei Nicotiana

tabacum cv. Samsun és B: N. tabacum cv. Érdi dohánynövények levelein [Horváth

József szívessége folytán]



Megjegyzés: Mesterséges mechanikai átvitelt lehetőség szerint mindig a reggeli vagy a kora délelőtti órákban

végezzünk. A mechanikai vírusátvitelhez különböző segédeszközökre van szükség (23. ábra).

23. ábra - A vírusok mechanikai átviteléhez használatos eszközök. A: orsóprés [J.A. de

Bokx szívessége folytán]; B: 1 = gömblombik; 2 = dörzsmozsarak; 3 = üvegspatulák; 4 =

desztillált víz; 5 = műanyag jelfa; 6 = pufferoldat; 7 = mérőhenger; 8 =

karborundumszóró [Horváth József szívessége folytán]

1.2.1.

1.2.1.1.

1.2.1.1.1. Egyléziós kultúrák kialakítása

Ha tiszta, tehát azonos populációt képviselő tenyészetet szeretnénk kapni, egyetlen lézióból kell kiindulni. Az

így kapott vírusizolátumot egyléziós kultúrának nevezzük.

a. A levél felületét 2%-os NaOH-val fertőtleníteni kell.



b. Szakítsuk le egy lokális tüneteket mutató Nicotiana tabacum cv. Xanthi-nc egyik levelét, és vágjunk ki belőle

egy léziót.

c. A léziót helyezzük porcelán dörzsmozsárba és adjunk hozzá pár csepp 0,1 M Sörensen foszfát-puffert (pH

7,0). Dörzsöljük szét.

d. A kapott szövetnedvet óvatosan vigyük fel a 2–3 leveles N. tabacum cv. Xanthi-nc növény levelére.

e. Ha a levélen pár nap múlva megjelennek a tünetek, már a teljes levelet eldörzsölhetjük, és a szövetnedvet

átvihetjük egészséges dohánynövényekre.

1.2.1.1.2. Petricsésze-módszer

A módszer előnye, hogy nem kell egy teljes növényt használni a vizsgálathoz a kórokozó tesztelésekor,

elegendő hozzá a tesztnövény egyetlen levele is. Ezt a vizsgálatot Petri-csészében, nedves szűrőpapíron

végezzük (Horváth és Pocsai, 1971). A módszert lokális tüneteket okozó vírusoknál alkalmazzuk.

1.3. Vegetatív szaporítószervekkel történő vírusátvitel

Ismert, hogy továbbszaporításhoz felhasznált szervek (gumók, hagymák, rizómák stb.) – az anyanövényhez

hasonlóan – vírussal fertőződhetnek. Ezért a vegetatív úton történő növényszaporítással vírusterjedés érhető el a

leghatékonyabb vírusátvitel.

A burgonya levélsodródás vírussal (potato leafroll polerovirus) fertőzött anyanövény alól származó gumók

többnyire vírusfertőzöttek lesznek, de előfordul az is, hogy nem mindegyik gumó fertőződik, ezért ezekből

egészséges növények is kifejlődhetnek. A gumókkal átvihető burgonyavírusok súlyos gazdasági problémát

jelenthetnek a termesztésben. A vegetatív szaporítószervekkel történő átvitelben szerepet játszhat a gumón kívül

a módosult föld alatti megvastagodott szár, a rizóma, a szamóca indája vagy a tulipán hagymája. A tulipán

színtörés vírus (tulip breaking potyvirus) átvitelében és terjedésében a legnagyobb szerepe a vírusfertőzött

tulipánhagymának van.

Rügydugványteszt (Horváth, 1962)

A burgonya nyugalmi állapotát megszakító vegyi készítmények alkalmazásával lehetővé vált a rügydugványok

vizsgálata már az ültetések megkezdése előtt. Ennél a módszernél a gumók dugófúróval kivájt csíráit

virágcserepekbe ültetjük. Ha a burgonya pl. levélsodródás vírust (potato leafroll polerovirus) tartalmazott, akkor

megfigyelhető a fiatal növények leveleinek főér menti sodródása, kanalasodása. Biztosabb eredményt érhetünk

el, ha a rügyeket a gumó csúcsi részéből vesszük és azokat gibberellinnel (10–50 mg/l) kezeljük.

1.4. Maggal és pollennel történő átvitel

A maggal és pollennel történő átvitel a vírusok természetes elterjedésének gyakori lehetőségei. A maggal

történő vírusátvitel gazdaságilag nagyon jelentős problémákat okoz (Mink, 1993; Schmidt, 1994). Jelenlegi

ismereteink szerint több mint száz, maggal átvihető vírus ismert; ezek a vírusok 25 taxonómiai csoportba

(nemzetségbe) tartoznak. Öt vírusnemzetségben [alfamovirus (1) cucumovirus (4), waikavirus (1), enamovirus

(1), tospovirus (1)] 8 olyan vírus található, amelyek maggal 100%-ban átvihetők. Az összes cryptovirus [pl.

szegfű vírus 1 (carnation 1 alphacryptovirus), vöröshere vírus 2 (red clover 2 betacryptovirus)] maggal könnyen

átvihető, és eltekintve a növények vegetatív szaporításától, ez az egyetlen vírusterjedési lehetőség a fenti vírusok

esetében. A maggal terjedő vírusok mechanikailag is átvihetőek, és parenchimasejteket fertőznek. A floem-

fertőző vírusok [pl. burgonya levélsodródás vírus (potato leafroll polerovirus)] maggal nem terjednek. A

magátvitel szempontjából fontos a vírusszaporodás, -terjedés és a gazdanövény növekedésének mértéke közötti

egyensúly (Johansen et al., 1994). Befolyásoló tényező többek között a növények fiziológiai állapota, a

vírusstabilitás, a hőmérséklet, a fajta és a tárolási idő is. Ha a kórokozó a mag felületén tapad meg, külső

magátvitelről beszélünk. Ilyenkor a csíranövény a talajban, a talajrögök által ejtett apró sérülések következtében

fertőződik. Az átvitelnek ez a formája főleg stabil vírusoknál lehetséges [dohány mozaik vírus (tobacco mosaic

tobamovirus) (24A ábra)].

24. ábra - A: a dohány mozaik vírus (tobacco mosaic tobamovirus) tünetei a fertőzött

paradicsommaggal történő átvitel után Lycopersicon esculentum növények levelein; B:



bab sárga mozaik vírus (bean yellow mosaic potyvirus) tünetei Phaseolus vulgaris cv.

Red Kidney növényen [Horváth József szívessége folytán]

A belső magátvitel bonyolultabb folyamat. Feltétele – többek között – az, hogy a vírus bejuthasson a

csírakezdeménybe vagy azok sejtjeibe. A bab sárga mozaik vírus (bean yellow mosaic potyvirus) is ezzel a

módszerrel terjed (24B ábra). Ez egyes esetekben sterilitást is eredményezhet [paradicsom magtalanság vírus

(tomato aspermy cucumovirus)].

A maggal átvihető vírusok a vírusbeteg növények pollenjével is terjednek. A kontaminálódott virágpor nemcsak

az embriózsákot, hanem a magkezdeményeket is fertőzi. Ilyen kórokozó a bab közönséges mozaik vírus (bean

common mosaic potyvirus). A vírusok pollennel történő terjedésének jelentős epidemiológiai szerepe van

(Schmelzer, 1980).

1.5. Vírusátvitel a talajban

A talajban történő vírusátvitel általában gyökérrel, alacsonyabb rendű gombákkal és nematódákkal

(fonálférgekkel) történhet; ez utóbbi átvitelről a Nematódák (fonélférgek) c. alfejezetben számolunk be.

Ismeretesek azonban olyan vírusok is, amelyek talajban vektor nélkül terjednek. A jelenleg ismert 13, talajjal

terjedő vírus [pl. szegfű foltosság vírus (carnation mottle carmovirus), Chenopodium mozaik vírus (sowbane

mosaic sobemovirus), szegfű gyűrűsfoltosság vírus (carnation ringspot dianthovirus), burgonya X-vírus (potato

X potexvirus), dohány mozaik vírus (tobacco mosaic tobamovirus), paradicsom bokros törpülés vírus (tomato

bushy stunt tombusvirus)] hat vírusnemzetségbe tartozik. Az említett vírusok mindegyike nagy koncentrációban

fordul elő a növényekben, igen stabil, széles gazdanövénykörrel rendelkezik, és mechanikailag könnyen

átvihető. A növények talajból, abiotikus körülmények között történő fertőződésének mechanizmusa nem ismert.

1.5.1. Gyökérrel történő átvitel

A vírusfertőzött növény gyökere jelentős szerepet játszik néhány vírus átvitelében. Feltétele az, hogy a fertőzött

növényben a víruskoncentráció elég nagy legyen, gyökerei pedig szorosan érintkezzenek az egészséges növény



gyökereivel. Ez az átviteli lehetőség különösen nagy gondot okoz a faiskolákban [pl. alma mozaik vírus (apple

mosaic ilarvirus)], valamint a szőlőkultúrákban és a többéves hüvelyes takarmánynövények köré-ben is.

1.5.2. Alacsonyabb rendű gombákkal történő átvitel

A gyökérfertőző Olpidium gomba az egyik legismertebb vírusvektor, amely több vírus [dohány nekrózis vírus

(tobacco necrosis necrovirus), uborka nekrózis vírus (cucumber necrosis tombusvirus), saláta érvastagodás vírus

(lettuce big vein varicosavirus), dohány satnyulás vírus (tobacco stunt varicosavirus)] átvitelére képes (25.

ábra). Egy másik gomba, a Polymyxa betae a répa nekrotikus sárgaerűség vírus (beet necrotic yellow vein

benyvirus) terjesztésében vesz részt. Az árpa sárga mozaik vírust (barley yellow mosaic bymovirus) a

gabonaféléken élő Polymyxa graminis terjeszti. A Spongospora spp. a burgonya szártörpülés vírust (potato mop-

top pomovirus), míg a Pythium spp. a borsó ál-levélsodródás vírust (pea false leaf roll virus) képes átvinni

(Horváth, 1972).

25. ábra - Az Olpidium brassicae gombavektor zoosporangiumai. A: saláta törzs

(lettuce strain) vektora; B: káposzta törzs (cabbage strain) nem vektor; C: az Olpidium

spp. zoospórái [Teakle, 1967 után]

A vírusok gombaátvitelének kritériumai a következők: a) légszáraz talajban a fertőzőképesség megmaradása; b)

a jelenlevő vírus mechanikai átvitellel vagy oltással történő kimutatása; c) kapcsolat a gomba és a vírus között;

d) a gombamentes vírusfertőzött gazdanövényekről a vírussteril gomba által történő vírusfelvétel és vírusátvitel.

1.6. Vírusátvitel Cuscuta fajokkal

A Cuscuta nemzetségbe tartozó fajok levél nélküli, megnyúlt, fonalszerű szárral rendelkező gyomnövények,

amelyek klorofillban szegények, ezért más növények parazitálására kényszerülnek. Az arankafajok a száron

kifejlődő szívógyökerek (hausztórium) segítségével veszik fel a gazdanövényből a táplálékot és ezzel gyakran a

vírusokat is. A vírus átvitele rendszerint passzívan történik, a parazita növény táplálékáramlása közben. A

tápanyagok a hausztóriumokon keresztül mind a fertőzött, mind az egészséges növény edénynyaláb-



rendszeréből az aranka floemjébe jutnak, és itt keverednek egymással. Számos Cuscuta faj alkalmas az átvitelre,

de a hatékonyság fajonként különböző. Legnagyobb jelentőségűek a C. subinclusa és a C. campestris fajok

(Schmelzer, 1956; Hosford, 1967; Jones, 1993a). Mindkét faj közismert vírus-gazdanövény is. Olyan

növényekre is átvihető a vírus arankával, amelyek a szövet-inkompatibilitás miatt nem mutatják az átvitelt

oltással vagy szemzéssel. Az aranka-átvitel különösen jelentős akkor, amikor mechanikai vagy vektorátvitellel

nem érhető el eredmény [pl. orgona boszorkányseprűsödés fitoplazma (lilac witches broom phytoplasma)].

1.7. Vízzel történő vírusátvitel

Csaknem négy évtizedre nyúlnak vissza azok a vizsgálatok, amelyek alapján megállapítást nyert, hogy öntöző-

és vízleeresztő csatornák (vízfolyások) vizéből növényvírus [uborka zöldfoltosság mozaik vírus (cucumber

green mottle mosaic tobamovirus) (26A ábra)] izolálható (Van Dorst, 1961). Megállapítást nyert az is, hogy az

öntözővízben jelen lévő vírus és az uborka vírusfertőzöttsége között szoros összefüggés van (26B ábra). Az

elmúlt évtizedekben számos stabil növénypatogén vírust izoláltak folyók és tavak vizeiből (Koenig és

Lesemann, 1985; Koenig, 1986; Horváth et al., 1986; Juretiæ et al., 1986; Koenig et al., 1988), valamint

vízinövényekből (Horváth, 1994). Ezek a kutatási eredmények felvetették azt a lehetőséget – amely később

bizonyítottá vált –, hogy növények vektormentes úton (állatvektorok és/vagy talajban élő gombák nélkül),

gyökéren keresztül, vírussal kontaminálódott vízzel (pl. öntözővízzel) is fertőződhetnek. Ezáltal a víz mint

„vektor” szerepet játszik stabil vírusok átvitelében és a növények megbetegítésében (Meyer-Kahsnitz, 1993).

Ismert az is, hogy a bentonit és az agyagásványok proteineket (vírusrészecskéket) képesek adszorbeálni, és

ezáltal a növényekből a kórokozó vírusok a talajkomponensekhez adszorbeálódva víz közvetítésével további

fertőzést indukálhatnak (Gibbs és Harrison, 1976; Blanco-Sanches et al., 1986; Juretiæ és Horváth, 1991).

26. ábra - A: az uborka zöldfoltosság mozaik vírus (cucumber green mottle mosaic

tobamovirus) tünetei Cucumis sativus cv. Delicatess uborkanövényen; B: az uborka

mozaik vírus (cucumber mosaic cucumovirus) tünetei Nicotiana tabacum cv. Xanthi-nc

dohányon [Horváth József szívessége folytán]

2. Állatvektorokkal történő vírusátvitel

A vírusok terjedésének talán legjelentősebb formája az állat-, rovarvektorokkal történő átvitel. Vektoroknak

nevezzük azokat az élő szervezeteket, amelyek egyes vírusok terjesztésében közvetítő szerepet játszanak.

Legfontosabb természetes vírusvektorok a szúró-szívó és rágó szájszervű rovarok, valamint a nematódák

(fonálférgek).



2.1. Levéltetvek

A növénypatogén vírusok terjesztésének kétségtelenül legáltalánosabb és gazdaságilag legfontosabb módja a

rovarvektorokkal történő vírusátvitel (Horváth, 1972; Fritzsche et al., 1972; Harris és Maramorosch, 1980). A

Homoptera rend – amely magában foglalja többek között a levéltetveket (Aphididae) és a mezei kabócákat

(Cicadellidae) – tartalmazza a legnagyobb számú és a legjelentősebb növényi vírusvektort. A Homoptera rendbe

tartozó más családok bizonyos fajai szintén terjesztik a növénypatogén vírusokat, de sem számukban, sem

jelentőségükben nem hasonlíthatók össze a levéltetvekkel és a kabócákkal. Ezen családok közé tartoznak a

levélbolhák (Psylloidae), a molytetvek (liszteskék vagy fehérlegyek) (Aleurodoidae), a pajzstetvek (Coccoidae),

valamint a púpos kabócák (Membracidae). A növénypatogén vírusok néhány rovarvektora más rendbe tartozik,

mint pl. a poloskák (Heteroptera), a tripszek (Thysanoptera), a bogarak (Coleoptera) és a szöcskék, sáskák

(Orthoptera) (Agrios, 1988). A szúró-szívó szájszervvel rendelkező rovarokhoz képest a rágó szájszervű rovarok

vírusátvitele kisebb jelentőségű. A vírusok terjesztésében a rovarok közül a levéltetvek játsszák a legnagyobb

szerepet. Az átvitelnek négy speciális formáját ismerjük (Horváth, 1972).

2.1.1.

2.1.1.1.

2.1.1.1.1. Nem-perzisztens (stylet-borne) vírusok

A fertőzött növény szövetnedvével való táplálkozás közben vírusrészecskék tapadnak a rovar szipókájára

(styletum). Ez esetben a rovar egészséges növényre kerülve azonnal fertőzőképes lesz, nincs szükség lappangási

időre. A vektorok hamar, egy-két szívás után elveszítik vírusátviteli képességüket. A stylet-borne vírusok a

levélparenchimában lokalizálódnak, mozaikos tüneteket okoznak, és mechanikailag könnyen átvihetők. A

védekezés ellenük szinte lehetetlen, leginkább a levéltetvek számának csökkentésére korlátozódik. Erre az

átviteli módra példa a burgonya Y-vírus (potato Y potyvirus) és a zöld őszibarack levéltetű (Myzus persicae)

kapcsolata.

A vírus és a vektor alapvető tulajdonságai a következőkben foglalhatók össze: 1. a felvételi szívás után a rovar

azonnal fertőzőképes lesz, inkubációs idő nincs; 2. A forrásnövényen való táplálkozás idejének növekedésével a

vektor fertőzőképessége csökken; 3. a vírusátviteli képesség a felvételi szívást megelőző éheztetéssel növelhető;

4. a vektorok egészséges növényen való szívogatás közben fertőzőképességüket hamar elveszítik; 5. a vírusok a

vektor szipókájának csúcsi barázdáiban helyezkednek el; 6. a vírus felvételét követő vedlés a fertőzőképességet

nagymértékben csökkenti; 7. a vektor testüregébe mesterségesen bejuttatott vírussal a rovart nem lehet fertőzővé

tenni; 8. a vírusok a rovar hemolimfájából nem nyerhetők vissza; 9. a nem-perzisztens vírusoknak nincsenek

speciális vektoraik.

2.1.1.1.2. Cirkulatív (perzisztens) vírusok

Ezek a vírusok abban különböznek az előző csoporttól, hogy rendszerint a floemben vagy a xylemben

lokalizálódnak, sárgaság típusú tüneteket okoznak, és mechanikailag alig, vagy nehezen vihetők át.

Legismertebb cirkulatív vírus az árpa sárga törpülés vírus [barley yellow dwarf luteovirus (27. ábra)] és a

burgonya levélsodródás vírus (potato leafroll polerovirus), amelyek leghatékonyabban Macrosiphum (Sitobion)

avenae, Rhopalosiphum spp. és Myzus persicae levéltetűvel terjednek.

27. ábra - Levéltetűvel történő árpa sárga törpülés vírus (barley yellow dwarf

luteovirus) átvitel sematikus ábrázolása. A nyilak a cirkulatív vírusátvitel útját jelzik.

JNyM: járulékos nyálmirigy, EnyM: elsődleges nyálmirigy, KB: középbél, UB: utóbél

[A. Miller szívessége folytán]



A vírus–vektor kapcsolat főbb jellemzői: 1. a forrásnövényen való táplálkozás idejének növekedésével a vektor

fertőzőképessége nő; 2. a vírusátviteli képességet a felvételi szívás előtti éheztetés nem befolyásolja; 3. a vírus

felvétele és az első eredményes fertőzés között meghatározott idő telik el, ezalatt a vektor még fertőzésképtelen.

Az inkubációs idő addig tart, amíg a kórokozó az utóbélből a hemolimfa rendszeren keresztül a

melléknyálmirigybe jut; 4. az inkubációs idő letelte után a vektorok fertőzőképességüket sokáig, gyakran életük

végéig megőrzik; 5. a vektor fertőzőképességét a vedlés nem befolyásolja; 6. a vektor fertőzővé tehető a

testüregébe mesterségesen bejuttatott vírussal; 7. a vírus visszanyerhető a vektor hemolimfájából; 8. a cirkulatív

vírusok vektorspecifikusak (általában egy, vagy kevés vektorral rendelkeznek).

2.1.1.1.3. Szemiperzisztens vírusok

Az ide tartozó vírusok a perzisztens és a nem-perzisztens csoport közötti átmenetet képviselik. A

szemiperzisztens vírusok mechanikailag általában nem vihetők át, vagy átvitelük nehéz [répa sárgaság vírus

(beet yellows closterovirus)].

A vírus–vektor kapcsolat főbb tulajdonságai: 1. a vektor rövidebb és hosszabb felvételi szívás után is képes a

kórokozót leadni; 2. a vektor felvételi szívás előtti éheztetése a vírusátvitel eredményességét nem érinti; 3. a

vektor fertőzőképességére a vedlés nincs hatással.

2.1.1.1.4. Propagatív vírusok

Ezek a vírusok a cirkulatív vírusokhoz tartoznak, de annak legmagasabb szinten specializálódott fokát mutatják.

A propagatív név abból adódik, hogy a vektor a vírust mintegy szaporítja, vagyis „számát növeli”. A répa

nyugati sárgaság vírus (beet western yellows luteovirus) így szaporodik pl. M. persicae levéltetűben. A

propagatív vírusok nemcsak szaporodnak a vektor szervezetében, hanem gyakran a rovarokban

betegségtüneteket is okoznak. Ez esetben már nehéz eldönteni, hogy növénypatogén (fito-) vírusról, vagy

rovarpatogén (arbo-) vírusról van-e szó. Az „arbo” rövidítés az angol arthropod-borne kifejezésből származik. A

saláta nekrotikus sárgaság vírus (lettuce necrotic yellows cytorhabdovirus) például Hyperomyzus lactuce

levéltetű vektorban szaporodik. A vírus jellegzetes bacilus formájú partikulumait elektronmikroszkóppal

kimutatták a vektor izomszöveteiben, a zsírtestecskékben, az agyvelőben, a tracheákban, a nyálmirigyekben és

az emésztőcsatornában.

A vírus–vektor kapcsolat általános jellemzői a cirkulatív vírusoknál leírtakon kívül az alábbiakban foglalhatók

össze: 1. a vírus a vektor testében hosszú ideig megmarad, sőt gyakran tojásaik is fertőződnek; 2. a vírus

mechanikai úton növényről növényre átvihetetlen, de a vírussal fertőzött levéltetvek szövetnedvével az

egészséges levéltetvekbe átvihető.

2.2. Kabócák

A sárgaság típusú növénybetegségek kórokozóit (vírusok és fitoplazmák) elsősorban kabócák terjesztik

(Horváth, 1972, 1974, 1999; Fritzsche et al., 1972; Harris és Maramorosch, 1980). A fitoplazmák főképpen

virágelzöldülést, virágellevelesedést és ún. boszorkánysöprűsödést idéznek elő. Hazánkban is elterjedt a sztolbur

fitoplazma (stolbur phytoplasma), a here virágelzöldülés fitoplazma (clover phyllody phytoplasma) vagy a here

törpülés fitoplazma (clover dwarf phytoplasma) (Gáborjányi és Lönhard, 1967; Horváth, 1969, 1970, 1972,

1974).



A kabócákkal átvihető vírusok a levéltetvekkel átvihető vírusokhoz hasonlóan stylet-borne, szemiperzisztens,

cirkulatív és propagatív természetűek lehetnek. Ez a négy csoport azonban nem különül el egymástól olyan

élesen, mint a levéltetveknél. A rizs tungro szférikus vírus (rice tungro spherical waikavirus) szemiperzisztens.

A Nephotettix impicticeps kabóca az éheztetés után a vírust egy órán belül képes felvenni és leadni. Az

őszirózsa sárgaság fitoplazmát (aster yellows phytoplasma) a Macrosteles fascifrons és az Elymana virescens

kabóca (28. ábra) csak akkor tudja felvenni, ha a táplálkozási idő meghaladja a két órát. A felvett kórokozót

viszont bármilyen rövid idő alatt le tudja adni. Tipikus cirkulatív természetű a répa levélcsúcs fodrosodás vírus

(beet curly top curtovirus). Szemiperzisztens a Psammotettix alienus vektor által átvihető búza törpülés vírus

(wheat dwarf monogeminivirus). A kabóca a forrásnövényen való 5 perces tartózkodás után felveszi a vírust. A

kórokozó inkubációs ideje egy és négy nap között ingadozik. A propagatív rizs törpülés vírus (rice dwarf

phytoreovirus) a Nephotettix apicalis kabócában szaporodik. A nőstényvektorok hét generáción keresztül

képesek a vírust átvinni. Egyes nem-vektor kabócafajok inokulációs technikával fertőzöttekké tehetők, és a vírus

felszaporodása szervezetükben kimutatható. A propagatív vírusok replikációjának kezdeti helye az

emésztőcsatornában van. A vírus később kimutatható a hemolimfából, a nyálmirigyekből és a petefészekből is.

A sárgaság típusú betegségek kórokozói transzováriálisan (a rovar tojásával) is terjednek. Elsősorban a

zsírtestecskékben és a sejtmagban okoznak kóros elváltozásokat. A kabócák élettartama gyakran megrövidül.

28. ábra - Az őszirózsa sárgaság fitoplazma (aster yellows phytoplasma) kabócavektorai

A-B: Macrosteles fascifrons; C-D: Elymana virescens. Balról hátoldali, jobbról hasi

helyzetben lévő nőnemű egyedek [L.N. Chiykowski szívessége folytán]

2.3. Nematódák (fonálférgek)

A talajban élő nematódák jelentős szerepet játszanak a vírusok átvitelében (Raski és Hewitt, 1967). Mintegy 20

növényi vírust képesek átvinni a talajban élő fonálférgek. Ezeket az ektoparazitákat négy nemzetség egy vagy

több faja képviseli. A nematódákkal átvihető vírusok alapvetően két csoportba (NEPO-vírusok, NETU-vírusok)

sorolhatók (Horváth, 1972; Fritzsche et al., 1972). A Longidorus és a Xiphinema nemzetségbe tartozó fajok a

poliéder alakú NEPO-vírusok [dohány gyűrűsfoltosság vírus (tobacco ringspot nepovirus), a paradicsom

gyűrűsfoltosság vírus (tomato ringspot nepovirus), a málna gyűrűsfoltosság vírus (raspberry ringspot

nepovirus), a paradicsom fekete gyűrűs vírus (tomato black ring nepovirus), a cseresznye levélsodródás vírus

(cherry leafroll nepovirus), a rozsnok mozaik vírus (brome mosaic bromovirus), a szőlő páfránylevelűség vírus;

syn.: szőlő fertőző leromlás vírus (grapevine fanleaf nepovirus)] vektorai. A Trichodorus és a Paratrichodorus

nemzetségbe tartozó fonálférgek a hajlékony, pálcika alakú, tubuláris NETU-vírusokat képesek terjeszteni. Ilyen

a dohány rattle vírus (tobacco rattle tobravirus) és a borsó korai barnulás vírus (pea early browning tobravirus).

A talajban élő nematódák a fertőzött növény gyökerén történő táplálkozás után könnyen átvihetik a vírusokat az

egészséges növényre (Harris és Maramorosch, 1980). Nemcsak az imágó, hanem a lárva is képes az átvitelre.

Ha lerakja tojását vagy a lárva vedlik, ismét táplálkoznia kell a forrásnövényen ahhoz, hogy visszanyerje

fertőzőképességét.

2.4. Atkák

Az atkákkal átvihető vírusok terjesztésében elsősorban az Eriophyidae család egyes fajai vesznek részt. Az

atkák egyik része szabadon él, levelek fonákán szívogatnak anélkül, hogy azokon különösebb kárt okoznának.

Másik részük viszont toxikusan ható nyálával súlyos deformációkat, gubacsképződményeket idéz elő. A

gubacsatkák közül néhány faj a növénypatogén vírusok terjesztésében is jelentős szerepet játszik. Az Aceria

tulipae atka gyakran tömegesen lép fel és súlyos gubacsszerű tüneteket okoz. Részt vesz pl. a búza csíkos



mozaik vírus (wheat streak mosaic tritimovirus) terjesztésében (29. ábra). A vírus–atkavektor kapcsolatban a

vírus–tesztnövények nem okvetlenül gazdanövényei a vektornak, amint ez más vírus–vektor kapcsolatban

természetes. Az atkavektorok fejlődési stádiuma nem határozza meg vírusátvivő képességüket (Horváth, 1972).

29. ábra - A: kifejlett Aceria tulipae atkavektor sematikus rajza az emésztőcsatornával

és a petefészekkel. Fg = előbél, Mg = középbél, Hg = utóbél, Ct = fejtor, Fl = mellső

lábak, Hl = hátsó lábak, Go = ivarszerv nyílása, E = tojás, Oc = érett petesejt, Hs =

utóbél végbélszerű zsákja, As = anális tapadókorong [Paliwal és Slykhuis, 1967 után];

B: búza csíkos mozaik vírussal (wheat streak mosaic tritimovirus) fertőződött búza

levelei a fertőzöttség súlyossága sorrendjében (alulról felfelé) [J.T. Slykhuis szívessége

folytán]

2.5. Tripszek

A tripszek a Thysanoptera rendbe tartozó kozmopolita, polifág rovarok. A tripszfajok közül a Thrips tabaci és a

Frankliniella fajok a legjelentősebb vírusvektorok (30. ábra). A tripszek nyála nem fitotoxikus. A vírus átviteli

módja általában cirkulatív, de előfordul, hogy 30 perc is elég a vírus felvételére és leadására. A vírus vektorban

történő szaporodása bizonyított. A mechanikailag könnyen átvihető, bár eléggé labilis paradicsom

bronzfoltosság vírust (tomato spotted wilt tospovirus) a Thysanoptera rendbe tartozó vektorok csak

lárvastádiumban képesek felvenni. Az imágók, amelyek vírussal fertőzött lárvákból fejlődtek ki,

fertőzőképességüket életük végéig megtartják (Horváth, 1972). A paradicsom bronzfoltosság vírusnak

hazánkban két vektora ismert: a Thrips tabaci és a Frankliniella occidentalis. Ezek közül a Thrips tabaci

őshonos, a Frankliniella occidentalis behurcolt faj. Szabadföldi körülmények között a T. tabaci vektornak 4–6

nemzedéke fejlődhet ki. A kifejlett nőstény áttelel, ezért már kora tavasszal fertőző forrás lehet. Az

üvegházakban egész évben zavartalanul szaporodik, ilyenkor 10–12 nemzedéke is kifejlődik. Az Észak-



Amerikából behurcolt F. occidentalis a magyarországi körülmények között szabadföldön nem tud áttelelni.

Télen csak üvegházi és hajtatóházi növényeken marad fenn. Mindkét faj széles tápnövénykörű, és közöttük több

növényfaj a paradicsom bronzfoltosság vírusnak is gazdanövénye. A hazai vizsgálatokat üveg-házi körülmények

között végezték a szabadföldön fertőzött gyomnövényekről gyűjtött T. tabaci egyedekkel. A rovarok jelentős

mértékben átvitték a vírust Nicotiana benthamiana tesztnövényekre (Gáborjányi et al., 1993, 1994, 1995;

Jenser, 1995). A paradicsom bronzfoltosság vírus szaporodását Frankliniella fusca tripszvektorban először

1998-ban igazolták (Pappu et al., 1998).

30. ábra - Thrips tabaci, a tospovirusok vektora [K.M. Smith szívessége folytán]

2.6. Poloskák

A Miridae és Piesmidae családok közül a Piesmidae családba tartozó poloskafajok vírusátvivő szerepe ismert

jobban (Horváth, 1972). A Nabidae családba sorolható Nabis punctipennis és a Tingidae családba tartozó

Stephanitis spp. vírusátvivő képességét nem sikerült minden kétséget kizáróan megállapítani. A répa

levélgöndörödés vírus (beet leaf curl ? rhabdovirus) és a Piesma quadratum (31. ábra) levélpoloska kapcsolata

a következőképpen alakul: a Piesma quadratum a növény parenchimájában és floemjében is szívogat.

Szúrósertéi 5–10 perc alatt elérik a rostacsöveket. A répa levélgöndörödés vírus cirkulatív természetű. A vektor

lárvái felveszik a vírust, leadni azonban nem tudják. A bélfal megcsapolásával azonban minden lárvastádium

alkalmas az átvitelre. Az átte-lelt imágók nyáron sokkal jobb vírusátviteli eredményt mutatnak, mint a fiatal

utódok. Ebből a vírus vektorban történő szaporodására lehet következtetni. A vírus felvételi ideje minimum 1–2

óra, leadási ideje 40 perc körül alakul. A vírus cirkulációja 3–4 hétig is eltarthat. A vírust hordozó nőnemű

poloskák később rakják le tojásaikat, mint a vírust nem tartalmazó poloskák, és tojásprodukciójuk is kisebb.

31. ábra - Piesma quadratum a répa levélgöndörödés vírus (beet leaf curl ?

rhabdovirus) levélpoloska-vektora [G. Proeseler szívessége folytán]



2.7. Molytetvek (fehérlegyek, liszteskék)

A molytetvekkel, vagy más néven fehérlegyekkel, ill. liszteskékkel átvihető vírusok és vektoraik közötti

kapcsolatok viszonylag kevéssé ismertek. Cirkulatív vagy szemiperzisztens természetűek lehetnek. A Bemisia

tabaci az egyik legfontosabb szerepet játssza a vírusok terjesztésében. Vektora többek között a mechanikailag is

átvihető uborka érsárgulás vírusnak (cucumber vein yellowing virus). A vektorok szívás előtti éheztetése nem

befolyásolja a vírusátvitelt. A vírusfelvétel utáni éheztetés viszont rontja a vírus átvihetőségét. A vírusfelvételtől

a -leadásig tartó ciklus 60 percig tart. A paradicsom sárga levélgöndörödés vírus (tomato yellow leaf curl

bigeminivirus) és a répa álsárgaság vírus (beet pseudo yellows crinivirus) cirkulatív természetű, a kórokozó

azonban nem marad meg a vektorban annak élete végéig. A paradicsom levélgöndörödés vírus (tomato leaf curl

bigeminivirus) mechanikailag is átvihető, míg a répa álsárgaság vírus (beet pseudo yellows crinivirus) nem. Ez

utóbbi lappangási ideje a vektorban kevesebb, mint hat óra. A Trialeurodes vaporariorum (32. ábra) egy óra

alatt felveszi és ugyanennyi idő alatt át is viszi a vírust. A molytetveknél a transzováriális (tojással történő)

átvitel nem bizonyított. A nőstények alkalmasabbak az átvitelre, mint a hímek (Horváth, 1972).

32. ábra - A crinivirusok átvitelében szerepet játszó molytetvek (Trialeurodes

vaporariorum) populációja dohánylevélen [Szalay-Marzsó László szívessége folytán]



2.8. Pajzstetvek

Néhány trópusi növénypatogén vírus [kakaó duzzadt hajtás vírus (cacao swollen shoot badnavirus)]

terjesztésében fontos szerepet játszanak a Pseudococcidae családba tartozó vándorpajzstetvek. A pajzstetveknek

fontos szerepük van a szőlő levélsodródás vírus (grapevine leafroll closterovirus) terjesztésében is.

2.9. Levélbolhák

A vektorok egészen kicsiny, viszonylag jelentéktelen csoportját képviselik a levélbolhák. A körtefapusztulást

egy korábban vírusnak vélt fitoplazma (pear decline phytoplasma) okozza. A betegség csak oltással vagy a

Psylla pyricola, P. piri, P. pyrisuga levélbolhákkal terjed. A fertőzés évében a körtefák levelein mozaikosodás

jelentkezik, majd a fertőzést követő években a leveleken vörös pettyesség és hajtásnövekedés-gátlás alakul ki.

Az egészséges körtefákon táplálkozó levélbolhák körtefára telepítése vagy toxinjaik növényekbe injekciózása

nem idézett elő hasonló szimptómákat. A körtefán táplálkozó fertőzött egyedek levélhullást idéznek elő.

2.10. Aknázólegyek

A Diptera rendbe tartozó aknázólegyek (Agromyzidae) vírusátvitele a légyimágók tojócsövével történik. Két

vektor vírusterjesztő szerepe ismeretes. Az egyik a Liriomyza langei [Chenopodium mozaik vírus (sowbane

mosaic sobemovirus), dohány mozaik vírus (tobacco mosaic tobamovirus)], a másik a Phytomyza rufipes

[tarlórépa göndörödés vírus (turnip crinkle carmovirus)].

2.11. Bogarak

A Chrysomelidae családba tartozó vektoroknak lényegesen fontosabb szerepük van a vírusok átvitelében, mint a

Bruchidae és a Curculionidae családba tartozóknak. A bogarakkal átvihető vírusok tulajdonságai nagyon

hasonlóak. Viszonylag stabilak, a fertőzött növényekben magas koncentrációban vannak jelen, mechanikailag

átvihetők és erős antigén tulajdonságokkal rendelkeznek. A vektor vírusmegőrzése alapján a vírusok két

csoportba oszthatók. Az egyik csoportban a megőrzési periódus hosszú ideig (7–20 nap), a másik csoportban

csupán 24–48 óráig tart. Előbbihez tartozik a tarlórépa sárga mozaik vírus (turnip yellow mosaic tymovirus), a

tehénborsó mozaik vírus (cowpea mosaic comovirus), a tök mozaik vírus (squash mosaic comovirus), a bab déli

mozaik vírus (bean southern mosaic sobemovirus). Az utóbbihoz sorolható a tarlórépa göndörödés vírus (turnip

crinkle carmovirus), a tarlórépa rozettás vírus (turnip rosette sobemovirus) és a retek mozaik vírus (radish

mosaic comovirus) (33. ábra) (Harris és Maramorosch, 1980). A vírus–bogárvektor kapcsolat

specializáltságának legmagasabb fokát a levélbogarak és a levélbogárlárvák, valamint az általuk átvihető

vírusok képviselik (Horváth, 1972). Ezek a rovarok nem rendelkeznek működőképes nyálmirigyekkel és

nyelőcső-összeköttetéssel. Táplálkozáskor folyadékot öklendeznek ki, amely a növény nedvéből és emésztési

enzimekből áll. Ha a vírusfertőzött növényen való táplálkozás közben a kórokozó az emésztőcsatornába jut, ott

bizonyos ideig aktív állapotban megmarad. Az újabb táplálkozás során – kiöklendezéssel egészséges növényre

kerülve – fertőzést idézhet elő.

33. ábra - Retek mozaik vírussal (radish mosaic comovirus) fertőzött Brassica

campestris növény levele [Horváth József szívessége folytán]

2.12. Sáskák



Az Acrididae családba tartozó fajok közül a Melanopus differentialis játszik aktív szerepet a vírusok átvitelében.

Ez a sáska képes a burgonya X-vírus (potato X potexvirus), a dohány gyűrűsfoltosság vírus (tobacco ringspot

nepovirus) és a dohány mozaik vírus (tobacco mosaic tobamovirus) terjesztésére. A szöcskék közül a

legaktívabb vektor a Tettigonia viridissima, amely több vírus átvitelére is képes (Horváth, 1972).

2.13. Lepkék

A Pieridae családból a Pieris brassicae képes a tarlórépa sárga mozaik vírus (turnip yellow mosaic tymovirus)

és a tarlórépa göndörödés vírus (turnip crinkle carmovirus) átvitelére. Már 2 perces táplálkozás után felveszi a

vírust. A P. brassicae hernyói a dohány mozaik vírust (tobacco mosaic tobamovirus) szájszerveiken hordozzák.

A hernyók éheztetésével a vírusátvitel eredményessége csökken. A táplálkozás idejének növekedésével az

átviteli képesség szintén csökken. A dohány mozaik vírus a hernyó ürülékében is kimutatható. A dohány mozaik

vírus terjesztésében a Sphingidae és a Noctuidae család különböző fajai vesznek részt.

2.14. Ászkák

Az Oniscus asellus ászkafaj szerepet játszik az uborka mozaik vírus (cucumber mo-saic cucumovirus)

terjesztésében. A vektornak a vírus járványtanában alárendelt szerepe van.

2.15. Fülbemászók

A Forficula auricularia fülbemászófaj vektora a tarlórépa sárga mozaik vírusnak (turnip yellow mosaic

tymovirus).

2.16. Csigák

A Gastropoda rend bizonyos fajai (Lehmannia marginata, Goniodiscus rotundatus stb.) alkalmi szerepet

játszanak a dohány mozaik vírus (tobacco mosaic tobamovirus) terjesztésében.

3. A vírusátvitel módszertana

3.1. Vírusátvitel levéltetvekkel

A vírus levéltetvekkel történő átvitele nem-perzisztens, szemiperzisztens vagy perzisztens (cirkulatív) módon

lehetséges. Egy nem-perzisztens vírust tartalmazó beteg növényen a levéltetveknek optimálisan 10–60

másodpercet kell táplálkozniuk ahhoz, hogy az adott vírust felvegyék. Az ún. felvételi táplálkozás hatékonysága

jelentősen csökken, ha pár perc helyett néhány napig tart. A vírus „inokulációs“ táplálkozással közvetlenül a

felvételi szívás után átvihető. Az átvitel hatékonysága fokozatosan csökken néhány perc után, és kb. 1 óra múlva

teljesen megszűnik. A levéltetveket az egészséges növényről (tápnövényről) levéve éheztetni kell néhány óráig,

ezzel az átvitel eredményessége növelhető. Szemiperzisztens vírusoknál a felvételi táplálkozás optimuma 12–24

óra. Ezt követően 1–3 nap múlva történik meg az átvitel. Perzisztens vírusok esetén legalább félórás felvételi

szívásra van szükség, de hosszabb ideig is történhet. A táplálkozás után 1–20 napos látens periódus (inkubációs

idő) van; ezt követően a vírus átvihetővé válik. Ez a típusú átvitel akkor történik meg, ha a felvételi táplálkozás

legalább néhány órán keresztül tart.

3.1.1.

3.1.1.1.

3.1.1.1.1. A vírusmentes levéltetvek tenyésztése

A vírusok ritkán vihetők át a levéltetvek tojásával. Az újonnan kikelő levéltetvek általában vírusmentesek, ezért

egy ilyen kultúrából elindítható a tenyészet (Sylvester, 1969).

a. Tegyük egy egészséges kínaikel-palánta (Brassica pekinensis) levelét Petri-csészébe, egy kissé

megnedvesített szűrőpapírra. A kifejlett, szárnyatlan (még szárnykezdeménnyel sem rendelkező) egyedeket

finom ecset segítségével rakjuk át 1 vagy 2 levélre. Megkönnyíti a munkánkat, ha az ecsetet előtte vízbe

mártjuk. Fedjük le a Petri-csészét, és néhány óra múlva tegyük át a levéltetveket egy egészséges kínai kel

növényre.



b. A növényt helyezzük inszektáriumba (34A, B, C ábra), amelynek 3 oldalát háló határolja (20 mesh/cm),

egyet pedig üveglap zár le. Az inszektáriumnak nincs alja, de a váz alá homokkal vagy kaviccsal teli tálcát

helyezünk. Ez az inszektárium megakadályozza az állatok szökését. A szárnyas alakok kifejlődését a 16 órás

megvilágítás megakadályozza. A Myzus persicae folyamatos megvilágítást igényel, az Aphis fabae esetében

szükség van sötét periódusokra is. A vírusok átvitelének tanulmányozásához sok esetben ún. „miniatűr”

inszektáriumokat is használnak (34D, E, F ábra).

c. A levéltetvek rendkívül érzékenyek az inszekticidekre. A környezet permetezése a rovarok pusztulását vagy

fejlődésbeli visszamaradását eredményezheti. Ha mégis permeteznünk kell, használjunk olyan szert, amely

toxicitását csak pár napig őrzi meg, pl. tetraetil-pirofoszfátot.

34. ábra - A–C: szövethálóval és üvegajtóval ellátott inszektáriumok; D–F: miniatűr

levéltetű-inszektáriumok, amelyeket csíptetővel lehet a növények levelére, egy

meghatározott helyre elhelyezni [Horváth József szívessége folytán]

3.1.1.1.2. A tesztnövények felnevelése

A Myzus persicae táplálására a legalkalmasabb a retek (Raphanus sativus) és a kínai kel (Brassica pekinensis).

Ezek a növények magas páratartalmú helyiségben gyorsan csíráznak, a magvetéstől számított öt héten belül

felhasználhatók, és immunisak pl. a burgonya levélsodródás vírussal (potato leafroll polerovirus) szemben. A

gőzöléssel sterilezett és átszitált talajba ültetett magvak magas páratartalom és 27 °C hőmérséklet mellett hamar

kicsíráznak. Később elég a 20–22 °C is. Amikor az első, valódi levél eléri a sziklevelek hosszának felét, a

növények alkalmasak a fertőzésre. Célszerű hetente háromszor is magot vetni, hogy a felhasznált tesztnövények

egyforma fejlettségűek legyenek. A Physalis floridana tesztnövények kiváló vírusforrásai a Myzus persicae

levéltetveknek.

3.1.1.1.3. A nem-perzisztens és a perzisztens vírusokkal végzett tesztvizsgálat

Ebben a vizsgálatban a burgonya Y-vírus (potato Y potyvirus) és a burgonya levélsodródás vírus (potato leafroll

polerovirus) átvitelét végezzük el, a levéltetvek egy csoportjával rövid, egy másik csoportjával pedig hosszú

ideig tartó felvételi szívás esetében (Miyamoto és Miyamoto, 1966). A rövid táplálkozási idő a nem-perzisztens,

a hosszú táplálkozási idő a perzisztens módon terjedő vírusok kimutatását szolgálja. A kísérlet akkor a

legeredményesebb, ha a nem-perzisztens vírus (burgonya Y-vírus) transzmissziós képességét csak rövid ideig

(kb. 1 óra) őrzi meg, a perzisztens vírus (burgonya levélsodródás vírus) pedig még egy nap elteltével is átvihető

marad. Hogy ezt nyomon kövessük, a levéltetveket egy második tesztnövényre helyezzük át az első inokulációs

táplálkozás után.

3.1.1.1.4. Háromnapos felvételi táplálkozás munkaterve

a. Tegyünk kb. 100 db szárnyatlan levéltetvet nedves ecset segítségével egy főzőpohárba. A vizsgálat alatti

áthelyezések során bánjunk óvatosan a levéltetvekkel. Ha a levéltetvek szipókája éppen a levélbe süllyedt,

ecsettel finoman piszkáljuk meg a potrohukat, és csak azután helyezzük át. Az átvitel sikere ettől függ. A

leválasztást úgy is megkönnyíthetjük, hogy a szívogató levéltetvekre hirtelen erős fényforrást bocsátunk, és

ilyenkor szipókájukat kihúzzák a növényből (Horváth, 1963).

b. A levéltetvek felét tegyük burgonya Y-vírussal, másik felét burgonya levélsodródás vírussal fertőzött

Physalis floridana növényekre.



c. A növényeket levéltetvekkel együtt 3 napra helyezzük inszektáriumba.

d. Három nap múlva vizsgáljuk meg a beteg növényeket, és inszekticiddel pusztítsuk el a szárnyas egyedeket.

Tegyünk 5 db szárnyatlan levéltetvet a burgonya levélsodródás vírussal fertőzött növényről 1 db egészséges,

majd további 5–5 db levéltetvet 4 db egészséges P. floridana tesztnövényre. Legalább 10 másik levéltetvet

helyezzünk egy „tartalék” növényre. Ugyanezt ismételjük meg a burgonya Y-vírussal fertőzött levéltetvekkel

is.

e. Tegyük egy napra inszektáriumba valamennyi tesztnövényt.

f. A felvételi szívást követő 5. napon mindegyik levéltetvet rakjuk át új tesztnövényre. Az elpusztult vagy

szárnyassá alakult tetveket mindig a „tartalék” növényről pótoljuk.

g. Tartsuk a növényeket egy napig inszektáriumban.

h. A 6. napon ecsettel tegyük át a levéltetveket a tesztnövények utolsó sorozatára, vagy kezeljük a növényeket

inszekticiddel.

Háromperces felvételi táplálkozás munkaterve

a. Tegyünk kb. 100 db levéltetvet főzőpohárba, zárjuk le egy műanyag fedővel, és éheztessük őket naptól védett

helyen 1 óráig.

b. Öt levéltetvet helyezzünk egy burgonya levélsodródás vírussal fertőzött levélre. Nagyítóval megfigyelhetjük,

hogy az állatok táplálkoznak-e. A próbaszívás rendszerint kevesebb mint 30 másodpercig tart. Szívás közben

a szipóka merőleges a levélfelületre, a csáp pedig hátracsapva a testhez simul.

c. Három perc múlva öt levéltetvet tegyünk át egy tesztnövényre, a szondázás időtartamának figyelembevétele

nélkül.

d. Ismételjük meg a b és c pontot, és vigyük át a rovarokat még négy teszt- és egy tartalék növényre. Ha a

levelek lankadnának, frissítsük fel őket. A folytatás hasonló a burgonya Y-vírusnál leírtakhoz.

Az első tünetek 1–2 hét után láthatóvá válnak. A burgonya levélsodródás vírussal fertőzött növények erőteljesen

satnyulnak, a levelek sodródnak, sárgulnak (különösen a levél csúcsa), az erek zöldek maradnak. A burgonya Y-

vírussal megbetegített növények törpülnek az egészséges növényhez képest és mozaikos tüneteket mutatnak.

Jegyezzük fel a szimptómákat. Lehet, hogy a háromnapos és a háromperces felvételi táplálkozást követően az 5.

napon burgonya Y-vírussal fertőzött növények, valamint a háromperces táplálkozást követően az 1. és 2. napon

burgonya levélsodródás vírussal fertőzött tesztnövények mind egészségesek maradnak. A nem-perzisztens

vírusok (burgonya Y-vírus) esetében az átvitel hatékonyabb, ha a felvételi szívás három nap helyett pár percig

tart. A kérdést, hogy melyik vírus perzisztens és melyik nem, csak akkor dönthetjük el véglegesen, ha a

különböző kísérleti feljegyzéseket összevetjük egymással.

Az uborka mozaik vírus (cucumber mosaic cucumovirus) átvitele gyakran eredménytelen. Ezért fontos, hogy

figyelembe vegyük a tesztnövények korát és a vírus koncentrációját a forrásnövényben (Stimman és Swenson,

1967). Ha Cucumis sativus tesztnövényt használunk, akkor a felvételi táplálkozást követően a levéltetveket a

növény sziklevelére kell helyezni, kb. 2–3 nappal a kikelés után. Azokat a levéltetveket használjuk, amelyek 10–

15 másodpercig tartó próbaszívást végeztek a forrásnövényen.

3.1.1.1.5. Epidemiológiai vizsgálatok nem-perzisztens vírusokat terjesztő levéltetvekkel

Ha választ szeretnénk kapni arra a kérdésre, hogy egy nagyobb területen előforduló levéltetű-populáció közül

mely fajok hozhatók leginkább öszzefüggésbe egy nem-perzisztens vírus [szilva himlő vírus (plum pox

potyvirus)] természetes elterjedésével, akkor nyomon kell követnünk a szárnyas levéltetvek rajzását és a

vektorok tevékenységének intenzitását (Basky és Gáborjányi, 1994).

Az intenzív vektoraktivitás idejének tesztelése fogónövényekkel

a) A vizsgálat elvégzéséhez válasszunk ki egy szilva himlő vírussal fertőzött szilvaültetvényt.

b) Áprilistól augusztus végéig 25–25 db GF 305 őszibarackmagoncot mint fogó-, illetve tesztnövényeket

helyezzünk ki és cseréljünk egyhetes időközönként egy igen fogékony Besztercei szilvaállományban.



c) Az egyhetes expozíciós idő elteltével a növényeket tartsuk vektormentes üvegházban.

d) Két hónap után a vírusfertőzöttséget vizuálisan és DAS-ELISA módszerrel állapítsuk meg.

A szárnyas levéltetvek rajzásának regisztrálása

a) A szárnyas levéltetvek rajzását Rothamsted típusú szívócsapdával követhetjük nyomon. Ez a szívócsapda

óránként körülbelül 3000 m3 levegőt szív be, 12,2 m ma-gasságból. Ez az a magasság, amelyen a távolsági

repülés során a levéltetvek repülnek.

b) A szívócsapda által gyűjtött anyagot naponta ürítjük, jól zárható üvegekben, 75%-os alkoholban tároljuk, és

sztereomikroszkóp segítségével meghatározzuk a levéltetveket. A határozáshoz mindig kérjük szakember

segítségét. A Magyarországon leggyakrabban előforduló levéltetvek leírását és a preparátumaikról készült

fényképeket a Basky (1993) által írt határozóban találjuk meg.

3.1.1.1.6. Különböző levéltetűfajok vírusátviteli képességének vizsgálata

a. Gyűjtsünk legalább száz, ha lehet, kb. 300 db azonos fajú levéltetvet bármely fáról vagy lágy szárú növényről

(lehet zöldség- vagy gyomnövény is). Tegyük a levéltetveket lefedhető Petri-csészébe vagy hintőporba

mártott szájú főzőpohárba.

b. Kétórás éheztetés után a levéltetvekkel teli edénybe helyezzük be a forrásnövényt. Ez legtöbbször fertőzött

szilvahajtás. A vizsgálatok kimutatták, hogy mirobalánról vagy dohánynövényekről az átvitel hatékonysága

kisebb volt.

c. Ötperces felvételi táplálkozás után nedves ecset segítségével helyezzük át a szárnyatlan (még

szárnykezdeménnyel sem rendelkező) egyedeket 10 db GF 305 őszibarackmagoncra. A fejletlen lárvákat

csakúgy, mint a szárnyas alakokat, hagyjuk az edényben. Nagyítóval figyeljük a szipóka és a csápok állását.

A magoncokon három hajtást hagyjunk, és mindegyikre 10–10 levéltetű kerüljön. A próbaszívás alatt a

szipókára került vírus lehetővé teszi, hogy olyan rovarfajokat is tesztelhessünk, amelyeknek egyébként nem

gazdanövénye a szilva vagy az őszibarack.

d. Két nap elteltével a megmaradt példányokat Pirimor 50 D-vel lepermetezzük, és az akceptornövényeket

vírusmentes üvegházba szállítjuk. A vírusnak körülbelül 2–3 hónapra van szüksége ahhoz, hogy a növényben

kimutatható mértékben felszaporodjon.

e. Az inkubációs idő elteltével a növényeket DAS-ELISA-módszerrel vizsgáljuk. A vírusfertőzött és a vírussal

nem fertőződött akceptornövények aránya adja meg az adott faj százalékban kifejezett vektorhatékonyságát.

3.1.1.1.7. Membránhártyán keresztül történő mesterséges táplálás

Kunkel (1977) egy olyan módszert tökéletesített, amely különböző levéltetvek mesterséges táplálását szolgálja.

Ennél az eljárásnál egy membránhártyán keresztül kínáljuk fel a tápanyagokat a rovaroknak. Az aszeptikus

tasakokat két parafilm szembefordításával és felgöngyölítésével kapjuk. A parafilmből létrehozott membrán

előnye, hogy könnyen megformázható, továbbá szivárgásmentes, mert a kifeszített darabok szorosan egymáshoz

tapadnak. Tárolásuk mélyhűtőben egyszerűen megoldható.

Ha aszeptikus hártyákat akarunk készíteni, a parafilmdarabkákat UV-fénnyel kell besugározni. Ezért

szükségünk van egy kellően felszerelt szobára. A táplálék oldatának megszűrésére mikrobiológiai szűrőt

használunk. Kunkel (1977) a Millipore R-rendszert alkalmazta, amely egy fecskendőre szerelt szűrőrendszerből

áll.

3.1.1.1.8. Az aszeptikus hártyák elkészítése

a. Előzőleg vágjunk le kémcsőből vagy 2,6 cm átmérőjű műanyag csőből olyan darabokat, hogy gyűrű, illetve

henger alakú csöveket kapjunk. Az üveg, ill. műanyag széleit csiszoljuk le, hogy megelőzzük a film

megsérülését.

b. Parafilmből vágjunk ki négyzeteket. Ezeket szétterítjük egy edény vagy egy kesztyűsdoboz aljába, és 1–2

órán keresztül besugározzuk. Az expozíciós idő befolyásolja a parafilm fizikai tulajdonságait. Ha túl hosszú

ideig tesszük ki az UV-sugaraknak, a parafilm később a kinyújtás közben könnyen elszakad.



c. Készítsük elő a fertőtlenített fecskendőt (kb. 20 ml) és néhány hengert. Vegyük ki a mélyhűtőből a táplálékul

szolgáló oldatot.

d. A két óra leteltével helyezzük a parafilmnégyzeteket a munkaasztalra, és miután feltöltöttük a fecskendőt,

tegyük rá a szűrőrendszert.

e. Vonjuk be a hengereket a parafilmmel a 35. ábra szerint. A két négyzetlap szembefordított oldalai sterilek. A

filmek keresztirányú meghúzásával egyenletes vastagságú, vékony hártyákat kapunk. Vigyázzunk, hogy a

kihúzás közben a membrán középső részét ne érintsük.

35. ábra - A membránhártyák elkészítésének folyamata. 1. a gyűrű oldalról, ill. felülről;

2. a gyűrűre ráfeszítjük az első parafilmet (P1); 3–4. a kifeszített hártyára

rácseppentjük a táplálékot; 5. kifeszítjük a második parafilmet (P2); 6. a P2 parafilmet

ráhelyezzük az első parafilm tetejére; 7–8. a két filmet összeszorítjuk és széleiket

feltekerjük; 9. az elkészült membránhártya [Kunkel, 1977 után]

3.1.1.1.9. Mini-inszektáriumok készítése az átvitelekhez

a. A csövekből levágott gyűrűkből készíthetők el azok a kis üveg- vagy műanyag inszektáriumok, melyek a

levéltetvek táplálkozásának helyei. Fontos, hogy a hengerek és a gyűrűk átmérője azonos legyen, mert az

elkészült membránhártyákra így tudnak tökéletesen illeszkedni.

b. Ezek a mini-inszektáriumok többféle úton állíthatók elő (36. ábra). Az egyszerű gyűrűk és a választásos

kamrák alja nejlon fátyolszövet. Ezt hozzáragasztjuk egy mikroszkóp-tárgylemezhez erősített parafadugó

tetejéhez. A választásos kamra keresztirányú darabja üveglapból van kivágva és parafilmmel beragasztva. Ez

olyan szorosan zárja el a két oldalt egymástól, mint egy pecsét.

c. Az elkészült inszektáriumba helyezzük be a levéltetveket.

36. ábra - A gyűrűk összeállításának módozatai (a 35. ábra folytatása). 9. az elkészült

membránhártya; 10. a gyűrű oldalról, ill. felülről; 11. gyűrű a hártyával. Az egyszerű

gyűrűk (12–13.) és a választásos kamrák (15–16.) alja nejlon fátyolszövet, amelyet

mikroszkóp tárgylemezéhez erősített parafadugóhoz ragasztunk. A választásos kamra

keresztirányú darabja (14.) üveglapból van kivágva és parafilmmel beragasztva

[Kunkel, 1977 után]



Helper komponens (HC) jelenlétének kimutatása

A potyvirusok közül a burgonya Y-vírus (potato Y potyvirus) nem-perzisztens módon terjed. Nem tudjuk

azonban, hogy a levéltetvek szipókájának pontosan mely részéhez tapad a kórokozó és miért csak bizonyos

levéltetűfajok képesek az átvitelre. Govier és Kassanis (1974) előzetes megfigyelései hasonló

membránhártyákon történtek, mint amilyeneket az előzőekben leírtunk. Ezeknek a mesterségesen előállított

hártyáknak az az előnyük, hogy a bennük lévő folyadék tetszés szerint változtatható. Govier és Kassanis (1974)

burgonya Y-vírussal fertőzött növények különböző módon előkészített kivonatait töltötték a tasakokba. A

levéltetvek (Myzus persicae) rövid ideig táplálkozhattak a membránokon, majd a tesztnövényekre kerültek.

Amikor a levéltetvek frissen készített növényi extraktumot kaptak, a tesztnövények 3/4 része fertőződött. Ha ezt

a kivonatot egy napon keresztül 4 °C-on vagy pár órán át 20 °C-on tartották, az átvitel néhány esetben

pozitívnak bizonyult. Ha csak a tisztított vírussal próbálkoztak, az átvitel eredménytelen maradt akkor is, ha a

fertőzött növény nagy mennyiségben tartalmazott burgonya Y-vírust. Ha azonban a tisztított vírust

összekeverték a tisztítás során keletkezett felülúszóval (szupernatáns), a tesztnövények (Nicotiana tabacum cv.

White Burley) többségén betegségtünetek jelentek meg. A felülúszó önmagában szintén nem volt alkalmas arra,

hogy az átvitel megvalósuljon. A kérdés az, hogy vajon a vírus változik-e meg a tisztítás alatt, vagy van egy

vírusidegen komponens, amely a tisztítás során a felülúszóba kerül. A 8. táblázat mutatja az elvégzett vizsgálat

eredményét.

8. táblázat - A burgonya Y-vírus (potato Y potyvirus) átvitele levéltetvekkel (Govier és

Kassanis, 1974 után)

Vírus Ismétlés1

1. 2. 3.

Tisztított vírus 0/10 0/8 0/8

Tisztított vírus + felülúszó a fertőzött

növényből 10/10 7/8 8/8

Tisztított vírus + felülúszó az

egészséges növényből – – 0/8



Felülúszó a fertőzött növényből 0/10 0/8 0/8

1 A számlálóban a megfertőződött növények, a nevezőben a tesztnövények vannak feltüntetve.

A helper komponens (HC) kimutatásának eredeti módszere (Govier és Kassanis, 1974)

a. Mielőtt a levéltetvek (Myzus persicae) a membránon keresztül táplálkozni kezdenének, minden tisztított

extraktumhoz szaharózoldatot adunk (20 w/v%). Húsz perc múlva 10 db levéltetvet helyezünk mindegyik

tesztnövényre (Nicotiana tabacum cv. White Burley).

b. Az extrahálás folyamán a leveleket 0,1 M ammonium-acetátot (pH 7,0), 0,02 M EDTA-t és 0,02 M Na-

DIECA-t tartalmazó oldatba mártjuk és vákuum segítségével a folyadékkal átitatjuk. Ezután a leveleket

dörzsmozsárban szétdörzsöljük és muszlinon átnyomkodva leszűrjük. A megszűrt oldatot 20 percig 2,5%

Triton X-100-al rázatjuk, majd kétszer centrifugáljuk (90 perc, 100 000 g). A csapadékot 0,01 M borát-

pufferben (pH 8,0) oldjuk vissza úgy, hogy a végső koncentrációt 1 mg/ml-re állítjuk be.

c. A burgonya Y-vírussal fertőzött növények kivonatának centrifugálása során (90 perc, 100 000 g) keletkezett

felülúszó bizonyult fertőzőképesnek.

d. Ha a tisztított vírust és a felülúszót együtt vizsgáljuk, akkor 0,5 ml vírushoz 1 ml szupernatánst adjunk.

A burgonya Y-vírus levéltetvekkel történő átviteléhez tehát szükséges egy olyan komponens, amely jóval

kisebb, mint a víruspartikulum. E komponens eredetét további vizsgálatokkal próbálták kideríteni (Govier et al.,

1977). A vizsgálat hasonlóképpen történt, mint azt korábban leírtuk. A különbség csak annyi, hogy a

szaharózoldatot (20 w/v%) nem az extraktumhoz keverjük, hanem külön membránon kínáljuk fel (5 vagy 20

percig) a levéltetveknek (9. táblázat).

9. táblázat - Burgonya Y-vírus (potato Y potyvirus) és helper komponens átvitelek

levéltetvekkel (Govier és Kassanis, 1974 után)

Vírus Ismétlés1

1. 2.

Helper + vírus/5 perc táplálkozás

szaharózon 8/8 8/8

Helper/5 perc táplálkozás

szaharózon/vírus 8/8 7/8

Helper/20 perc táplálkozás

szaharózon/vírus – 3/8

Helper/vírus 8/8 7/8

1 A számlálóban a megfertőződött növények, a nevezőben a tesztnövények vannak feltüntetve.

Azt a komponenst, amely elősegíti a burgonya Y-vírus átvitelét, a szerzők segítő (helper) komponensnek (HC)

nevezték. Az eredmények szerint a levéltetvek akkor voltak képesek a burgonya Y-vírus felvételére és

átvitelére, ha előzőleg HC-t tartalmazó preparátumon szívogattak. Abban az esetben, ha sokáig (20 perc)

hagyták a rovarokat a szaharózoldatból táplálkozni, az átvitel hatékonysága jelentősen romlott.

A helper komponens (HC) kimutatásának újabb módszere (Wang et al., 1998)

Wang et al. (1998) négy levéltetűfaj potyvirus átviteli képességét vizsgálták. A levéltetvek táplálkozását, vagyis

a vírus megszerzésének folyamatát elektronikus monitoringgal követték nyomon, amellyel kiderítették, hogy a

különböző átviteli eredmények a levéltetvek eltérő táplálkozási magatartásából adódtak. A vírus szipókában

való megmaradását 125I-izotóppal jelölt virionokkal figyelték meg. Az eredmények azt mutatták, hogy a



különböző levéltetűfajok tápcsatornájának alkotóelemei más-más kölcsönhatásba lépnek a potyvirusokkal, és ez

okozza az átvitelben megmutatkozó eltéréseket. Végül homológ és heterológ potyvirusok segítségével

kimutatták a segítő komponens meghatározó szerepét a vírusátvitelben.

A vizsgálathoz olyan levéltetűfajokat kell választani, amelyek ismert potyvirus vektorok (pl. Myzus persicae,

Aphis gossypii), illetve olyanokat, amelyek átviteli képessége a vírustól függően változik (pl. Lypaphis erysimi,

Myzus ascalonicus). A M. persicae és L. erysimi fajokat Brassica, az A. gossypii fajokat Cucumis, míg a M.

ascalonicus vektorokat Allium ascalonicum növényeken lehet fenntartani. A vizsgálatokban a szárnyas

egyedeket és a lárvaállapotú nimfákat lehet felhasználni.

3.1.1.1.10. A szívószájszerv (szipóka, stylet) aktivitásának kimutatása elektronikus jelekkel

a. A M. persicae és a L. erysimi levéltetveket óvatosan Petri-csészébe helyezzük, és szobahőmérsékleten (23–26

°C) 1–3 órát éheztetjük.

b. A M. ascalonicus egyedeket 24–26 órán át éheztetni kell.

c. A levéltetvekhez finom vezetőképes elektródot (3 cm hosszú, 20 μm átmérőjű) kell ragasztani, amelyet egy

EPG-vel (Electrical Penetration Graph) kötünk össze.

d. A másik elektródot egy cserepes, 2–3 leveles dohány tesztnövény földjéhez csatlakoztatjuk, amelyre alacsony

feszültségű egyenáramot kapcsolunk.

e. Amikor a rovarok szívó szájszervüket a levél epidermiszébe helyezik, záródik az áramkör, és ez jel

formájában megjelenik a monitoron.

f. Az elemzéshez a STYLET 2.0 programot kell alkalmazni (Tjallingii és Mayoral, 1992).

A vírus és a helper komponens (HC) tisztítása

a. A dohány karcolatos vírus (tobacco etch potyvirus) levéltetvekkel könnyen átvihető törzsének tisztítását

Murphy et al. (1990) alapján végezzük.

b. A tarlórépa mozaik vírus (turnip mosaic potyvirus) levéltetvekkel átvihető izolátumának tisztítására Murphy

et al. (1990), valamint Sako (1980) módszere nyújt útmutatást.

c. Mivel a dohány karcolatos vírus tisztított HC-je nem mutat eredményt az átvitelek során, ezért ezt a vírust a

burgonya Y-vírus (potato Y potyvirus) HC-jével lehet a levéltetvek számára felvehetővé tenni. A burgonya

Y-vírus HC-jének tisztítását Thornbury et al. (1985) szerint végezzük.

d. A tarlórépa mozaik vírus (turnip mosaic potyvirus) HC-jének tisztítása Sako és Ogata (1981) módszerének

kis módosításával történik (lásd e–l pontok).

e. A fertőzött tarlórépalevelek 50 g-ját 100 ml K-foszfátpufferrel homogenizáljuk (pH 8,5) és 15 percig 8000 g

fordulaton centrifugáljuk.

f. A felülúszót egy órán keresztül centrifugáljuk (120 000 g).

g. A felülúszóhoz (NH4)2SO4-ot adunk a 18%-os telítettség eléréséig és 4 °C-on 10 percig keverjük.

h. A kapott oldatot 20 percig jégen, keverés nélkül inkubáljuk.

i. Az inkubálás után 15 percig centrifugáljuk (8000 g) az oldatot.

j. A csapadékot 20 ml 0,02 M K-foszfát-pufferben (pH 7,5) feloldjuk és 10 percig 5000 g fordulaton

centrifugáljuk.

k. A felülúszóhoz annyi cukrot adunk, hogy a végső koncentrációban az oldat 20%-os legyen.

l. Az oldatot maradék nélkül szétosztjuk és –20 °C-on fagyasztjuk.



m. A HC-preparátumok aktivitását a 100 g/ml tisztított vírushoz (dohány karcolatos vírus, tarlórépa mozaik

vírus) adott különböző mennyiségű HC-oldatok elegyével teszteljük. A további vizsgálatokhoz azokat az

elegyeket használjuk fel, amelyek a M. persicae vektorral 100%-os átvitelt mutatnak (Pirone, 1981).

n. A virionok radioaktív jódozását Wang et al. (1996) módszere alapján végezzük (lásd o–q pontok).

o. 200 μl tisztított viriont (3,5 g/l) helyezünk el egy erre a célra alkalmas IODO-GEN jódozócsőbe, és 10 percig

1 mCi Na125I-izotóppal reagáltatjuk.

p. A be nem épült Na125I-izotópokat a radioaktív virionoktól Sephadex G-25-oszlopon különítjük el.

q. A vírus koncentrációját spektrofotométerrel határozzuk meg. A jelölés akkor jó, ha a vírus aktivitása 2640–

4200 beütés per perc/nanogram (drive per minute/nanogram, d.p.m./ng) (dohány karcolatos vírus), ill. 1140–

1780 d.p.m./ng (tarlórépa mozaik vírus) közé esik. Ezt gammaszámlálóval kell mérni.

3.1.1.1.11. A vírusátvitel általános menete

a. A szárnyas levéltetveket üvegfiolákban tartjuk, és a felvételi táplálkozás előtt 2–3 órát éheztetjük.

b. A dohány karcolatos vírust dohánynövényről dohánynövényre, a tarlórépa mozaik vírust tarlórépanövényről

tarlórépanövényre visszük át.

c. A felvételi táplálkozást sztereomikroszkóp alatt követjük nyomon.

d. A levéltetvek 20–30 másodpercig táplálkoznak a fertőzött növényeken, azután egy éjszakára áthelyezzük

őket a tesztnövényekre.

e. Ha a rovarok táplálkozását nem kísérjük figyelemmel, akkor 10 percig hagyjuk őket a fertőzött növényeken,

és ezután helyezzük át a tesztnövényekre, ahol egy éjszakán át maradnak.

f. Ezt követően inszekticiddel elpusztítjuk a levéltetveket.

g. A növények szimptomatológiai megfigyelését végezzük rendszeresen.

h. A 125I-izotóppal jelölt vírus felvételét mini-inszektáriumokban, membránhártyákon keresztül lehet

megfigyelni.

i. A membrántasakokba 100 vagy 200 g/ml homológ vagy heterológ jelölt vírus kerül.

j. Az éheztetett levéltetvek 10 percig táplálkozhatnak. A felvételi táplálkozást befejező levéltetveket

tesztnövényekre helyezzük.

k. A rovarok szívogatását sztereomikroszkóppal figyeljük meg.

l. Kontrollként olyan jelöletlen dohány karcolatos vírust használunk, amely a burgonya Y-vírus HC-jét

tartalmazza.

m. A radioaktivitást folyadékszcintillációs számlálóval mérjük.

3.1.1.1.12. Az átviteli eredmények

A levéltetvek táplálkozása, vagyis a szívás folyamata három fázisra bontható: (1) az epidermisz (vagy membrán)

átszúrása, (2) a szívó szájszerv (szipóka, stylet) levélszövetben tartása és (3) a szipóka visszahúzása a

levélszövetből. A szívás időtartama (második fázis) a Myzus persicae, a M. ascalonicus és a Lipaphis erysimi

fajoknál – a vizsgálatok szerint – 3–11 másodperc között változott, szignifikáns különbség a vektorok között

nem mutatható ki (Wang et al., 1998).

Az elektronikus jelek feljegyzése szerint csak a második fázis szubfázisai (2/1, 2/2, 2/3) között tapasztalhatók

időtartam- és frekvenciabeli különbségek. Valószínű, hogy a 2/1 szubfázis a nem-perzisztens vírusok

inokulációjával, a 2/3 szubfázis a vírus megszerzésével függ össze.



A M. persicae és az Aphis gossypii levéltetűvektorok hatékonyak a dohány karcolatos vírus és a tarlórépa

mozaik vírus átvitelében. A L. erysimi csak a tarlórépa mozaik vírus átvitelére képes, míg a M. ascalonicus vagy

nem képes ezeket a vírusokat átvinni, vagy csak rendkívül kis hatékonysággal.

A vírus megtartásának folyamata jól nyomon követhető a 125I-izotóppal. A levéltetvek testében mért

radioaktivitás erősségében azonban nem mutatható ki különbség az egyes fajok között.

A vírust sikeresen kimutatták a levelekből, ha a rovarok a membránokon keresztül megszerezhették a HC-t

tartalmazó homológ vírust. Ha a membránokon keresztül történő etetéskor a heterológ vírussal (burgonya Y-

vírus HC-jét tartalmazó dohány karcolatos vírus, tarlórépa mozaik vírus HC-jét tartalmazó dohány karcolatos

vírus, burgonya Y-vírus HC-jét tartalmazó tarlórépa mozaik vírus) vehették fel a HC-t, a M. persicae levéltetű

nagy, a M. ascalonicus alacsony hatékonyságú vektornak bizonyult. A L. erysimi azonban eredményesen átvitte

a dohány karcolatos vírust, ha az tartalmazta a tarlórépa mozaik vírus HC-jét. Az A. gossypii vektor alacsony

átviteli képességet mutatott mindkét vírus esetén, ha azok a tarlórépa mozaik vírus HC-jét tartalmazták. Ezek az

eredmények egyértelműen bizonyítják a HC vírusátvitelben játszott kiemelkedő szerepét.

3.2. Vírus-, illetve fitoplazma-átvitel kabócákkal

A kabócákkal átvihető vírusok és fitoplazmák legnagyobb része csak hosszú inkubációs idő után vihető át

vektorokkal. A vírusok (és a fitoplazmák), valamint a kabócák közötti kapcsolat jellemzését célzó vizsgálatok

munka- és időigényesek. Ennélfogva fontos a megfelelő felszerelés beszerzése: inszektáriumok, fényforrások és

a növények egyenletes növekedésének biztosítása (Horváth, 1972).

3.2.1.

3.2.1.1.

3.2.1.1.1. A kabócák tenyésztése

Az 1–5 lárvastádiumú Euscelis plebejus kabócák táplálására a Faba vulgaris, az ötödik stádiumtól a Bromus

inermis növények a legalkalmasabbak (Musil, 1965). A Bromus növények előnye a Faba vulgaris növénnyel

szemben az, hogy a nőstények előszeretettel rakják levelére a tojásaikat, valamint hogy nem fogékonyak a

sárgaság típusú betegségekre. A tápnövényeket 7–10 naponta cseréljük frissre. A lárvák fejlődése fehérhere

növényeken meggyorsítható. Nyáron a kabócák szaporodása folyamatos. Télen a lárvák nyugalomba vonulnak,

erre a 0 – mínusz 5 °C a legmegfelelőbb (Horváth, 1972). Ha aszeptikus, azaz kórokozóktól mentes

környezetben szeretnénk felnevelni a rovarokat, akkor Mitsuhashi és Maramorosch (1963) szerint kell

eljárnunk:

a. A kabócatojásokat mikroszkóp alatt óvatosan, tű segítségével kivágjuk a levélből. A tojásokat ezután

viaszpapírcsíkokra erősítjük. A papírcsíkokat előzőleg 3 percig 0,1%-os Hiamin 2389-oldattal fertőtlenítjük.

b. A sterilezett tojásokat agar táptalajon felnevelt növényeket tartalmazó üvegpalackokba rakjuk. A nimfák

néhány nap alatt kikelnek a tojásból és a növényekre másznak.

c. 30 °C-on 16 órás megvilágítás mellett kifejlődnek az imágók, amelyeket újabb steril növényeket tartalmazó

üvegbe rakunk át. Itt párosodnak és lerakják tojásaikat.

d. A felesleges pára elszívására akasszunk kis szilikagéllel töltött zsákokat az üvegedénybe.

3.2.1.1.2. Steril növények termesztése

A steril növények termesztésének alapja a növényi magvak fertőtlenítése. Ezt egyperces etilalkoholos (70%),

majd 5 perces Hiamin 2389- (0,1%) oldatos, végül újra etilalkoholos (70%) mosással érhetjük el. Közben

mindig steril desztillált vízzel öblítsünk. A magvakat (rozs, árpa, kukorica, lucerna, saláta, hagyma, sárgarépa,

bíborhere stb.) Hoagland- és Knop-oldatot (Hoagland és Arnon, 1950) tartalmazó agar táptalajba helyezzük. A

kikelt csíranövényeket tenyész-kémcsövekben, 25 °C-on, hosszúnappalos megvilágítás alatt tartjuk. A Dalbulus

maidis a kukoricanövényeken, az Agallia constricta a lucernán és a bíborherén tenyészthető a

legeredményesebben. A Macrosteles fascifrons kabócák sárgarépa-szövetkultúrákon néhány hétig életben

tarthatók.

Here virágelzöldülés fitoplazma (clover phyllody phytoplasma) átvitele kabócával



A kapcsolódó kísérletet a here virágelzöldülés fitoplazmával (clover phyllody phytoplasma) végezhetjük el

Euscelis plebejus vektor segítségével, Trifolium pratense gazda-, ill. tesztnövényen (Peterson, 1953). A

kabócákat inszektáriumban tartjuk fenn, a rács mérete 50 mesh. A nimfákat ecset segítségével helyezzük át. A

kifejlett kabócákat a 37. ábrán látható „szívókészülékkel” fogjuk, és kémcsőbe gyűjtjük. Óvatosan helyezzünk

finom nejlonszűrőt az üvegcső nyílásához, hogy megakadályozzuk a kabócák kiszívását. Ha szükséges, a

rovarokat immobilizálhatjuk úgy, hogy pár másodpercig belefújunk a csőbe. A kabócák a kis lyukon keresztül

vihetők át egy másik növényre. Két napig tartó felvételi szívás után kb. 30 napnak kell eltelnie ahhoz, hogy a

kórokozó átvihető legyen a tesztnövényre. Az eredményes fertőzést követő inkubációs idő elteltével figyeljük az

indikátornövényeken megjelenő, betegségre utaló tüneteket.

37. ábra - A kifejlett kabócák gyűjtésére alkalmas szívókészülék [Washio et al., 1968

után módosítva Noordam (1973) után]

3.3. Vírusátvitel nematódákkal (fonálférgekkel)

A szárazföldi fajok gyűjtéséhez nagyon kevés és egyszerű eszközre van szükség (néhány doboz vagy zacskó és

kézi ásó). Nematódák mindenféle talajban élnek, amelyen növényzetet találunk. A fonálféreg-fauna 90%-a a

földfelszín 5–30 cm-es rétegében található, ezért felesleges mélyebbre ásni. Ha a begyűjtött állatokkal átviteli

vizsgálatokat végzünk, akkor fontos, hogy minél több példány életben maradjon. Ezért ügyelni kell arra, hogy a

dobozba vagy zacskóba gyűjtött földet ne tömörítsük, és minél gyorsabban a laboratóriumba szállítsuk. Ha erre

nincs mód, tegyük az anyagot pár napig hűtőszekrénybe.

3.3.1.

3.3.1.1.

3.3.1.1.1. A vírus talajban való jelenlétének bizonyítása teszt- (vagy csalogató) növényekkel

A begyűjtött földet tegyük olyan virágcserépbe, amelyben a tesztnövénypalántákat felnevelhetjük. Tekintettel

arra, hogy a fonálférgek élettartama és aktivitása (különösen a Xiphinema és Longidorus fajok), valamint a

vírusátvitel eredményessége a talaj nedvességétől függ, így a kísérleti növények talajának folyamatos vízellátása

nagyon fontos. Ezért ajánlatos műanyag cserepet használni. Ültessük el a „csalogató” növényeket a cserépbe.

A nematódák izolálása talajból és a tesztnövények inokulálása nematódákkal

Ha a laboratóriumba vitt minta friss és abban az állatok még élnek, akkor a fonálférgek kinyerését azok aktív

mozgására alapozzuk. Kétféle futtatás általános: a tölcséres és a tálcás. A tölcséres módszert Baermann-féle

futtatásnak is nevezzük.

Baermann-féle futtatás (Andrássy és Farkas, 1988)



a. Egy üveg- vagy műanyag tölcsért állványra rögzítünk, a végére rövid gumicsövet húzunk és azt

pillanatszorítóval leszorítjuk.

b. A tölcsérbe 1,5 mm lyukbőségű fém- vagy műanyag hálót, szitát vagy teaszűrőt helyezünk. Ebben van a

kifuttatandó anyag.

c. Ha nem talajból, hanem növényről akarunk fonálférgeket nyerni, akkor a fertőzött növény gyökerét vagy a

föld feletti részét daraboljuk fel és kevés vízzel turmixoljuk öszsze.

d. Az alul elzárt tölcsérbe – lehetőleg a szita mellett – töltsünk annyi vizet, hogy az a mintát 1–2 cm-nyire

ellepje.

e. A mintában lévő fonálférgek aktív mozgásuk következtében kiszabadulnak a talaj- vagy a növényrészecskék

közül és a víznél nagyobb fajsúlyuk miatt lesüllyednek. Kb. 12 óra elég ahhoz, hogy a nematódák

összegyűljenek a gumicsőben a szorító felett.

f. Kinyitjuk a szorítót és a víz kis részét óraüvegbe vagy Petri-csészébe engedjük.

Tálcás futtatás (Andrássy és Farkas, 1988)

A tálcás futtatás elve is az állatok aktív mozgásán alapszik. Ezt a módszert akkor alkalmazzuk, ha egyszerre

nagyobb mennyiségű állatot akarunk kinyerni.

a) Egy lapos, 0,5–1 mm lyukbőségű szitába durva szövésű vászondarabot, gézt vagy vattát helyezünk.

b) Ezen szétterítjük a vizsgálandó anyagot.

c) A szitát lábakra állítva tálcára tesszük, majd annyi vizet töltünk rá, hogy a mintát ellepje.

d) Pár óra állás után a nematódák a tálcába kerülnek.

e) Meggyorsíthatjuk a futtatást, ha a szitát fölülről lámpával melegítjük. Ekkor a száradó anyagot a fonálférgek

igyekeznek minél gyorsabban elhagyni, ezáltal az alsó, nedvesebb régiók felé mozognak.

f) A tálcában lévő vizet ezután a benne lévő nematódákkal üveghengerbe töltjük, és kb. 10 perces várakozás

után a fölösleges vizet leöntve összegyűjtjük az állatokat.

g) A hengerben lévő vizet planktonhálón is átönthetjük, és a hálóban fennakadt állatokat Petri-csészébe mossuk.

Seinhorst (1956) két módszert írt le a fonálférgek izolálására, amely a fajok különböző méretéből adódik.

Első módszer: Trichodorus fajok izolálása

a. Mérjünk ki 500 g talajmintát (ha nagy a nematódák száma, elég 250 g is).

b. Tegyük a talajt 2 mm-es lyukátmérőjű, félgömb alakú szűrőbe, amelyet egy tölcsérben helyeztünk el. A

tölcsér nyílását dugóval zárjuk el. Helyezzük a tölcsért egy lombikba (38. ábra).

c. Öntsünk a tölcsérbe annyi vizet, hogy a mintát ellepje.

d. Ha a talaj agyagos, adjunk hozzá egy teáskanál nátrium-oxalátot vagy „Calgont”, és óvatosan keverjük össze.

e. A keverő segítségével tördeljük a földet kicsi, 1 cm-es darabokra.

f. Mozgassuk a szűrőt fel és le, hogy a talaj átjuthasson a lyukakon.

g. A madzag segítségével húzzuk ki a dugót a tölcsérből, és mossuk a földet a lombikba, majd ezt követően

töltsük tele vízzel.

h. Erősítsünk a lombikra kis műanyag tölcsért, és zárjuk le dugóval.

i. Fordítsuk meg a lombikot néhányszor oda-vissza.



j. Helyezzük a lombikot fejjel lefelé egy vízzel telt főzőpohárba, és húzzuk ki a dugót a vízben. Mindezt olyan

gyorsan végezzük, amennyire csak lehet. Előzetesen próbáljuk ki, hogy a dugót elég gyorsan ki tudjuk-e

húzni, és hogy a lombikot elég jól tartja-e az állvány (39. ábra).

k. 12–15 perc után újra visszahelyezzük a dugót, és a felső lombikot visszafordítjuk. Eltávolítjuk a tölcsért, és

tartalmát tartályba ürítjük. A 12–15 perces időtartam alatt a homok és más részecskék lefelé, míg a víz felfelé

áramlik. Ez a felfelé áramlás akadályozza meg a Trichodorus (és más kisebb nematóda fajok) leülepedését. A

nagyobb Xiphinema fajoknak ez az áramlás túl lassú, ezért átkerülnek az alsó edénybe.

l. Ha szükséges, a h és k lépéseket újra megismételhetjük a főzőpohár tartalmával.

m. Öntsük át a tartály tartalmát 0,1 mm-es szűrőn keresztül egy másik tartályba.

n. Mossuk át a szűrőt gyorsan és finoman a második tartályba.

o. A szűrőn ragadt maradékot kis főzőpohárba öblítjük.

p. Az m és n lépést megismételhetjük a második tartály tartalmával. Nagyon hatékony a visszanyerés, ha a

szuszpenziót legalább ötször átszűrjük, de kétszeri szűrés általában elegendő.

q. Öntsük az o pontban összegyűjtött anyagot 0,05 mm-es lyukátmérőjű szűrőbe. Helyezzük a szűrőt

alátámasztva egy Petri-csészébe, és csak annyi vizet adjunk hozzá, hogy benedvesedjen, de a víz ne lepje el.

r. 4–24 óra múlva ellenőrizzük a Petri-csésze tartalmát sztereomikroszkóppal (nagyítás 40×-es), és helyezzük

fényre. A jobb vizsgálhatóság kedvéért használjunk négyzetrácsos műanyag dobozt. Amikor a nematódák

néhány perc múlva leülepednek, távolítsuk el a vizet, és ürítsük a kis főzőpohár tartalmát a műanyag

dobozba. Egy pici pálcára erősített disznószőrrel emeljük ki a fonálférgeket és tegyük vízbe egy kicsi,

szállítható, sima aljú edénybe (40A–C ábra).

38. ábra - A Trichodorus fajok izolálásához szükséges, ún. Baerman-féle tölcsér

[Noordam, 1973 után]

39. ábra - A Trichodorus fajok izolálásának következő lépése [Noordam, 1973 után]



40. ábra - A: szűrő (0,05 mm) a Petri-csészében az állványon; B: doboz a bevésett

négyzetráccsal: 1. fogantyú, 2. emelt szegély; C: disznószőr vékony fadarabra ragasztva

[Noordam, 1973 után]

Könnyen észrevehető, hogy a nematódák alakja és mérete milyen különböző (41. ábra). Az elfogott

fonálférgeknek csak egy kis része tartozik azon fajokhoz, amelyek vírusátvivők (42. ábra). A Trichodorus

fajoknak lekerekített farka és görbült szájszerve van. Laboratóriumi gyakorlat nélkül a nematódák határozása

nehéz.

41. ábra - Talajból izolálható nematódafajok. 1. Tylenchorhynchus dubius. 2.

Rhabditid. 3.*Longidorus elongatus. 4. Dorilaimid. 5. Rotylenchus uniformis.

6.*Xiphinema diversicaudatum. 7. Tylolaimophorus. 8. Diphtherophora. 9.

Trichodorus. A *-gal jelölt fajok vírusátvitelre alkalmasak [J. Seinhorst rajza alapján

Noordam, 1973 után]



42. ábra - A vírus megőrzésének speciális helyei a vektor fonálférgekben. A vírus

kapcsolatban van a tápcsatorna falával a jelzett területeken [Taylor és Robertson, 1975

után]

A formalinos rögzítésen kívül még ismertek többkomponensű fixálóoldatok is, de a határozás szempontjából

leginkább ajánlott módszer a hőmerevítés. Ha 45–50 °C-os vizet öntünk a már kiválogatott állatokra, vagy az

óraüvegben összegyűjtött szuszpenziót láng fölött párszor áthúzzuk, a fonálférgek kinyúlnak, ezáltal könnyen

mérhetők és tanulmányozhatóak. Vigyázzunk, a melegítést csak addig végezzük, amíg a vízben lévő állatok

erősen vibrálni nem kezdenek. A megdermedés pillanatában nyomban fixálni kell. A hazai agronematológiával

foglalkozó irodalom közül Andrássy és Farkas (1988), valamint Jávor (1974) kézikönyvében találhatók a

fonálférgek életmódjával, szaporodásával, vizsgálati módszereivel és határozásával kapcsolatos ismeretek.

A dohány rattle vírus (tobacco rattle tobravirus) átvitele fonálférgekkel

a. Ültessünk 10 db Nicotiana tabacum növényt műanyag cserépben lévő, sterilizált földbe (legalább 3 héttel a

vizsgálat előtt).

b. Ültessünk dohány rattle vírussal fertőzött Nicotiana tabacum palántákat fonálférgeket tartalmazó földbe.



c. Két nap múlva a földtől megtisztított nematódaszuszpenziót (akár szétválogattuk, akár nem) öt részre osztva

ömlesszük az egészséges dohánypalánták szárához közel lévő sekély lyukba. Hagyjuk a másik öt cserepet

kezeletlenül.

d. Kb. 10 nap múlva a leveleken megjelennek a dohány rattle vírus tipikus tünetei (nekrotikus gyűrűk,

érnekrózis). Ha a tünetek elmaradnak, vizsgáljuk meg, hogy a vírus a gyökérből kimutatható-e.

3.3.1.1.2. A vírus jelenlétének kimutatása gyökérből

A növényt vegyük ki a cserépből és mossuk le a földet a gyökeréről. Vágjuk le a gyökér egy darabját és

mozsárban dörzsöljük szét. Inokuláljunk egy karborundummal beszórt N. tabacum tesztnövényt, mindegyik

növény gyökerének szövetnedvével külön-külön. A szövetnedvet 1:10 arányban hígítsuk foszfát-pufferrel (pH

7,0). A tüneteket (nekrotikus foltok, gyűrűk) 2–5 nap elteltével ellenőrizhetjük.

Második módszer: Xiphinema és Longidorus fajok izolálása

A Xiphinema és a Longidorus fonálférgek sokkal nagyobbak, mint a Trichodorus fajok. Ezek a fonálférgek az

izolálás során a homokkal, törmelékkel együtt az üledékbe kerülnek (vö. az Első módszer című módszertani

leírás k pontjával). Ezeket a nematódákat csak szűrővel különítettük el a kisebb fajoktól. Az izolálást ettől a

lépéstől is folytathatjuk, vagy használhatjuk az eredeti talajmintát is.

a. Öntsünk vizet a talajmintára egy megfelelő edényben, pl. vödörben. Legalább tízszeresére hígítsuk a földet és

keverjük össze.

b. A durva talajdarabok pár másodperc múlva leülepednek.

c. Öntsük át a felülúszót 0,25 mm-es lyukátmérőjű szűrőn, és a maradékot gyűjtsük egy főzőpohárba.

d. Ismételjük meg a c pontot kétszer-háromszor.

e. Az így összegyűjtött maradékokat 0,1–0,2 mm-es lyukátmérőjű szűrőbe töltjük, és a szűrőt sekély rétegű

vizet tartalmazó Petri-csészébe helyezzük.

f. Sztereomikroszkóppal fény alatt vizsgáljuk.

g. A nematódák fertőzőképességét az előbb leírtak szerint ellenőrizzük. A vírus jelenlétét tesztnövényekkel

mutatjuk ki.

h. Fonálféreggel történő átvitel, javított standard módszerrel (Fritzsche, 1967)

i. A magvető ládákban kikelt 3–4 cm-es növényeket nem cserépbe, hanem 4 × 4 cm nagyságú kimélyített

üvegkockákba rakjuk (43. ábra).

j. Az üvegkockákba csak annyi sterilizált földet rakjunk, amennyi éppen ellepi a benne elültetett növény

gyökerét.

k. A talajnedvesség fenntartása céljából tegyük a kockákat egy nagy Petri-csészébe. A módszer előnye, hogy

így a fonálférgek közvetlenül a gyökér közelébe helyezhetők, mozgásukat a talaj nem befolyásolja. A

módszer hátránya, hogy a vizsgált növények élettartama igen rövid.

43. ábra - Javított standard módszerrel végzett vírusátvitel fonálférgekkel[R. Fritzsche




3.4. Vírusátvitel talajlakó gombákkal

A talajlakó gombák közül a legismertebb az Olpidium brassicae, amely a dohány nekrózis vírus (tobacco

necrosis necrovirus) és a Spongospora subterranea, amely a burgonya szártörpülés vírus (potato mop-top

pomovirus) (44. ábra) átvitelére alkalmas (Harris és Maramorosch, 1980; Jones, 1993b).

44. ábra - A burgonya szártörpülés vírus (potato mop-top pomovirus) lokális tünetei

Chenopodium amaranticolor diagnosztikai tesztnövényen, 27 nappal az inokulálás után

[Horváth József szívessége folytán]

A dohány nekrózis vírus átvitele Olpidium brassicae gombával

a. Az O. brassicae gombát légszáraz gyökérből vagy közvetlenül saláta- (Lactuca sativa) növény gyökeréből

izolálhatjuk. A Solanum nigrum, Solanum villosum vagy a Lactuca sativa növényeket virágcserépben

neveljük, durva homok és kagylózúzalék keverékén. Egy hét múlva hígítsunk Hoagland-oldatot 1:20

arányban (pH 7,0) és öntsük a virágcserépbe. További napokon vízzel öntözzük (Teakle, 1967).



b. Amikor a gyökerek elérik a 3 mm-es hosszúságot, akkor a zoospóra-szuszpenziót a palánta szárához közel

lévő sekély lyukba öntjük. 5–8 nap után a zoospórák nagy tömegben vannak jelen.

c. Az inokuláláshoz kb. 60 db növény gyökerére van szükségünk, amelyet előzőleg folyóvízben gyorsan

lemostunk és kb. 30 ml desztillált vizet tartalmazó Petri-csészébe raktunk. 1%-os nyúlszérumot adunk a

vízhez, hogy meghosszabbítsuk a zoospórák mozgásképességét.

d. Kilenc rész zoospóra-szuszpenzióhoz (105–106 zoospóra /ml) egy rész dohány nekrózis vírust tartalmazó

szövetnedvet (15 g/l) adunk.

e. Öt perc elteltével 5 db Phaseolus aureus palánta gyökerét tesszük az elegybe, 5–30 percre. Ültessük a

növényeket Hoagland-féle ásványi tápoldattal átitatott homokba.

f. Az összehasonlítás kedvéért helyezzünk 5 db P. aureus növényt 5–30 percre dohány nekrózis vírust

tartalmazó szövetnedvbe (1,5 g/l), és utána ültessük el. Egy-két nap elteltével nekrotikus lokális léziók

jelennek meg a megfertőződött gyökereken.

3.5. Vírusátvitel Cuscuta fajokkal

Több vírus is képes egy olyan „természetes hídon” keresztül átjutni a fertőzött növényből az egészségesbe,

amelyet egy parazita növény, az aranka (Cuscuta spp.) indája hoz létre. Arankával nemcsak az átnövő szár

segítségével tudnak a vírusok átjutni a beteg növényről az egészséges növényre, hanem akkor is, ha a fertőző

növényen felnőtt aranka egy levágott hajtása rátekeredik a tesztnövény szárára és levelére.

Uborka mozaik vírus (cucumber mosaic cucumovirus) és dohány rattle vírus (tobacco rattle tobravirus)

átvitele arankával

A tesztelést elvégezhetjük vírussal fertőzött Nicotiana glutinosa növényről vírusmentes növényekre (Bakos et

al., 1995).

a. Tegyünk Cuscuta subinclusa magokat steril desztillált vizes, 0,5%-os agarózra (pH 5,5). Az arankamagoknak

kemény burka van, ezért áztassuk a magokat 20 percig H2SO4-ban, majd öblítsük háromszor bőséges

desztillált vízzel. Ezután tegyük 20 percre 20%-os hypóba, majd legalább háromszor alaposan mossuk le

desztillált vízzel. Az aranka a csírázást követően rendkívül gyorsan növekszik. A kezdetleges gyökérre csak

addig van szüksége, amíg a csíranövény számára szükséges vizet felveszi, később elszárad. A további

tápanyagfelvétel a hausztóriumokon keresztül történik.

b. Helyezzük a magról kelt 2–4 cm-es növényeket közvetlenül a gazdanövény szára vagy levélnyele mellé úgy,

hogy érintkezzenek egymással. Mindezt párás körülmények között végezzük. Olyan növények alkalmasak

gazdának, amelyeknek nincsen hosszú szőre (Beta vulgaris, Vicia faba). Mielőtt virágzásnak indulna, tegyük

át a csúcstól számított 10–20 cm hosszú szárakat egy új gazdanövényre, hogy megtartsuk az arankát

vegetatív stádiumban. A szárak csúcsain vannak ugyanis a gazdanövényt felismerő receptorok.

c. Az arankát fertőzhetjük úgy, hogy palántáját vagy 10–20 cm-es szárát a beteg növényre helyezzük.

Ügyeljünk arra, hogy a szár csúcsa elérje a gazdanövényt. Két hét múlva vagy később tegyük olyan közel a

tesztnövényhez, hogy az aranka szára átérhessen hozzá, vagy vágjunk 10–20 cm-es szárat és tekerjük ezt a

tesztnövény köré.

d. Egy-két nap elteltével figyeljük meg a megjelenő tüneteket a tesztnövények gyökerein.

4. Rovarokkal történő vírusátvitel molekuláris aspektusai

A vektorokkal történő vírusátvitel valamennyi típusában a víruspartikulumok mozgását kell nyomon követni. A

vírus és a vektor közötti molekuláris kölcsönhatást a víruspartikulumok felszíne határozza meg. A legtöbb vírus

esetében a virionok felszíne lép kölcsönhatásba a vektorral. Ez a kölcsönhatás lehet közvetlen, vagy történhet

közvetett módon is, egy másik, vírus által kódolt fehérjén keresztül (Hull, 1994). Ma már bizonyított tény, hogy

a vírusgenom és a géntermékek meghatározzák az átvitelt.

4.1. Köpenyfehérje (CP)



A vírus-köpenyfehérje meghatározó az átvitel szempontjából. A köpenyfehérje pontos természete több esetben

még nem tisztázott, de azt tudjuk, hogy bizonyos aminosavak és domének lényegesek a folyamatban. A

köpenyfehérjét vizsgáló tanulmányok többségének középpontjában azok a módosult vagy módosított

vírusváltozatok állnak, amelyek eredetileg nem képesek a vírusátvitelre, de molekuláris úton átvihetővé tehetők

(Pirone, 1991).

A propagatív vírus–vektor kapcsolatok közül a here seb tumor vírus (clover wound tumor phytoreovirus) és a

kabócák között mutatták ki – első esetben molekuláris szinten – a köpenyfehérje szerepét. A here seb tumor

vírus vad típusú izolátumaiban a kettős szálú RNS 12 szegmensében hiány (deléció) található, ami az átviteli

képesség elvesztését eredményezi. A 2. vagy 5. szegmens deléciója esetén megszűnik az átvitel, és ezek az

izolátumok a rovarsejteket sem fertőzik. Ez a két génszakasz kódolja a vírus köpenyének 130 kD és 76 kD

nagyságú fehérjéit. A külső köpeny enzimatikus eltávolítása nem okozza a vektorsejtek fertőzöttségének

elvesztését. Valószínű, hogy a génszakaszok hiánya fontosabb az átvitel szempontjából, mint a külső köpeny

eltávolítása. Egy másik vírus, a burgonya sárga törpülés vírus (potato yellow dwarf nucleorhabdovirus)

felszínén glükoprotein (G-protein) „tüskék” helyezkednek el, ezek okozzák a kórokozó kabócával történő

átvihetőségét. A „tüskék” eltávolítása a rovar testében a vírusfertőzés csökkenését eredményezi, a növényben

azonban nem. A burgonya sárga törpülés vírusnak két törzse ismert, amelyet különböző kabócavektorok

terjesztenek. A két törzs G-proteinjének különböző izoelektromos pontja összefüggésben van az egyrétegű

vektorsejt fertőzésének pH-optimumával.

Az árpa sárga törpülés vírus (barley yellow dwarf luteovirus) levéltetvekkel történő terjedése cirkulatív jellegű,

de a vírus a vektor testében nem szaporodik. Az árpa sárga törpülés vírus MAV-izolátuma normális

körülmények között nem vihető át Rhopalosiphum padi levéltetűvel, míg a vírus RPV-izolátuma igen. Ha a

MAV-izolátum RNS-ét az RPV-izolátum köpenyfehérjéjébe burkolták, akkor a MAV-RNS is átvihetővé vált R.

padi által. Cirkulatív átvitel esetén a köpenyfehérje szerepét bizonyítja az a tény is, hogy luteovirusokkal történt

kevert fertőzés hatására levéltetvekkel nem átvihető vírusok is átvihetővé válnak. A kevert fertőzéseknél a nem

luteovirus-RNS a luteovirus köpenyfehérjébe enkapszidálódik. A kevert vírusoknak speciális vektoraik vannak,

amelyeket a luteovirus eredetű köpenyfehérje határoz meg. A cirkulatív borsó enációs mozaik vírus (pea enation

mosaic enamovirus) átvitelét a köpenyfehérje kisebb alkotója határozza meg. Ez a 22 kD fehérje a levéltetűvel

átvihető és a nem átvihető izolátumokban egyaránt túlsúlyban van. Ennek a kis fehérjének a jelenléte összefügg

a levéltetűvel átvihető izolátumban egy magas molekulatömegű RNS1-gyel, amelyik a köpenyfehérjét kódolja.

A genom részének elvesztése eredményezi az 56 kD-os termék hiányát, ami nélkülözhetetlen a levéltetű-

átvitelben. Az árpa sárga törpülés vírus és a borsó enációs mozaik vírus esetében a kórokozónak be kell kerülnie

a vektor nyálmirigyébe, és ezt követően lehetséges a vírusátvitel. A köpenyfehérje szerepét egy geminivirus

vektorában génkicseréléssel bizonyították. Az egyszálú DNS-t tartalmazó geminivirusoknak két alcsoportját

különböztetjük meg. Az egyik alcsoportot molytetvek, míg a másikat kabócák terjesztik. Kiméra klónokat

állítottak elő úgy, hogy a konstrukcióban a molytetűvel átvihető Cassava afrikai mozaik vírus (Cassava African

mosaic bigeminivirus) DNS-éhez a kabócával átvihető répa levélcsúcs fodrosodás vírus (beet curly top

hybrigeminivirus = curtovirus) köpenyfehérjéjét illesztették. A kimérával növényeket fertőztek, majd a tisztított

víruskimérát kabócába injektálták. A rovar a vírust átvitte, a növény a Cassava afrikai mozaik vírus tüneteit

mutatta.

A nem cirkulatív vírusátvitelnél a vektor–vírus kölcsönhatás nem annyira specifikus, mint a cirkulatív vírusok

esetében. A nem cirkulatív vírusok mechanikailag könnyen átvihetők. Ebben a víruscsoportban is vannak

levéltetűvel kevésbé és jobban átvihető izolátumok. Mindkét típust használták a köpenyfehérje szerepének

kimutatására cucumovirusok és potyvirusok levéltetű átvitelében. Az uborka mozaik vírus (cucumber mosaic

cucumovirus) eltérő izolátumaival végzett vizsgálatok azt mutatták, hogy az átvihetőséget az határozza meg,

hogy az RNS-t melyik típusú köpenyfehérje burkolja. A paradicsom magtalanság vírus (tomato aspermy

cucumovirus) V törzsének köpenyfehérjéje, amely levéltetvekkel átvihető, szintén lehetővé tette az uborka

mozaik vírus átvitelét. A paradicsom magtalanság vírus a dohány mozaik vírust (tobacco mosaic tobamovirus) is

képes az előbb leírtak szerint a levéltetvek számára felvehetővé tenni. Az uborka mozaik vírus genomjában az

RNS-3 kódolja a köpenyfehérjét. A levéltetű-átvihetőséget szintén az RNS-3 határozza meg. Az

összehasonlítási vizsgálatok azt mutatták, hogy a köpenyfehérje 168. aminosava felelős a vírus terjedéséért. A

köpenyfehérje szerepét közvetett módon bizonyítja a dohány karcolatos vírus (tobacco etch potyvirus)

levéltetvekkel nem terjeszthető izolátuma. Ezen izolátumok köpenyfehérjéjének N-végén lévő aminosav-

szekvenciákat összehasonlították ugyanezen vírus magas átviteli hatékonysággal rendelkező izolátumaival és

más, levéltetűvel átvihető potyvirusok N-végeivel. Az eredmény meglepő volt. A levéltetűvel átvihető

izolátumokban három aminosav-szekvencia mutatkozott konzervatívnak: Asp-Ala-Gly (DAG). A nem átvihető

izolátumban pedig az Asp-Ala-Ser (DAS). Ez az aminosavtriplet foglalja magában a levéltetűvel történő

átvihetőséget. Más potyvirusok tripletjeivel végzett összehasonlító vizsgálatok azt mutatták, hogy a triplet 2., ill.

3. helye gyakran változik az izolátumokban, pl. a szilva himlő vírus (plum pox potyvirus) esetében Asp-Ala-Leu



(DAL), a papaya gyűrűsfoltosság vírusnál (papaya ringspot potyvirus) és a cukkini sárga mozaik vírusnál

(zucchini yellow mosaic potyvirus) Asp-Thr-Gly (DTG), végül a szója mozaik vírusban (soybean mosaic

potyvirus) Asp-Ala-Asp (DAD). A triplet harmadik aminosavjának szerepét a dohány érfoltosság vírus (tobacco

vein mottling potyvirus) levéltetvekkel terjedő izolátumával bizonyították, amelyben a triplet Asp-Ala-Glu

(DAE). Olyan transzkriptumokkal fertőztek növényeket, amelyekben az átvihető izolátum teljes hosszúságú

cDNS klónjába a nem átvihető izolátum köpenyfehérjéjének cDNS klónját helyezték. Ezt a kiméra vírust a

levéltetvek képtelenek voltak átvinni, annak ellenére hogy a kiméra mechanikai fertőzhetőségét megőrizte.

Később felbecsülték a köpenyfehérje N-vég DAG-tripletjében létrejövő hiányok vagy helyettesítések

jelentőségét a dohány érfoltosság vírus levéltetű-átvitelében. A molekuláris módszerrel létrehozott mutánsokat a

dohány érfoltosság vírus levéltetűvel terjeszthető izolátumának teljes hosszúságú cDNS klónjába építették, és a

transzkriptumokkal növényeket fertőztek. A DAG-triplet teljes deléciója pl. az átviteli képesség megszűnésével

járt. Ha a triplet első aminosavját Asp-ról Asn-ra változtatták, akkor a mutáció az átvitelre nem volt hatással. A

második aminosavban történt változtatás már drasztikusan érinti az átviteli képességet. Ha a relatív átviteli

képességet százalékban fejezzük ki a kontroll DAG-izolátumokhoz képest, akkor ez az érték 3%. A harmadik

aminosav helyettesítése az átvitel hatékonyságát 0%-ra csökkentette. A továbbiakban azt kell meghatározni,

hogy a levéltetű-átvitelért felelős domain kiterjedése mekkora a genomban. Ehhez hasonló hiányok vagy

helyettesítések a természetben is létrejöhetnek, bizonytalanná téve a potyvirusok átvitelét. A potyvirusok

ugyanis megkötődhetnek a tápcsatornában vagy a vektor előbelében. A potyvirus-köpenyfehérje N-végének

aminosavai a virion felszínén helyezkednek el, ezért alapvetően befolyásolhatják a vírus kötődését és

megtartását.

4.2. Helper komponens (HC)

Míg a cirkulatív cucumovirusok levéltetű-átvitelét kizárólag a köpenyfehérje határozza meg, addig a potyvirusok

és caulimovirusok esetében szükség van egy vírus által kódolt, nem szerkezeti fehérjére. Ezt a fehérjét helper,

azaz segítő komponensnek (HC) nevezzük, de a caulimovirusoknál megszerzési vagy levéltetű-átviteli faktornak

is hívják.

A karfiol mozaik vírus (cauliflower mosaic caulimovirus) HC-je elősegíti a klónozott vírus-DNS fertőzését. A

deléciós mutánsok analízise és a karfiol mozaik vírus izolátumok különböző átviteli képességekkel rendelkező

kimérájának szerkezete bizonyítja, hogy a genom nyílt leolvasási szakasza (open reading frame, ORF), az

ORFII kódolja a HC-t. Az ORFII egy 18 kD (P18) fehérjét kódol, amely kimutatható a vírussal fertőzött

növényben. Valószínűleg a P18 fehérje maga a HC. A karfiol mozaik vírus levéltetvekkel nem átvihető

izolátumával fertőzött növényekben vagy nincs P18 fehérje, vagy van, de egy kicserélődés eredményeképpen

mutáció jön létre a 94. aminosav helyén. Egy deléció az ORFII rendszeren belül vagy a P18 fehérje végében a

levéltetű-átvitel megszűnését okozza. Nagyon nehéz közvetlenül bizonyítani, hogy a P18 tulajdonképpen a HC.

A karfiol mozaik vírus levéltetvekkel átvihető izolátumával fertőzött növények nedvével végzett membrán-

etetéses vizsgálatok pozitív összefüggést mutattak a P18 jelenléte és a levéltetű-átvihetőség között. Két

potyvirus [dohány érfoltosság vírus (tobacco mottling potyvirus) és burgonya Y-vírus (potato Y potyvirus)] HC-

jét tisztították, és két fehérjét kaptak (53 kD, 58 kD). Ebből arra következtettek, hogy a HC biológiailag aktív

formája valószínűleg egy dimer. Az in vitro transzláció és a nukleotidok szekvenciaanalízise alapján a dohány

érfoltosság vírus HC-jét a második gén kódolja. Ha a vírus HC-jének N-terminusa blokkolt, nem lehetséges a

HC-gén 5‟ végének meghatározása. A vírus-HC N-vége valószínűleg szerin, míg C-terminusa a dohány

karcolatos vírussal (tobacco etch potyvirus) analóg módon glicin. Ennek alapján a dohány érfoltosság vírus HC-

gén a 947. nukleotidnál kezdődik és a 2344. nukleotidnál végződik. Bizonyos burgonya Y-vírus és cukkini sárga

mozaik vírus törzsek a HC deléciója miatt váltak levéltetvekkel átvihetetlenné. A burgonya Y-vírus HC-defektív

törzsének elektroforetikus és immunológiai tulajdonságai hasonlítanak a burgonya C-vírushoz [= burgonya Y-

vírus C-törzse (C-strain of potato Y potyvirus)]. A burgonya Y-vírus és a C-vírus törzs aminosav szekvenciáinak

és nukleotidjainak összehasonlítása a HC–PRO (helper component-protease) régióban 92%-os homológiát

mutat, és csak 24 aminosavban van eltérés. A C-vírus törzs HC-szekvenciáit további öt potyvirussal

összehasonlítva csak két aminosavban van eltérés (lizinről glutaminsavra és izoleucinról valinra). Az

aminosavaknak a HC tevékenységében játszott szerepe a mai napig vizsgálat tárgyát képezi. A HC tehát

közvetlenül vagy közvetett úton képes irányítani a vírusátvitelt. A direkt viszonyban a köpenyfehérje N-

terminális aminosavai közvetlenül lépnek kölcsönhatásba a HC-vel, míg a közvetett (indirekt) viszonyban a HC

csak közvetítő szerepet játszik a virionok és a vírus megőrzési helye között a vektorban.

5. Fonálférgekkel történő vírusátvitel molekuláris aspektusai



A növényvírusok fonálférgekkel történő átvitele egyéb vektorokhoz (rovarok, gombák, stb.) hasonlóan három

fázisból tevődik össze: 1. a vírus felvétele, 2. a vírus megtartása és 3. a gazdanövény sejtbe juttatása. A vírus

felismerésének mechanizmusa ebben a kapcsolatban is rendkívül bonyolult és fajlagos. E folyamatban a

vírusgenom által kódolt fehérjék fontos szerepet játszanak. Az eddigi tanulmányok pl. azt mutatták, hogy a

tobravirusok esetében jelentősek a vírusnukleinsav által meghatározott nem-szerkezeti fehérjék (Schmitt et al.,

1998). A nepovirusok gén funkciói kevésbé ismertek, de a vírus–vektor kölcsönhatás a tobravirusokéhoz

hasonló (Vassilakos et al., 1997).

A nepovirusok pl. dohány gyűrűsfoltosság vírus (tobacco ringspot nepovirus) osztott genomú, poliéder alakú

vírusok. E nemzetségbe tartozó vírusokat a Xiphinema és a Longidorus fajok terjesztik. A tobravirusok, pl.

dohány rattle vírus (tobacco rattle tobravirus), borsó korai barnulás vírus (pea early-browing tobravirus),

paprika gyűrűsfoltosság vírus (pepper ringspot tobravirus) osztott genomúak, pálcika alakú virionjaik egyszálú

pozitív RNS-t tartalmaznak. A nagyobbik RNS-szál (RNS1) a replikációban játszik szerepet és a vírus sejtről

sejtre történő terjedéséért felelős. A kisebbik RNS-szál (RNS2) változó hosszúságú és szekvenciájú, amely a

köpenyfehérjét kódolja. Az RNS2 további géneket is tartalmazhat, amelyek nem-szerkezeti fehérjéket kódolnak.

A tobravirusokat a talajban élő Trichodorus és Paratrichodorus fonálférgek terjesztik. A szerológiailag jól

elkülöníthető vírusizolátumoknak speciális fonálféregfajaik vannak. Jelenleg a dohány rattle vírus PpK20 jelű

izolátumának Paratrichodorus pachydermus vektorral és a borsó korai barnulás vírus TpA56 jelű izolátumának

Trichodorus primitivus vektorral történő átvitele ismert részletesebben. A PpK20 jelű izolátumban az RNS2 két

nem-szerkezeti fehérjét kódoló gént (29,4K, ill. 32,8K) tartalmaz, míg a TpA56 jelű izolátum három ilyen

fehérjét határoz meg (9K, 29,6K és 23K). MacFarlane et al. (1998) szerint ugyanezen gének molekulatömege

37K, 32.8K, ill. 9K, 29K, 23K.

A dohány rattle vírus PpK20 jelű izolátumával végzett vizsgálatok azt mutatták, hogy a vírus mechanikai

inokulációját követően a két nem-strukturális fehérjét meghatározó génben bekövetkező hiányok az

enkapszidációt (köpenyfehérjébe burkolást) és az RNS1 és RNS2 együttes replikációját nem gátolják. A 29,4

kD fehérjét kódoló génszakaszban fellépő mutációk megszüntetik az átvitelt, míg a 32,8 kD fehérjét kódoló

régióban bekövetkező deléciók nem. Ebből arra következtettek, hogy a PpK20 izolátumban a 29,4K gén felelős

a vírusátvitelért (Hernández et al., 1997).

Az RNS2 vírusátvitelben játszott meghatározó szerepét pszeudorekombináns vírusokkal bizonyították,

amelyeket a vektorral könnyen átvihető dohány rattle vírus PpK20 jelű izolátum és a vektorral átvihetetlen

dohány rattle vírus PLB jelű izolátum RNS1 és RNS2 kicserélésével hoztak létre. A borsó korai barnulás vírus

TpA56 jelű izolátum RNS2-jének fertőző cDNS klónjában és egy ezzel rokon SP5 jelű izolátumban

bekövetkező mutációk analízise is azt mutatta, hogy a vírusátvitelben az RNS2-nek van szerepe.

MacFarlane et al. (1998) négy különböző tobravirus izolátum genom-analízisét végezték el. A vírusizolátumok

a következők voltak: a már említett TpA56 jelű borsó korai barnulás vírus izolátum és a PpK20 jelű dohány

rattle vírus izolátum, valamint további két újabb dohány rattle vírus izolátum (TpO1 és PaY4). Az izolátumok

nukleotid szekvenciái között történt összehasonlítások nagyfokú homológiára, de szembetűnő eltérésekre is

rámutattak. A köpenyfehérjén kívül a vírusgenom további két vagy három fehérjét kódol. A TpA56 jelű

izolátum és a TpO1 jelű izolátum köpenyfehérjegénje és 29K génje között helyezkedik el a 9K gén. A megelőző

vizsgálatok arra mutattak, hogy ez a fehérje magában foglalja a vírusátviteli képességet. Később beigazolódott,

hogy szerepe van ebben a folyamatban. A nem-szerkezeti fehérjék közül a 29K fehérjének nélkülözhetetlen

szerepe van a vírusátvitelben. A borsó korai barnulás vírus TpA56 jelű izolátum 29K fehérjéjét kódoló gén

nagyfokú homológiát mutat a többi három dohány rattle vírus izolátum ennek megfelelő génszakaszaival (PaY4

27K, TpO1 29K, PpK20 37K). Az utolsó gén hosszúsága és szekvenciái igen változatosak a különböző

izolátumokat illetően (TpA56 23K, PaY4 32,1K, TpO1 18K, PpK20 32,8K). Az előzetes vizsgálatok azt

mutatták, hogy a borsó korai barnulás vírus TpA56 jelű izolátum 23K fehérjéjét érintő nagyobb átírási szakasz

mutációi meggátolják az átvitelt, míg a kisebb deléciók csökkentik a hatásfokát. Létrehoztak olyan mutánst is,

amelyből teljesen hiányzik a 23K fehérje. Ez a mutáns átvihető ugyan fonálférgekkel, de csak nagyon kis

hatékonysággal. A 23K gén, ill. fehérje szerepének pontos tisztázása még további vizsgálatokat igényel. Ennek a

köpenyfehérjétől legtávolabb kódolt fehérjének az aminosavai és a dohány rattle vírus izolátumok megfelelő

fehérjéinek az aminosavai között nem mutatható ki homológia. A dohány rattle vírus PpK20 izolátum 32,8K

génjének és a PaY4 izolátum 18K génjének a hiánya a vírusátvitel gyakoriságát nem csökkenti a

Paratrichodorus anemones fonálféreg alkalmazása esetében. A PaY4 izolátumot a P. anemones és a P.

pachydermus fajok, míg a PpK20 izolátumot csak a P. pachydermus fajok terjesztik. A jövőbeni vizsgálatoknak

az a célja, hogy megállapítsák a köpenyfehérje vagy a mellette elhelyezkedő 27K (PaY4), ill. 37K (PpK20)

fehérjék szerepét az eltérő vírusátvitelben.



A fonálférgekkel történő vírusátvitellel kapcsolatban új eredményekről számolt be Brown és Trudgill (1998).

Vizsgálataik során olyan mikrotechnikát fejlesztettek ki, amely alkalmas volt a fonálférgek vírusátvitelének

vizsgálatára. Négy nepovirus átvihetőségét mutatták ki a Xiphinema americanum vonalba tartozó fonálférgek

közül. Ebbe a vonalba 45 szűznemzéssel szaporodó és morfológiailag hasonló X. americanum faj tartozik. Ezt a

technikát alkalmazva megállapították, hogy az Európában élő Longidorus vektorfajok egy vagy két,

szerológiailag jól megkülönböztethető vírustörzset képesek terjeszteni, míg az Amerikában élők akár mind a

négy nepovirust. További érdekes megfigyeléseket tettek a X. americanum fajt illetően. Észak-Amerikában

ugyanis a vírusterjesztő fajok csak a harmadik lárvastádiumig fejlődnek, míg a világ többi részén, ha a negyedik

lárvastádium is kialakul, ezek az alakok már nem képesek a vírusátvitelre. Ezt a felfedezést biológiai jelzőként

használják fel a vírus–vektor kapcsolatban.

Az 1990-es évektől kezdődően kifejlődő molekuláris technikák lehetővé tették, hogy zöld fluoreszcens fehérjék

tobravirus izolátumokba építésével láthatóvá váljék a Trichodorus vektorfajok táplálkozási mechanizmusának

vírusátvitelben betöltött szerepe, valamint a vírus terjedése a gyökérben. A jelenleg folyó kutatások

középpontjában a fonálférgek elleni kémiai védekezés helyett a vírusátvitel megelőzése szerepel. Ennek

érdekében burgonyában a fonálférgekkel terjedő vírusokkal szemben kialakított természetes rezisztencia

létrehozása az elsődleges kutatási feladat.


8. fejezet - A biotesztek virológiai alkalmazása

A vírusok vizsgálatának tesztnövényes módszere egyidejűleg fejlődött a növényvirológiával. Mayer (1886) volt

az első, aki a dohány mozaik betegségét vizsgálta, és megállapította, hogy a betegség kórokozója növényi

nedvvel átvihető az egészséges növényre. Ez a felfedezés, valamint Johnson (1925), Holmes (1929) és Smith

(1931) tesztnövényekkel végzett kísérletei, majd Price (1940) és Holmes (1946) a gazdanövénykörökről szóló

tanulmányai megnyitották az utat a felbecsülhetetlen fontosságú elméleti és gyakorlati tudományos eredmények

felé. Azok a vizsgálatok, amelyeket a kutatók a XX. században a vírusok tesztnövényeivel végeztek,

napjainkban sem veszítették el jelentőségüket annak ellenére, hogy a tesztnövények használata a

vírusdiagnosztikában drága; sok kézi munkát, helyet és időt igényel. A biotesztek jelentősége főleg abban van,

hogy a vírusok patológiai tulajdonságai csak tesztnövényeken vizsgálhatók, és eredményei bizonyos esetekben

megbízhatóbbak, mint a szerológiai és egyéb vizsgálatoké. A növényi nedvből a tesztnövények segítségével kis

víruskoncentráció esetén is kimutathatók a vírusok. Az utóbbi években kifejlesztett gyors és megbízható

víruskimutatási módszerek (ELISA-módszer, elektronmikroszkópos vizsgálatok, PCR-technika) sem zárják ki a

tesztnövények használatának szükségességét, hiszen a növényi vírusok tanulmányozása növények nélkül nem

lehetséges. A CMI/AAB Descriptions of Plant Viruses c. kiadvány 446 növényfajt (43 család és 163 nemzetség

fajait) említ mint a biotesztek során használható tesztnövényt (Murant és Harrison, 1970–1988; Horváth, 1993 a,

c).

1. A növény–vírus kapcsolat típusai

A növények és vírusok közötti alternatív kapcsolat a kompatibilitásban és az inkompatibilitásban jut kifejezésre

(Horváth, 1976). A növény–vírus kapcsolat egy különleges esete a túlérzékenység, ill. hiperszenzitivitás

(hypersensitive reaction, HR-reaction) (45. ábra).

45. ábra - A: Vicia faba hiperszenzitív reakciója a bab sárga mozaik vírussal (bean

yellow mosaic potyvirus) és B: Melandrium sárgafoltosság vírussal (Melandrium yellow

fleck bromovirus) szemben [Horváth József szívessége folytán]

1.1.

1.1.1.

1.1.1.1.

1.1.1.1.1. Kompatibilitás

Kompatibilis gazda–parazita kapcsolatban a növény gazdája a vírusnak. Az ilyen növényben a kórokozó

replikációjának és elterjedésének nincs akadálya. A kompatibilis növény gyakran látható tünetekkel reagál az

inokulációra. Az inokulált növények reakciója (szimptómák) attól függően, hogy a növény inokulált levelein

vagy a nem inokulált (az inokuláció után képződött) új levelein mutatkozik-e, lokális vagy szisztemikus lehet.

Egyes gazda–vírus kombinációban lokális és szisztemikus kapcsolat együtt is kialakulhat. A kompatibilis

A biotesztek virológiai alkalmazása


növény–vírus kapcsolat egyes esetekben nem jut kifejezésre látható tünetekben, hanem tünetmentes marad. A

látens fogékonyság mind lokális, mind szisztemikus, mind pedig lokális és szisztemikus lehet. Horváth (1983)

egyik összefoglaló tanulmányában 1312 új gazda–vírus kapcsolatot állapított meg, amelyből 13% látensnek

bizonyult. A kompatibilis gazda–vírus kapcsolatban a tünetek megjelenése után bekövetkezhet az ún.

kigyógyulás (recovery), amely az újabb vélemények szerint a rezisztencia egyik formájának tekinthető

(Pennazio et al., 1999).

1.1.1.1.2. Inkompatibilitás

Inkompatibilitás esetében a növény–vírus kapcsolatban a kórokozó ugyan eredményesen fertőzi a növényt, de

nem betegíti meg. Az inkompatibilitás létrejöhet a vírus elégtelen támadóképessége vagy a növény ellenálló

tulajdonsága miatt. Az inkompatibilis kapcsolatban a vírus replikációja zavart szenved, majd leáll, és a kórokozó

nem terjed el a gazdanövényben (nem szisztemizálódik).

1.1.1.1.3. Hiperszenzitivitás

Az inkompatibilitás gyakran hiperszenzitivitás formájában jelentkezik. A túlérzékenységi vagy hiperszenzitív

reakció esetén a gazdanövénybe juttatott vírus helyileg replikálódik ugyan, de a folyamat a gazdaszervezet aktív

leküzdési reakciója következtében gátolt. Hiperszenzitív reakció (nekrózis, esetleg amputáció) esetén a növény

igyekszik a kórokozót lokalizálni. A hiperszenzitív reakció attól függően, hogy a növény melyik részén lép fel,

kétféle lehet: lokális és szisztemikus. A hiperszenzitív reakciónak nagy jelentősége van a növénynemesítésben.

1.1.1.1.4. A növény–vírus kapcsolatokat befolyásoló tényezők

A tesztnövények fejlettségi állapota befolyásolja fogékonyságukat a vírusfertőzéssel szemben. A Chenopodium

amaranticolor, a Chenopodium quinoa és a Nicotiana clevelandii 10 leveles, a Nicotiana glutinosa 7 leveles, a

Nicotiana tabacum és a Gomphrena globosa 4 leveles állapotban ideális diagnosztizálási célra. Az uborkának

(Cucumis sativus) és a töknek (Cucurbita pepo) a sziklevelét, a babnak (Phaseolus vulgaris) és a tehénborsónak

(Vigna sinensis) a primer leveleit kell inokulálni, mert a növény idősebb levelei nem alkalmasak a fertőzésre. Az

uborkát pl. a vetést követően a 10. és a 15. nap között kell fertőzni, mert a 10 napnál fiatalabb és a 15 napnál

idősebb sziklevelek rezisztensek a vírusfertőzéssel szemben (Yarword, 1971).

A növény vírusfogékonyságát a levél helyzete (a levélemelet szekvenciája) is befolyásolja; a fertőzés idejében

kritikus a levél mérete is (Horváth, 1969 a, b).

Fontos ismernünk a tesztnövények fotoperiódusát is. A Chenopodium quinoa és a Nicotiana clevelandii

hosszúnappalosak, a Chenopodium album és a Glycine max rövidnappalosak, míg a Vicia faba, a Cucumis

sativus és a Phaseolus vulgaris közömbös a napszakok hosszának változására. Harrison és Jones (1971) a

hőmérséklet és a fény hatását tanulmányozták a burgonya szártörpülés vírussal (potato mop-top pomovirus)

fertőzött dohányleveleken. Megállapították, hogy a vírusakkumuláció növekedett, ha a növényeket 22 °C-os

megvilágított helyről 14 °C-os sötétbe helyezték. Horváth és Pocsai (1972) különböző fotoperiódusos kezelések

során azt tapasztalták, hogy alacsony hőmérsékleten a lokális léziók megjelenését elősegítette a hosszabb

megvilágítás, míg magas hőmérsékleten a rövidebb megvilágítás volt hatásos.

2. A vírusfertőzés tünetei (szimptomatológia)

A kompatibilis gazda–vírus kapcsolatban a vírusfertőzés és a vírusreplikáció következtében a gazdanövény

gyakran tünetekkel (szimptóma) reagál a fertőzésre. A tünetek vizsgálatával a tünettan (szimptomatológia)

foglalkozik (Bos, 1970; Schmelzer, 1980). A vírusfertőzés következtében megjelenő szimptómák két nagy

csoportra oszthatók: szabad szemmel látható, a növényeken megjelenő, ún. makroszkópos, ill. külső

szimptómák és szabad szemmel nem látható, a növényekben megjelenő, ún. mikroszkópos, ill. belső

szimptómák. E fejezetben a makroszimptómák részletezésével foglalkozunk.

2.1.

2.1.1.

2.1.1.1.

2.1.1.1.1. Makroszimptómák



A vírusfertőzés hatására a növényeken jelentkező, szabad szemmel látható tünetek két csoportra oszthatók:

lokális vagy primer szimptómákra és szisztemikus vagy szekunder szimptómákra. A makroszimptómák

osztályozása az alapján is ismert, hogy a növény mely részén (gyökér, levél, szár, virág, termés, mag) jelennek

meg a tünetek.

2.1.1.1.2. Lokális tünetek

Kompatibilis kapcsolat esetén az inokulációt követően néhány nap, esetleg néhány óra múlva a gazdanövény

inokulált levelén klorotikus és/vagy nekrotikus elváltozások jelentkeznek, amelyeket lokális lézióknak nevezünk

(46. ábra). A léziók mérete gombostűfej nagyságútól több centiméter átmérőjű nekrotikus vagy klorotikus foltig

terjedhet. A léziók lehetnek klorotikusak (világoszöld, sárgászöld és sárgásfehér foltok) vagy nekrotikusak

(fekete, barna, vörös és szürkésfehér foltok). A lokális léziók formája igen változatos; lehetnek foltszerűek,

gyűrű alakúak és csíkok (10. táblázat).

10. táblázat - Lokális növény-vírus kapcsolatok

Gazda–vírus kapcsolat Lokális tünettípus

Chenopodium amaranticolor–dohány

mozaik vírus1 nekrotikus léziók

Chenopodium amaranticolor–uborka

mozaik vírus2 klorotikus léziók

Chenopodium quinoa–burgonya Y-vírus3 klorotikus léziók

Chenopodium quinoa–dohány mozaik vírus1 klorotikus léziók

Datura stramonium–paradicsom mozaik

vírus4 nekrotikus léziók

Nicotiana glutinosa–paradicsom mozaik

vírus4 nekrotikus léziók

Nicotiana tabacum cv. Xanthi-nc–dohány

mozaik vírus1 nekrotikus léziók

Phaseolus vulgaris–lucerna mozaik vírus5 nekrotikus léziók

1 tobacco mosaic tobamovirus

2 cucumber mosaic cucumovirus

3 potato Y potyvirus

4 tomato mosaic tobamovirus

5 alfalfa mosaic alfamovirus

46. ábra - Lokális szimptómák Datura stramonium (A) és D. gigantea (B) inokulált

levelein. A: klorotikus léziók belladonna foltosság vírussal (belladonna mottle

tymovirus) fertőzött növény levelén; B: nekrotikus léziók dohány gyűrűsfoltosság

vírussal (tobacco ringspot nepovirus) inokulált növény levelén [Horváth József




2.1.1.1.3. Szisztemikus tünetek

A szisztemikus tünetek megjelenéséig az inokulációt követően napok, hetek vagy hónapok, sőt egyes esetekben

évek kellenek. A lágy szárú növények gyorsabban reagálnak a fertőzésre, mint a fásszárúak, a fiatal növények

általában fogékonyabbak, mint az idősek. A szisztemikus tünetek megjelenésénél beszélhetünk lappangó

(látens) és heveny (akut) fázisról. A leggyakrabban előforduló szisztemikus tünetek: mozaik, érnekrózis,

érkivilágosodás, hólyagosodás, márványozottság, levéldeformáció, páfránylevelűség, kinövések (11. táblázat).

11. táblázat - Szisztemikus növény-vírus kapcsolatok

Gazda–vírus kapcsolat Szisztemikus tünettípus

Cucurbita maxima–tök mozaik vírus1 kinövések (enációk)

Datura stramonium–beléndek mozaik vírus2 levéldeformáció

Nicotiana glutinosa–uborka mozaik vírus3 márványozottság, mozaik,

növekedésgátlás

N. tabacum cv. Samsun–dohány mozaik

vírus4 mozaik

Nicotiana tabacum cv. Samsun–burgonya

Y-vírus5 érkivilágosodás, mozaik (C-, N-törzs)

Nicotiana tabacum cv. Samsun–burgonya

Y-vírus5 érkivilágosodás, mozaik, érnekrózis (R-,

NTN-törzs)

Phaseolus vulgaris–bab közönséges mozaik

vírus6 hólyagosodás, mozaik,

levéldeformálódás



Vitis vinifera–szőlő páfránylevelűség vírus7 páfránylevelűség

1 squash mosaic comovirus

2 henbane mosaic potyvirus

3 cucumber mosaic cucumovirus

4 tobacco mosaic tobamovirus

5 potato Y potyvirus

6 bean common mosaic potyvirus

7 grapevine fanleaf nepovirus

2.1.1.1.4. A növényi szerveken lévő tünetek

A növényi szerveken megjelenő tünetek közül a leveleken lévők mutatják a legváltozatosabb képet. Ha a levél

fejlődésében zavar áll be, elszíneződések (sárgulás, nekrózis, érkivilágosodás, mozaikfoltok, tarkulás, gyűrűk,

minták, csíkok, hálózatosság stb.) és deformációk (ráncosodás, hólyagosodás, torzulás, kinövések,

levélkeskenyedés, páfránylevelűség stb.) alakulhatnak ki (47. ábra).

47. ábra - Szisztemikus szimptómák. A: lucerna mozaik vírussal (alfalfa mosaic

alfamovirus) inokulált Solanum marginatum mozaikos levele; B: paradicsom

magtalanság vírussal (tomato aspermy cucumovirus) inokulált Nicotiana glutinosa

deformált levele; C: burgonya Y-vírussal (potato Y potyvirus) inokulált burgonya

(Solanum tuberosum) levele; D: dohány mozaik vírussal (tobacco mosaic tobamovirus)

fertőzött Petunia atkinsiana páfránylevelűsége [Horváth József szívessége folytán]

A száron, hajtáson, terméseken és virágokon mutatkozó tünetek közül a különböző foltok, elszíneződések,

nekrózisok, deformációk, internódium-megnyúlás, ill. -rövidülés, hajtáshervadás és a szártumorok a

legjelentősebbek (48. ábra).

48. ábra - A: burgonya Y-vírussal (potato Y potyvirus) fertőzött Nicotiana tabacum

szárnekrózisa; B: nekrotikus léziók a burgonya Y-vírus NTN-törzsével fertőzött

burgonya (Solanum tuberosum) bogyóin; C: nekrotikus léziók a burgonya Y-vírus NTN

törzsével fertőződött burgonyagumókon; D: tarlórépa mozaik vírussal (turnip mosaic

potyvirus) fertőződött Matthiola incana virágának színtörése (flower breaking) [A és D:

Horváth József szívessége folytán; B és C: Pintér Csaba szívessége folytán]



A korai vírusfertőzés a generatív szerveken is elváltozásokat okoz. A virágtakaró levelek színtörését a tulipán

színtörés vírus (tulip breaking potyvirus) vagy a tarlórépa mozaik vírus (turnip mosaic potyvirus) okozza (48D

ábra), de találhatunk a virágon nekrotikus foltokat, kinövéseket, létrejöhet deformáció, és gyakori tünet a

pártacső felrepedése is.

A burgonya Y-vírus NTN törzsének (potato Y potyvirus, PVYNTN) fertőzése esetén a burgonyagumón és bogyóin

nekrotikus foltok keletkeznek (48B és C ábra). A dohány rattle vírus (tobacco rattle tobravirus) jellegzetes

nekrotikus tüneteket idéz elő a burgonyagumókon (49A ábra). Kövecsesedést okoz a körte termésén a körte

kövecsesedés vírus (pear stony pit virus), amely a gyümölcs minőségét jelentősen rontja. A vírusfertőzés egyes

tünetei a magvak felületén is megjelennek. A szilva himlő vírus (plum pox potyvirus) a fertőzött szilván

gyűrűket, torzulásokat idéz elő.

49. ábra - A: dohány rattle vírus (tobacco rattle tobravirus) által előidézett tünetek

Libertas burgonyafajta gumószöveteiben; B: répa nekrotikus sárgaerűség vírus (beet

necrotic yellow vein benyvirus) által előidézett gyökérproliferáció (szakállasodás)

cukorrépán [Horváth József szívessége folytán]

A növényi szervek közül a gyökéren lévő vírustünetek (valószínűleg elhelyezkedésük miatt) ismertek a

legkevésbé. Az eddigi vizsgálatok nekrózist, járulékos gyökérképzést és gyökértumor-képződést mutattak ki.

Járulékos gyökérképződést idéz elő a cukorrépa rizománia betegsége, amit a répa nekrotikus sárgaerűség vírus

(beet necrotic yellow vein benyvirus) idéz elő (49B ábra).



A vírusfertőzés következtében keletkező rendkívül változatos tünetek sora szükségessé teszi azok szimbolikus

jelekkel történő írását. Erre vonatkozóan nemzetközileg is egységes normák azonban nem állnak rendelkezésre.

A továbbiakban néhány tünet angol és magyar nyelvű rövidítését ismertetjük:

B: browning (barnulás)

Bli: blistering (hólyagosodás)

Cb: colour breaking (színtörés)

Ch: chlorosis (klorózis)

Chl: chlorotic lesions (klorotikus léziók)

D: plant death (a növény elhalása)

E: etched patterns (tölgyfalevél-mintázat)

Fle: fern leaf (páfránylevelűség)

Gr: growth reduction (növekedésgátlás)

HR: hypersensitive local necrotic lesions (lokális hiperszenzitív reakció)

HRS: hypersensitive systemic symptoms (szisztemikus hiperszenzitív reakció)

La: latent or symptomless (tünetmentes)

Ldef: leaf deformation (levéltorzulás)

Led: leaf drop (levéllehullás)

Lo: local (lokális)

M: mosaic (mozaik)

Mo: mottling (foltosodás)

N: necrosis (nekrózis)

Nl: necrotic lesions (nekrotikus léziók)

NLL: necrotic local lesions (nekrotikus lokális léziók)

NLRi: necrotic local rings (nekrotikus lokális gyűrűk)

P: pattern (mintázottság)

S: systemic (szisztemikus)

Sledef: systemic leaf deformation (szisztemikus levéldeformáció)

SMo: systemic mosaic symptoms (szisztemikus mozaiktünetek)

Sp: spots (foltok)

Tn: top necrosis (csúcsnekrózis)

Vb: vein banding (érszalagosodás)

Vc: vein clearing (érkivilágosodás)

Vn: vein necrosis (érnekrózis)



Vnt: vein netting (érhálósodás)

Ysp: yellow spots (sárga foltok)

Megjegyzés: A szimptomatológia a tüneteket általában tört alakban írja le, ahol a számlálóban a lokális tünetek,

a nevezőben a szisztemikus tünetek rövidítései találhatók. Például: Nl/Ldef (lokális nekrotikus

léziók/szisztemikus levéldeformáció).

Mikroszimptómák (anatómiai elváltozások)

A vírusfertőzés hatására a növényekben megjelenő belső elváltozások a sejtek, szövetek belsejében figyelhetők

meg (Horváth, 1972). Ilyenek pl. a magállomány gyors növekedése, a kloroplasztiszok degenerálódása,

intracelluláris zárványok kialakulása, citoplazmatikus zárványok, a rostacsövek nekrózisa, floem hipertrófia,

kromoszóma-abnormalitás (törések) (Esau, 1967; Schmidt, 1980). A mikroszimptómákat A vírusfertőzött

növényi sejtek finomszerkezete, illetve a Fénymikroszkópos festéses módszerek c. fejezetek ismertetik.

3. A vírusfertőzés mértékének meghatározása

A vírusfertőzés mértékének megállapítására korábban a félleveles lokálislézió-számlálás és a latin négyzet

módszerét alkalmazták. Erre ma már az ELISA-féle szerológiai módszer a megfelelőbb.

Lokálislézió-számlálás féllevél módszerrel

a. A kiválasztott vírust, pl. a dohány mozaik vírust (tobacco mosaic tobamovirus) tartalmazó szövetnedvet a

megfelelő töménységűre hígítjuk (pl. 10–2).

b. Tíz darab, 8–10 leveles Nicotiana glutinosa 5 levelének a jobb, 5 levelének pedig a bal felét inokuláljuk a

vírussal. A lokális léziók a kezelt leveleken jól megszámolhatók.

c. Sztereomikroszkópba szerelt okulár mikrométerrel a lokális léziók pontos területe (cm2) megmérhető.

Megjegyzés: Kellő számú ismétlés estén a módszer alkalmas különféle kezelések (hormonok, vírusgátló

anyagok stb.) közvetlen fertőzésfogékonyságot befolyásoló hatásának statisztikai elemzésére is.

Lokálislézió-számlálás latin négyzet módszerrel

A tesztnövényeken keletkezett lokális léziók számának összehasonlítására különböző levélméret esetén a latin

négyzet módszer alkalmazható. A kísérlet beállítását, 4 különböző vírusszuszpenziót (A, B, C, D) és 4 db

tesztnövényt használva (I–IV), a 12. táblázat mutatja.

12. táblázat - Lokálislézió-számlálás latin négyzet módszerrel

A kezelt

levelek

sorszáma

A tesztnövények sorszáma

I II III IV

1 A D B C

2 B A C D

3 C C A B

4 D B D A

Megjegyzés: Pontosabb eredmény kapható, ha a latin négyzet és a féllevél módszert együtt használjuk (13.

táblázat). A vírusfertőzés mértékét az előző módszerhez hasonlóan a lokális léziók számával, a nekrózis

mértékét a léziók területének kiszámításával állapíthatjuk meg.



13. táblázat - Lokálislézió-számlálás féllevél és latin négyzet módszerrel

A kezelt

levelek

sorszáma

A tesztnövények sorszáma

I II III

jobb bal jobb bal jobb bal

1 A B C B C A

2 B A B A B C

3 C C A C A B

4. Fizikai tulajdonságok vizsgálati módszerei

A fizikai tulajdonságokat vizsgáló módszerek eredményei tájékozódást nyújtanak a vírusok fizikai

tulajdonságairól (hőinaktiválási pont, hígíthatósági határ, in vitro eltarthatóság, eltarthatóság kiszárítással

szobahőmérsékleten, ill. alacsony hőmérséketen) (Horváth, 1972). A fizikai tulajdonságok meghatározásával

kapcsolatos módszereket Horváth (1966a,b), Noordam (1973), Schmelzer et al. (1980) és Hill (1984) alapján az

alábbiakban foglaljuk össze. Dijkstra és De Jager (1998) e könyv kéziratának leadása után megjelent

vírusmódszertani könyvükben a fizikai tulajdonságok meghatározását részletesen tárgyalják.

Hőinaktiválási pont meghatározása

A vírusok hőmérséklettől függő tulajdonsága a vírusra jellemző érték. A hőinaktiválási pont az a legalacsonyabb

hőmérséklet, amelyen a hígítatlan présnedv tízperces kezelés után már elveszti fertőzőképességét.

a. A hígítatlan dohány mozaik vírust (tobacco mosaic tobamovirus) tartalmazó szövetnedvből 2–2 ml-t 6 db

vékonyfalú kémcsőbe pipettázunk, s a kémcsöveket parafa- vagy vattadugóval lezárjuk.

b. Egy-egy kémcsövet 10–10 percre 95, 90, 80, 70 és 60 °C-os vízfürdőbe állítunk, és hagyunk egy kezeletlen

kontrollt. A kezelés után a kapott növénynedvet tesztnövényekre (pl. Nicotiana glutinosa) visszük át. Az

inokulációt követően a keletkezett tünetek alapján megállapítható a vírus hőinaktiválási pontja, amely a

dohány mozaik vírus esetében 90 és 95 °C között van.

Hígíthatósági határ meghatározása

A vírustartalmú növényi nedv fokozatos hígításával fokozatosan csökken a fertőzőképesség is. A hígíthatóság

határa az a legnagyobb hígíthatósági érték, amelynél még kimutatható a fertőzőképesség.

a. A kísérlethez 8 db kémcső szükséges, amelyekből hétbe 9–9 ml vizet pipettázunk. A nyolcadik kémcsőbe 2

ml hígítatlan vírustartalmú szövetnedvet teszünk.

b. A hígítatlan szövetnedvből kiveszünk 1ml-t, ezt belerakjuk a következő kémcsőbe, majd ebből is kiveszünk

1ml-t és a következő kémcsőbe pipettázzuk. Ezt a műveletet addig folytatjuk, amíg az utolsó kémcsőhöz nem

érünk. Így 10–1, 10–2, 10–3, 10–4, 10–5, 10–6, 10–7 töménységű hígítási sorozatot kapunk.

c. Az így kapott oldatokkal lokális tesztnövényeket (Nicotiana glutinosa) inokulálunk, s a kifejlődött léziók

alapján megállapítható a vírus szövetnedvének hígítási végpontja. A dohány mozaik vírus esetében ez 10–6 és

10–7 között van.

In vitro eltarthatóság meghatározása

A fertőzött növényi szövetnedv szobahőmérsékleten tartva fokozatosan elveszti fertőzőképességét. A virionok

stabilitását az in vitro eltarthatóság határával órákban, napokban vagy hetekben fejezzük ki.



a. Uborka mozaik vírussal (cucumber mosaic cucumovirus) fertőződött Nicotiana tabacum cv. Samsun

leveleiből 25 g-ot dörzsmozsárban homogenálunk, majd a kapott növénynedvből 2–2 ml-t 7 db kémcsőbe

töltünk.

b. A kémcsöveket gumi- vagy vattadugóval lezárjuk, és szobahőmérsékleten, kb. 20 °C-on 0, 4, 8, 24, 48, 72 és

96 órát hagyjuk. Egyes vírusok esetében az in vitro eltarthatóság hosszabb is lehet.

c. A tárolási idő letelte után a kezelt növénynedvekkel tesztnövényeket inokulálunk, majd ellenőrizzük a

fertőzőképesség csökkenését. Az uborka mozaik vírus a 72 órás, szobahőmérsékleten való tárolás után

elveszti fertőzőképességét, tehát in vitro a kevésbé stabil vírusok közé tartozik.

Eltarthatóság kiszárítással szobahőmérsékleten

A vírusok inaktiválódásának vagy in vitro eltarthatóságának egyik, gyakorlati szempontból is lényeges kérdése,

hogy mennyire viselik el a kiszáradás körülményeit.

a. Az uborka mozaik vírussal szisztemikusan fertőződött Nicotiana tabacum cv. Samsun növényeket 20–22 °C-

os szobahőmérsékleten felfüggesztve szárítjuk.

b. Minden 24. órában néhány levelet leveszünk a növényről, dörzsmozsárban homogenáljuk, majd pár csepp

vizet hozzáadva, az oldattal Nicotiana glutinosa növényeket inokulálunk.

c. A kísérletek szerint a vírus 12–50 napi szobahőmérsékleten való tárolás után is megtartja fertőzőképességét.

Egyes vírusok (pl. a dohány mozaik vírus) több évig, évtizedig is megőrzik fertőzőképességüket a száraz

levelekben.

Eltarthatóság kiszárítással alacsony hőmérsékleten (Horváth, 1976; Horváth és Besada, 1980)

a. Az előzőleg vírussal inokulált és megbetegedett növények leveleit a főér kivételével zsilettel vékony csíkokra

vagdossuk és hűtőszekrényben 2 °C és 5 °C között a CaCl2-tól perforált alumíniumlemezzel elválasztva steril

Petri-csészékben és steril szitaszöveten tároljuk.

b. A beszárított vírustartalmú levélszövetből bizonyos idő eltelte után (hetek, hónapok, évek) mintát veszünk és

a mintával azonos mennyiségű foszfát-pufferrel (0,1 M, pH 7,0) szövetpépet készítünk.

c. Az inokulációra lehetőleg lokális léziókkal reagáló tesztnövényeket használunk, s megállapítjuk a vírus

fertőzőképességét, ill. eltarthatóságát.

Megyjegyzés: Az egyes vírusok eltarthatósága (19 vírus 24 izolátum esetében) 10–87 hónap között váltakozhat

(Horváth és Besada, 1980).

5. A vírusok differenciálása tesztnövényekkel

A vírusok differenciálásának szükségessége már akkor felmerült, amikor a virológia még az ún.

szimptomatológiai korszakát élte. A növényvírusok szeparálása kezdetben mégsem tünettani ismeretekre

támaszkodott – amely bizonyára a gazda–vírus kapcsolatok nem kellő ismeretéből fakadt –, hanem kémiai-

fizikai ismeretekből indult ki (Horváth, 1967). A korai növényvirológiai kutatások megállapították, hogy

különböző vírusok, pl. az uborka mozaik vírus (cucumber mosaic cucumovirus) és a burgonya X-vírus (potato X

potexvirus) elválasztására a nátrium-permanganát, az ezüst-nitrát, a fenol és a higany-klorid alkalmas. A későbbi

vizsgálatok a különböző vírusok eltérő pH-val és alkohollal szembeni toleranciájának a megállapítására és a

vírus differenciálásban történő felhasználhatóságára vonatkoznak.

A vírusdifferenciálás során ún. virofil növényeket, relatív virofób növényeket és intermedier vírusgazdákat

használunk (Horváth, 1976). A virofil növények, pl. a Chenopodium amaranticolor (50. ábra) vagy a Nicotiana

clevelandii számos vírusra fogékonyak. Ismertek azonban olyan növények is, mint pl. a Crucianella stylosa és a

Ruta graveolens, amelyek viszonylag kevés vírusra fogékonyak. Az intermedier vírusgazdák jelentősége abban

áll, hogy az eredeti donor vírusgazdához viszonyítva kevesebb vírusinhibitort tartalmaznak, és ennélfogva

lehetővé teszik a vírusizolálást olyan virofil gazdában, amelyben egyébként a gazda nagy inhibitortartalma miatt

az izolálás alig, vagy egyáltalán nem lehetséges. Ilyen növények pl. a Cucumis sativus és a Gomphrena globosa.

Újabb besorolások diagnosztizáló, vírust fenntartó, ill. felszaporító, tesztelő, tisztító, szűrő és áthidaló



tesztnövényeket különböztetnek meg. Az ideális tesztnövény gyors és jellegzetes választ ad az inokuláció után,

amely a leveleken keletkezett lokális léziókban nyilvánul meg (Horváth, 1993a, b).

50. ábra - A: Chenopodium amaranticolor a polifág uborka mozaik vírus (cucumber

mosaic cucumovirus) és B: burgonya Y-vírus (potato Y potyvirus) virofil gazdája


A differenciáló tesztnövények azért lényegesek a vírusdiagnosztika szempontjából, mivel egyesek érzékenyek a

vírusokra, mások pedig nem fertőzhetők, ennélfogva tehát alkalmasak arra, hogy segítségükkel elkülönítsük

őket egymástól. Egyesek lokális vagy szisztemikus tünetekkel, mások lokális és szisztemikus tünetekkel

reagálnak a fertőzésre (14. táblázat).

14. táblázat - A dohány mozaik vírus és a paradicsom mozaik vírus szétválasztása

differenciáló tesztnövényekkel (Horváth, 1993a után)

Tesztnövények Vírusok1

TMV ToMV

Nicotiana sylvestris LS2 L

Chenopodium

amaranticolor L LS

Chenopodium quinoa L LS

Lycopersicon esculentum S S

Plantago major L LS

1 TMV = dohány mozaik vírus (tobacco mosaic tobamovirus); ToMV = paradicsom mozaik vírus (tomato

mosaic tobamovirus).

2 L = lokális tünetek; S = szisztemikus tünetek; LS = lokális és szisztemikus tünetek.

Johnson (1925) és Köhler (1933) szerint a burgonya X-vírus (potato X potexvirus) és a burgonya Y-vírus

(potato Y potyvirus) a Datura stramonium növényen elkülöníthető, ugyanis a burgonya X-vírusra fogékony, a



burgonya Y-vírusra pedig extrém rezisztens (immunis). A Chenopodium fajok kiválóan alkalmasak bizonyos

vírusok és vírustörzsek elkülönítésére. Horváth (1969c) megállapította, hogy a burgonya X-vírus a

Chenopodium murale-n lokális léziókat okoz, míg a burgonya Y-vírus nem mutat tüneteket. A Chenopodium

amaranticolor és a Plantago major alkalmas két tobamovirus, a dohány mozaik vírus (tobacco mosaic

tobamovirus) és a paradicsom mozaik vírus (tomato mosaic tobamovirus) elkülönítésére (vö.: 14. táblázat). A

Chenopodium quinoa gazdája az arabis mozaik vírusnak (arabis mosaic nepovirus), és alkalmas arra, hogy a

vírus egyes dísznövényeken előforduló törzseit a tünetek alapján szétválassza. A vírus rózsáról származó

izolátuma kicsi, szisztemikus érközötti léziókat okoz a tesztnövényen, míg a tulipánról származó izolátum

lokális nekrotikus tüneteket és csúcsnekrózist okoz (Thomas, 1983). A Nicotiana sylvestris szintén alkalmas

vírusok szétválasztására. A paradicsom mozaik vírus csak lokális tüneteket, a dohány mozaik vírus viszont

lokális és szisztemikus tüneteket mutat a tesztnövényen (14. táblázat). A Physalis minima tesztnövény

segítségével szétválaszthatjuk az uborka mozaik vírust (cucumber mosaic cucumovirus) a bab közönséges

mozaik vírustól (bean common mosaic potyvirus) és a bab sárga mozaik vírustól (bean yellow mosaic

potyvirus), amelyek sok esetben együtt lépnek fel. A uborka mozaik vírus jól látható tüneteket mutat a Physalis

minima növényen, a bab közönséges mozaik vírussal és a bab sárga mozaik vírussal való inokuláció után pedig

tünetmentes marad a tesztnövény. Ma már ismertek olyan gazdanövények, amelyek nemcsak az individuális

vírusfajok, hanem víruscsoportok identifikálására és elkülönítésére is alkalmasak (Horváth, 1993c).

6. A vírusok fenntartása tesztnövényeken

A növényvírusok élő növényen való fenntartásának napjaink virológiai kutatásaiban is nagy jelentősége van.

Olyan gazdanövényekre van szükség, amelyek laboratóriumi körülmények között is könnyen felnevelhetők, jól

inokulálhatók, és bennük az adott vírus megfelelően replikálódik.

A vírusok fenntartása tesztnövényeken a megfelelő gazdanövény kiválasztásával kezdődik. A tesztnövények

magvainak vetése előtt el kell végezni a szükséges magkezelési eljárásokat (koptatás, áztatás, fertőtlenítés, hideg

kezelés). A munka ütemezéséhez fontos tudni, hogy a vetést követően mikor kapunk inokulálható állapotban

levő növényeket (15. táblázat).

15. táblázat - Vírusok fenntartására alkalmas tesztnövények és azok inokulációjának

optimális ideje (Noordam, 1973 után)

Növényfaj A mag vetésétől

eltelt idő általában Fejlettségi állapot

Beta vulgaris 5 hét 5 lomblevél

Brassica pekinensis 3–4 hét 5 lomblevél

Celosia argentea 4 hét 6 lomblevél

Chenopodium

amaranticolor 2 hónap 6 lomblevél

Chenopodium quinoa 2 hónap 6 lomblevél

Cucumis sativus 10 nap szikleveles állapot

Datura stramonium 5–8 hét 1–2 lomblevél

Dianthus barbatus 6–7 hét 3 pár lomblevél

Dianthus caryophyllus 6–7 hét 3 pár lomblevél

Gomphrena globosa 10 hét 2–4 pár lomblevél



Lycopersicon esculentum 3–4 hét 2–3 lomblevél

Nicotiana glutinosa 6 hét 3–4 lomblevél

Nicotiana rustica 5 hét 3–4 lomblevél

Nicotiana tabacum cv.

Samsun 5 hét 3–4 lomblevél

Petunia hybrida 5 hét 3–4 lomblevél

Phaseolus vulgaris 10 nap 2 primer lomblevél

A növény fejlettségi stádiuma az inokuláció szempontjából rendkívül fontos. A töknek (Cucurbita pepo) pl. a

sziklevelét, a babnak (Phaseolus vulgaris) az első két lomblevelét inokuláljuk, mert az idősebb levelek nem

fogékonyak a vírusfertőzésre. A Chenopodium amaranticolor kifejlett lomblevelei a legalkalmasabbak e célra.

A tesztnövények fertőzés előtti sötétben tartása általában fokozza azok érzékenységét, s ugyanaz igaz a 36 °C-os

vagy annál magasabb hőmérsékletre is. Több gazdanövény szövetnedve általában inhibitort (gátlóanyagot)

tartalmaz, amely a vírusátvitelt akadályozza vagy meggátolja. Ezért a vírust tartalmazó növényi nedvet 1:10

arányban vízzel kell hígítani és 0,01 M-os foszfát-pufferrel pH 7-re beállítani. Az inokuláció előtt a növényre

karborundumport szórunk, majd a vírust tartalmazó növényi nedvet finoman rádörzsöljük a tesztnövény

levelére. Ezt követően az általános növényápolási munkákat (öntözés, árnyékolás, növényvédelem) kell

elvégezni a következő passzálásig.

Az egyes vírusok fenntartására más és más tesztnövényeket használnak (16. táblázat). Újabban, a számítógépek

használatának általános elterjedésével, előtérbe került a vírusok és víruscsaládok nevének rövidítése mellett a

tesztnövények botanikai nevének (nemzetségnév, fajnév, fajtanév) és családnevének rövidítése, ill. annak

nemzetközileg is elfogadott használata (Horváth, 1993a, b). Pl.: a Nicotiana tabacum cv. Xanthi fajta jelölését

(NIOTA XAN SOL) a következőképpen kell értelmezni: NIO a Nicotiana nemzetség rövidítése, a TA a

tabacum fajnévre utal, a XAN a fajta nevét jelenti, a SOL rövidítés pedig a Solanaceae család nevének

rövidítése (16. táblázat).

16. táblázat - Néhány vírus fenn tarthatósága gazdanövény ékben

Vírus neve Gazdanövény és kódja1

Bab közönséges mozaik vírus

(bean common mosaic potyvirus)

Phaseolus vulgáris (PHSVX LÉG),

Nicotiana clevelandit (NIOCL SOL)

Beléndek mozaik vírus

(henbane mosaic potyvirus)

Chenopodium amaranticolor (CHEGI CHE),

Datura stramonium (DATST SOL),

Nicotiana sylvestris (NIOSI SOL),

Nicotiana tabacum cv. Xanthi-nc

(NIOTAXAN SOL)

Burgonya M-vírus (potato M

carlavirus) Lycopersicon esculentum (LYPES SOL)

Burgonya S-vírus (potato S

carlavirus) Nicotiana clevelandit (NIOCL SOL)



Burgonya X- vírus (potato

üpotexvirus) Datura stramonium (DAST SOL),

Gomphrena globosa (GOMGL AMA)

Burgonya Y- vírus (potato Y

potyvirus) Nicotiana tabacum cv. Xanthi-nc (NIOTA

XAN SOL)

Dohány gyűrűsfoltosság vírus

(tobacco ringspot nepovirus)


Nicotiana tabacum cv. Xanthi-nc (NIOTA

XAN SOL)

Dohány mozaik vírus

(tobacco mosaic tobamovirus)

Nicotiana sylvestris (NIOSI SOL),

Nicotiana tabacum cv. Samsun (NIOTA

SAM SOL)

Karfiol mozaik vírus

(cauliflower mosaic caulimovirus)

Brassica campestris (BRSRA CRU)

Lucerna mozaik vírus

(alfalfa mosaic alfamovirus)

Chenopodium quinoa (CHEQU CHE),

Nicotiana benthamiana (NIOBE SOL),

Nicotiana tabacum cv. Xanthi-nc (NIOTA

XAN SOL)

Melandrium sárgafoltosság vírus

(Melandrium yellow fleck

bromovirus)

Gomphrena globosa (GOMGL AMA),

Melandrium album (MELAL CÁR)

Paradicsom mozaik vírus

(tomato mosaic tobamovirus)

Nicotiana tabacum cv. Samsun (NIOTA

SAM SOL)

Retek mozaik vírus

(radish mosaic comovirus)

Brassica campestris (BRARA CRU)

Répa mozaik vírus (beet mosaic

potyvirus) Spinacia oleracea (SPQOL CHE)

Rozsnok mozaik vírus

(brome mosaic bromovirus)

Hordeum vulgare (HORVX GRA)

Tarlórépa sárga mozaik vírus

(turnip yellow mosaic tymovirus)


Chenopodium quinoa (CHEQU CHE),

Brassica rapa (BRSRA CRU)

Uborka mozaik vírus

(cucumber mosaic cucumovirus)

Nicotiana clevelandit (NIOCL SOL),

Nicotiana megalosiphon (NIOSU SOL)

Zeller mozaik vírus (celery mosaic Ammi május (ANIMAUMB)



potyvirus)

1 Anövények kódja megtalálható Horváth (1993b) dolgozatában.

7. Gazdanövénykörök

Egyes növények általában érzékenyek, mások ellenállók (immunisak) a vírusok fertőzésére. A vírusfertőzésekre

fogékony gazdanövények csaknem minden növénycsaládban megtalálhatók. Horváth (1993a) által a vírus–

gazda kapcsolatok szempontjából fontosnak tartott nemzetségek az alábbiak: Amaranthus, Capsicum,

Chenopodium, Cucumis, Cucurbita, Gomphrena, Lycium, Nicotiana, Phaseolus, Pisum, Physalis, Solanum,

Tetragonia, Vigna. A biotesztek során a legszélesebb körben alkalmazott gazdanövények a felhasználás

gyakoriságának sorrendjében a következők: Chenopodium quinoa, Chenopodium amaranticolor, Nicotiana

clevelandii, Phaseolus vulgaris, Nicotiana glutinosa, Gomphrena globosa, Cucumis sativus, Datura

stramonium, Pisum sativum, Nicotiana tabacum, Chenopodium murale, Tetragonia expansa, Nicotiana tabacum

cv. White Burley, Nicotiana tabacum cv. Xanthi-nc, Vigna sinensis.

A könyv korlátozott terjedelme miatt nem tudunk kitérni valamennyi gazdakör jellemzésére, így csak a

tesztnövényekkel végzett virológiai vizsgálatok során példaként a leggyakrabban használt Chenopodium fajokat

részletezzük. A Chenopodium fajok és a vírusok között 123 gazda–vírus kapcsolatot (99 lokális, valamint 24

lokális és szisztemikus) határoztak meg (Horváth, 1986). A Chenopodium fajok közül leggyakrabban az

alábbiakat használják: C. album, C. amaranticolor, C. ambrosioides, C. capitatum, C. foetidum, C. foliosum, C.

hybrida, C. murale, C. quinoa. Edwardson és Christie (1991) szerint a Potyvirus nemzetségből 141 vírus

kapcsolódik a Chenopodiaceae családhoz, amelyből 68 vírus patogén a C. amaranticolor, ill. C. quinoa

növényekre. A rozsnok mozaik vírus (brome mosaic bromovirus) egyike azoknak a fűféléken előforduló

vírusoknak, amely lokális léziókat idéz elő a C. amaranticolor, a C. quinoa és a C. album növényeken.

Ugyancsak e három növény a gazdája a lucerna mozaik vírusnak (alfalfa mosaic alfamovirus) is. Vannak

természetesen olyan vírusok is, amelyek nem fertőzik meg a Chenopodium fajokat, ilyen pl. a lucerna látens

vírus (alfalfa latent carlavirus). A Chenopodium quinoa és a C. amaranticolor kevesebb inhibitort tartalmaznak,

ezért igen jelentős vírusgazdák. Érzékeny indikátorai a fás szárú növények vírusainak, alacsonyabb

víruskoncentráció esetén is alkalmasak a vírusok kimutatására. A Chenopodium quinoa a fonál alakú vírusok, a

C. amaranticolor a poliéder alakú vírusok meghatározó tesztnövényei. Mindkét növény jól használható a

rutinteszteléseknél és a dísznövényvírusok diagnosztizálásánál. A Chenopodium murale és a C. album fontos

gazdanövénye a paradicsom bronzfoltosság vírusnak (tomato spotted wilt tospovirus). Thomas (1983) 47

dísznövényvírust tesztelt, amelyek közül 19-nek volt a Chenopodium quinoa a gazdája és 12-nek a C.

amaranticolor. Megemlítjük, hogy az utóbbi években a Nicotiana benthamiana a legjelentősebb

vírusdiagnosztikai tesztnövényként vált ismertté. Horváth (1993d) adatai szerint a nevezett növény 24

víruscsoportba (-nemzetségbe) tartozó 203 vírussal szemben fogékony.

8. A fás szárú növények virológiai ellenőrzése

A fás szárú növények (szőlő, gyümölcs) gazdasági jelentősége igen nagy. A vírus és fitoplazma eredetű

betegségek a gyümölcstermesztést és szőlőtermesztést súlyosan veszélyeztetik (Németh, 1979, 1986; Lehoczky,

1992). Az ellenük való védekezés egyetlen módja a vírusmentes szaporítóanyag előállítása, ill. használata (Kiss,

1998).

A fás szárú növények virológiai tesztelése és vírusmentesítése eltér a lágy szárú növények vizsgálatától, ezért

ezzel külön fejezetben foglalkozunk (Lehoczky és Beczner, 1980; Lehoczky, 1981; Németh és Kölber, 1998;

Lázár, 1998; Voigt és Kállay, 1998).

8.1. A szőlő virológiai ellenőrzésének rendszere

A vírusok és más oltással átvihető fertőző kórokozók (viroidok, fitoplazmák) a szőlő termesztett fajtáinak

jelentős mértékű – az egyes vírusoktól és a fertőzöttség mértékétől függően évenként 10–80%-os – leromlását

okozzák (Lehoczky, 1992; Lázár, 1998). A termesztés számos területén jelentkezhetnek a vírusbetegségek

gazdasági következményei, amelyek a fokozatos tőkeleromlásban és -elhalásban, a hozam csökkenésében, a

minőség gyengülésében, a tőkék produktív időszakának megrövidülésében, az oltványkészítés

eredményességének csökkenésében, a szaporítóanyag gyökeresedőképességének romlásában, a beteg tőkék

környezeti tényezőkkel szembeni ellenálló képességének csökkenésében nyilvánulnak meg.



A szőlőtermesztő államok, így hazánk is, kidolgozta a szőlő növény-egészségügyi vizsgálatának programját,

amely tartalmazza a szőlő virológiai szűrését (ellenőrzését) is (51. ábra).

51. ábra - A szőlő virológiai ellenőrzésének rendszere [Lázár János szívessége folytán]

8.1.1. A szőlő üvegházi tesztelése

A tesztelésre kijelölt tőkék előszűrését mechanikai vírusátvitellel lágy szárú tesztnövényeken kell elvégezni

(Lázár, 1996). Ez a tevékenység egész évben végezhető, amennyiben a nyári időszakban az üvegház

hőmérséklete nem haladja meg a 25 °C-ot. A téli időszakban vizsgálatba vont fajta, ill. klón ellenőrzése hajtatott

dugványainak leveleiből történik. Az április–május hónapban (virágzásig) a szabadban fakadó tőkék

hajtáscsúcsi (vitorla alatti 3–4. levél), ill. később a hónalj levelei a legalkalmasabbak a vizsgálatokra.

A tesztelés menete

a. A levélminta felületi fertőtlenítése 2%-os NaOH-val és folyóvizes öblítéssel.

b. A minta homogenizálása grammonként 3 ml 0,067 M-os foszfát-puffer (pH 7,2) és 3%-os polietilén-glikol

(PEG 6000) hozzáadásával.



c. A lágy szárú tesztnövények (Chenopodium amaranticolor, C. quinoa, Cucumis sativus cv. Delicatess,

Gomphrena globosa, Nicotiana clevelandii, N. glutinosa, N. tabacum cv. Samsun, Phaseolus vulgaris cv.

Beautiful) inokulálása, majd leöblítése vízzel.

d. A tünetek folyamatos értékelése.

Megjegyzés: a fás szárú növényekben előforduló inhibítorok (gátlóanyagok, amelyek megnehezítik vagy

megakadályozzák a vírusátvitelt) semlegesítésére ajánlott a koffein (1–3% w/v), a tojásalbumin (0,3–1,0% w/v),

a nikotin (1–2% w/v) és a 0,01 M, foszfát-puffer pH 7,0 (Dijkstra és De Jager, 1998).

8.1.2. A szőlő szabadföldi tesztelése

A szőlő fás szárú növényeken történő tesztelése lehetőséget ad a fertőzöttség vagy a vírusmentesség

megállapítására. E tesztelési módszer alapja az egyes szőlőfajták (indikátorok) fokozott érzékenysége, ami jól

látható elváltozásokban (levéldeformáció, mozaik, törpe növés) nyilvánul meg. A szőlőfajták virológiai

ellenőrzéséhez a tesztelésre kerülő fajták tőkéit a törzsültetvények vizuális szelekciójával jelölik ki. A szelekciót

két alkalommal, június elején-közepén (virágzás) és szeptember közepén-végén (érés) kell végezni.

A szőlő vírusbetegségeinek kimutatásához 9 indikátorfajtát (17. táblázat) használnak 5 ismétlésben. A

vizsgálatba vont tőke vesszőiből az összehasonlító ellenőrzéshez 5 db kontrollnövény beállítása is szükséges.

17. táblázat - A magyar vírusellenőrzési rendszerben használt fás szárú indikátorokkal

kimutatható szőlőpatogén vírusok1

Fás szárú indikátorok Vírusok

Siegfriedrebe (FS 4 201-39) Szőlő fertőző leromlás vírus

Arabis mozaik vírus


Szőlő bulgáriai látens vírus

Vitis rupestris cv. St. George Paradicsom fekete gyűrűs vírus

Szőlő fertőző leromlás vírus

Szőlő foltosság vírus



vírus

Vitis vinifera cv. Pinot noir

(és egyéb vörös fajták)

Szőlő levélsodródás vírus

Szőlő króm mozaik vírus


Paradicsom fekete gyűrűs vírus


Vitis vinifera cv. Chardonnay Szőlő fertőző leromlás vírus


Paradicsom fekete gyűrűs vírus



Vitis riparia cv. Glorie de

Monpellier Szőlő érmenti mozaik vírus

Szőlő bulgáriai látens vírus

Vitis vinifera cv. Jubileum 75 Szőlő króm mozaik vírus

Szőlő vonalas mintázottság

vírus

Kober 5BB (V. berlandieri x V.

riparia) Szőlő faszöveti barázdáltság

vírus

LN 33 (Couderc 1613 x V.

berlandieri) Szőlő parakérgűség vírus

Szőlő enációs vírus


vírus

110 R (V. rupestris x V.

berlandieri) Szőlő érnekrózis víru

1 A szőlővírusokkal kapcsolatos hazai információk Martelli és Lehoczky (1968), Lehoczky és Beczner (1980),

Beczner és Lehoczky (1981), Lehoczky et al. (1984), Lehoczky és Burgyán (1986) és Lehoczky (1992)

munkáiban találhatók meg. Köszönettel tartozom néhány adat rendelkezésre bocsátásáért dr. Kobza Sándornak

(Budapest).

A tesztelés menete

a. A tesztelésre kerülő tőkék és az indikátorfajták beérett vesszőinek begyűjtése.

b. A vesszők előkészítése 24 órás, vízben történő áztatással, majd 5 órán keresztül 0,5%-os Solvochin Extra-

kezeléssel.

c. Téli tárolás hűtőtárolóban, 1–2 °C-on.

d. Tavasszal az indikátorfajták vesszőinek előkészítése: 2 rügyes dugványok vágása, alsó rügy „kivakítása”. Az

alsó rügy alatt 0,5–1 cm-rel kell „megtalpalni” a vesszőt, a felső rügy felett 2–3 cm-es csonkot kell hagyni.

e. A kétrügyes (indikátor) dugványvessző felső, ép rügye alatt 0,5–1 cm-re egy 12–15 mm hosszú metszlapot

kell készíteni.

f. A vizsgálandó tőke vesszőjéről az indikátorfajtával megegyező pozícióból történő, az arról leválasztott

metszlappal azonos méretű szövetpajzs készítése.

g. A szövetpajzs rugalmas fóliával történő rögzítése az indikátor dugványvesszőhöz.

h. A dugványok gyökereztető közegbe (fóliakonténerbe) helyezése.

i. A dugványok hajtatása üvegházban, növényasztalon, talpmeleg biztosításával.

j. A 4–6 lombleveles, begyökeresedett dugványok kiültetése szabadföldi iskolába.

k. A kísérlet értékelése két éven keresztül, évente két alkalommal.

8.2. A gyümölcsfajok virológiai ellenőrzésének rendszere

A vírusmentes szaporítóanyag az alapja a versenyképes, jó minőségű termés előállításának. A fejlett

gyümölcstermesztő országokban – köztük hazánkban is – már több évtizede kialakítottak olyan központosított,

zárt vírusmentesítési rendszereket, ahol teljes koordinációban történik a fajtaminősítés, a törzskönyvezés, a



növény-egészségügyi ellenőrzés, amelyekhez szervesen kapcsolódik az előállított vírusmentes faiskolai termék

igazolvánnyal való ellátása.

8.2.1. A gyümölcsfajok üvegházi, lágy szárú biológiai tesztelése

A vizsgálatokhoz lágy szárú indikátornövényeket használnak. A vírusátvitel során a mechanikai módszert

alkalmazzák.

Az almatermésűek lágy szárú biológiai tesztelése (Bach és Szőnyegi, 1996)

a. A tesztelés során használt lágy szárú tesztnövények a következők: Cucumis sativus (mozaik és NEPO

vírusok), Chenopodium quinoa [alma klorotikus levélfoltosság vírus (apple chlorotic leaf spot trichovirus);

alma törzsbarázdáltság vírus (apple stem grooving capillovirus) és NEPO vírusok] és a Celosia argentea

(alma klorotikus levélfoltosság vírus).

b. A vizsgálatokat március–április hónapokban kell elvégezni.

c. A tesztelésnél használt növényi rész a virágszirom, amelyhez 1 : 5 arányban stabilizáló puffer szükséges. Az

almástermésűek esetében kétféle puffert használnak: 0,01 M Tris/HCl-puffer (pH 8,5) + 0,005 M MgSO4 +

1% koffein; 0,01 M Tris/HCl-puffer (pH 8,5) + 0,005 M MgSO4 + 0,1% Na2SO3 + 0,1% aszkorbinsav + 1%

ni-kotin.

d. A virágszirmokat porcelánmozsárban, a stabilizáló puffer jelenlétében kell szétdörzsölni, és a kapott

szövetnedvvel inokulálni a tesztnövények leveleit.

e. A Cucumis sativus esetében 20, a Chenopodium quinoa és a Celosia argentea esetében 6-6 ismétlés

beállítása szükséges.

f. A tesztnövényeket a vizsgálat időtartamára (kb. 20 napra) 20–22 °C-os, vektormentes üvegházban kell

elhelyezni.

A csonthéjasok lágy szárú biológiai tesztelése

a. A tesztelés során használt lágy szárú tesztnövények a következők: Cucumis sativus [Prunus nekrotikus

gyűrűsfoltosság vírus (Prunus necrotic ringspot ilarvirus); szilva törpülés vírus (prune dwarf ilarvirus) és a

NEPO vírusok), Chenopodium quinoa (Prunus nekrotikus gyűrűsfoltosság vírus, alma klorotikus

levélfoltosság vírus és a NEPO vírusok), és Celosia argentea (alma klorotikus levélfoltosság vírus)].

b. A vizsgálatokat február végétől április végéig kell elvégezni.

c. A tesztelés során használt növényi részhez (meghajtatott rügyek levelei) 1: 3 arányban stabilizáló puffert kell

adni. A csonthéjasok esetében használt puffer a következő: 1/5 M foszfát-puffer (pH 7,5) és 0,005 M DIECA

+ 0,001 M N,N-difeniltiokarbamid + 0,03 M koffein 1:1:1 arányban.

d. A meghajtatott rügyek leveleit porcelánmozsárban, a stabilizáló puffer jelenlétében szét kell dörzsölni és a

kapott szövetnedvvel inokulálni a tesztnövények leveleit.

e. A Cucumis sativus esetében 20, a Chenopodium quinoa és a Celosia argentea esetében 6–6 ismétlés

beállítása szükséges.

f. A tesztnövényeket a vizsgálat időtartamára (kb. 20 napra) 20–22 °C-os vektormentes növényházba kell

elhelyezni.

8.2.2. A gyümölcsfajok üvegházi, fás szárú tesztelése

Az oltás nyugalmi állapotban lévő, cserepes és jól meggyökeresedett alanyokra történik. A vírusátvitel történhet

kettős oltással, amely akkor használatos, ha az alany, a vizsgált fa és az indikátor azonos fajhoz tartoznak. A

kéregátültetést akkor kell használni, ha az alany és a vizsgált fa nem azonos fajhoz tartozik. A gyökéroltást a

Golden Delicious indikátoron, az alma seprűsödés fitoplazma (apple proliferation phytoplasma) kimutatására

használják. E módszer kivitelezése a következő: a vizsgálandó növényekből márciusban szedett

gyökérdarabokat rá kell oltani almamagoncgyökerekre kézben oltással, nyelves párosítással, majd ezt követően

az alanyokat be kell oltani a Golden Delicious indikátorral.



Az üvegházi fás szárú biológiai tesztelés során használt indikátorokat, a kimutatható kórokozókat és a kísérlet

körülményeit a 18. táblázat tartalmazza.

18. táblázat - Gyümölcsfajok üvegházi fás szárú biológiai tesztelése (Bach és Szőnyegi,

1996 után)1

Indikátornövény Kimutatható kórokozók Ismétlés Hőmérsékle

t °C Időtartam

Alma

Malus pumila

R 12740-7A

Spy 227

Alma klorotikus levélfoltosság vírus

(apple chlorotic leaf spot trichovirus)

Alma 227 epinasztia és pusztulás vírus

(apple spy 227 epinasty and decline

virus)

Alma törzsgöndörödés vírus

(apple stem pitting virus)

3

3

18–20

22–26

4 hét

3 hónap

Virginia Crab Alma törzsgöndörödés vírus


Alma törzsbarázdáltság vírus

(apple stem grooving capillovirus)

3 22–26 4 hét

Golden Delicious

Pyronia veitchii

Alma seprűsödés fitoplazma

(apple proliferation phytoplasma)

Alma fapuhulás fitoplazma

(apple rubbery wood phytoplasma)


(apple chlorotic leaf spot capillovirus)

4

3

18–20

22

4 hónap

10 hét

Körte

Pyronia veitchii

Pyrus calleriana

Körte érsárgulás vírus

(pear vein yellows virus)

Alma 227 epinasztia és fapusztulás

vírus

(apple 227 spy epinasty and decline

virus)

Alma fapuhulás fitoplazma

(apple rubbery wood phytoplasma)

Körte érsárgulás vírus

(pear vein yellows virus)

3

3

23

22

10 hét

4 hét



Cseresznye és

meggy Prunus

persica

GF 305, vagy

Elberta magonc

Prunus tomentosa

IR 473/1, vagy

IR 474/1

Prunus nekrotikus gyűrűsfoltosság

vírus

(Prunus necrotic ringspot ilarvirus)

Szilva törpülés vírus

(prune dwarf ilarvirus)

Földieper látens gyűrűsfoltosság vírus

(strawberry latent ringspot nepovirus)

Alma szárgöndörödés vírus



vírus






5

3

20

22

3 hónap

3 hónap

Szilva, kajszi és

őszibarack

Prunus persica

GF 305 vagy

Elberta

Prunus tomentosa

IR 473/1, vagy

IR 474/1


vírus






Földieper látens gyűrűsfoltosság vírus

(strawberry latent ringspot nepovirus)

Alma szárgöndörödés vírus


Szilva himlő vírus (plum pox

potyvirus)


vírus




5

3

20

22

3 hónap

3 hónap





1 Köszönettel tartozom dr. V. Németh Máriának (Budapest) kritikai észrevételeiért.

8.2.3. A gyümölcsfajok szabadföldi, fás szárú tesztelése

A gyümölcsfák virológiai tesztelésénél alkalmazott átviteli módszer megválasztását befolyásolja az

indikátornövény típusa, az indikátor és az alany faja, a kimutatandó vírus és az, hogy a kórokozó a fa melyik

részében helyezkedik el, valamint a környezeti körülmények.

Átviteli módszerek

a. Egyszerű szemzés abban az esetben alkalmazható, ha az indikátorként használt alany és a vizsgálandó fa

azonos fajhoz tartoznak, vagy legalábbis szemzésnél kompatibilisek (pl. GF 305 – Myrobalan). A

Shirofugen-tesztnél inkompatibilis partnerek esetében is használható az egyszerű szemzés, mert a

vírusátvitelhez elegendő a Prunus serrulata var. Shirofugen-indikátor és a vizsgálandó fáról származó szem

3–4 napos öszszetapadása.

b. Kettős szemzést akkor alkalmazunk, ha az indikátor valamely nemes faj vagy vad faj. Ebben az esetben

egymás fölé kell szemezni a vizsgált fáról és az indikátorról származó szemeket, majd a következő évben a

kihajtás után a vizsgálandó fáról származó szemből kihajtó hajtást (az alsót) vissza kell csípni.

c. A kettős oltás ugyanazon az elven alapszik, mint a kettős szemzés. Az indikátort kézben kell oltani a

megvizsgálandó fa oltóvessző darabjára, majd ez a kettős kombináció kerül egy vírusmentes alanyra. Ez a

módszer szabadföldön csak módszertani kísérleteknél használatos, elterjedtebb az üvegházi fás szárú

teszteléseknél.

d. Kéregátültetés akkor használandó, ha az alany és a vizsgált növény különböző fajhoz tartoznak. Legkevesebb

3-4 nyelv alakú, szem nélküli kéregpajzsot kell készíteni, és azt az alanyon megfelelően bevágott, lehetőleg

spirálisan elhelyezett bemetszésekbe kell helyezni. Ha nem az alany az indikátor, akkor a kéregpajzsocskák

fölé kell szemezni az indikátort.

e. Indikátorkombinációk alkalmazása esetén a fa teszteléséhez szükséges növényszámot csökkentik. E módszer

használata esetén a kettős szemzéssel kapott egyéves indikátorsuhángokra augusztusban 60–70 cm

magasságban újabb indikátorszem kerül.

Szabadföldi gyorstesztek (Shirofugen-teszt, GF 305-teszt, GF 31-teszt)

Ezek a módszerek a csonthéjas gyümölcsfajok gazdaságilag legsúlyosabb vírusbetegségeinek kimutatására

alkalmasak, és aránylag rövidebb időt igénybevevő, nagy tömegben végezhető vizsgálatok.

Shirofugen-teszt

A Prunus nekrotikus gyűrűsfoltosság vírus (Prunus necrotic ringspot ilarvirus) és a szilva törpülés vírus (Prune

dwarf ilarvirus) kimutatására alkalmas. A tesztelés időtartama 6 hét. A terület kiválasztásánál izolációs

távolságra nincs szükség, mert a Shirofugen-növények vektorokkal nem fertőződnek, a fák nem virágoznak,

ezért pollenfertőzés sem lehetséges. A lúgos kémhatású talajok nem felelnek meg a neveléshez.

Az alanyok közül a Mazzard F 12/1 a legmegfelelőbb. A növények térállása lehetőleg 1,5 × 1 m legyen. Az

alanyok szemzése júliusban–augusztusban történik, a gyökérnyakba. Az egyéves suháng korig a növények

faiskolai nevelése a szokásos körülmények között történik. Az 1 éves Shirofugen-suhángot tavasszal 80 cm

magasságban vissza kell vágni, majd a legfelső 3–4 rügy kivételével a törzset fel kell tisztítani. A vizsgálandó

fákról 5–5 szem kerül egymás fölé 2–3 cm távolságra a lelevelezett hajtásokra. Egy hajtás 1–3 fa vizsgálatára

elegendő. A szemzés ideje július vége, augusztus eleje. A kiértékelést a szemzés után 6 héttel kell elvégezni, a

szem körüli mézgásodás, majd a szemzés felvágása után a szem körüli szövetnekrózis alapján (Németh, 1979).

GF 305-teszt



A szilva himlő vírus (plum pox potyvirus), a szilva törpülés vírus (prune dwarf ilarvirus) és a Prunus nekrotikus

gyűrűsfoltosság vírus (Prunus necrotic ringspot ilarvirus) kimutatására alkalmas. A tesztelés időtartama 1 év. A

terület kiválasztásánál fontos az 500 m-es izolációs távolság betartása (a szilva himlő vírus fertőzéstől való

védelem érdekében). A talaj nematódamentessége is fontos. A telepítéshez vírusmentes mag vagy magoncalany

szükséges. Kívánatos térállás: 0,8 × 0,5 m. A faiskolai nevelést a szokásos módon végzik. A GF 305

magoncokra az átvitel augusztus hónapban egyszerű szemzéssel vagy kéregátültetéssel történik. Egy fa

vizsgálatához 5 növényt kell felhasználni. A tüneteket az alanyon fejlődött hajtások mutatják, amelyek

kiértékelését 15–20 cm-es és 30–40 cm-es hajtáshosszúságnál kell elvégezni.

GF 31-teszt

A szilva himlő vírus (plum pox potyvirus) kimutatására alkalmas. A tesztelés időtartama 1 év. A terület

kiválasztásánál 500 m-es izolációs távolság betartása fontos (a szilva himlő vírus fertőzéstől való védelem

érdekében). A talaj nematódamentessége is fontos. A telepítés fás dugványból előállított vírusmentes GF 31

alanyokkal, 0,8 × 0,5 m-es térállásban történik. A faiskolai nevelést a szokásos módon végzik. A magoncokra az

átvitel egyszerű szemzéssel, augusztus hónapban történik. A beszemezett növényeket a következő év tavaszán a

szemzés felett 15–20 cm-re vissza kell vágni. Kihajtás után a szemzés alatti részt le kell „vadalni”, a szemzést

vissza kell csípni, a szemzés felett két, ellenkező oldalon elhelyezkedő hajtást meg kell hagyni, a többi hajtást

pedig el kell távolítani. Augusztus közepén a meghagyott két hajtást le kell levelezni. A bonitálás augusztus

végén, szeptember elején történik addig, amíg a hajtások kérge még zöld színű. Vírusfertőzés esetén a hajtások

alsó részén, a kérgen rozsdabarna parásodás, repedezettség látható.

Szabadföldi főteszt

Jelenlegi ismereteink szerint ez a gyümölcstermő növények legmegbízhatóbb biotesztelési módszere. A

központi törzsültetvények kontrollvizsgálatainál alkalmazzák, mert idő-, munka- és területigényes. A tesztelés

időtartama, a telepítés és szemzés évét is beleszámítva, 4 év. A bonitálások az almástermésűeknél júniustól

szeptember közepéig tartanak. A csonthéjas indikátornövényeknél, a tünetek értékelése május eleje és június

vége között 3 alkalommal történik.

9. Szántóföldi növények virológiai ellenőrzése

A szántóföldi növények vírusfertőzöttsége az utóbbi években jelentősen megnövekedett. Ennek következtében

az egyes növényeken fellépő mennyiségi és minőségi veszteségek igen jelentősekké váltak (Pennazio et al.,

1996). Ez indokolja azt, hogy a fás szárú növényeken kívül a szántóföldi növények vírusmentesítése is képezze

a növényvédelem szerves részét. Ezt támasztják alá azok a szántóföldi növényfajták állami elismerését,

fenntartását, vetőmag-előállítását és -forgalmazását, virológiai ellenőrzését és vírusmentességi igazolási

rendszerét szabályozó rendeletek [FM 88/1997. (XI. 28.)], a növényvédelemről szóló 1988. évi 2. törvényerejű

rendelet, valamint ennek végrehajtásáról szóló rendelet [FM, 89/1997. (XI. 28.)], amelyek egyértelműen

megszabják azokat a feladatokat, amelyek az egészséges, vírusmentes növények termesztését segítik elő.

A szántóföldi növények közötti jelentős biológiai és termesztési eltérések miatt az ellenőrzési rendszerek is

kisebb-nagyobb mértékben eltérnek egymástól. Több növény esetében az ellenőrzési rendszerek még nincsenek

kidolgozva, vagy csak részben valósultak meg. Az egyes növényekkel (gabonafélék, burgonya, kukorica,

hüvelyes növények, szálas takarmánynövények) kapcsolatos vírusmentesítési rendszerekről Pocsai (1998)

közleménye adott áttekintő tájékoztatást. Az alábbiakban – e munkát felhasználva – áttekintést adunk a

modellnövényként szereplő burgonyára vonatkozó vírusmentesítési rendszer lényeges szempontjairól.

9.1. A burgonya virológiai ellenőrzésének általános szempontjai

A burgonya azok közé a növények közé tartozik, amelynek affinitása a különböző vírusokkal szemben igen

nagy (Horváth, 1988, 1990, 1995; Horváth és Kazinczi, 1999). A vegetatív szaporítószervekkel és levéltetvekkel

terjedő vírusok elleni védekezés legfontosabb módja az egészséges (vírusmentes) vetőburgonya előállítása és

használata. A burgonya egészségi állapotának fenntartására az alábbi rendszabályokat kell betartani:

a. Burgonya-vetőgumó csak olyan területen szaporítható, amelyen a szaporítást megelőző négy évben

burgonyát nem termeltek.



b. Az elővetemények között dohány (Nicotiana tabacum), paprika (Capsicum annuum), paradicsom

(Lycopersicon esculentum), tojásgyümölcs (Solanum melongena), cukorrépa (Beta vulgaris), kukorica (Zea

mays) és lucerna (Medicago sativa) nem szerepelhet.

c. A szaporítótáblán belül elhelyezett, különböző fajtájú és szaporítási fokozatú, valamint különböző helyekről

(vetőgumó-előállító hely) származó, fémzárolt vetőgumótáblák (parcellák) között 1,5 m izolációs távolságot

kell hagyni.

d. A vetőgumótábla széleitől 200 m távolságon belül Solanaceae családba tartozó növényeket (pl. burgonya,

paradicsom, dohány, paprika) nem lehet termelni.

e. A vetőgumót előállító szaporítótáblában a levéltetűvektorok megjelenését ellenőrizni kell, és veszélyes

populációszám elérése esetén inszekticidekkel szükséges ellenük védekezni.

f. Szártalanításos módszerrel történő vetőgumó-szaporítás esetén – amelyet általában vetőgumó-előhajtatás és

korai ültetés előz meg – a burgonya fejlődését agrotechnikai módszerekkel és megfelelő tápanyag-

utánpótlással elő kell segíteni, hogy a levéltetű-vektorok tömeges rajzásának idejére a szártalanítás

elvégezhető legyen.

9.1.1. A burgonya vírusellenőrzésének rendszere

A burgonya vírusfertőződésének ellenőrzésénél az alábbiakra kell tekintettel lenni:

a. A vetőgumó szaporítótábláinak szimptomatológiai (tünettani) ellenőrzését a tünetek megjelenésekor

(virágzáskor) és a burgonyagumók fiziológiai beérésekor kell elvégezni.

b. A mintavételi terek száma a vetőburgonya-tábla nagyságától függ; 20 ha-ig 4 mintateret, és ezt követően

további 10 ha-onként 2 mintaterületet kell kijelölni.

c. Az egyes mintaterek nagyságát 200 burgonyanövény tenyészterülete adja meg.

d. A vizsgált (ellenőrzött) mintatereken fel kell jegyezni a tüneteket (tünettani csoportonként), és meg kell

határozni a beteg növények előfordulását %-ban. Ezt jegyzőkönyvben rögzíteni kell.

e. A tünettani vizsgálatokat laboratóriumi vizsgálatokkal kell kiegészíteni; ehhez a szabadföldről vizsgálati

mintákat kell begyűjteni.

f. Az ELISA-féle szerológiai, laboratóriumi vizsgálatot ki kell terjeszteni a következő vírusokra: burgonya

levélsodródás vírus (potato leafroll polerovirus), burgonya Y-vírus (potato Y potyvirus), burgonya A-vírus

(potato A potyvirus), burgonya M-vírus (potato M carlavirus), burgonya S-vírus (potato S carlavirus),

burgonya X-vírus (potato X potexvirus), dohány rattle vírus (tobacco rattle tobravirus) és lucerna mozaik

vírus (alfalfa mosaic alfamovirus). Ezekhez a vizsgálatokhoz 30 ha-onként 250 növény- (levél- vagy gumó-)

mintát kell megvizsgálni.

g. A vírusfertőzöttség mértéke a szuperelit szaporítási fokozatnál a 0,2%-ot, az elit szaporítási fokozatnál a

0,5%-ot, az utántermesztésnél a 2,0%-ot nem haladhatja meg. Ha ezek a határértékek nagyobbak, akkor a

burgonyatáblát a továbbszaporításból ki kell zárni.

h. A vírusfertőzöttség mértéke alapján alkalmasnak minősített vetőgumó-szaporító területek termését gumó-

vírusvizsgálattal is ellenőrizni kell.

Nem szabad figyelmen kívül hagyni, hogy a burgonya és általában a növények vírusellenőrzési és

vírusmentesítési módszere alapvetően a) diagnosztikai és biotechnológiai technikák, valamint b)

vírusmentesítési technikák együttes alkalmazásából áll. A vírusdiagnosztikai technikák (pl. szimptomatológia,

biotesztek, szerológiai és elektronmikroszkópiai vizsgálatok, molekuláris technikák, nukleinsav-hibridizáció,

elektroforezis, PCR-technika stb.) a vírusfertőzöttség pontos meghatározását, a vírusmentesítési technikák

(hőterápia, kemoterápia, merisztématenyésztés stb.) pedig a vírusok eltávolítását eredményezik. Ezeket a

módszereket a könyv egyes fejezeteiben részletesen ismertetjük.


9. fejezet - Elektronmikroszkópos módszerek

A növényvírusok a gazdanövényben olyan szöveti elváltozásokat idézhetnek elő, amelyeket elektronmikroszkóp

segítségével megfigyelhetünk. Egy új vírus leírása ma már elképzelhetetlen elektronmikroszkópos vizsgálatok

nélkül. A növényvírusok rendszerét összefoglaló tanulmányok, kézikönyvek is tartalmaznak

elektronmikroszkópos felvételeket minden csoport egy-egy fontosabb, jellegzetes képviselőjéről (Schmidt,

1980a; Milne, 1984, 1993; Francki et al., 1985). A vírusfertőzés hatására bekövetkezett kóros változások a

növény élettani működésében mindig valamilyen szerkezeti eltéréshez kapcsolhatók. A beteg növény

anyagcsere-folyamataira vonatkozó mérések és az ultrastrukturális vizsgálatok eredményeinek együttes

elemzése teljesebb képet adhat a fertőzés hatásmechanizmusáról. Ezért az elektronmikroszkópos kutatómunkán

alapuló adatok nem önállóan, hanem többnyire összetett vizsgálatok részeredményeként értékelhetők. A

növényvírusok osztályozása alakjuk, méretük, felépítésük, szerológiai jellemzőik, genetikai szerkezetük és

újabban replikációs stratégiájuk szerint történik. Ezért a növényvirológia számára új, még le nem írt vírusok

rendszerbe sorolása részben elektronmikroszkópiai technikákon alapul. Ahhoz, hogy ilyen jellegű vizsgálatokat

végezzünk, tisztában kell lennünk a növényvírusok morfológiájával, amelyet csak elektronmikroszkóppal

tudunk megállapítani. A virionok nukleinsavból (vírusgenom) és az azt körülvevő fehérjeburokból állnak. A

fehérjeburok (kapszid) köpenyfehérje-alegységekből (kapszomer) épül fel. Ezek elrendeződése szabja meg a

virion szimmetriáját, illetve alakját, amely lehet izometrikus, ikozaéder (más szóval szférikus, mivel kisebb

felbontású felvételeken gömbölyűnek tűnnek) és anizometrikus szimmetriájú – ezen belül megkülönböztetünk

merev pálcika, hajlékony fonál formát és bacilus alakot (52. ábra). A legkisebb, izometrikus virion átmérője 12

nm körüli, míg a leghosszabb, fonál alakú vírusok hoszszúsága körülbelül 2000 nm.

52. ábra - Különböző morfológiájú növénypatogén vírusok. A: pálcika alakú dohány

mozaik vírus (tobacco mosaic tobamovirus); B: fonál alakú saláta mozaik vírus (lettuce

mosaic potyvirus); C: szférikus belladonna foltosság vírus (belladonna mottle

tymovirus) [Horváth József szívessége folytán]

1. Negatív festéses módszer

Az eljárás lényege, hogy a fertőzött növényből származó, virionokat tartalmazó nedvet vagy tisztított

víruspreparátumot nagy molekulatömegű nehézfémsókkal „megfestjük”. Az erősen elektronszóró

nehézfémionok a hátteret alkotó hártyához kötődnek aspecifikusan, azokat a virionok nem adszorbeálják. Így az

elektronmikroszkóp képernyőjén a virionok a sötét háttérből világosan rajzolódnak ki (mivel önmagukban nem

elég elektronszóróak). A módszer neve is innen származik, ugyanis az így előállított kép hasonlít egy fénykép

negatívjára (Hitchborn és Hills, 1965).

A festés menete

A vizsgálathoz legjobb olyan 400 mesh mintahordozó fémrácsot (gridet) használni, amelyet előzőleg

szénréteggel vagy műanyag hártyával (Formvar) vonunk be, és ezt követően szenezünk. A víruspreparátum és a

nehézfémsó-oldat egyesítése és feljuttatása a rácsra kétféle módon történhet: 1. a preparátumot felcseppentjük a

gridre, és a hártyához kötődés után adjuk hozzá a festéket; 2. a mintát a festékkel már a rácsra történő felvitel

Elektronmikroszkópos módszerek


előtt egyenlő arányban összekeverjük. Ha a minta és a festékoldat a rácson van, a felesleg eltávolítása után

hagyjuk rászáradni. A virionok egyenletesebb eloszlása érdekében a minta felvihető spray vagy sűrített

levegővel működő szórópisztoly segítségével, apró cseppek formájában is. Ennek a módszernek az az előnye,

hogy mennyiségi meghatározásra is alkalmas lehet. A virionok ugyanis többnyire a cseppek szélén gyűlnek

össze, és a cseppek elég kicsik ahhoz, hogy a teljes kerületük áttekinthető legyen.

A festéshez használt oldatok

a. Nátrium- vagy kálium-foszfo-volframát 2%-os vizes oldata, melynek kémhatását pH 7,0-re állítjuk be Na-,

illetve KOH-dal. Bizonyos vírusok szerkezetét károsítja ez az oldat [pl. a Cucumo, a Gemini, Ilarvirus

nemzetség tagjait: lucerna mozaik vírus (alfalfa mosaic alfamovirus), paradicsom bronzfoltosság vírus

(tomato spotted wilt tospovirus)]. Feltehetően a kapszidot stabilizáló nukleinsav-fehérje között létrejött

kölcsönhatások lazításával vagy felbontásával, illetve a Tospovirus nemzetség és Rhabdoviridae család

tagjainál a külső burok sérülésével, ezért ilyen esetben a víruspreparátumot tartalmazó gridet a festés előtt

szobahőmérsékleten, öt percig, 1%-os glutáraldehid-oldattal kell kezelni.

b. Uranil-acetát 2,0 vagy 0,1%-os vizes oldata, a pH-t nem állítjuk be. (Az uranil-acetát gyengén radioaktív,

kezelése fokozott elővigyázatosságot igényel. Fényérzékenysége miatt sötét üvegben tárolandó.) A

volframáthoz képest kontrasztosabb, részletgazdagabb kép nyerhető a finomszerkezet jobb megtartásának

köszönhetően, azonban 5,5 pH-érték felett kicsapódik. Gondot okozhat, ha a növényi nedv vagy a foszfát-

ionok koncentrációja nem megfelelő. A kristályképződés elkerülése érdekében ügyelni kell arra, hogy a

mintát hordozó rácson ne legyen semmiféle szennyeződés.

c. Uranil-formiát vizes oldata az uranil-acetátnál leírt hígításban; elsősorban helikális szerkezetű vírusok

negatív festésére használják.

d. Ammónium-molibdát 2%-os vizes oldata, a közeg pH-ját 4–9 közé kell beállítani ammóniával vagy sósavval.

Bár a kontraszt szegényes, előnye, hogy az oldat közvetlenül összekeverhető a víruskészítménnyel, és a

labilis vírusok szerkezetét is jól megtartja.

A felsoroltakon kívül még számtalan nehézfémsó választható vírusok negatív festésére; a fentiekben a teljesség

igénye nélkül a legelterjedtebb, legszélesebb körben használt anyagokat soroltuk fel.

Általános tudnivalók

Mint minden in vitro vizsgálati módszer alkalmazása esetén, így az elektronmikroszkópos munka során is

keletkezhetnek műtermékek, ezért külön figyelmet kell fordítanunk ezek kiküszöbölésére, vagy ha nem

lehetséges, számolnunk kell velük az eredmények értékelésekor. Például a közeg összetételétől és fizikai-kémiai

tulajdonságaitól függően változik a pálcika alakú vírusok virionjainak hossza, mint ahogyan ez a dohány mozaik

vírus (tobacco mosaic tobamovirus) esetében jól ismert. Zavaró lehet, ha szennyezés kerül a gridre; ilyenkor

vízzel vagy semleges 0,01–0,05 M-os foszfát-pufferral mossuk le a nemkívánatos anyagokat (a mosást 0,1 M

CaCl2 oldattal is végezhetjük, akár a festés előtt). Uranil-acetát használatakor előfordul, hogy a nehézfémsó nem

a hártyához kötődik, nem jön létre elektronszóró háttérréteg. Ez olyan, mintha pozitív képet kapnánk, és ezért a

virionok átmérője is kisebb, közel fele a normális módon kapott értéknek. Ilyenkor a hártyázott rács

elektrosztatikus feltöltődését kell megszüntetnünk (például nagyfeszültségű kisülést hozunk létre levegőn, 0,1

torr nyomáson). Ha másképp nem sikerül, akkor 0,01–0,1% marha- (bovin-) szérumalbumin hozzáadásával a

festéket rögzíteni tudjuk a hártyához. Gyakran találkozunk olyan növényi mintával, amelyben kevert fertőzés

van, tehát a mintánk két, három, vagy akár több vírus virionjait is tartalmazza.

A virionok között versengés lép fel a tartóhártya szabad kötőhelyeiért, és mivel a vírus szerkezetétől, fizikai-

kémiai sajátságaitól függően a kialakuló kötőerők nem azonos erősségűek, nem feltétlenül a koncentrációjuknak

megfelelő eloszlás alakul ki a rácson; sőt, el is veszíthetjük egy részüket úgy, hogy végül csak egyetlen vírus

marad a preparátumon. Ha olyan vírussal akarunk dolgozni, melynek negatív festésére vonatkozóan nincs saját

tapasztalatunk, sem irodalmi adatok nem állnak rendelkezésünkre, akkor problémát okozhat a megfelelő

nehézfémsó-oldat megválasztása. Különböző festékek és eljárások kipróbálásával, az oldatok pH-jának vagy

koncentrációjának megváltoztatásával találhatjuk meg az adott vírus esetében legmegfelelőbb vagy az

elfogadható módszert.

Brandes-féle „levél-bemártásos” (leaf-dip) módszer

Ezt az eljárást a vírus(ok) gyors kimutatására dolgozták ki, mert közvetlenül az élő növényből, mindennemű

tisztítási folyamat nélkül, igen egyszerűen megállapítható, hogy milyen típusú virionok vannak a gazdaszervezet



sejtjeiben (Brandes, 1964; Ball, 1971; Schmidt, 1980b). A frissen elvágott levelet vagy epidermisznyúzatot

keresztülhúzzuk egy tárgylemezre cseppentett vízcseppen, így a sérült sejtek tartalma részben a csepp belsejébe,

részben annak felületére kerül. Egy hártyázott rácsot a víz felületébe érintünk, hogy a sejtnedv rátapadjon, majd

negatív festést alkalmazunk. A minta felvételét úgy is végezhetjük, hogy a levél metszett felszínét közvetlenül a

griden lévő festékcseppen húzzuk keresztül, majd szárítjuk.

A vírusok méretének meghatározása

Szférikus (izometrikus) vírusok átlagos átmérőjének számítása általában nem okoz gondot, az átlagtól való

eltérések nem jelentősek. Hitchborn és Hills (1965) például a tarlórépa sárga mozaik vírus (turnip yellow mosaic

tymovirus) átmérőjének átlagértékét 27,0 nm-nek állapította meg úgy, hogy a negatívan festett mintában 50

viriont vizsgáltak 400 000 szeres nagyítás mellett.

A pálcika és a fonál alakú vírusok hosszúságában ezzel szemben nagy különbségek lehetnek, bár a virionok

többségének mérete szűk határok közé esik. Azt az átlagértéket, amely ebben az intervallumban található, Bode

és Köhler (1952) elnevezte a vírus normál hosszának. Később a normál hossz meghatározását módosították

(Brandes és Wetter, 1959; Brandes, 1964; Schmidt, 1980b), és javasolták a fő maximum átlagát. A mérések

eredményét hisztogramokon lehet ábrázolni: a vízszintes tengelyen a virionok hosszát veszik fel (nm-ben), a

függőleges tengelyen a megfelelő hosszhoz tartozó virionok számát, vagyis az eloszlási gyakoriságot (53. ábra).

Gibbs et al. (1963) úgy pontosították a számításokat, hogy az egyes hosszúságkategóriákat megjelenítő

oszlopokat a két szomszédos oszloppal összegezték (folyamatos összegzés, „running sums of three groups”). Így

az egymás mellett lévő oszlopok magasságában (vagyis az egyes csoportokba tartozó virionok számában) kapott

nagy eltérésekben rejlő hiba lehetőségét csökkenteni tudták. A mérést, illetve számolást végezhetjük a mintáról

készült fényképen, vonalzót használva. A negatívokon szereplő nagyításértékeket pontosan kell kalibrálni, a

mikroszkóp nagyítását időről időre ellenőrizni kell.

53. ábra - BSMV: árpa csíkos mozaik vírus (barley stripe mosaic hordeivirus) és LRSV:

Lychnis gyűrűsfoltosság vírus (Lychnis ringspot hordeivirus) részecske-hosszúság

eloszlása. A sötét oszlopok a mért virionok eloszlását mutatják, míg a vonaldiagram a

három csoport folyamatos összegezésével kapott eredményt ábrázolja. ⇓ : normál

hosszúság; ↓: látszólagos hosszúság [Gibbs et al., 1963 után]

A virionok hosszúságát (a hajlékony, fonál alakú vírusokat kivéve) a negatívokon is meg lehet mérni

sztereomikroszkóp segítségével, átvilágító fénnyel, 0,6 vagy 1,0 × objektívvel. Az okulárlencsébe épített

mikrométerskálát szintén kalibrálni kell. A mérést addig folytatjuk, amíg legalább 100 viriont találunk, amelyek

hosszúsága a főmaximumsávba esik.

2. Immuno-elektronmikroszkópos módszer

Az elektronmikroszkópos vizsgálatok kombinálása szerológiai meghatározással lehetővé teszi a vírusok pontos

azonosítását, illetve rendszertani helyük megállapítását, rokonsági körük felderítését. Az immunosorbent

electron microscopy (ISEM) technikát akkor alkalmazzuk, ha a víruskészítményben olyan alacsony a virionok

koncentrációja, hogy hagyományos negatív festéssel nem detektálhatóak (Milne és Lesemann, 1984; Dijkstra és

De Jager, 1998). A módszer előnye a fajlagosság és az érzékenység növelése. A rácson lévő szenezett hártyára

antitesteket kötünk, majd inkubáljuk a vírustartalmú szuszpenzióban. Az antitestek megkötik az antigenikusan



közelálló rokon vírusokat. A rácsterületre számított részecskeszám-növekedés a szerológiai reakció nélküli

mintákhoz képest 2000–10 000-szeres is lehet.

Az antitest és az antiszérum hígítása

A negatív festéshez hasonlóan 400 mesh, Formvar vagy Parlodion hártyával bevont, szenezett rácsot

használunk. Az antiszérum-, vagy antitest-készítmény hígítása általában 1:1000, illetve 1:5000 arányban

ajánlott. Kisebb hígítás (pl. 1:100) esetében az antigén (vagyis a virionok) kötődése gátolt az IgG és az egyéb

szérumfehérjék között kialakuló, a kötőhelyekért folyó versengés miatt. Az antiszérum és egyben a

víruskészítmény hígítására többféle puffer alkalmas. Sok esetben jó a 0,1 M-os, semleges foszfát-puffer, de a

6,0–8,0 közé eső pH-optimumot be kell állítanunk. 0,05 M-os Tris-HCl-oldat (pH 7,2–7,5), vagy az ELISA-

tesztben is használt 9,6 pH-jú nátrium-karbonát-puffer szintén megfelelő lehet. Az antiszérummal történő

inkubációhoz öt perc elegendő. Erősebb kötődést érünk el, ha az inkubációt nem szobahőmérsékleten, hanem 37

°C-on végezzük; ez a negatív festék jobb eloszlását is elősegíti. A vírusok kivonásához, a gazda–vírus kapcsolat

típusától függően, különböző puffereket használhatunk. Bizonyos növényeknél nyers kivonat készítésekor

szükség lehet különböző védőanyagok hozzáadására. Ezzel részben elkerüljük a növény gátló, vagy roncsoló

komponenseinek károsító hatását. Kínai kelből (Brassica pekinensis) tarlórépa mozaik vírus (turnip mosaic

potyvirus) kinyerésekor a szövetnedvhez 0,1 M EDTA-t, szilvából vagy kajszibarackból történő szilva himlő

vírus (plum pox potyvirus) kivonása esetében 2,5%-ban nikotint kell tennünk. Egyéb vírusoknál még 2%-os

polivinil-pirrolidon (PVP) vagy 1%-os polietilén-glikol (PEG) hozzáadása is lehetséges.

A kontrasztosítás

A kontrasztosításnak három alapvető módja van: 1. árnyékolás platina/palládiummal; 2. pozitív festés etanolos

uranil-acetáttal és 3. negatív festés, amely az előbbi kettővel szemben olyan előnyös tulajdonságokkal

rendelkezik, hogy a növényi vírusdiagnosztikában már szinte kizárólag a negatív festést alkalmazzák. Az

aspecifikus reakciók kizárása és a tiszta háttér biztosítása érdekében a befejező fázist kivéve (kontrasztosítás)

minden egyes lépés után mossuk át a rácsot a hígításnál használt pufferral vagy desztillált vízzel. Ez úgy

történhet, hogy valamilyen tiszta felületre (például parafilmdarabka, Petri-csésze) kevés folyadékot (puffer vagy

desztillált víz) cseppentünk, majd óvatosan belemerítjük vagy ráúsztatjuk a gridet. Végül a negatív festéket

felvisszük a rácsra, rászárítjuk, és ezzel hozzáfoghatunk a minta elektronmikroszkópos vizsgálatához.

3. Dekorációs módszer

Az eljárás megegyezik az ISEM-technikával, azzal a különbséggel, hogy a negatív festés előtt az antitestekkel a

hártyához adszorbeált virionokat antitest-készítménnyel inkubáljuk. Ez a másodlagos jelölés (dekoráció,

„díszítés”) tovább növeli a kimutatás érzékenységét (az ELISA-hoz hasonló mértékben). A virionok élesebben

rajzolódnak ki, mivel méretük is növekszik a hozzájuk kötődő antitestek által. Az ELISA-teszttel ellentétben

nem kell konjugált antitestet használni, az eredmény közvetlenül értékelhető. Kis mennyiségű hígított

antiszérum (5–10 µl) és víruskészítmény (1 µl) elegendő. A szenynyező növényi anyagok és a nem specifikus

reakciók nem zavaróak, mivel a virionoktól morfológiailag jól megkülönböztethetőek. Az ELISA-teszttel

történő összehasonlításból azonban nem szabad azt a következtetést levonni, hogy ez a módszer teljes

mértékben felválthatja az ELISA-módszert, mert például magas költségigénye miatt a dekoráció és általában az

elektronmikroszkópos eljárások nem alkalmasak nagyszámú minta feldolgozására. A vírus azonosításán kívül ez

az eljárás módot ad az antiszérum titerének megállapítására, a vírusok közötti szerológiai rokonság

meghatározására is (Dijkstra és De Jager, 1998).

A dekorációs módszer lépései

a. Az antiszérum, ill. antitest hígítása, a mindenkori antiszérum titerértékétől függően 1:1000 vagy 1:5000-

szeresére, 0,1 M pH 7,0 foszfát-pufferrel.

b. Hártyázott rács inkubálása az antiszérumot tartalmazó oldatban 5 percig, 37 °C-on.

c. Mosás desztillált vízzel vagy foszfát-pufferrel.

d. Inkubáció a víruspreparátummal 15 percig szobahőmérsékleten vagy 37 °C-on.

e. Mosás desztillált vízzel vagy foszfát-pufferrel.

f. Az antiszérumot 1:10 vagy 1:100 hígításban használjuk. Inkubáció 15 percig szobahőmérsékleten.



g. A grid mosása desztillált vízzel vagy foszfát-pufferrel.

h. Negatív festés.

4. Kicsapásos (precipitációs) módszer

A víruskészítményt összekeverjük az antiszérummal és inkubáljuk. Az immunreakció lejátszódása után az

összecsapódott anyagot felvesszük a gridre és negatív festékkel kontrasztosítjuk.

5. Finomszerkezeti vizsgálatok módszerei

A növényi szövet tartósításával, megtartásával a virionokat sejten belüli környezetükben tanulmányozhatjuk

(Kay, 1961). Az elektronmikroszkóp felbontóképességének köszönhetően sokkal részletgazdagabb képet

kapunk a fertőzés okozta tünetekről. A gyantába ágyazott mintából bármikor készíthetünk metszeteket (Martelli

és Russo, 1984), amelyeket szintén tárolhatunk és később újra vizsgálhatunk. Citokémiai módszerek

alkalmazásával nyomon követhetjük egyes anyagcseretermékek sejten belüli elhelyezkedését, vagy

megállapíthatjuk adott képletek (például zárványok) kémiai természetét.

A növényi szövetminta megválasztása

A vizsgálati anyag megválasztásánál tekintetbe kell vennünk, hogy szisztemikusan vagy lokálisan fertőzött

növénnyel dolgozunk-e, meg kell különböztetnünk a tünetes és a (látszólag) tünetmentes, illetve a különböző

szintről vett leveleket. Figyelnünk kell arra, hogy a minták a lehetőségekhez mérten eléggé homogének

legyenek, tehát például sötétzöld-világoszöld mozaik esetén egy mintába vagy csak a sötét, vagy csak a világos

területből kerüljön a szövet. Érdemes a növényt mintavétel előtt sötétben tartani, hogy a kloroplasztiszok

keményítőtartalmát csökkentsük (ilyenkor az egészséges kontrollnövényt is sötétben kell tartani).

Fixálás

Célja, hogy a szöveten, sejten belüli alkotóelemeket a mintavételkor fennálló állapotukban rögzítsük és a sejt

szerkezetét a legkevésbé drasztikus beavatkozással megőrizzük. A fixáló oldat és a fixálás körülményeinek

meghatározásakor több tényezőt kell számításba venni. Problémát okozhat a kristályos aggregátumok,

zárványok jelenléte, ilyen esetben speciális fixálást kell alkalmazni.

A fixálók úgy működnek, hogy bizonyos molekulák között keresztkötéseket hoznak létre. Ehhez először be kell

jutniuk a sejt belsejébe, ami kémiai természetüktől függően gyorsan vagy lassabban történhet. Minél később

alakulnak ki a kereszthidak, annál nagyobb a valószínűsége a műtermék keletkezésének. Ezért először

előfixálást kell végezni egy aldehid típusú anyaggal, amely aránylag gyorsan bejut a sejtbe, és a

fehérjemolekulák között, illetve a molekulákon belül képez keresztkötéseket.

A következő aldehideket használják általánosan fixálóként: glutáraldehid, formaldehid, akrolein, glutáraldehid

és formaldehid keveréke (Karnovsky-féle fixáló). A glutáraldehid előnye, hogy gyorsan létrehozza a

keresztkötéseket, jól megőrzi a citoplazma és a sejtalkotók szerkezetét, viszont lassabban hatol be a szövetekbe.

A fixálást szobahőmérsékleten, 3–6%-os glutáraldehid koncentrációjú, 0,05–0,1 M foszfát- vagy kakodilát-

pufferben, semleges pH-n végezzük. A nagy tisztaságú oldatot felhasználás előtt tartsuk hidegen és sötétben. A

formaldehid reverzíbilis metilén-hidakat alakít ki. Önmagában kizárólag enzimatikus vizsgálatokra használják,

glutáraldehiddel keverve kitűnő fixálószer.

A következő lépés az utófixálás, amihez leggyakrabban ozmium-tetroxidot használnak. Ez az oldat lassabban jut

be a sejtekbe, és ott a telítetlen lipidmolekulák között alkot keresztkötéseket, így a membránok láthatóvá

tételéhez feltétlenül szükséges. 0,02–0,1 M (pH 7) kakodilát-, foszfát-, Veronal- vagy PIPES-NaOH-pufferban

oldjuk, 1–2%-ban. Az ozmium-tetroxidot – mivel gőzei erősen roncsolóak mind belélegezve, mind bőrön

keresztül – tartsuk elszívófülke alatt. Bizonyos esetekben kálium-permanganáttal végzik az utófixálást (2–5%-os

vizes oldatban), ez azonban erélyes oxidálószer, ezért a citoplazmában található virionokat és riboszómákat is

tönkreteszi.

A legáltalánosabban használt pufferek a következők: 0,1 M kakodilát-HCl, 0,2 M Na-foszfát, Millonig-féle Na-

dihidrogén-foszfát. Ozmium-tetroxid oldásához használhatunk Veronal-acetátot és 0,05 vagy 0,1 M kakodilát-

vagy foszfát-puffert.



A fixálás úgy történik, hogy a levéllemezből (vagy az adott növényi szervből) borotvapengével 0,5–1 cm2-es

darabokat vágunk, majd egy csepp fixálóoldatban még kisebb, 1 × 1 × 1,5 mm-es mintákat készítünk. Fiolába

tesszük őket, és annyi fixáló oldatot öntünk hozzá, hogy a szövetdarabkák belemerüljenek. Ha nem süllyednek

le a minták, a szövetek közötti térben lévő levegőt vízlégszivattyú segítségével távolíthatjuk el. Az aldehides

előfixálás 1–3 óráig tart szobahőmérsékleten. Ezután az aldehidmaradványokat pufferral mossuk ki a mintákból

Pasteur-pipettával. Ozmium-tetroxiddal utófixálás következik 1–3 óra hosszat szobahőmérsékleten, vagy 4 °C-

on egy éjszakán át. Desztillált vizes mosással (2–3-szor 1 órán keresztül) eltávolítjuk a maradék OsO4-ot.

Dehidratálás

A gyantába ágyazás előtt a szövetekből ki kell vonnunk a víztartalmat és az oldatot szerves oldószerre kell

cserélni, mert a gyanták általában vízben nem oldódnak. A víztelenítés fokozatosan növekvő koncentrációjú

aceton- (epoxi gyanták) vagy etanol- és propilén-oxid-oldat sorozattal történhet. Minden oldatban 10, de

maximum 30 percig állhat a minta (máskülönben a lipidek kioldódnának). Etanolos dehidratálás során a

koncentrációsorozat: 1 × 30 perc 20, 40, 60, 95%-os és 2 × 30 perc abszolút alkoholban.

Gyantába ágyazás

Metszet készítésére a puha növényi szövetek kevésbé alkalmasak, különösen, ha ultravékony metszeteket

akarunk nyerni. A gyanták jobb tartást adnak az anyagnak és meghosszabbítják a minta eltarthatóságát. Kémiai

természetüket tekintve a gyanták polimer vegyületek, beágyazásra is különböző típusúak alkalmasak. Három fő

csoportjuk az epoxi-, a poliészter- és az akril-gyanták. Szobahőmérsékleten folyékonyak, magasabb

hőmérsékleten polimerizálódnak. A folyékony gyantakomponensek összemérésekor, illetve formába öntésekor

vigyázzunk, hogy az a bőrünkre ne kerüljön, mert ezek általában rákkeltő anyagok. Az epoxi típusú gyanták

közé tartoznak az Epon, az Araldit és a kettő keveréke. Ebben az esetben etanolos víztelenítés után 2x30 percre

propilén-oxidba tesszük a mintákat, majd propilén-oxid:gyanta 3:1 arányú keverékébe helyezzük. Végül friss,

tiszta gyantát öntünk a formákba, amelyekbe megfelelő orientációval beletesszük a szövetdarabkákat.

Kemencében az előírt hőfokon és ideig (30–40 °C-on, egy éjszakán át) hagyjuk megkeményedni

(polimerizálódni) az anyagunkat. Manapság sok laboratóriumban szívesebben használnak ún. Spurr gyantát

(vinil-ciklohexén-dioxid), mert egyszerűbb vele dolgozni, víztelenítésre pedig egyaránt alkalmazhatunk etanolt

vagy acetont. Magasabb hőmérsékleten polimerizálódik (kb. 70 °C-on, minimum 8 órán át). Akril-gyanta

például a glikol-metakrilát, amely vízben oldódó vegyület, ezért a víztelenítést nem szerves oldószerrel

végezzük, hanem közvetlenül víz és gyanta keverékének sorozatával.

A minta metszése

Ahhoz, hogy a gyantába ágyazott mintáinkból (amelyet blokknak neveznek) megfelelő méretű és vastagságú

metszeteket tudjunk készíteni, mikroszkóp alatt egy csonkagúla vagy piramis alakot kell kifaragnunk. Ennek

célja részben az, hogy eltávolítsuk a fölösleges gyantát a minta fölött (és körül), másrészt ez az alakzat

biztosítja, hogy jól metsződjön a minta és ne törjön le. A piramis oldalait határozott mozdulattal alakítsuk ki,

hogy a sík felületek simák legyenek. A piramis csúcsát metsszük le úgy, hogy felülnézetből négyszög alakú

lapot kapjunk. Ez a sík felület merőlegesen essen a mintánk síkjára vagy a levéldarabka lemezére, ha

levélkeresztmetszetet akarunk vizsgálni. Ezzel a felülettel párhuzamosan fogjuk metszeni a blokkot. Ezt a

műveletet érdemes gondosan elvégeznünk, mert nagyon sok múlik azon, hogy hogyan képeztük ki a vágási

felületet, amely nem lehet nagyobb 0,5 × 0,5 mm-nél.

A következő lépés a minta metszése ultramikrotómmal. A készülékbe gyémánt- vagy üvegkést fogunk be, adott

szögbe állítjuk. Ha nem áll rendelkezésünkre gyémántkés, vagy nem rendelkezünk elég gyakorlattal, üvegkést

magunk is készíthetünk késtörő műszerrel. A késhez ún. „csónakot” kell készíteni, amelyet a késhez ragasztunk

és vízzel töltünk fel. A kész metszetek a csónakban lévő víz felületére úsznak rá. Jó esetben a metszetek sorban

egymás után, szalagszerűen összekapcsolódva jönnek le a késről. A metszeteket összetereljük egy

fogpiszkálóból vagy gyufaszálból és néhány szál ecsetszőrből készített eszközzel, majd felszedjük a gridre

(egyszerűen belemerítjük a rácsot a vízfelületbe). Választhatunk 300–400 mesh hártyázatlan rácsot, vagy

nagyobb rácsméretű, 200 mesh hártyázott (és szenezett) gridet. Ha sikerült a metszeteket a rácsra juttatni,

szűrőpapírral finoman leitatjuk a vizet.

Festés (kontrasztosítás)

A biológiai anyagok jellemzője, hogy nem eléggé szórják az elektronokat, ezért az elektronmikroszkópban

kapott kép kontrasztszegény lesz. Különböző eljárásokkal megnövelhetjük az elektronszóródást, s ezáltal a

kontrasztot. Nehézfémionokat tartalmazó oldattal megfestve a mintánkat nagyon jó eredményt érhetünk el.



Kontrasztosítást végezhetünk a fixálás során, víztelenítés előtt vagy alatt, illetve a beágyazás és metszés után,

magukon a metszeteken uranil-acetát, uranil-nitrát vagy egyéb urániumsók oldatával. Víztelenítés előtt 15

percre 0,5–2,0%-os vizes oldatba tesszük a mintákat. Víztelenítés alatt a 70%-os etanol- vagy acetonoldathoz

1%-ban uranil-acetátot adunk, vagy uranil-acetátra nézve telített oldatot készítünk, és 15 percig tartjuk benne a

mintákat. A metszeteket úgy festjük, hogy vízben, vagy 50%-os etanolban telített uranil-acetát-oldatot

készítünk, és 1 órát hagyjuk benne a mintákat. Metszetek esetében használhatunk ólomsókat is (ólom-citrát, -

tartarát), de ezek oldatban hajlamosak a levegő CO2-tartalmával karbonátos csapadékot képezni. Leginkább

bevált festési mód az uranil-acetát és ólom-citrát együttes alkalmazása, amit kettősfestésnek nevezünk.

A kettősfestés menete

a. 50%-os etanollal 2%-os uranil-acetát-oldatot készítünk.

b. A grideket a metszeteket hordozó felületükkel fölfelé 10 percre vagy 1 órára az oldatba helyezzük.

c. 20–30 csepp 50%-os etanollal mossuk, majd száraz szűrőpapírra tesszük.

d. Néhány darab szilárd NaOH-pasztillát Petri-csészébe rakunk, lefedjük hidrofób anyaggal.

e. A hidrofób anyagra ólom-citrátot csepegtetünk.

f. A cseppekre 2 percre ráúsztatjuk a grideket.

g. CO2-mentes desztillált vízzel mossuk.

h. A grideket szűrőpapíron szárítjuk.

6. Citokémiai vizsgálatok

A fertőzött sejtek bizonyos alkotóelemeinek kémiai természetét vagy a sejten belüli elhelyezkedését enzimatikus

emésztés vagy kelátok alkalmazása révén határozhatjuk meg. Enzimes kezelést a vizsgálat céljától függően vagy

a gyantába ágyazás előtt, vagy azt követően végezhetünk. Az első esetben az aldehides fixálás után történik az

enzim hozzáadása, ezután OsO4-os utófixálás, víztelenítés és beágyazás következik. A második esetben a

beágyazást követi az enzim alkalmazása.

7. Immunokémiai vizsgálatok

Konjugált immunoglobulinok használatával szerológiai reakción alapuló kimutatásokat elektronmikroszkópos

vizsgálathoz előkészített ultravékony metszeteken is végezhetünk. Az immunoglobulinokhoz ferritin- vagy

kolloidális aranyszemcséket kötnek (immunogold jelölés), amelyek eloszlása jelzi, hogy a kérdéses anyag hol

fordul elő a sejtben.

Immunokémiai és citokémiai vizsgálatok végzésekor a gyantába ágyazáshoz jobb olyan gyantát használni,

amely alacsony hőmérsékleten polimerizálódik (pl. LR Gold), mert így a sejtalkotók, az enzimek és a fehérjék

működőképesek maradnak (Van Lent et al., 1990; Dijkstra és De Jager, 1998).


10. fejezet - A vírusfertőzött növényi sejtek finomszerkezete

Ha a fertőzés során a gazdanövény és a vírus között kölcsönhatás alakul ki, akkor a vírus bejut a növény

sejtjeibe, és ott közvetlen vagy közvetett úton kóros elváltozásokat okoz. A vírusok – mint közismert – önálló

szaporodásra képtelenek, a gazdaszervezet anyagait, illetve replikációs-transzlációs egységét parazitálják, s

ezzel fölborítják a növény anyagcsere-folyamatainak egyensúlyát. A sejt működésében bekövetkező eltérések

gyakran együttjárnak a szerkezet változásával, amit elektronmikroszkópos metszeteken tanulmányozhatunk. Ez

azért is fontos, mert a fertőzés folyamatának megértéséhez tudnunk kell, hogy a vírusreplikáció a növény mely

sejtalkotóiban történik (de Zoeten, 1976). A növényi szövetek, sejtek vizsgálata módot nyújt arra, hogy a vírus

sejtbe jutásától a virionok összeépüléséig végbemenő változásokat lépésről lépésre nyomon kövessük. Másrészt

e készítményeken vizsgálhatjuk a virionokat vagy a vírus eredetű képleteket, illetve ezek sejten belüli

elhelyezkedését.

1. Sejtek és sejtalkotók

Vírusfertőzött növényeknél gyakori jelenség a sejtfal megvastagodása. Ennek oka a sejt fenil-propanoid

anyagcsere-folyamatainak kóros megváltozása. A növény a mérgező vegyületek felhalmozódását úgy

akadályozza meg, hogy a sejtfalban megkötött enzimjei segítségével átalakítja azokat ligninné vagy egyéb

polimerekké, és ilyen formában a sejt anyagforgalmából kivonja azokat. Ezek az anyagok a sejtfalra rakódnak,

ezáltal sejtfalvastagodást idéznek elő (Mc Mullen et al., 1977). A plazmodezmák szerkezete is módosulhat a

fertőzés következtében. Például a plazmodezma-átmérő jelentős növekedése szerepet játszhat a virionok sejtről

sejtre történő terjedésében (Davison, 1969). Dália mozaik vírussal (dahlia mosaic caulimovirus) fertőzött

dálialevélben a virionokat tartalmazó plazmodezmák átmérője közel kétszerese volt az egészséges növény

plazmodezmáinak (Kitajima és Lauritis, 1969). A mitokondriumok megnagyobbodását és a sejt egyes területein

történő tömörülését, a kriszták fellazulását is észlelték (Matthews, 1980, 1981).

Számos gazda–vírus kapcsolatban kialakuló mikroszkopikus tünet a kloroplasztiszok rendellenessége: külső

alakjuk eltérése, belső membránrendszerük felbomlása vagy a tilakoidok és gránumok számbeli változása (Mc

Mullen et al., 1978). Ezek az eltérések attól függetlenül kiakulhatnak, hogy a vírus szaporodása a

kloroplasztiszban megy végbe vagy sem. Nem zárult le a vita arról, hogy a dohány mozaik vírus (tobacco

mosaic tobamovirus) fertőzéskor tapasztalt fotoszintetikus aktivitáscsökkenés közvetlen vagy közvetett gátlás

következménye-e. Esau (1968) elektronmikroszkópos felvételein dohány mozaik vírussal fertőzött Nicotiana

tabacum növények kloroplasztiszaiban vírusfelhalmozódás látható (54. ábra). Reinero és Beachy (1986, 1989)

vírus-köpenyfehérjét mutattak ki a tilakoidokhoz kapcsolódva, és feltételezték, hogy ez a PSII (photosystem II)

fehérjéihez kötődve közvetlenül gátolja azok működését. Így valószínűnek tűnt, hogy a vírusreplikáció vagy a

virionok összeépülése itt történik. Ezzel szemben olyan mutáns vírusok, amelyek köpenyfehérjéje nem képes

bejutni a kloroplasztiszba, ugyanolyan tüneteket okoztak, mint a vad típusú vírus (Lindbeck et al., 1991).

54. ábra - Vírusfelhalmozódás a kloroplasztiszban. Két vírushalmaz dohány mozaik

vírussal (tobacco mosaic tobamovirus) fertőzött dohány (Nicotiana tabacum)

mezofillum sejtjének kloroplasztiszában. Az alsó szétnyomja a gránumokat, a felső

halmaz kidomborítja a kloroplasztiszt határoló kettős membránt. GR = gránum, V =

vírushalmaz, VA = központi sejtüreg, W = sejtfal. 30 000-szeres nagyítás [Esau, 1968

után]

A vírusfertőzött növényi sejtek

finomszerkezete


Nem ilyen ellentmondásos a helyzet a tarlórépa sárga mozaik vírus (turnip yellow mosaic tymovirus) fertőzése

esetében. A kloroplasztiszok szélén apró hólyagok lefűződését írták le. A hólyagocskák a két kloroplasztisz-

borítómembrán betűrődésével keletkeznek, nyaki részük nyitott a citoplazma felé, tehát a tartalmuk

kapcsolatban marad a citoplazmával. Részletes vizsgálatok alapján (Matthews, 1981) megállapították, hogy a

sejtben lejátszódó események a következő sorrendben követik egymást: először megjelennek az említett apró

hólyagocskák a kloroplasztisz borítómembránjainak belső felületén. Ezután a kloroplasztisz duzzadni kezd,

keresztmetszetben kör alakot mutat. Egyre több hólyagocska fejlődik, ezek csoportokba tömörülnek, közelükben

endoplazmatikus retikulummembránok képződnek a kloroplasztisz felőli oldalon, sima felszínnel; a citoplazma

felé eső oldalukhoz riboszómák kapcsolódnak. Ezek a membránok egymással is összeköttetésben vannak, így

egy hálózatot hoznak létre a kloroplasztisz körül. A következő szakaszban az endoplazmatikus retikulum hártyái

eltűnnek; ezek a területek elektromikroszkópban elektronáteresztővé válnak. A kloroplasztiszok

összecsapódnak, majd a közöttük lévő elektronáteresztő zónában virionok halmozódnak föl (55. ábra). Végül a

levelek öregedésével (szeneszcencia) a citoplazma és a kloroplasztiszok vakuolizálódnak, szétesnek.

Megállapították, hogy a vezikulumok a vírus-RNS szintézisével hozhatók összefüggésbe, vagyis a

vírusreplikáció helye ebben a nemzetségben (Tymovirus) a kloroplasztisz. Árpa csíkos mozaik vírus (barley

stripe mosaic hordeivirus) szisztemikus fertőzés esetében Lin és Langenberg (1985) igazolták a plasztiszok

vírus-RNS-tartalmát. Egy olyan vírus–gazda kapcsolatban, mint a paradicsom bonzfoltosság vírus (tomato

spotted wilt tospovirus) és Nicotiana benthamiana – amelyben a vírus nem a kloroplasztiszban replikálódik –, a

fertőzési folyamat végére a plasztiszok szerkezete teljesen fölbomlik (Almási et al., 1996). Ezek az

organellumok a fertőzés kezdeti szakaszában csak enyhe változást mutatnak, később duzzadttá válnak, tilakoid

membránjaik fellazulnak, eltávolodnak egymástól, nagy keményítőszemcsék és lipidcseppek (ozmiofil

globulusok) halmozódnak föl, végül szétesnek (56. ábra). Mohamed (1973) hólyagok (vezikulumok)

keletkezését is megfigyelte, amelyeknek azonban nem a vírusreplikációban, hanem a kloroplasztisz

fölbomlásában van szerepük (Matthews, 1980). Ezekkel a tünetekkel párhuzamosan a klorofillkoncentráció is

csökken, sok más vírusfertőzéshez hasonlóan (Mohamed, 1973; Brakke et al., 1988).

55. ábra - A: tarlórépa sárga mozaik vírussal (turnip yellow mosaic tymovirus) fertőzött

kínai kel (Brassica pekinensis) levél mezofillumsejtjének kloroplasztiszai. Jellegzetes

széli vezikulumok (V) a kloroplasztiszban, és virionok felhalmozódása a két


finomszerkezete


kloroplasztisz közötti citoplazmában. B: széli vezikulumok kinagyított képe. Nyilak

jelzik a kettős membránnal borított hólyagocskák nyaki részét, amely a citoplazmába

nyílik. Az alsó vonalak mérete = 100 nm [Francki et al., 1985 után]

56. ábra - A kloroplasztiszok kóros eltérései paradicsom bronzfoltosság vírussal (tomato

spotted wilt tospovirus) fertőzött Nicotiana benthamiana növények levelének

mezofillumsejtjeiben A: a megnagyobbodott keményítőszemcsék (nyíllal jelölve)

szétnyomják a tilakoidmembránokat; B: a kloroplasztiszok alakja megváltozott, a belső

membránrendszer fellazult. A tilakoidok (T), a plasztoglobulusok (P) és a

kloroplasztiszban található vezikulumok nyíllal jelölve; C: az erősen duzzadt

kloroplasztiszban plasztoglobulusok halmozódtak fel (nyíl jelzi); D: a fertőzés utolsó

szakaszában a külső burokkal rendelkező virionok az egész citoplazmában

megtalálhatók, de sohasem fordulnak elő a kloroplasztiszokon belül. A nyíllal jelzett

virionok hármas-négyes csoportokban, vagy többesével láthatók egy közös

membránban


finomszerkezete


Az endoplazmatikus retikulum, a Golgi-készülék és egyéb membránok vesznek részt a paradicsom

bronzfoltosság vírus (tomato spotted wilt tospovirus) virionjainak „érési” folyamatában. Ez a vírus, akár a

Bunyaviridae család többi tagja, azért különleges a növényvírusok között, mert a vírusgenomot a

köpenyfehérjén kívül még egy glükoprotein burok borítja. A virionok összeépülése bonyolult (Dubois-Dalcq et

al., 1984); a külső burkot a különböző sejtalkotókon történő áthaladás során nyerik (Ie, 1971; Kitajima et al.,

1992).

2. Zárványok

A fertőzés során létrejött zárványokat (inclusions) elhelyezkedésük, felépítésük, illetve eredetük alapján

csoportosíthatjuk. Vannak a citoplazmában található zárványok, és vannak olyanok, amelyek különböző

sejtalkotókban (sejtmag, mitokondrium stb.) helyezkednek el. Szerkezetük és származásuk szerint virionokból

vagy vírus eredetű képletekből és növényi eredetű összetevőkből állhatnak. Szabályos kristályos elrendeződést,

kristályszerű vagy lazább amorf halmazt alkothatnak. A különböző vírusok létrehozhatnak hasonló belső vagy

mikrotüneteket, ennek ellenére egyes zárványtípusok annyira egyedi jellegűek, hogy diagnosztikai célra is

felhasználhatók. A zárványok finomszerkezete elektronmikroszkóppal vizsgálható, a szöveten belüli

elhelyezkedésüket, gyakoriságukat fénymikroszkóppal lehet megfigyelni (Christie és Edwardson, 1977, 1986;

Martelli és Russo, 1977; Edwardson et al., 1993; Dijkstra és De Jager, 1998).

2.1. Kristályos citoplazmatikus zárványok

A dohány mozaik vírus (tobacco mosaic tobamovirus) által szisztemikusan fertőzött növények sejtjeinek

citoplazmájában a virionok gyakran nagy területre kiterjedő aggregátumokat hoznak létre (Esau, 1968). A


finomszerkezete


szabályos kristályszerkezet úgy alakul ki, hogy a virionok szorosan egymás mellé és fölé rendeződnek, több

rétegben hexagonális síkot alkotnak. Ezért ezeket a zárványokat sokszor hexagonális lemezekként említik (57.

ábra). A kristályok metszete hatszögletű, négyzet vagy téglalap alakú lehet. A dohány mozaik vírus egyes

törzsei és a Tobamovirus nemzetség egyéb tagjai esetében a zárványok nem egyenes síkokkal határoltak, hanem

kör, ovális vagy szabálytalan alakúak. Ezeknél több lemez kerül egymás fölé, amelyekben a lemez síkjára

merőlegesen, hexagonális rendszerben találhatók a virionok, egy vagy több rétegben. A lemezek behajolhatnak,

keresztmetszetben koncentrikus köröket alkotnak. A vírus „aucuba” törzse olyan virionfelhalmozódást okoz,

amelyben az egyes rétegek egy síkban fekszenek és a virionok rétegenként körülbelül 60°-os szöget zárnak be

egymással. Ezek hosszú nyaláboknak vagy tű alakú képleteknek látszanak. A fertőzés előrehaladtával a

szabályos kristályos szerkezet fellazulhat, ekkor a virionok kristályszerű zárványt képeznek.

57. ábra - Kristályos citoplazmatikus zárvány, dohány mozaik vírussal (tobacco mosaic

tobamovirus) fertőzött dohány (Nicotiana tabacum) parenhimasejtjében. A pálcika

alakú virionok egymással párhuzamosan, sorokba rendeződve, számos réteget

képeznek. 26 000-szeres nagyítás. CH = kloroplasztisz, VA = központi vakuólum, W =

sejtfal [Esau, 1968 után]

2.2. Amorf citoplazmatikus zárványok

A virionok (elsősorban a fertőzés korai szakaszában) amorf zárványokat is létrehozhatnak. A dohány mozaik

vírussal szisztemikusan fertőzött dohánynövényben Esau (1968) X-testnek nevezte el ezeket a formákat,

amelyek mátrixba ágyazott érett virionokat tartalmaznak (58. ábra). A mátrix, amely riboszómákat is tartalmaz,


finomszerkezete


szemcsékből (granulumok), csövecskékből (tubulusok) és membránokból áll. Az érett virionok jelenléte a

citoplazmában a vírusösszeépülés folyamatára utal. Az X-testeket ezért viroplazma néven is említik.

58. ábra - Amorf citoplazmatikus zárvány (X-test) dohány mozaik vírussal (tobacco

mosaic tobamovirus) fertőzött Nicotiana tabacum levelének parenhimasejtjében. A

tubulusok (csövecskék) kis csoportokban, a nyalábok egymással szöget bezárva

rendeződtek. RB = riboszómák, ER = endoplazmatikus retikulum, VA = üregek, V =

virionok [Esau, 1968 után]

A karfiol mozaik vírussal (cauliflower mosaic caulimovirus) fertőzött tarlórépa sejtjeiben az amorf

zárványokban az izometrikus virionokon kívül a vírus nem-szerkezeti géntermékét is kimutatták (Espinoza et

al., 1991). A vírusgenomban kódolt fehérje a zárványok egy részében a levéltetű-átvitelért felelős. A zárványok

másik részében más fehérje-összetevőket találtak, melyek valószínűleg a vírusreplikációban és az összeépülési

folyamatban vesznek részt.

2.3. Hengeres citoplazmatikus, forgókerékszerű (pinwheel) zárványok

A Potyviridae család tagjai egy egészen különleges zárvány képződését idézik elő a fertőzött növényekben. A

zárványnak több típusa van, amely vírusra jellemző, és nem függ a gazda–parazita között kialakuló kölcsönhatás

jellegétől. Ezért ez az elektronmikroszkópos tünet diagnosztikai jelentőségű. A zárvány típusa szerint négy

alcsoportot különböztetünk meg. Az I. alcsoportba tartoznak azok a vírusok, amelyek csak lemezes zárványt, a

II. alcsoportba, amelyek csak tekercseket hoznak létre, a III. alcsoport tagjai a tekercsek mellett rövid, lemezes

aggregátumokat is képeznek, míg a IV. alcsoportban a tekercsek hosszú lemezekkel együtt fordulnak elő

(Christie és Edwardson, 1977). Felépítésükben egy egyszerű, a vírusgenom által kódolt, nem-glükozilált protein

vesz részt. Egy központi tubulusból és abból kiinduló öt–tizenöt visszahajló lemezből állnak. Keresztmetszetben

forgókerékszerű (pinwheel) alakzatot mutatnak, hosszmetszetben a lemezek nyalábként tűnnek föl (59. ábra). A

lemezek kiterítve négyszög vagy háromszög alakúak; az előbbiek hengeres, az utóbbiak kúpos zárványt

alkotnak. Ha a lemezek egyenesek maradnak, akkor lemezes aggregátumról beszélünk, ha feltekerednek, akkor

tekercsről.

59. ábra - Potyvirusokra jellemző forgókerékszerű (pinwheel) zárványok (A, B, C). C:

Malva érkivilágosodás vírus (Malva vein clearing potyvirus) forgókerékszerű

zárványai. 80 000-szeres nagyítás. La = lemezes aggregátumok, P = plasztid

(kloroplasztisz), M = mitokondrium, Pw = forgókerékszerű (pinwheel) zárvány



finomszerkezete


A zárványoknak a fertőzési folyamatban betöltött szerepét sokan tanulmányozták és tanulmányozzák

napjainkban is (Shukla et al., 1994). A hengeres zárványok a fertőzés első szakaszában a plazmalemma

közelében képződnek és központi tubulusuk a plazmodezmán áthúzódik; később eltávolodnak a

plazmalemmától, a sejt belseje felé kerülnek és a citoplazmában gyűlnek össze. Ezért valószínű, hogy a virionok

sejtről sejtre történő terjedését segítik elő. Másrészt viszont a lemezek általában a durva felszínű

endoplazmatikus retikulummal is szorosan kapcsolódnak (Huth et al., 1984). A zárványfehérje egyes

aminosavszakaszai nukleotidkötő képességgel rendelkeznek, és az N-végi régiója helikáz-aktivitást mutat. Ezek

a tulajdonságok, és az a tény, hogy a zárványokhoz virionok is kapcsolódnak, azt a feltételezést támasztják alá,

hogy részt vesznek a vírusreplikációban és a virionok összeépülésében is (Ammar et al., 1994).

2.4. Kristályos sejtmagzárvány

A Potyviridae család egyes tagjai (elsősorban a II. alcsoportba tartozók) a gazdanövény sejtmagjában kristályos

zárványok keletkezését váltják ki (60. ábra). Ezek eltérő alakúak: négyoldalú csonka piramis, bipiramidális

rombusz, csonkagúla, kocka vagy tű alakúak (Shukla et al., 1994; Edwardson és Christie, 1991). Kimutatták

bennük azt a vírus eredetű proteázt, amely a vírusgenomban kódolt poliprotein poszt-transzlációs feldarabolását

végzi, és egy másik fehérjét is, az RNS-függő RNS-polimeráz enzimet is.

60. ábra - Sejtmagzárványok dohány karcolatos vírussal (tobacco etch potyvirus)

fertőzött dohánylevél (Nicotiana tabacum) sejtjeiben. A: a metszés síkja merőleges a

zárvány síkjára; B: a metszet egy bipiramidális zárvány lemezének síkjában készült. Az

ábrák bal alsó sarkában a vonal 500 nm-nek felel meg. Nu = nucleolus (sejtmagvacska)

[Francki et al., 1985 után]


11. fejezet - Fénymikroszkópos festéses módszerek

Fénymikroszkópos vizsgálatokat a növényvirológiában elsősorban akkor végzünk, ha valamely tünet, illetve a

fertőzés hatására létrejött képlet jelenlétére vagy pontos elhelyezkedésére vagyunk kíváncsiak (Esau, 1968; de

Zoeten, 1976; Christie és Edwardson, 1977, 1986; Schmidt, 1980; Matthews, 1981). Megfigyelhetjük például a

kristályos zárványok durva morfológiáját, vagy azt, hogy mely növényi szövetekben találhatók (61. ábra).

Módunk van arra is, hogy a festődés alapján megkülönböztessük a fehérjetermészetű zárványokat a nukleotid

tartalmúaktól (19. táblázat). A trifán-kék, a narancs-zöld (O–G) pl. a fehérjetermészetű, a metilzöld-pironin a

nukleinsavak megfestésére alkalmas (Dijkstra és De Jager, 1998). Elektronmikroszkópos vizsgálatok

eredményének kiegészítésére is lehetőségünk nyílik, ha ugyanabból az anyagból készítünk mintát a

fénymikroszkópos analízishez is. A festési technika előnye, hogy olcsó, gyors és egyszerű munkára ad

lehetőséget, ezenkívül a növényi szövet nagy területéből vehetünk mintát.

19. táblázat - A citoplazmatikus és a normális sejtalkotórészek elszíneződése különböző

festések alkalmazásakor (Dijkstra és De Jager, 1998 után)

Festék Sejtmag Sejtmagvac

ska Plasztidák

Citoplazm

a Zárványok

Trifán-kék világoskék kékesfekete színmentes

(a

kloroplasz

- tiszok

zöldek)

színmentes kékesfekete

Floxin-metil-

kék rózsaszín rózsaszín-

viola

rózsaszín színmentes rózsaszín-viola

Metilzöld-

pironin kék világosvörö

s világosvör

ös színmentes rózsaszíntől

sötétvörösig

Azúr-A kék vörös-viola színmentes színmentes rózsaszíntől és

vörös-violától

színmentesig

(proteinszerű

zárvány

esetén)

Narancs-zöld

(O-G) narancs zöld sárgászöld sárgászöld zöldesbarna

61. ábra - A: Malva érkivilágosodás vírus (Malva vein clearing potyvirus)

fénymikroszkópos zárványai; B: retek mozaik vírus (radish mosaic comovirus)

zárványai. 800-szoros nagyítás; C: karfiol mozaik vírus (cauliflower mosaic

caulimovirus) zárványai. 450-szeres nagyítás; IB = zárványtestek (inclusions), N =

Fénymikroszkópos festéses

módszerek


sejtmag, P = plasztid, CN = kristályos, tűszerű zárványok, V = vakuolum [Horváth


A növényi minta előkészítése

Ennél az eljárásnál általában friss növényi szövetekből készítünk mintát, de bizonyos esetekben lehet

formalinnal vagy glutáraldehiddel fixált szövetet használni. Friss anyagból nehezebb metszeni, fixálás során

viszont sérülhetnek a zárványok. Készíthetünk epidermisznyúzatot finom, egyenes szárú csipesz segítségével.

Ha levélkeresztmetszetet akarunk vizsgálni, bodzabélben rögzíteni tudjuk a levelet és borotvapengével

vághatunk vékony szeletet. Ilyenkor a levél epidermiszét az egyik oldalról előzőleg el kell távolítani, hogy a

festék be tudjon diffundálni a sejtekbe (a kutikula akadályozza a festék bejutását).

1. Calcomine orange–Luxol brilliant green bl festés (o–g festés)

Protein tartalmú zárványok festésére alkalmas (ilyenek a potyvirus fertőzések következtében kialakuló

zárványok) (Dijkstra és De Jager, 1998).

A festés menete

A háromféle festékből (calcomine orange 2RS vagy direct orange 102, ill. 26 és Luxol brilliant green BL)

külön-külön törzsoldatot készítünk. A törzsoldatokat szobahőmérsékleten korlátlan ideig tárolhatjuk.

a. 1 g festéket 100 ml 2-metoxi-etanolban oldunk, összekeverjük, majd leszűrjük.

b. A törzsoldatokból és vízből egy kisméretű óraüvegen keveréket készítünk a következő arányban: 1 rész

narancs festékhez 1 rész vizet és 8 rész zöld festéket adunk. A narancs és a zöld festék egymáshoz

viszonyított aránya ettől eltérhet, de a víz a teljes térfogat 10%-a legyen.

c. A mintát a festékben 5–10 percig inkubáljuk.

d. A festékoldatot Pasteur-pipettával eltávolítjuk, majd 95%-os etanollal többször mossuk (egy-egy mosás 15–

20 másodpercig tartson). Ezután kevés 2-metoxi-etilacetátot adunk hozzá.

e. 5 perc elteltével csipesz segítségével felvesszük a mintát, tárgylemezre helyezzük, egy csepp rögzítőt

(Euparal) teszünk rá, és óvatosan rányomjuk a fedőlemezt (hogy a szövet kisimuljon).

f. A mintát olaj-immerziós tárgylencsével, kb. 1000-szeres nagyítással tanulmányozhatjuk.

Amennyiben zöld Luxol festékhez nem tudunk hozzájutni, magunk is előállíthatjuk, a következő módon: 2 g

1,3-di-orto-tolylguanidint (DOTG) oldunk 50 ml 0,7 M HCl-oldatban (3 ml 37%-os HCl-at vízzel 50 ml-re

hígítunk), keverjük, majd átszűrjük szűrőpapíron. 3 g Guinea-zöld B (savas zöld 3-CI42085) festéket 50 ml

vízben feloldunk. Az így kapott két törzsoldatot összeöntjük, keverés után szűrjük, és a csapadékot többször

átmossuk vízzel. Végül a szűrőpapíron összegyűlt csapadékot (kb. 2,7 g) vákuum alatt 1–2 percig szárítjuk.

2. Nukleoproteidek azúrkék festése

Fénymikroszkópos festéses

módszerek


A festéket mindig frissen kell készíteni. A tiazin típusú festékek közül elterjedt az azúr-A, de helyette az azúr-B,

toluidin kék is megfelel. A mintát a növényi szövetből ugyanúgy nyerjük, mint az előző festésnél.

a. 0,1 g azúr-A festéket 100 ml 2-metoxi-etanolban feloldunk. Ebből 18 részt (cseppet) veszünk, ehhez

hozzáadunk 2 rész (csepp) 0,2 M Na2HPO4-ot, és összekeverjük.

b. Ezt követően az előzőekben leírt Calcomine orange–Luxol brilliant green BL (O–G festés) festésnél leírtak

szerint járunk el, ha epidermisznyúzattal dolgozunk.

2.1.

2.1.1.

2.1.1.1.

2.1.1.1.1. Vastagabb szövetdarabok festése

a. Eltávolítjuk az epidermiszt, és levéldarabkákat vágunk.

b. A szövetet 30 percre 100%-os 2-metoxi-etanolba helyezzük, hogy kivonjuk a mintánkból a klorofillt.

c. Megfestjük azúr-A-val (10–15 perc).

d. 95%-os etanolban mossuk (10–15 perc).

e. 15–30 percen át egy lefedett edényben 2-metoxi-etilacetátban áztatjuk, hogy a festékfeleslegtől

megszabaduljunk.

f. A mintát tárgylemezre rögzítjük, majd megvizsgáljuk.

Megjegyzés: Ha ezen a módon nem sikerül a festés (mint a tobamovirusok esetében), akkor az eljárás végén,

amikor a szövetdarab már a tárgylemezen van és fedőlemezzel lefedtük, 1–2 percig melegítsük 60 °C-on.


12. fejezet - A vírusok izolálása és tisztítása

A vírusokról szerzett ismereteink lényegesen gazdagodtak, amióta lehetővé vált a virionok tisztítása, és ezáltal

fizikai és kémiai szerkezetük feltárása. A tisztítási és elválasztási módszerek tökéletesedésével magas

tisztaságfokú és jelentékeny mennyiségű anyagot lehetett a biofizikai és biokémiai vizsgálatok számára

előállítani és a vírusszerológia számára alkalmassá tenni. Az izolálásra és tisztításra általános módszer nincsen,

hiszen az alkalmazott eljárás minden esetben a vírusbeteg növénytől, a víruskoncentrációtól és elsődlegesen a

kórokozó fizikai és kémiai tulajdonságaitól függ. Mindezek ellenére vannak olyan alapvető eljárások és

módszerek, amelyeket részleteiben ugyan módosítva, de minden vírus tisztításánál alkalmazhatunk (Dijkstra és

De Jager, 1998; Foster és Taylor, 1998).

1. A virionok tisztítása fertőzött növényekből

A vírusok tisztítása elsősorban a virionok elkülönítését jelenti a növény más anyagaitól, míg más értelemben, pl.

az osztott genomú (multikomponens) vagy a szatellit vírusok esetén az egyes viriontípusok elválasztását is

jelenti. Nyilvánvaló, hogy első lépésként a tiszta, azaz a más vírusokat nem tartalmazó izolátumot a megfelelő

körülmények megválasztásával fel kell szaporítani a számára legkedvezőbb (azaz a legnagyobb

víruskoncentrációt biztosító) gazdanövényben. Ezt követi a növény sejtjeinek feltárása, a virionok kivonása,

extrahálása. A feltárt vírusszuszpenziót több lépésben meg kell tisztítani a durva és a finomabb

sejtalkotórészektől, és tömény állapotba kell hozni, azaz koncentrálni kell. Az így kapott vírusoldat további

tisztítása elsősorban a virionok és a hozzájuk molekulatömegben és alakban hasonló anyagok különválasztását,

vagy az egyes víruskomponensek elválasztását jelenti. A tisztítási folyamat végén a virionok tisztaságát és

töménységét kell ellenőrizni és tárolásra alkalmassá tenni.

1.1. A vírusok biológiai tisztasága

A fertőzött növények az esetek nagy részében más vírusokkal vagy ugyanazon vírus eltérő törzseivel is

fertőzöttek lehetnek. Alapvető követelmény, hogy a tisztításra váró anyag idegen kórokozót ne tartalmazzon. A

biológiai tisztaságot a gazdanövénykör ismeretében olyan differenciáló vagy szeparáló (elválasztó) növényekkel

biztosíthatjuk, amelyek csak a számunkra kiválasztott vírus gazdanövényei. A víruselválasztás egyes esetekben

akár bonyolult rendszert is jelent, amelynek eredményeképp egy komplex fertőzés összetevői biztosan

elkülöníthetők (lásd A vírusok differenciálása tesztnövényekkel c. fejezetet). A biológiai tisztaság legfontosabb

követelménye a genetikai azonosság. A növényekből izolált vírusok általában genetikailag nem teljesen azonos

populációt képviselnek, bennük eltérő törzsek, szerotípusok vagy mutánsok is előfordulhatnak. Megközelítő

tisztaságú izolátumhoz úgy juthatunk, ha egy lokális gazdanövényt mechanikai módszerrel úgy inokulálunk,

hogy csak kevés lézió fejlődjön ki. Egyetlen léziót (ami nagy valószínűséggel homogén populációt képvisel)

kiválasztunk, és abból kiindulva új lokális gazdanövényt fertőzünk, majd ennek egyetlen léziójából kezdjük el

az izolátum felszaporítását egy fogékony gazdanövényben. Egyléziós kultúra kialakítására nem minden esetben

nyílik lehetőség. Egyes esetekben a fajlagos vektorátvitel nyújt lehetőséget a más kórokozóktól való

elkülönítésre. A paradicsom bronzfoltosság vírus (tomato spotted wilt tospovirus) például könnyen tisztítható

más, mechanikailag átvihető vírusoktól, ha az izoláláshoz tripsz vektort használunk. Hasonló lehetőség

kínálkozik a levéltetvekkel terjedő vírusok elválasztására is olyan komplexekből, amelyek többi tagjai

levéltetvekkel nem vihetők át, vagy eltérő levéltetű-átviteli módszerrel (cirkulatív vagy nem-perzisztens

módszer) terjednek.

1.2. A vírusok felszaporítása fogékony növényben

A vírusokat tisztításra elegendő mennyiségben kell előállítani. E célra olyan fogékony gazdanövény a

legalkalmasabb, amelyben a lehető legnagyobb víruskoncentráció érhető el, gátló anyagokat (nyálkát,

inhibitorfehérjéket) vagy nagymennyiségű fenolt nem tartalmaz, ami a feltárás során oxidálódva a labilisabb

vírusokat inaktiválja. A növény levelei lehetőség szerint laza szerkezetűek, vízben gazdagok legyenek.

Ellenkező esetben a kivonó oldattal többszöri feltárást kell végezni. Az esetek többségében a legnagyobb

víruskoncentrációt a növények fiatal csúcsi levelei biztosítják. Ha csak lokális gazdanövények állnak

rendelkezésre [például a dohány nekrózis vírus (tobacco necrosis necrovirus) esetében], akkor a tisztításhoz

lényegesen nagyobb mennyiségű növényi anyagra van szükség (62. ábra).

A vírusok izolálása és tisztítása


62. ábra - A dohány nekrózis vírus (tobacco necrosis necrovirus) lokális tünetei

Nicotiana knightiana (A) és Solanum capsicastrum (B) növények levelein [Horváth


Lényeges szempont a vírusfelszaporítás körülményeinek jó megválasztása. A felszaporítás céljaira használt

növény folyamatos növekedésű, harmonikus tápanyag-ellátottságú legyen. A magasabb szintű nitrogénellátás

többnyire kedvez a nagyobb víruskoncentráció elérésének. Az alacsony hőmérséklet általában nem segíti a

vírusok replikációját, s hasonlóképpen kerülni kell az igen magas üvegházi hőmérsékleteket is; mindkettő

megváltoztathatja a gazdanövény reakciótípusát vagy mutációkhoz vezethet. Az árnyékolás, különösen nyáron,

kedvező hatású, a víruskoncentráció nagyobb lesz, a lazább levélszerkezet pedig a feltárást segíti.

A felszaporításhoz legmegfelelőbb a 20–25 °C hőmérséklet, amelyet ellenőrzött körülmények között legjobban

klímakamrákban biztosíthatunk. A felszaporított növényi anyag vírustisztításra akkor a legalkalmasabb, ha a

víruskoncentráció a legnagyobb értéket éri el. Ennek ideje a gazda–vírus kapcsolattól függ, de általában a

tünetek teljes kifejlődésével esik egybe. Tisztításra legalkalmasabbak a levelek, de egyedi esetekben a

gyökerekből is történhet. A floémben lokalizálódó sárgaság típusú vírusok (luteovirusok) tisztításához

elsősorban a levélereket használják.

A frissen összegyűjtött növények a legmegfelelőbbek a tisztításra. A hűtőszekrényben vagy fagyasztóládában

történő tárolás lényegesen rontja a hatékonyságot, különösen labilis szerkezetű vírusoknál. A szisztemikus

gazdanövény víruskoncentrációját vagy a tisztítás egyes lépéseinek hatékonyságát lokális gazdanövények

inokulációival folyamatosan ellenőrizhetjük.

1.3. A feltárás és kivonás körülményei

A tisztításhoz olyan kíméletes eljárással kell a gazdanövény sejtjeit elroncsolni, hogy a virionok ne

inaktiválódjanak, vagy ne denaturálódjanak. A feltárás történhet kis mennyiség esetén porcelán dörzsmozsárban,

míg nagyobb tömegű anyag esetén általában késes homogenizálást alkalmazunk. A feltáráshoz feleslegben adott

kivonó puffert használunk, amelynek összetétele a tisztítandó vírustól függ. Az oxidációs és más

enzimfolyamatok visszaszorítása érdekében a feltárást alacsony (0–4 °C) hőmérsékleten kell végezni, amit jeges

fürdővel, hűtött eszközökkel, illetve hideg szobában történő munkával érhetünk el. Egyes esetekben ajánlott a

folyékony nitrogénben történő feltárás is.

A kivonó puffer kiválasztása a legfontosabb, hiszen ennek kémhatása a vírus stabilitása szempontjából döntő.

Leggyakrabban 7,0 pH körüli, enyhén lúgos kémhatású puffereket használunk, de egyes virionok [például a

rozsnok mozaik vírus (brome mosaic bromovirus)] csak savas közegben tárhatók fel. A túlságosan lúgos



közegben ugyanis a nukleinsavak és a fehérjék közötti kötés fellazul, a virionok felduzzadnak, szétesnek. Az

ionerősség megválasztása is a tisztítandó vírustól függ, általában ez 0,1–0,2 M közötti érték.

Adalékanyagokat használhatunk a virionok stabilitásának növelésére (Ca++), a fenoloxidáció elkerülésére

(koffein, nikotin szulfát, polivinil-pirrolidon), más oxidatív folyamatok ellensúlyozására (aszkorbinsav, cisztein,

tioglikolsav, dietil-ditiokarbamát), és a fehérje- vagy a nukleinsavbontó enzimek gátlására (proteináz-

inhibítorok, bentonit). A szállítószövetekben felhalmozódott, nehezen feltárható vírusok esetében sejtfalbontó

enzimekkel (maceráz, pektináz) növelhetjük a kitermelés hatékonyságát.

1.4. A vírusoldat szűrése

A vírusokat tartalmazó nyers növényi szövetnedv tisztításában az első lépés a szűrés. Géz, tüllháló (cheesecloth)

igen alkalmas a legdurvább sejtmaradványok, rostok eltávolítására, bár a felületük sok viriont is megköthet.

Alacsony koncentráció esetén a szűréskor visszamaradt rostokat még egyszer feltárhatjuk a kivonó pufferrel.

1.5. A vírusok elválasztása más sejtalkotórészektől

A tisztítás lényege, hogy a szövetkivonatot lehetőség szerint minden, vírustól idegen szennyeződéstől, a lehető

legkevesebb veszteséggel megtisztítsuk. A sötétzöld, zavaros szűrt nyers présnedv sok alakos elemet

(kloroplasztiszt, sejtmagvakat, sejtfaldarabokat, a vakuólum zárványait, keményítőt stb.) tartalmaz. Alacsony

fordulatú centrifugálással (5–6000 ford/perc) viszonylag rövid idő alatt a durvább és a nehezebb alakos elemek

eltávolíthatók. Szerves oldószereket (kloroform, kloroform és butanol keveréke, széntetraklorid) tanácsos a

centrifugálás előtt a présnedvhez adni, azzal jól összerázni, majd hűtés mellett állandóan keverni. Az apoláros

szerves oldószerek a lipoproteideket és a klorofill nagy részét összegyűjtik. Ezeket az oldószereket néha már a

feltárásnál is használjuk. A centrifugálás az emulziót elválasztja vizes és oldószeres fázisra, ez utóbbit

eltávolítva a virionokat tartalmazó felülúszó tisztább, enyhén opálos, halványzöld lesz. (A barna szín oxidált

fenolok jelenlétét jelzi, ajánlott ilyenkor redukáló szerek alkalmazása.) A szerves oldószeres tisztítást

természetesen azoknál a vírusoknál nem lehet alkalmazni, amelyeknek külső lipoproteid vagy glükoproteid

burkuk van (tospovirusok, rhabdovirusok). A szerves oldószerek alkalmazása esetenként tetemes veszteségeket

okozhat.

1.6. A növényi fehérjék elkülönítése

A nyers, egyszer centrifugált szövetnedv sok növényi fehérjét tartalmaz. Hőkezeléssel ezek közül sok

denaturálódik, kicsapódik, és így az oldatból alacsony fordulatszámú centrifugálással eltávolítható. Csak igen

stabil vírusok [például a tarlórépa sárga mozaik vírus (turnip yellow mosaic tymovirus)] tisztításánál

alkalmazható a virionok károsodása nélkül. A hőkezeléshez hasonlóan a fagyasztás is alkalmas lehet a növényi

fehérjék koagulálására. A fagyasztás és újrafeloldás e célból célravezetőbb, mint az egyszeri fagyasztás, de

alkalmazása azzal a veszéllyel jár, hogy a tisztítandó vírus is inaktiválódik. A fehérjék kicsapása az oldat

kémhatásának csökkentésével is történhet. Alacsony (pH 5,0 körüli) értéknél sok fehérje kiválik. Izometrikus

vírusoknál ez bevált módszer, helikális vírusoknál [például a dohány mozaik vírus (tobacco mosaic

tobamovirus)] nem.

Régebben a fehérjék kisózását gyakran használták tisztítási célra. Legelterjedtebb a 0,4%-os

ammóniumszulfátos kisózás, de a citoplazma és kloroplasztisz riboszómáinak elválasztására Ca++ és Mg++ sókat

is alkalmaznak. Derítéssel a tisztítandó oldatból számos olyan anyag (fenolok, inhibitorok, ribonukleázok, zöld

sejttörmelékek stb.) eltávolítható, ami a tisztítás folyamatát zavarja. E célra felületaktív anyagokat,

leggyakrabban faszénport, bentonitot, Celit-et (tisztított kovaföld), Ca-foszfát gélt, vagy DEAE cellulózt

használhatunk. Tekintettel arra, hogy az adszorpció a pH és az ionerősség függvénye, a derítés körülményeit

úgy kell megválasztani, hogy a virionok ne kötődjenek meg a felületen. A derítéshez használt anyagot szűréssel

vagy centrifugálással különíthetjük el. Derítésnek tekinthetjük azt az eljárást is, amikor az egészséges növény

fehérjéivel szemben termelt antiszérumot keverjük a tisztítandó oldathoz. Ez esetben a gazdanövény fehérjéi

specifikusan kicsapódnak a vírusoldatból.

1.7. A virionok elkülönítése és a vírusoldat töményítése

A szennyezőanyagoktól mentesített növényi szövetnedv nagy hígításban tartalmazza a virionokat, amelyeket az

oldattól el kell választani (izolálni), illetve a vírusoldatot be kell töményíteni. E célra leggyakrabban a vírusok

kémiai kicsapását vagy fizikai ülepítését (ultracentrifugálását) alkalmazzák.



A kémiai kicsapás lényege azonos a növényi fehérjéknél alkalmazott módszerrel. Izoelektromos pontjuk

közelében a virionok (nukleoproteidek) kicsaphatók, pl. a pH megváltoztatásával, extrém (3–5 pH) értékeken. A

kicsapódott virionok centrifugálással gyűjthetők össze. A módszer hátránya, hogy csak a vírus fizikai

tulajdonságainak teljes ismeretében biztonságos, az irreverzíbilis hatások miatt. A kicsapásra ezért inkább

nagyobb koncentrációjú sóoldatokat – leggyakrabban ammóniumszulfátot – használnak. Az első kisózásnál

(20%) a növényi fehérjék nagy része kicsapódik a virionok viszont nem. A centrifugálás után a felülúszó

sókoncentrációját növelve (40%) már a vírusok nagy része kicsapódik a virion inaktiválódása nélkül. A

kicsapást lassan, fokozatosan, kevergetés közben, hidegen kell végezni. A művelethez kristályos sót vagy

tömény oldatot egyaránt használhatunk. A virionok kíméletes kicsapását az igen elterjedt (szintén több lépcsős)

polietilén-glikolos (Mt 6000) kezeléssel érhetjük el. Ez esetben a virionok hidrátburkukat vesztve ülepíthetők ki

az oldatból, ami a kémiai kicsapáshoz hasonló folyamat.

A fizikai elválasztási módszerek közül az ultraszűrésnek, a mozgó határfelületű elektroforézisnek vagy

ioncserélő és adszorbciós oszlopon történő elválasztásának alárendelt jelentősége van. A leggyakoribb és

legeredményesebb a virionok ultracentrifugással történő ülepítése. A nagy (40 000 ford/perc feletti)

fordulatszámú szögfejes ultracentrifugákban a virionok mintegy két óra alatt a cső aljára ülepíthetők. Az

ülepítést feloldás (szuszpendálás) követi, általában 1/10, vagy 1/5-rész pufferben. Az oldásra használt puffer

gyakran azonos a kivonó pufferrel, ionerőssége azonban lényegesen kisebb, gyakran tartalmaz virionokat

stabilizáló Ca- vagy Mg-ionokat. Lényeges, hogy a csapadék oldása lassan (akár egy éjszakán keresztül)

történjen, a teljes oldódásig. Az oldhatatlan maradékot kis fordulatszámú centrifugálással különíthetjük el.

Gyakran az ultracentrifugálás és a kis fordulatszámú centrifugálás lépéseit megismételve magas tisztaságfokú

(opálos) vírusoldatot (szuszpenziót) kapunk. Az ultracentrifugálás többórás ideje alatt a fehérje- és

nukleinsavbontó enzimek károsítanak, ezért az alacsony hőmérsékletet tartósan biztosítani kell, a feloldásra

használt puffert célszerű sterilezni.

A hosszabb, helikális vírusok (potyvirusok) virionjai sérülékenyek, az ultracentrifugálás alatt eltörhetnek.

Kíméletes ülepítési mód, ha a centrifugacsövek aljára pufferben oldott, töményebb „cukorpárna”-réteget

teszünk, ami lassítja a virionok ülepedését.

A vírusok tisztításában döntő fordulatot jelentett a kilendülőfejes centrifugák és a lineáris cukorsűrűség-

gradiensek alkalmazása. Ezekben a centrifugákban a gravitációs erő hatására a virionok a centrifugacső azonos

magasságaiban koncentráltan, ülepedési állandójuknak megfelelően, egy zónában helyezkednek el. Ha az

ülepítéshez cukorsűrűség-gradiens oldatot használunk, a virionok egyre töményebb oldattal találják szembe

magukat, ülepedésük lelassul, leáll. A centrifugálás befejezése után a vírusokat tartalmazó zónák egymástól

elválnak. Kellő töménység esetén az egyes frakciók felső megvilágítással, sötét háttérben jól láthatók.

A nukleoproteid tartalmú frakciók a centrifugacső injekcióstűvel történő megcsapolásával, vagy UV-detektorral

ellátott frakciószedő géppel összegyűjthetők. Az ülepedési állandók különbözősége alapján a multikomponens-

vírusok azonos nagyságú, de eltérő tömegű virionjai egymástól elkülöníthetők, frakcionálhatók.

A cukorsűrűséggradiens-centrifugálás terméke a virionokat tartalmazó sűrű cukoroldat. Az oldatot újból

szögfejes ultracentrifugában ülepíthetjük. Híg pufferoldattal szemben dializálva a cukor eltávolítható, polietilén-

glikollal (Mt 20000) szemben végzett fordított dialízissel töményíthető. Az egyes frakciók pontosabb

elkülönítését teszi lehetővé a cézium-kloridos (CsCl2-os), borkősavas vagy nátrium-bromidos gradiens-

centrifugálás.

1.8. A tisztított vírusoldat minőségi ellenőrzése, eltartása

A vírusok fizikai jellemzői közül a vírustisztítás szempontjából a legfontosabb az ülepítési állandó

(szedimentációs koefficiens), amely a részecskék adott gravitációs térben történő ülepedési idejét jelzi. Egysége

a Svedberg (1S = 1 × 10–13 cm s–1 dyn–1 = 0,1 ps, picosecundum), amit analitikai ultracentrifugában kísérletesen

határoztak meg. Mértékét befolyásolja a virionok nagysága, alakja és sűrűsége, a közeg viszkozitása. Értéke 50S

[szatellit dohány nekrózis vírus (tobacco necrosis satellivirus)] és 1000 S (rhabdovirusok) között van. Az

ülepedési állandó ismeretében lehet megszabni az ultracentrifugálás idejét és az alkalmazott fordulatszámot.

A tisztított vírusoldat elvileg csak nukleoproteinből áll. A víruskoncentrációt UV-fényben állapítják meg, az

oldat 220 és 300 nm közötti fényelnyelése (optikai denzitása, extinkció) alapján. Az extinkciós együttható

(extinkciós koefficiens) egységnyi töménységű vírusoldatban mért, a vírusra jellemző (általában 2 és 10 közötti)

érték (1 mg/ml vírusoldat 1 cm fényútnál mért extinkciója 260 nm hullámhosszon). A vírusok UV-abszorpciós

spektruma nem vírusspecifikus, de jelzi a készítmény tisztaságát (63. ábra). A virionoldatok általában 260 nm

közelében mutatnak abszorpciós maximumot, míg a minimumérték 240 nm-nél észlelhető.



63. ábra - A burgonya X-vírus (potato X potexvirus) és a belőle izolált fehérje és

nukleinsav abszorpciós spektruma [Francki és McLean, 1968 után]

A fehérjék adszorpciós maximuma 280 nm-nél van (A280), a nukleinsavaknál a legnagyobb érték 260 nm-nél

mérhető (A260). A két érték hányadosa (A280/A260) alapján következtethetünk a nukleinsav-tartalomra.

Csak stabil vírusok tarthatók hűtőszekrényben hosszabb ideig. Tartósítószerként mertiolátot vagy nátriumazidot

is alkalmaznak, utóbbi azonban a szerológiai reakciókat zavarhatja. A tisztított vírus tartósítására használt

puffert az adott helyzetnek megfelelően kell kiválasztani. Jó tárolást biztosít a fagyasztás és –20 °C-on való

tárolás is, azonban a többszörös felengedés és fagyasztás tönkreteszi a virionokat. Egyes vírusok 50% glicerin

hozzáadásával tartósíthatók. A tisztított vírusok legjobban folyékony nitrogénben vagy liofilezve tárolhatók.

Megjegyzés: A könyvben csak néhány víruscsoportra jellemző vírus tisztítása szerepel példaként. A virológiai

irodalom azonban tisztítási módszerekben gazdag, célszerű az adott vírus tisztítása előtt ezekről tájékozódni. A

legtöbb ismert vírus tisztítására útmutatást találunk Murrant és Harrison (1970–1988) C.M.I./A.A.B.

Descriptions of Plant Viruses című sorozatában, továbbá Dijkstra és De Jager (1998), valamint Foster és Taylor

(1998) vírusdiagnosztikai könyvében. Magyarul először a burgonya M-vírus (potato M carlavirus) tisztításáról

jelent meg közlemény (Horváth, 1972), majd ezt követően Balázs és Vassányi (1984) számolt be mintegy

harminc vírus tisztítási módszereiről.

Stabil, egykomponensű RNS-vírus egyszerű tisztítása (Gooding és Hebert, 1967)

A stabil, egykomponensű vírusok közül a dohány mozaik vírus (tobacco mosaic tobamovirus) a legismertebb

növénypatogén kórokozó. A fogékony dohánynövényekben nagy koncentrációban, parakristályos formában van

jelen. A tisztításra legalkalmasabbak a fiatal, mozaikos felső levelek. Merev, pálcika alakú virionjai 300 nm



hosszúak és 18 nm vastagok. 95% fehérje és 5% (egyszálú, pozitív) ribonukleinsav alkotja. Tisztítás során a

virionok gyakran aggregálódnak. A vírus tisztításának egyes lépései a következők:

a. A frissen leszedett vagy fagyasztott leveleket késes homogenálóban (Waring blendor) feltárjuk. A feltáráshoz

125 g levelet és vele azonos mennyiségű (125 ml) kivonó (extrakciós) puffert (0,25 M Na2HPO4 és 5 mM

Na2EDTA), 1 g aszkorbinsavat és 1 ml 2-merkaptoetanolt adunk.

b. A kivonatot 25 ml kloroformmal emulgeáljuk, jól összekeverjük, majd az elegyet durva szűrőpapíron, tüll-

vagy nejlonszöveten átszűrjük.

c. A szűrletet centrifugálással (10 perc, 10 000 g) tisztítjuk, a felülúszót durva szűrőpapíron szűrjük át.

d. 80 ml szűrlethez 10 ml 5 M NaCl-t és 10 ml 30%-os PEG-et (0,02 g Na-azidot tartalmazó 30%-os polietilén-

glikol 6000) adunk kis adagokban, majd az oldatot 20 percig lassan kevertetjük.

e. A kicsapódott vírusokat 10 perces centrifugálással (10 000 g) ülepítjük. A felülúszót elöntjük, az üledéket 10

ml oldó pufferben (hígított NaOH-val pH 7,6-ra állított 2 mM Na2EDTA) feloldjuk. Az oldathoz 3 ml

kloroformot adunk.

f. Centrifugálással (3 perc, 10 000 g) a fázisokat elválasztjuk, a felső, vizes fázist Pasteur-pipettával

összegyűjtjük, a kloroformos fázist elöntjük.

g. A tisztított vírusoldatot 1 órán át 150 000 g-vel ultracentrifugáljuk. A felülúszót elöntjük.

h. A csapadékot az oldó pufferrel (e pont) feloldjuk, majd alacsony fordulatszám mellett centrifugáljuk (10

perc, 15 000 g).

i. A tisztított vírusoldatot ultracentrifugában (1 óra, 150 000 g) újra ülepítjük.

j. Az üledéket az oldó pufferben feloldjuk, mintegy 20 mg/ml töménységben.

Megjegyzés: A tisztított vírusoldat (1 mg/cm3) fajlagos fényelnyelése (abszorpciója) E260 = 3,0. Tároláskor a

hűtőszekrényben lassan aggregálódik, ami a biológiai (RNS) vagy a szerológiai tulajdonságokra (fehérje) nincs

hatással. 5% etilén-glikol jelenlétében –70 °C-on jól eltartható.

Bomlékony, egykomponensű RNS-vírus tisztítása (López-Moya, 1993)

A bomlékony egykomponensű RNS-vírusok közül a szilva himlő vírus (plum pox potyvirus) az egyik gazdasági

szempontból legfontosabb kórokozó. Helikális, hajlékony, fonál alakú virionjai mintegy 700 nm hosszúak,

törékenyek. A feltárás során elsősorban a szerológiai tulajdonságokat meghatározó köpenyfehérje (CP) N-végi

szakaszai károsodnak, amelyek a virion külső részein helyezkednek el. A kíméletes feltárás érdekében

proteinázkeveréket (cocktail) alkalmazva a CP különlegesen labilis része nem károsodik, megőrzi eredeti

szerológiai tulajdonságait. A vírustisztítás lépései a következők:

a. Mintegy 100 g fertőzött, fiatal levelet (Nicotiana benthamiana vagy N. clevelandii) kétszeres mennyiségű

proteáz inhibitor „coctail”-t [(1 mM fenolmetil-szulfonil-urea (MSF), 2 mM EDTA és 20 mM Na-jódacetát)]

tartalmazó pufferben, késes homogenálóban hidegen feltárjuk. A 0,18 M McIlvain-puffer (pH 7) 0,25%

tioglikolsavat, 0,01 M Na-DIECA-t és 0,5 M ureát tartalmaz. A feltáráshoz egyharmad térfogat (30 ml)

kloroformot adunk.

b. Szűrés után a növényi nedvet alacsony fordulatszámú centrifugában (Sorvall GSA) 10 percig (6000

ford/perc) ülepítjük.

c. A felülúszót T 30 rotorban (Beckman) 90 percig ultracentrifugáljuk (25 000 ford/perc) 4 °C-on.

d. A kiülepedett vírusokat (0,2% 2-merkapto etanolt és 1,0 M ureát tartalmazó) 0,01 M citrát-foszfát-pufferrel

(pH 7,0) hidegen, minimum két órán keresztül szuszpendáljuk, a kiindulási súly negyedének megfelelő (25

ml) mennyiségű pufferben.

e. A vírusszuszpenziót 10 percig centrifugáljuk (6000 ford/perc), a felülúszót megtartjuk.

f. A felülúszót Ti 50 rotorban (Beckman) 90 percig (25 000 ford/perc) hidegen ultracentrifugálva a virionokat

kiülepítjük.



g. A csapadékot egy éjszakán keresztül tized térfogat (10 ml) (0,01 M Na2EDTA-t tartalmazó) 0,1 M borát-

pufferrel (pH 7,0) oldjuk.

h. A vírusszuszpenziót 10 percig centrifugáljuk (10 000 ford/perc), a felülúszót megtartjuk.

i. A virionokat ultracentrifugálással ülepítjük (Beckman Ti 50 rotor, 25 000 ford/perc, 3 óra).

j. Az összegyűjtött virionokat 1 ml 50 mM-os borát-pufferben (pH 8,2) oldjuk. A spektrofotometriás méréshez

mintegy 50-szeres hígítást használunk. E260 = 2,4.

Többkomponensű, ill. multikomponens-vírusok tisztítása (Lane, 1986)

A többkomponensű rozsnok mozaik vírus (brome mosaic bromovirus) fogékony gazdanövényeiben (árpa, búza)

nagy koncentrációban fordul elő. A víruskoncentráció a fertőzés után egy-két héttel a legnagyobb. A 30 nm

átmérőjű izometrikus virionok 20% nukleinsavat tartalmaznak. A tisztított vírus osztott genomú, négy

komponense van. Az azonos nagyságú, de eltérő nukleinsav-tartalmú virionok a tisztítás után cukorgradiens-

centrifugálással elkülöníthetők. A vírustisztítás lépései a következők:

a. A fertőzött szöveteket azonos mennyiségű kivonó pufferrel (0,5 M Na-acetát, 0,8 M ecetsav) késes

homogenálóban (Waring blendor) homogenáljuk.

b. A kivonattal és kloroformmal (0,2 ml/g szövet) emulziót készítünk, az oldatot összerázzuk.

c. Alacsony fordulaton centrifugáljuk (10 perc, 5 000 g).

d. A felülúszót durva szűrőpapíron átszűrjük, majd állandó kevergetés közben (harminc percig) 1/4 rész 30%-os

PEG-et (30% polietilén-glikol 6 000 és 0,02% NaN2) adunk hozzá. Erős kicsapódás látható.

e. A kicsapódott vírusokat 10 perces centrifugálással (5 000 g) összegyűjtjük. A felülúszót kiöntjük.

f. A csapadékot az eredeti súlynak (g) megfelelő 0,2 ml mennyiségű desztillált vízzel oldjuk, és a folyadék

térfogatának megfelelő 0,4 rész kloroformmal emulgeáljuk.

g. Öt perces centrifugálás után (5 000 g) a felülúszóhoz újra 1/4 térfogatnyi, 30%-os polietilén-glikolt (PEG) és

1/20 térfogatnyi 5 M NaCl-t adunk, állandó keverés (30 perc) közben.

h. Centrifugálás (10 perc, 5 000 g) után a felülúszót elöntjük.

i. A csapadékot az eredeti súlynak (g) megfelelően grammonként 0,2 ml acetát-pufferben (0,05 M Na-acetát,

0,01 M ecetsav, 1 mM Na2EDTA, 1 mM MgCl2) oldjuk.

Megjegyzés: A rozsnok mozaik vírus fajlagos abszorpciója E260 = 5 mg. A kitermelés kb. 1 mg/g szövet. Az

oldat –70 °C-on fagyasztva (5% etilén-glikol hozzáadásával) tartható el a legjobban. A módszer alkalmas más

izometrikus vírusok [lóbab foltosság vírus (broad bean mottle bromovirus), tehénborsó klorotikus tarkulás vírus

(cowpea chlorotic mottle bromovirus), tarlórépa sárga mozaik vírus (turnip yellow mosaic tymovirus)]

tisztítására is.

DNS-vírus tisztítása (Guilfoyle, 1986)

A DNS-genomú vírusok legismertebb képviselője a karfiol mozaik vírus (cauliflower mosaic caulimovirus). Az

izometrikus virionok 50 nm átmérőjűek. A köpenyfehérje 42 kD, a kétszálú, kör alakú DNS mintegy 8 kilobázis

(kb) nagyságú. A gazdanövényköre szűk. A felszaporításra leggyakrabban a tarlórépát (Brassica rapa cv. Just

Right) használják. Az inokulációt követő 1-2 hét a legalkalmasabb a vírustisztításra. A víruskoncentráció a

fiatal, tüneteket mutató levelek sejtjeiben (citoplazmában) a legnagyobb, ahol zárványtestekben (inklúziók

formájában) fordul elő. A tisztítás sikere rendszerint a zárványtestek feltárásától függ. A tisztítás 2–4 °C-on

történik.

a. A fertőzött szöveteket folyékony nitrogénben, dörzsmozsárban vagy acélköpenyes Waring blendorban

elporítjuk. Kioldás után a szöveteket a nyers súlynak megfelelő térfogatú, 0,75% nátriumszulfitot tartalmazó,

0,5 M foszfát-pufferrel (pH 7,2) feltárjuk, majd magas fordulaton tovább homogenáljuk még egy percig.

b. A homogenátumot nyolc réteg tüllhálón és egy réteg nejlonszűrőn (Miracloth, Calbiochem) átszűrjük.



c. A szűrlethez Triton X-100-at (2,5% koncentrációig) és 1 M ureát adunk, majd a szövetnedvet 10–16 órán

keresztül keverjük. Az oldathoz az enzimfolyamatok gátlására proteáz inhibitor PMSF-et (fenilmetil-

szulfonilurea) adhatunk.

d. A kivonatot centrifugálással (7 000 g, 10 perc) tisztítjuk meg a durva szennyeződésektől. Az üledéket

eltávolítjuk.

e. A felülúszó ultracentrifugálásával (40 000 rpm, 1 óra, 45-Ti Beckman-rotorban) a virionok kiülepíthetők.

f. A vírusokat is tartalmazó üledéket 50 mM Tris-HCl (pH 7,2), 1mM EDTA és 2,5% Triton X-100 pufferrel

feloldjuk.

g. A szuszpenziót a durva szennyezésektől centrifugálással (7000 g, 10 perc) tisztítjuk meg, a virionok a

felülúszóban maradnak.

h. Újabb ultracentrifugálással (lásd e pont) a virionok újra kiülepíthetők.

i. A csapadékot ionmentesített vízben oldjuk, 36% céziumklorid hozzáadása után 16–24 óráig 35 000

fordulaton 75-Ti Beckman-rotorban centrifugáljuk.

j. A centrifugálás után a virionok határozott opaleszkáló réteget mutatnak a gradiens közepe táján, amit

frakciószedővel vagy a centrifugacső lékelésével összegyűjtünk.

k. A tisztított vírusoldatot dialízissel sómentesítjük 50 mM Tris-HCl (pH 7,2), 1 mM EDTA és 150 mM NaCl

ellenében 24 órán keresztül, a dializáló oldat többszöri cseréjével. A cézium-klorid-gradiens helyett

cukorgradiens is használható.

Megjegyzés: A kitermelés 1–10 mg vírus/kg levél.

Glükoproteid burkú vírus tisztítása (Tas et al., 1977)

A paradicsom bronzfoltosság vírus (tomato spotted wilt tospovirus) az állatpatogén vírusokkal rokon. A

növénypatogén vírusok nagy részétől egyrészt a glükoproteid burok megléte, másrészt a multikomponens RNS-

genom kettős, részben pozitív, és részben negatív jellege (ambiszenz polaritás) különbözteti meg. A 70–100 nm

átmérőjű, változékony, majdnem szférikus virionok nagyon bomlékonyak, a membránburok lipofil jellege

kizárja a poláros oldószerek használatát, a tisztítást állandóan alacsony hőmérsékleten (3 °C-on) kell végezni.

a. 60–100 g fertőzött (Nicotiana rustica, vagy N. benthamiana) levelet vákuumban infiltrálunk 0,01 M Tris,

0,01 M nátrium-szulfit és 0,1% cisztein-hidroklorid (pH 8,0) extrakciós pufferrel. A leveleket Waring

Blendorban homogenáljuk alacsony fordulaton 30 másodpercig.

b. A szövetnedvet gézen átszűrjük, centrifugáljuk (10 perc, 10 000 ford/perc), a felülúszót megtartjuk. Az

üledék is sok vírust tartalmaz, ezért nem dobjuk el, hanem újra feltárjuk.

c. A centrifugálás üledékét 200 ml szuszpenziós pufferrel (0,01M glicin, 0,1% cisztein-hidroklorid és 0,1 Na-

szulfit, pH 7,9) oldjuk, és 1–2 órán keresztül állni hagyjuk.

d. A harmadik kivonatot újra centrifugáljuk (10 perc, 10 000 ford/perc), a felülúszót megtartjuk.

e. Az első (b pont) és a második centrifugálás (d pont) felülúszóit elkülönítve ultracentrifugáljuk (30 perc, 25

000 ford/perc, Spinco R30 rotorban), a virionokat kiülepítjük.

f. Az üledéket 20 ml szuszpendáló pufferben (c pont) oldjuk, majd a tisztított szövetnedvhez 0,2–0,4 ml

egészséges növény (N. rustica vagy N. benthamiana) fehérjéivel szemben készített antiszérumot adunk, a

szövetnedvet állni hagyjuk egy órára.

g. A fehérjeprecipitátumot centrifugálással (10 perc, 10 000 ford/perc) eltávolítjuk, a felülúszót megtartjuk.

h. A felülúszót 6 ml-es adagokban szuszpenziós pufferben készített 3–30%-os cukorsűrűség-gradiens tetejére

rétegezzük, majd kilendülőfejes centrifugában (23 000 ford/perc, 45 perc, SW 25 Spinco rotor) ülepítjük.

i. A vírustartalmú zónát összegyűjtjük, majd 25–50% cukorsűrűség-gradiensben újra 5–16 órán keresztül

ultracentrifugáljuk (23 000 ford/perc).



j. A virionokat szuszpenziós pufferrel hígítjuk, majd az oldatot 30 000 ford/perc fordulaton 1 órán keresztül

ultracentrifugálva koncentráljuk.

Megjegyzés: A kitermelés 1 mg/100 g szövet. A tospovirusokhoz tartozó vírusok [Impatiens nekrotikus

foltosság vírus (Impatiens necrotic spot tospovirus), földimogyoró gyűrűsfoltosság vírus (groundnut ringspot

tospovirus), paradicsom klorotikus foltosság vírus (tomato chlorotic spot tospovirus)] tisztítására Feldhoff et al.

(1996) dolgoztak ki új módszert. Az extrakciós puffer 0,1 M Na2SO3-at tartalmazó 0,1 M foszfát-puffer (pH 6), a

szuszpenziós puffer tizedannyi töménységű. Az ultracentrifugálás 30 000 fordulatszámon történik harminc

percig, a cukorgradiens-centrifugálás 27 000 fordulatszámon, 2 órán át, 20–50%-os cukoroldatban. A végső

koncentrálás 1 órán keresztül tart, 50 000 ford/perc mellett.

2. A vírusfehérjék izolálása és tisztítása

Korábban a vírus-köpenyfehérje aminosavsorrendjének megismerése állt a vizsgálatok homlokterében, ma

azonban inkább a vírusgenom által kódolt összes fehérjék másodlagos és harmadlagos szerkezetének

megismerésén van a fő hangsúly, amelyek célja a virionok felépítésének és működésének tanulmányozása, az

antigénszerkezet megismerése. A továbbiakban csak a köpenyfehérje vizsgálatának főbb módszereit tárgyaljuk.

A vírusfehérjéket tisztított vírusokból izoláljuk. Általában a kivonásnak olyan módszereit kell alkalmazni, amely

megvédi a fehérjék természetes (natív) jellegét és nem vezet a térbeli szerkezet módosulásához. Az alkalmazott

módszer természetesen a vizsgálat céljától, és nem utolsósorban az adott vírus tulajdonságaitól függ. Az izolálás

első lépése a fehérjék és más alkotórészek (nukleinsav) közötti kötések megbontása, majd a nemkívánatos

szennyezőanyagok denaturálása és eltávolítása.

A dohány mozaik vírus (tobacco mosaic tobamovirus) köpenyfehérje-tisztítása hideg ecetsavas

módszerrel (Fraenkel-Conrat, 1957)

a. A vírus vizes oldatához (10–30 mg/ml) fokozatosan két térfogat hideg jégecetet adunk, az oldatot 30–60

percig állni hagyjuk, időszakonként felkeverjük.

b. Az oldatot centrifugálással (10 perc, 10 000 ford/perc) tisztítjuk meg a kicsapódott nukleinsavtól.

c. A felülúszót 2–3 napig dializáljuk desztillált vízzel, a víz többszöri cserélésével. A dialízis során a fehérje

kicsapódik, ahogy az oldat pH-ja az izoelektromos ponthoz közelít.

d. A kicsapódott fehérjéket centrifugálással összegyűjtjük, majd a fehérjét desztillált vízzel szuszpendáljuk. A

pH-értéket híg lúggal (NaOH) fokozatosan 8,0-ra emeljük, majd az oldatot egy éjszakára állni hagyjuk, hogy

a fehérje feloldódjék.

e. Az oldhatatlan anyagokat (emésztetlen virionok, denaturálódott fehérjék) ultra-centrifugálással (10 0000 g, 1

óra) eltávolítjuk.

Megjegyzés: A kitermelés a vírus összetételének megfelelően mintegy 95%-os. A módszer alkalmas más

tobamovirusok, valamint a tarlórépa sárga mozaik vírus (turnip yellow mosaic tymovirus) és a dohány rattle

vírus (tobacco rattle tobravirus) köpenyfehérjéjének tisztítására is.

A rozsnok mozaik vírus (brome mosaic bromovirus) köpenyfehérje-tisztítása hideg kalcium-kloridos

módszerrel (Yamazaki és Kaesberg, 1963)

Ismert, hogy a virionok magas sókoncentrációjú oldatban disszociálnak. A módszer alapja, hogy a kétértékű Ca-

ionok a virionban a fehérjék és nukleinsavak közötti kötést megbontják.

a. Dializáljuk a tisztított vírusoldatot 1 M CaCl2-oldatban (pH 6,3) 12 órán keresztül, 4 °C-on. Az oldat

opaleszkálóvá válik.

b. A precipitátumot (RNS) centrifugálással (2 500 g, 20 perc) eltávolítjuk és a tiszta, fehérjéket tartalmazó

felülúszót pufferrel szemben dializáljuk.

Megjegyzés: A módszer kis módosítással alkalmas egyéb vírusok [lóbab tarkulás vírus (broad bean mottle

bromovirus), az uborka mozaik vírus (cucumber mosaic cucumovirus), az árpa csíkos mozaik vírus (barley

stripe mosaic hordeivirus) és a lucerna mozaik vírus (alfalfa mosaic alfamovirus) (64. ábra)]

köpenyfehérjéjének tisztítására is. Más vírusok [(tehénborsó klorotikus foltosság vírus (cowpea chlorotic mottle



bromovirus), vad uborka mozaik vírus (wild cucumber mosaic tymovirus)] alkalikus közegben disszociálnak

(Tsugita és Hirashima, 1972).

64. ábra - A lucerna mozaik vírus (alfalfa mosaic alfamovirus) szisztemikus tünetei

néhány gazdanövényen. A: Ocimum viridae; B: Solanum marginatum; C: Viburnum

opulus [Horváth József szívessége folytán]

3. A vírusnukleinsavak kivonása és tisztítása

3.1. RNS-kivonás tisztított vírusszuszpenzióból

A vírusnukleinsavak (RNS vagy DNS) kivonása a vírus struktúrájának megbontása, roncsolása nélkül nem

lehetséges, ezért a nukleinsav-kivonás mindig bizonyos mértékű veszteséggel vagy a nukleinsavak

károsodásával jár. Az alkalmazott módszerek e veszteségek csökkentésére, illetve a nukleinsavak károsodásának

megakadályozására irányulnak. A virion szerkezetének megbontása természetesen nagymértékben függ az adott

vírus stabilitásától. A feltárás során a vírusnukleinsavak kémiai és biológiai épségét meg kell őrizni, óva

egyrészt a denaturáló hatásoktól (alacsony vagy magas pH), másrészt a nukleinsavbontó enzimektől. A legtöbb

nukleinsav-tisztítási módszer alapja a kétfázisú fenolos módszer, amely során detergenseket,

nukleázinhibitorokat, fémkelátképző anyagokat használnak. Az alkalmazott módszerek lényege, hogy a feltárás

minél rövidebb ideig tartson, és a fehérjéktől kétfázisú rendszerben a nukleinsavak elkülöníthetők legyenek. A

nukleinsav-tisztítás centrifugálással, alkoholos kicsapással vagy szilárd fázison történő megkötéssel történik

(Bruening, 1972).

3.1.1.

3.1.1.1. Feltárás fenolos extrakcióval

A nukleinsavak feltárására leggyakrabban vízzel telített fenolt használnak, ami további víz (puffer)

hozzáadásakor kétfázisú rendszert képez. A nukleinsavak nagy része a vizes fázisban marad, míg az opálos,

fenolos fázis többnyire a kicsapódott fehérjéket tartalmazza. A két rendszer alapos összerázása után a frakciók

egymástól centrifugálással elválaszthatók. Néha interfázis is kialakul, ami a fenolban nem oldott fehérjéket

tartalmazza. Alacsony sótartalom mellett, 60–65 °C-on, interfázis nem alakul ki. Ha a kirázáskor kloroformot

(kloroform és fenol 1:1 arányú keverékét) is használnak – ami javítja a tisztaságot –, akkor interfázis alakulhat

ki. Ez 1% izoamil-alkohollal javítható.

A fenolos módszer gyakran akár 50% RNS-kinyerési veszteséget okoz, amit javítani lehet azzal, ha a fenolhoz

krezolt keverünk. A vizes fázisból a nukleinsavak ultracentrifugálással kiülepíthetők. Ez az üledék azonban

vírusfehérjéket is tartalmaz. Az üledék oldása és detergenssel történő kezelése után magas tisztaságfokú

nukleinsavat nyerhetünk óvatos cukor- vagy céziumklorid-gradiens-centrifugálással. Ha a centrifugacsövek 1/4

részébe 25%-os cukoroldatot rétegezünk, a gyorsabban ülepedő nukleinsavak a sűrűbb cukorpárnába ülepednek,

míg a kisebb ülepedési sebességű fehérjék a felső részben maradnak.

A nukleinsavak kicsapásának ismert módszere a savas közegben (0,05–0,1 M kálium-acetát, pH 5) kétszeres

mennyiségű 95%-os alkohollal történő kicsapás 0 °C-on vagy 0 °C alatt. A kicsapott nukleinsav centrifugálással

(10 000 g, 15 perc) összegyűjthető. A tisztított nukleinsav biológiai állapotát a fertőzőképesség megmaradásával

ellenőrizhetjük (pl. lokális léziós gazdanövényeken).



Megjegyzés: A fenol maró hatású, a bőrön nehezen gyógyuló égési sebeket okoz. Az eljárás során

védőszemüveg, gumikesztyű, köpeny használata kötelező. Fenolos extrakcióhoz üvegeszközöket használjunk.

Dohány mozaik vírus- (tobacco mosaic tobamovirus) RNS-kivonás fertőzött levelekből, fenolos

módszerrel (Schlegel, 1960)

a. A növényi anyagot súlyának megfelelő 4-szeres vagy többszörös mennyiségű, vízzel telített fenol és 1%

nátrium-pirofoszfát (Na4P2O4) 1:1 arányú keverékével homogenáljuk 5 percig, hűtött eszközökkel. (Az egész

kivonást ajánlott hideg szobában, 5 °C alatt végezni).

b. A kapott emulziót 5 percig 6 000 fordulaton centrifugáljuk.

c. A nukleinsavat tartalmazó vizes fázist 2-szeres vagy többszörös mennyiségű, vízzel telített fenollal újra

átrázzuk.

d. A vizes fázisból a fenolmaradékot éterrel távolítjuk el, háromszor ismételve a kirázást.

e. A nukleinsavakat 2 térfogatnyi hideg, 95%-os etanollal kicsapjuk.

f. Az alkoholos oldatot 5 percig centrifugáljuk (6 500 ford/perc).

g. A nukleinsavat tartalmazó csapadékot hideg, 1%-os K2HPO4-oldattal feloldjuk. (A fertőzőképesség

ellenőrzésére kontrollként az 1%-os K2HPO4-ban homogenált levélszöveteket használhatunk.)

Megjegyzés: A fenti módszer egyéb vírusok [lucerna mozaik vírus (alfalfa mosaic alfamovirus), uborka mozaik

vírus (cucumber mosaic cucumovirus), burgonya X-vírus (potato X potexvirus), dohány gyűrűsfoltosság vírus

(tobacco ringspot nepovirus) (65. ábra), dohány nekrózis vírus (tobacco necrosis necrovirus), borsó enációs

mozaik vírus (pea enation mosaic enamovirus)] esetében is fertőzőképes nukleinsavat eredményezett.

65. ábra - Dohány gyűrűsfoltosság vírus (tobacco ringspot nepovirus) tünetei. A: lokális

tünetek Datura gigantea növény levelén; B: szisztemikus szimptómák Tropaeolum

peregrinum növény levelén [Horváth József szívessége folytán]

Javított (kloroform-fenol) módszer nukleinsavak (RNS és DNS) kivonására tisztított oldatból



a. Egy rész konyhasóval telített fenolt fél térfogat vizes oldattal és egy térfogat kloroformmal Vortexben 10

percig keverünk, fél térfogatmintával (vírusszuszpenzió).

b. A két fázist 2 perces centrifugálással mikrocentrifugában elválasztjuk. A szerves fázis a 8-hidroxikinolintól

sárga színű, általában alul helyezkedik el. Ha a sókoncentráció magas, akkor a fázisok fordítva helyezkednek

el.

c. A vizes fázist összegyűjtjük és új csőbe tesszük. Ügyeljünk, hogy a vizes fázis interfázist és szerves oldószert

ne tartalmazzon.

d. A vizes fázist egy térfogat kloroformmal összerázzuk, majd az elegyet 2 perces centrifugálással

szétválasztjuk. A tiszta kloroformos fázis alul marad.

e. A vizes fázist tiszta kémcsőbe gyűjtjük.

f. A vizes fázishoz 1/10 térfogat 3 M Na-acetátot (pH 7) és 2,5 tf 95%-os etanolt adunk. Vortex-szel keverjük,

majd 10 percig jeges fürdőn állni hagyjuk. Kis mennyiségeknél a kicsapás egy éjszakán át tart, vagy –20 °C-

on rövidebb ideig.

g. A csapadékot mikrocentrifugával ülepítjük (min. 10 perc, 14 000 ford/perc). Tíz mikrogrammnál több

nukleinsav már látható üledéket ad.

h. Mikropipettával a felülúszót eltávolítjuk.

i. Az üledékhez 500 mikroliter 80%-os etanolt adunk. Összerázás után 5 percig (14 000 ford/perc)

centrifugáljuk, majd az alkoholt óvatosan elöntjük.

j. Az üledéket vákuummal szárítjuk, míg az alkohol el nem párolog.

k. A nukleinsavat steril vízben vagy pufferben oldjuk.

3.2. Vírus-DNS kivonása

A növénypatogén vírusok kisebb részében a genom DNS, és leginkább kétszálú. E vírusok jelentősége

elsősorban abban van, hogy a magasabb rendű élőlények genetikai anyagával megegyező felépítésűek, így

különösen alkalmas objektumai a molekuláris virológiai és a biotechnológiai kutatásoknak.

DNS-kivonás fenolos módszerrel (Shepherd et al., 1968)

A karfiol mozaik vírus (cauliflower mosaic caulimovirus) különösen stabil kapszidjait csak fenolos, vagy csak

nátrium-dodecil-szulfátos (SDS, 2,5 mg/ml), vagy pronázos (50 µg/mg vírus) inkubálással bonthatjuk meg 37

°C-on (Shepherd et al., 1970).

a. A tisztításhoz tisztított vírusoldatot használunk, amit 37 °C-on inkubálunk 6 órán keresztül 50 mM Tris-HCl-

pufferben (pH 7,2) 10 mM EDTA, 150 mM NaCl, 1% Sarkosyl és 500 µg/ml proteináz K jelenlétében.

b. A proteázos emésztés után az oldathoz CsCl2-t teszünk, 0,78 g/ml végkoncentrációig, majd 300 µg/ml

etidium-bromidot keverünk hozzá.

c. A DNS-t ultracentrifugálással tisztítjuk (24 óra, 52 000 ford/perc 20 °C-on, Ti-75 Beckman rotorban). A

DNS-zóna helyzetét UV-fényben láthatjuk, ezt a frakciót összegyűjtjük.

d. Az etidium-bromidot 3 M CsCl2-dal telített izopropanollal ismételt kirázással távolítjuk el.

e. A DNS-oldatot 10 mM Tris-HCl (pH 7,2) és 1 mM EDTA-val szemben dializáljuk, az oldat többszöri

cseréjével.

Megjegyzés: Ha az enzimes kezelés után a DNS-t fenol-kloroformos módszerrel választjuk el, a Sarkosyl

helyett SDS-t használunk. Fenolos kivonásnál az enzimes feltárás után a kivonó pufferhez 1 mM etanolamint

(pH 10,5) keverve a kitermelés javítható.

3.3. Kettős szálú rns-ek kivonása a fertőzött növényekből



Az egészséges növény szövetei a DNS és RNS mellett – ha kis mennyiségben is, de – kettős szálú

ribonukleinsavakat (dsRNS) is tartalmaznak; néhány vírus genomja maga is dsRNS. A növénypatogén vírusok

nagy része azonban egyszálú RNS (ssRNS), ami a replikáció során kétszálú formában fordul elő. Ez egy

replikatív forma (RF), amely a pozitív genomi RNS-ből és annak negatív tükörképéből (template) áll. Az RF

mellett azonban a fertőzött sejtekben olyan kettős szálú formák, a replikációs intermedierek (RI) is előfordulnak,

amelyeken már egyszálú RNS-részek is vannak – ezek kisebbek, mint a RF. E szálakat azonban a tisztítás során

az RNázok többnyire elemésztik.

A dsRNS-kivonás több módszerrel is lehetséges (cf. Jones, 1992): (1) a szövetek DNáz- és RNáz-kezelésével,

(2) sóoldatban (pl. LiCl), eltérő oldékonyság alapján, (3) cukorsűrűség-gradiens centrifugálással, (4) cellulózról

eltérő etanololdékonyság alapján. Morris és Dodds (1979) módszere egyesíti a fenti lehetőségeket. E módszer

lényege, hogy az általában folyékony nitrogénben elporított szövetet olyan pufferrel tárják fel, ami az RNáz-

aktivitást alacsony szinten tartja (magas pH, nagy sókoncentráció, detergensek, antioxidánsok és kelátképző

anyagok). A nukleinsavak és fehérjék elválasztása általában kloroform és fenol keverékében történik, majd a

nukleinsavakat cellulózporon választják el. A maradék, szennyező DNS-t és RNS-t enzimes emésztéssel

távolítják el. Az így kinyert dsRNS-eket agaróz- vagy poliakrilamid-gélelektroforézissel lehet elválasztani.

Részletesebb leírást és gyakorlati kimutatásra alkalmas módszereket Dodds (1986) tanulmánya tartalmaz.

Egyszerűsített módszer dsRNS kivonására (Morris et al., 1983)

a. 10 g szövetet folyékony nitrogénben, dörzsmozsárban elporítunk és 10 ml (vagy több) kétszeres töménységű,

1% SDS-t és 0,1% 2-merkaptoetanolt tartalmazó STE-pufferrel (1 × STE = 100 mM NaCl, 50 mM Tris,

1mM EDTA, pH 8) extraháljuk.

b. 10 ml vízzel telített fenol és 5 ml kloroform-pentanol (25:1) keverékével keverjük.

c. A kivonatot 10 percig centrifugáljuk (10 000 g), majd a vizes felülúszót összegyűjtjük.

d. A vizes fázishoz annyi etanolt adunk, hogy annak végső koncentrációja 16–18% legyen.

e. Az oldatot lassan, kis mennyiségekben 18% etanolt tartalmazó, STE-pufferben szuszpendált cellulózporral

(Whatman CF11) töltött oszlopra (injekciós fecskendő) öntjük.

f. A cellulózoszlopot 18% etanolt tartalmazó STE-pufferrel néhányszor átmossuk, ami az egyszálú RNS-t és a

DNS-t lemossa az oszlopról.

g. A dsRNS-t kis mennyiségű (1–3 ml), alkoholt nem tartalmazó STE-pufferrel leoldjuk (eluáljuk) az oszlopról.

h. 2,5 térfogat etanol hozzáadásával a dsRNS-eket kicsapjuk. Az alkoholos oldatot éjszakára –15 °C-ra vagy

néhány órára –70 °C-ra helyezzük.

i. A kicsapódott dsRNS-eket centrifugálással (10 perc, 10 000 g) gyűjtjük össze, majd a csapadékot kiszárítjuk.

Feloldjuk 100 µl (10% RNáz-mentes szaharóz és egy kevés brómfenol-kéket tartalmazó) TPE-pufferrel (35

mM Tris, 30 mM NaH2PO4, l mM EDTA, pH 7,6).

j. Az oldatot 5 percig (5 000 g) centrifugálva tisztítjuk, majd a felülúszó nukleinsavmintát az előző példában

leírtak szerint elektroforézissel elválasztjuk. Jelzőanyagként uborka mozaik vírus (cucumber mosaic

cucumovirus) vagy dohány mozaik vírus (tobacco mosaic tobamovirus) dsRNS-t használhatunk.

Fás szárú növények esetében alkalmazható módszer (Watkins et al., 1990)

a. 10 g friss vagy fagyasztott szövetet folyékony nitrogénnel mozsárban elporítunk és 20 ml 2% polivinil-

pirrolidont (PVP) (Mt. 44000), 1% SDS-t, 1% bentonitot, 0,2% DIECA-t és 0,1% thioglicerolt tartalmazó

TMS-pufferrel (100 mM TRIS, 10 mM magnézium-acetát, 500 mM NaCl, pH 8,5) extrahálunk.

b. 20 ml (10% m-krezolt, 0,3 % 8-hidroxikinolint és 20 ml kloroform és pentanol 25:1 arányú keverékét

tartalmazó) vízzel telített fenollal keverjük.

c. Az elegyet 60 °C-on 15 percig állni hagyjuk.

d. Az oldatot centrifugáljuk (10 000 g, 10 perc), a vizes felülúszót összegyűjtjük.



e. A vizes fázishoz ml-enként 0,02 g cellulózport (Cellex N-1 vagy Whatman CF-11) és 0,22 ml etanolt (95%)

adunk.

f. A szuszpenziót 30 percig keverjük szobahőmérsékleten.

g. Tízperces centrifugálást követően (10 000 g) a felülúszót elöntjük.

h. A cellulózüledéket feloldjuk 1–2 ml 18% etanolt tartalmazó STE-pufferben (200 mM NaCl, 50 mM Tris, 1

mM EDTA, pH 7).

i. 10 perces (10 000 g) centrifugálást követőn a felülúszót elöntjük.

j. A cellulózüledéket kétszer mossuk 18%-os alkoholt tartalmazó STE-pufferben, a cellulózt centrifugálással

gyűjtsük össze.

k. Az utolsó mosáskor a cellulózt 18%-os etanollal szuszpendáljuk, és üvegoszlopra vagy eldobható injekciós

fecskendőre öntjük, majd száradni hagyjuk.

l. Az oszlopról a dsRNS-t és a maradék szennyező DNS-t etanolt már nem tartalmazó STE-pufferrel eluáljuk

(leoldjuk).

m. A leoldott dsRNS-t 2,5 térfogat etanollal (95%) kicsapjuk, és egy éjszakán keresztül állni hagyjuk –15 °C-on,

vagy néhány órán keresztül –70 °C-on.

n. A kicsapott nukleinsavakat centrifugáljuk (10 000 g, 10 perc), elöntjük a felülúszót, a csapadékot 1 ml (30

mM MgCl2-t tartalmazó) STE-ben oldjuk.

o. 10 µg/ml DNázzal kezeljük és 60 percig inkubáljuk 30 °C-on.

p. Hozzáadunk 1 ml (1 mM EDTA-t és 4% SDS-t tartalmazó) 20 mM-os Tris-puffert, majd 60 °C-on további

15 percig inkubáljuk.

q. Azonos mennyiségű vízzel telített fenollal emulgeáljuk.

r. Centrifugáljuk (10 000 g, 10 perc), majd összegyűjtjük a vizes felülúszót és hozzáadunk 2,5 térfogatnyi

etanolt. Ezt követően egy éjszakán –15 °C-on vagy –70 °C-on néhány órát állni hagyjuk, míg a dsRNS-ek

kicsapódnak.

s. Centrifugálás után (10 perc, 10 000 g) a felülúszót elöntjük, a kicsapódott dsRNS-t kiszárítjuk. A csapadékot

100 µl RNáz-mentes, 10%-os szaharózoldatban készített, kevés brómfenol-kéket is tartalmazó TPE-pufferrel

(35 mM Tris, 30 mM NaH2PO4, 1 mM EDTA, pH 7,6) szuszpendáljuk.

t. A szuszpenziót 5 percig centrifugáljuk (5 000 g), majd 20–40 µl mintát 7% TPE-pufferben készített

poliakrilamid- vagy 1% agarózgélre felviszünk.

u. A mintákat 50 V feszültség mellett 16–20 órán keresztül poliakrilamid-gélben, vagy 3–5 órán át

agarózgélben futtatjuk.

v. A géleket etidium-bromiddal vagy ezüstnitráttal festjük.


13. fejezet - A vírusgenom szerveződése és a vírusok replikációja

A vírusok – bár az élettelen és az élő anyag szerveződésének határterületén állnak – felfoghatók olyan obligát

parazita (biotróf), azaz feltétlen élősködő szervezetekként is, amelyek önálló anyagcserével nem rendelkeznek,

hanem a gazdanövény nukleinsav- és fehérjeszintetizáló rendszerét parazitálva annak anyagcseretermékeit

(energiaforrásait, nukleinsavbázisait és aminosavait) használják fel saját bioszintézisükhöz. A vírusoknak önálló

szaporodásuk nincs; ehhez az életjelenséghez ugyanis olyan szaporítószervekre vagy szaporító képletekre és

önálló anyagcserére lenne szükségük, amivel nem rendelkeznek.

A vírusokat (és a viroidokat is) fertőző genetikai információként is felfoghatjuk, ami ebben a megfogalmazásban

azt jelenti, hogy olyan fertőző (és betegségeket okozó) nukleinsavak, amelyek a gazdanövény nukleinsav-

anyagcseréjébe kapcsolódva saját genetikai anyaguk újratermelését (bioszintézisét) biztosítják.

A vírusnukleinsavnak kettős szerepe van. Egyrészt meg kell sokszoroznia saját genetikai anyagát (ez maga a

nukleinsav-replikáció); másrészt irányítania és kódolnia kell a gének kifejeződését, azaz a vírusfehérjék

szintézisét (génexpresszió). A vírusfertőzött sejtben ez a két folyamat időben és térben szigorúan meghatározott

sorrendben és elválasztva, rendezetten megy végbe, amelynek végső eredménye az új virionok szintézise.

A nyugalomban levő, meghatározott alakkal rendelkező (tehát elektronmikroszkóppal látható), inaktív

vírusrészecskéket virionoknak nevezzük. A fertőzés után azonban a virionok „felbomlanak” (dissembly), és

megkezdődik az új virionok szintézise. Ebben az állapotában „vegetatív vírus”-ként tartjuk számon a kórokozót.

A szintetizált vírusnukleinsavak és a köpenyfehérje in vitro összeépülése (assembly) zárja a vírusbioszintézis

folyamatát, amelynek végén újra virionok mutathatók ki, legtöbbször a vakuolumokban vagy a citoplazmában

felhalmozottan. A vírusfertőzés következtében új genetikai információ kerül a sejtekbe, amelyek már a

továbbiakban új, nehezen megbontható biológiai egységet jelentenek.

A replikáció vizsgálata során három alapvető kérdésre keressük a választ: 1. Hogyan szerveződik a vírusgenom

(milyen géneket, milyen sorrendben tartalmaznak)? 2. E gének milyen módon nyilvánulnak meg (mi a

génkifejeződés stratégiája)? 3. A szintézis milyen fehérjetermékeket eredményez (mi ezek feladata, működése)?

1. A vírusreplikáció alapvető vizsgálati módszerei

A vírusreplikációval kapcsolatos ismereteink az elmúlt két évtizedben ugrásszerűen szaporodtak. Ezt az

időszakot – amelyet a molekuláris virológia és a biotechnológia kez-deti korszakának is tekinthetünk – több új,

alapvető vizsgálati módszer bevezetése jellemezte.

1.1. Restrikciós enzimek és a vírusok elsődleges szerkezetvizsgálata

A restrikciós endonukleázok (mikrogombákból vagy baktériumokból izolált, a kettős szálú nukleinsavszálakat

nem a végeiken, hanem a lánc belsejében fajlagosan bontó enzimek) és a nukleinsavsorrendet meghatározó

módszerek segítségével elsőként a karfiol mozaik vírus (cauliflower mosaic caulimovirus) mintegy nyolcezer

bázispárból álló teljes nukleinsavsorrendje vált ismertté (Franck et al., 1980; Rezelman et al., 1980; Ahlquist et

al., 1981; Gardner et al., 1981; Balázs et al., 1982).

1.2. Kettős szálú nukleinsavmásolatok (cDNS) készítése egyszálú RNS-ből

A fordított átírást (RNS-től függő DNS-polimeráz) szabályozó reverz transzkriptáz enzim retrovirusokból

történt izolálása és azok növényvirológiai alkalmazása lehetővé tette az egyszálú RNS-vírusok kettős szálú

DNS-kópiává (cDNS) történő átírását. E cDNS-szakaszok restrikciós enzimekkel bonthatók, szekvenciájuk

meghatározható. Először a dohány mozaik vírus (tobacco mosaic tobamovirus) és viszonylagos egyszerűségük

miatt az osztott genomú vírusok [tehénborsó mozaik vírus (cowpea mosaic comovirus), rozsnok mozaik vírus

A vírusgenom szerveződése és a

vírusok replikációja


(brome mosaic bromovirus)] teljes szekvenciáit határozták meg (Goelet et al., 1982; Lomonossoff és Shanks,

1983). Napjainkra a legfontosabb típusvírusok e szempontból már ismertté váltak, és több esetben

megismerhettük az egyes vírustörzsek közötti biológiai eltérések molekuláris hátterét is.

1.3. A protoplasztok virológiai alkalmazása

A genomban foglalt információk kifejeződéséről szerzett ismereteinket részben az izolált protoplasztok

virológiai alkalmazásának köszönhetjük. A vírusfertőzés során a nukleinsav-replikáció és a vírusfertőzés többi

lépése (sejtről sejtre terjedés, majd az egész növény fertőződése) során szükséges funkcionáló gének és fehérjék

szerepe nem különíthető el pontosan. A sejtfaluktól enzimes (macerozim, celluláz, pektináz) úton megfosztott

protoplasztok cm3-enként több millió sejtből álló szuszpenziója (66. ábra) azonnal fertőzhető, azaz a replikáció

szempontjából szinkron-, in vivo rendszernek tekinthető. A génekben kódolt fehérjék szintézise viszonylag

azonos időben történik meg, jól nyomon követhető. Az 1970-es évek végén és az 1980-as évek elején végzett

kísérletek úttörő munkák voltak a molekuláris virológia kialakulásában (Takebe, 1975; Howell és Hull, 1978;

Gonda és Symons, 1979; Jarvis és Murakishi, 1980; Nassuth et al. 1983).

66. ábra - Dohány-mezofillumból izolált protoplasztok

1.4. A sejtmentes, in vitro fehérjeszintetizáló rendszerek

E transzlációs rendszerek (retikulocita-lizátum, búzacsíra-kivonat, Xenopus oocyta) virológiai alkalmazhatósága

azon alapszik, hogy ezekben az alakos sejtalkotórészeket nem, de riboszómákat tartalmazó szuszpenziókban –

ha minden más feltétel (nukleozidok, energiaforrás, transzfer RNS-ek, stb.) adott – a kívülről bejuttatott pozitív

értelmű ribonukleinsavak, így a vírusnukleinsavak is (mint messenger RNS-ek) az információjuknak megfelelő

fehérjék szintézisét megindítják. Ez az folyamat is gyakorlatilag azonos időben megy végbe. A szinkron

tenyészetek adták az első alkalmat a vírusok proteinszintézisének megismerésére (Efron és Marcus, 1973;

Davies és Kaesberg, 1974; Dougherty és Hiebert, 1980). A két utóbbi módszer (protoplaszt- és sejtmentes

fehérjeszintézis) eredményei együttesen adnak útmutatást a fehérjetermékekre, azok képzési mechanizmusaira.

2. A vírusgenom szerveződésének alaptípusai

A vírusok teljes génállománya a genom. Mint ismert, ezek formái: egyszálú DNS (pl. geminivirusok); kettős

szálú RNS (pl. reovirusok), kettős szálú DNS (pl. caulimovirusok); valamint a növénypatogén vírusok túlnyomó

többsége egyszálú (+) RNS. A növény- és az állatpatogén vírusok határán – mintegy a rokonságot bizonyítandó

– foglalnak helyet a rhabdovirusok és a tospovirusok, amelyek genomja negatív (antiszensz), illetve részben

kettős (+ és –), azaz ambiszenz. A nukleinsavlánc lehet fonalas (lineáris) vagy kör alakú (cirkuláris). Bár a

nukleinsavak térbeli szerkezete sem közömbös, a főbb tulajdonságokat a nukleotidsorrend (nukleinsav-

szekvencia) határozza meg. Egy nukleotid eltérés – különösen, ha az a fehérjében aminosavcserét eredményez –




már a biológiai tulajdonságok megváltozását (pl. tünettípus, átvitel, hőérzékenység stb.) okozhatja. A vírusok és

vírustörzsek rokonságát a nukleinsav-homológia foka határozza meg.

A genom lehet egykomponensű, azaz osztatlan, de lehet osztott, azaz multikomponensű is. Ez utóbbi esetben az

egyes komponensek csak együtt fertőzőképesek, hiszen a megosztottság a feladatok megosztását is

eredményezi.

2.1. A nukleinsavak jellemző végei

A vírus-RNS 5‟ és 3‟ végei sajátos szerveződésűek. Egyes RNS-ek 5‟ végén 7metil-guanozin (m7Gppp) sapka

(cap) van (Tobamovirus, Potexvirus, Bromovirus nemzetségek), míg másokra (Comovirus, Nepovirus,

Potyvirus, Sobemovirus) a genomhoz kötött kis molekulatömegű fehérje (VPg) a jellemző (Davies és Hull,

1982). A sapka jelenléte a fertőzés eredményességét, az RNS stabilitását és a transzlációt befolyásolja; szerepe a

proteinszintézis megindításában van. A VPg-regulátor szerepe az RNS-szintézis megindításában nem minden

vírus esetén bizonyított, de feltételezhető, hiszen ez az egyetlen fehérjemolekula, amely a replikáció teljes idején

a nukleinsavhoz kötődik (Matthews, 1991).

Az RNS 3‟ végén egyes nemzetségeknél (Tymovirus, Tobamovirus, Bromovirus, Potyvirus, Cucumovirus)

tRNS-re emlékeztető szerveződésű és szerepű szakasz található, másoknál (Comovirus) ezt egy poliadenilsav-

láncból [poly (A)] álló hosszú farok (tail) helyettesíti. A tRNS-szerű vég feltehetően a replikáz enzim

felismerési helye, ahol a negatív szálak szintézise elkezdődhet. Szerepe egy olyan aminosav megkötésében van,

ami elősegíti a replikációban szereplő enzimek felismerését és a transzlációt. A poly (A) farok a replikációnál

nélkülözhetetlen, az RNS-t stabillá teszi. A láncvégi szerveződés nem követi a virion morfológiáját, de

jellemzője lehet a vírusok új, nukleinsav-szerveződésen alapuló rendszerének. Az osztott genomú

(multikomponens) vírusok nukleinsavvégei típus szerint megegyeznek.

Az RNS kezdeti szakaszain hosszabb, fehérjéket nem kódoló, de a működés szempontjából fontos szakaszok is

lehetnek. Az 5‟ vég fehérjét nem kódoló szakaszai például a riboszómákhoz történő kötődést biztosíthatják. Az

egyes gének között néha csak egy-két, máskor több száz nem kódoló nukleotid van. A növénypatogén vírusok (a

geminivirusok kivételével) intronokat nem tartalmaznak.

2.2. Nyitott leolvasási szakaszok, fehérjetermékek

A vírusgenom, hosszúságától függően, 1–12 gént tartalmazhat. Egy gént tartalmaz például a szatellit dohány

nekrózis vírus (tobacco necrosis satellivirus) virionja, míg a potyvirusokban a gének száma 10, a reovirusokban

12. Minden nyílt leolvasási szakasz (open reading frame, ORF) elején egy kezdő szignál, a végén pedig egy stop

kondon (termination signal) foglal helyet. Ez a szakasz egy peptid vagy polipeptid leolvasására ad lehetőséget,

amelynek nagysága a leolvasási szakasz hosszától függ. Ha a stop kodon gyenge, akkor ezt a riboszómák

átolvashatják, és egy, a korábbinál hosszabb polipeptid szál is keletkezik (read-through protein). Ritkán átfedő

(overlapping) gének is vannak egy nukleinsavszakaszon, ami azt eredményezi, hogy azon a szakaszon akár két

fehérjetermék is képződhet. Gének lehetnek a negatív szálon is (pl. tospovirusok), de ez esetben ezek

megnyilvánulása egy mRNS szintézisétől függ.

A fehérjetermékek feladatuknak megfelelően az alábbiak szerint csoportosíthatók: 1. strukturális fehérjék (pl.

köpenyfehérje); 2. replikációban szereplő enzimek (proteázok, polimerázok, helikázok); 3. transzport-fehérjék,

amelyek a vírus növényen belüli elterjedését, a fertőzés szisztemizálódását biztosítják; vagy 4. ún. segítő

(helper) fehérjék, amelyek a vektortevékenységet fajlagosan segítik.

2.3. A vírusnukleinsav-replikáció általános menete

A fertőzés után a pozitív (+) szálú RNS-vírusok (67. ábra) replikációjuk első lépésében fehérjeburkukat veszítik

el, deproteinizálódnak. A folyamat az 5‟ végen kezdődik el, és lehetővé teszi a nukleinsav (80S) riboszómákhoz

történő kapcsolódását és az első géntermék, legtöbbször egy polimeráz enzim szintézisét. Ennek az RNS-től

függő RNS polimeráz enzimnek (replikáz) segítségével a pozitív szálról egy negatív szálú (–) minta- (templát)

RNS íródik át. A negatív szál bázissorrendjében a kiegészítő nukleotidokat tartalmazza, tehát tükörképe a

pozitív szálnak. A két szál együtt egy kettős szálú RNS-nek felel meg, amit replikatív formának (RF) nevezünk.

Ennek az átmeneti formának a jelenlétét több gazda–vírus kapcsolat [pl. árpa csíkos mozaik vírus (barley stripe

mosaic hordeivirus)] esetében sikerült bizonyítani. A továbbiakban a negatív szálról indul meg több ponton is a

pozitív szálak szintézise. Ezt a csak részben kétszálú, de már több (+) egyszálú RNS-t tartalmazó formát




replikatív intermediernek (RI) nevezzük. A replikáció helye víruscsoportonként eltérő is lehet, történhet a

sejtmagban, a citoplazmában a kloroplasztiszok határán vagy a citoplazma elkülönült helyein (viroplazma).

67. ábra - A dohány mozaik vírus (tobacco mosaic tobamovirus) replikáció szakaszai a

növényi sejtben. A: fertőzés, B: az RNS kiszabadulása, C: kötődés a riboszómákhoz, D:

vírusreplikáz (vagy egy része), E: a replikatív forma keletkezése, F: replikatív

intermedierek keletkezése, G: replikatív komplex, H: összeépülés, I: kész virionok, RF:

replikatív forma, RI: replikatív intermedier, sRNS: kis (szubgenomi) RNS [Érsek és

Gáborjányi, 1998 után]

A templát RNS a 3‟-végtől íródik át. A VPg és köpenyfehérje (5‟-végen vannak) a fehérjeszintézis elkezdésében

játszik szerepet. Az egyes genomnál kisebb, azaz szubgenomi RNS-ek szintézisét szintén a replikáz enzim

komplex szabályozza. Néha [pl. tarlórépa sárga mozaik vírus (turnip yellow mosaic tymovirus)] az RNS

szintézisében (pontosabban az RNS-től függő RNS polimeráz komplex képzésében) a gazdanövény fehérjéi

(host coded proteins) is részt vesznek. A vírusfertőzés eredményessége (a gazdanövénykör kialakulása) attól is

függ, hogy mennyire képes a kórokozó a gazdanövény fehérjéit saját nukleinsav-szintéziséhez felhasználni.

Az egyszálú, de negatív értelmű RNS-ek replikációja (tospovirusok) pozitív templát RNS segítségével valósul

meg. A kettős szálú DNS-vírusok (caulimovirusok) replikációja szintén mRNS szintézisét igényli, erről a

mRNS-ről fordított transzkripcióval képződik a pozitív szálak szintézise. E speciális eseteket a következő

fejezetben tárgyaljuk.

2.4. A génkifejeződés általános módjai




A vírus-nukleinsav második funkciója hírvivő (messenger) RNS jellegű, feladata a génkifejeződés biztosítása. A

transzlációkor a genomnak csak az 5‟ végi, első nyílt leolvasási szakasza fejeződik ki polipeptid formájában, a

többi „néma” marad. A vírusoknak a teljes génkifejeződéshez többféle stratégiát, egyszerre esetleg több

módszert kell választani ahhoz, hogy minden génje expresszálódjék. Erre több lehetőség is van. Az első esetben

a) a genom osztatlan (bennük belső stop szignál nincs), egyetlen poliprotein képződik, ami később, a transzláció

után hasad funkcióképes alegységekre; b) a genom osztottságából adódik, a multikomponens-vírusok minden

virionja (általában) csak egy-egy RNS-darabot foglal magában, ezek az RNS-ek csak egy (vagy két) gént

hordoznak; c) a genomban több gén is van, a belső szakaszok leolvasását egy vagy több, a genomnál kisebb,

azaz szubgenomi RNS szintézise előzi meg. Ezek a szubgenomi RNS-ek már csak egy (vagy két) rövidebb gént

tartalmaznak. Egy vírus génkifejeződéséhez egyszerre több szubgenomi RNS-t is felhasználhat; d) ha a 3‟ vég

zárószekvenciái gyengék, lehetővé válik a stop kodon átolvasása és egy hosszabb szál szintézise is. Az így

képződött átolvasott fehérje (read-trough protein) hosszabb szekvenciái tehát részben azonosak a rövid száléval.

Hasonló a mechanizmusa a különböző leolvasási fázisokban keletkezett (transframe) fehérjéknek is. Ez esetben

e) egy fehérje szintézise még nem ér véget, de a másik fehérje szintézise már megkezdődhet.

3. A génkifejeződés stratégiái a különböző vírusnemzetségekben

A növénypatogén vírusok a génexpresszióhoz az alapvető lehetőségeket vírusnemzetségenként jellemző módon,

egy formában, vagy különböző kombinációkban valósítják meg (Foster és Taylor, 1998). Ez a forma egyes

nagyobb csoportok esetében hasonlóságokat mutat, ami alkalmas új vírusrendszer alapjainak felvázolásához is.

Az alábbiakban csak néhány jól ismert stratégiát mutatunk be.

3.1. A potyvirusok replikációja: poliprotein szintézise és transzláció utáni hasadási termékek

A potyvirusok [burgonya Y-vírus (potato Y potyvirus), kukorica csíkos mozaik vírus (maize dwarf mosaic

potyvirus), szilva himlő vírus (plum pox potyvirus) stb.] virionjai helikálisak, kb. 700 nm hosszúak. Az egyszálú

(+) RNS genom mintegy 10 000 nukleotidot tartalmaz. 5‟ végén VPg van, 3‟ vége poliadenilált. Az első,

mintegy 85–205 nukleotid nem kódoló régiót egy hosszú leolvasási szakasz követi, amiről egyetlen (350–360

kD) hosszú poliprotein-prekurzor íródik át, amit a vírus által kódolt proteázok vágnak el a transzláció után

funkcióképes fehérjékké. A potyvirusok génkifejeződésének szabályozását valószínűleg e különböző fehérjék

időben eltérő megjelenése teszi lehetővé (Riechmann et al., 1992).

A potyvirusok génkifejeződését a szilva himlő vírus (plum pox potyvirus) példáján mutatjuk be (Riechmann et

al., 1992) (68. ábra). Az első géntermék (P1 fehérje) biológiai szerepe még nem teljesen tisztázott, de ismert,

hogy proteolitikus aktivitású és transzport-fehérje funkciót is betölthet. A fertőzött levelek epidermiszsejtjeiben

zárványok formájában halmozódik fel. A második végtermék a levéltetűvel történő átvitelt segítő fehérje (helper

komponens, HC-Pro) szintén többfunkciós jellegű, nemcsak a vektorátvitelben van szerepe, de a floemben

történő transzportban is. A fehérje C terminális része proteáz jellegű. A sejtekben amorf zárványokat alkot. A

harmadik polipeptid (P3 protein) szerepe jórészt ismeretlen. Részt vehet a proteolitikus hasítás szabályozásában.

A 6K1 és 6K2 fehérjéknek – szekvenciájuk alapján – a replikációban, a VPg mebránhoz kötésében van

jelentőségük. A henger vagy forgó kerék (szélkerék) alakú citoplazmikus zárványfehérje (CI) a potyvirusok

legjellemzőbb terméke. Helikáz-aktivitású. A kis sejtmagi zárványfehérje (NIa) proteáz-aktivitású, és felelős a

poliprotein nagyobbik részének hasításában. A genomhoz kötött protein (VPg) az RNS pozitív szálak

szintézisének megindításához szükségesek. A nagy sejtmagi zárványfehérje (NIb) anyagáról feltehető, hogy ez

az RNS-től függő RNS-polimeráz, ami a CI, a VPg(NIa), valamint a 6K1 és 6K2 fehérjékkel együtt a replikációs

komplex egyik tagja. A hosszú polipeptidlánc utolsó származéka a kapszid- vagy köpenyfehérje (CP). Szerepe –

a nukleinsavat védő funkcióján kívül – a gazdaspecifitásban és a levéltetűvel történő átvitelben van. A

potyvirusok taxonómiája elsősorban a köpenyfehérje eltérésein alapul. A CP N terminális része igen

változékony, vírus- és törzsspecifikus eltéréseket tartalmaz. A középső régió erősen konzervatív, ez felelős a

sejtről sejtre terjedésért és a vírus összeépüléséért. A C és az N végek a virionok felületén helyezkednek el.

68. ábra - A potyvirusok [szilva himlő vírus (plum pox potyvirus)] géntérképe. P1(Pro)

= P1 fehérje proteázaktivitással, HC-Pro = segítő (helper) komponens, P3 = P3 fehérje,

6K1 = 6K1 fehérje, CI (Hel) = citoplazmikus zárványfehérje helikázaktivitással, 6K2 =

6K2 fehérje, NIa = sejtmagfehérje, NIb (Rep) = sejtmagfehérje replikázaktivitással, CP




= köpenyfehérje, poli (A) = poliadenilsav. Magyarázat a szövegben [Riechmann et al.,

1991 után]

A potyvirusok jellegzetes replikációjában az egyes fehérjetermékek azonos, tehát ekvimoláris mennyiségben

termelődnek. Ahhoz, hogy egyetlen köpenyfehérje-molekula kialakuljon, az egész nukleinsavnak újra

transzlálódnia kell. Ennek a „gazdaságtalan” termelésnek egyrészt az a következménye, hogy kevés a

növényben felhalmozott burok- (kapszid-) fehérje és virion mennyisége, másrészt a bioszintézis más

„felesleges” termékei zárványok formájában halmozódnak fel.

3.2. A tehénborsó mozaik vírus (cowpea mosaic comovirus) replikációja: osztott genom és poliproteinek

A tehénborsó mozaik vírus (cowpea mosaic comovirus) a Comovirus nemzetség típus tagja. A vírusnemzetség

hazai képviselője a vöröshere tarkulás vírus (red clover mottle comovirus). A genom két (+) RNS szálra osztott

(M és B); ezek külön-külön, azonos méretű (30 nm) izometrikus virionokban enkapszidálódnak. A rövidebb M

szál 3481 nukleotidból (nt) áll. A hosszabb B szál 5889 nt nagyságú. Mindkét szál 5‟ végén kovalens kötésű

VPg található, a 3‟ végén poliadenilált. Mindkét szál első 44 kezdeti szekvenciáiban, illetve a szálak adenilált

része előtti szakaszaiban nagy a hasonlóság. Ez utóbbinak valószínűleg a köpenyfehérje-felismerésében van

szerepe (69. ábra).

69. ábra - A tehénborsó mozaik vírus (cowpea mosaic comovirus) géntérképe és a

transzláció utáni hasadás termékei: poli(A) = poliadenilsav farok, ORF = nyílt leolvasási

szakasz, nt = nukleotid, kD = kilodalton. Magyarázat a szövegben [Matthews, 1991

után]

Az egyes szálak külön replikálódnak. Mindkét szál replikatív formáját a fertőzött levelekben azonosították, és

csak egy-egy leolvasási szakaszt tartalmaznak. A replikáció során így mindkét szálról csak egy poliprotein (105

és 202 kD) szintézise valósul meg, amelyek a transzláció után proteolitikusan alegységekre hasadnak. A

protoplasztok fertőzésekor kimutatható első hosszú polipeptid (202 kD) többlépcsős hasadási termékei közül

egy (32 kD) proteáz-aktivitású, míg az 58 kD-os fehérje a replikáz enzim része, de ugyanennek a poliproteinnek

a terméke a 4 kD nagyságú VPg is. A 110 kD nagyságú replikáz enzim is a B komponensben kódolt. Ha a

protoplasztokat csak a B komponenssel fertőzték, akkor virionok nem képződtek. Eredménytelen volt a

protoplasztok fertőzése akkor, ha azokat csak a rövidebb komponenssel fertőzték. Az eredménytelenség oka –

ma már nyilvánvalóan – arra vezethető vissza, hogy a replikáz enzim kódja a B RNS-hez kötött. Ha a két

komponens a fertőzéskor együtt volt, akkor a fertőzés eredményes volt, és komplett virionok is képződtek. A

virionokhoz szükséges két köpenyfehérje (37 és 23 kD) ugyanis az M szálon kódolt, hasonlóan az 58 és 48 kD

nagyságú fehérjékkel, amelyek a sejtről sejtre terjedés feltételeit biztosítják. A 48 kD nagyságú fehérjét a

membránokból izolálták. Mindezek a peptidek egyetlen polipeptid (105, illetve 95 kD) hasadási termékei, ezt az




elsődleges terméket azonban – valószínűleg gyors bomlása miatt – a fertőzött protoplasztokból nem lehetett

kimutatni. Mindkét elsődleges poliproteinszál hasítását a B komponensben kódolt (24 kD) fehérje végzi

(Goldbach és van Kammen, 1985; Rezelman et al., 1989).

A vírusszintézisben a B komponensben kódolt 60 és 58 kD, illetve 110 kD fehérjék mellett részt vesznek a

gazdanövény polimeráz emzimei is, amelyek jelenlétét sikerült a fertőzött növényekből kimutatni (Dorssers et

al., 1984). A replikáció helye a citoplazma, a virionok a sejtfal mellett tubuláris szerkezetű formákból, a

viroplazmából mutathatók ki, majd a citoplazmában és a vakuolumokban halmozódnak fel.

A comovirusokhoz hasonló replikációs stratégiát követnek a nepovirusok [dohány gyűrűsfoltosság vírus

(tobacco ringspot nepovirus) és a paradicsom fekete gyűrűs vírus (tomato black ring nepovirus)] is.

3.3. A rozsnok mozaik vírus (brome mosaic bromovirus) replikációja: osztott genom és szubgenomi RNS

A rozsnok mozaik vírus (brome mosaic bromovirus) a gabonaféléket hazánkban is gyakran fertőző, jól ismert

kórokozó. Három részre osztott genomja 8243 nukleotidot tartalmaz (Ahlquist et al., 1984; Ahlquist, 1987). Az

egyes nukleinsavszálak mellett az izometrikus (30 nm) virionokba még egy kis szubgenomi RNS is

enkapszidálódik úgy, hogy cukorgradiens-centrifugálással csak három nukleinsavat tartalmazó [nehéz (B),

közepes (M) és könnyű (L) frakció különíthető el] (70. ábra). A nehéz, B szálban egy hosszú nukleinsavszál

(RNS1) van, a középsőben két kisebb (RNS3 és a szubgenomi RNS), míg a harmadik frakcióban ugyancsak egy

szál (RNS2) foglal helyet. A fertőzött növényből azonban egy negyedik, nukleinsavat nem tartalmazó üres

köpenyfehérje-kagylókból álló (T), ún. felső frakció is elválasztható.

70. ábra - A rozsnok mozaik vírus génszerveződése. cap = sapka, tRNS = transzfer

RNS-szerű vég, ORF = nyílt leolvasási szakasz, nt = nukleotid, kD = kilodalton

[Matthews, 1991 után]

Az RNS1 3234, az RNS2 2865 és a RNS3 2144 nukleotidot tartalmaznak. Minden szál 5‟ végén metil-guanozin

„sapkát”, 3‟ végén tirozin megkötésére alkalmas traszfer-RNS-hez hasonló másodlagos szerkezetet hordoz.

Elvileg minden nukleinsavszálon egy gén foglal helyet, azaz egy leolvasási szakaszt tartalmaz. Ez alól kivétel az

RNS3, amelyen két, fehérjének megfelelő leolvasási szakasz is helyet foglal. A két gén között rövid, mintegy

250 nukleotid hosszúságú nem kódoló szakasz is van, amiből mintegy 20 adenilált.

A replikációs stratégia lényege a genom osztottságából ered. Az RNS-eken csak egy leolvasási szakasz van, ami

egy-egy fehérje szintézisét teszi lehetővé. A harmadik RNS-szál azonban két cisztront is tartalmaz, a 3‟ vég felé

eső részen foglal helyet a köpenyfehérje-gén. Ez egy új, genomnál kisebb, 0,9 kilobázis nagyságú szubgenomi

RNS szintézisén keresztül olvasódik le. A szubgenomi RNS maga is hasonló a genomi RNS-ekhez, amennyiben




ez is 5‟ végén „sapkát” hordoz, 3‟ vége pedig szintén tRNS-jellegű. A szubgenomi RNS maga is

enkapszidálódik az RNS3-al, együtt alkotva a középső (M) frakciót.

Az RNS1 terméke (109 kD) részt vesz az RNS-replikációban, metil-transzferáz- és helikáz-aktivitása van. Az

RNS2 által kódolt fehérje (94 kD) szintén részt vesz a replikációban (valószínűleg ez az RNS-függő RNS-

polimeráz enzim). Az RNS3 olyan fehérje (32 kD) szintézisét irányítja, ami a vírus növényen belüli elterjedését

segíti (transzport-fehérje). A negyedik termék – amelynek szintézise a rövid szubgenomi RNS-től függ – a

köpenyfehérje (20 kD).

A replikáció – feltehetően a genom osztottsága miatt – igen gyors és nagyon hatékony. Mind a négy kettős szálú

RNS (dsRNS) kimutatható a fertőzött protoplasztokból. Először a hosszabb RNS-ek termékei jelennek meg,

majd az idő haladtával túlnyomóvá válik a köpenyfehérje szintézise. A különböző bromovirusok egyes

komponensei (például az RNS3) annyira hasonlóak, hogy azok egymással kicserélhetők [tehénborsó klorotikus

tarkulás vírus (cowpea chlorotic mottle bromovirus)] (pszeudo-rekombináció). A vírustörzsek, esetleg

vírusfajok közötti rekombináció a faj számára nagy evolúciós előnyt jelenthet, az új kombinációk a természetes

szelekció révén vagy állandósulhatnak, vagy eltűnhetnek.

A bromovirusok a sejtmagban [pl. lóbab tarkulás vírus (broad bean mottle bromovirus)] replikálódnak, de az új

virionok a citoplazmában (esetenként viroplazmában) halmozódnak fel. A bromovirusokhoz hasonló replikációs

utat követnek a cucumovirusok [pl. uborka mozaik vírus (cucumber mosaic cucumovirus)], a hordeivirusok [pl.

árpa csíkos mozaik vírus (barley stripe mosaic hordeivirus)] és az ilarvirusok [pl. alma mozaik vírus (apple

mosaic ilarvirus)], valamint a lucerna mozaik vírus (alfalfa mosaic alfamovirus) is. Utóbbi kórokozó e

szempontból azért érdekes, mert a nukleinsav-replikáció kezdeményezésében a köpenyfehérjének különleges

szerepe van.

3.4. A dohány mozaik vírus (tobacco mosaic tobamovirus) replikációja: átolvasott fehérje és szubgenomi RNS-ek

A dohány mozaik vírus (tobacco mosaic tobamovirus) a tobamovirus nemzetség típustagja. A legrégebben és

legrészletesebben tanulmányozott víruskórokozó. A genom egy pozitív szálú, 6395 nukleotidból álló RNS.

Teljes szekvenciája 1982 óta ismert (Goelet et al., 1982). Az 5‟ végen 7-metil guanozin sapka (m7Gppp), a 3‟

vég tRNS-szerű (hisztidint kötő) másodlagos szerkezetű. Az RNS 3‟ végétől kb. 1000 nukleotid távolságra a

köpenyfehérjét specifikusan felismerő és megkötő szekvenciák helyezkednek el. Az RNS első 70 nukleotidja és

a 3‟ vég utolsó szekvenciái fehérjét nem kódoló szakaszok.

Az első leolvasási szakasz egy 126 kD nagyságú fehérje szintézisét teszi lehetővé. Ezt egy gyenge stop kodon

(UAG) követi, ami lehetővé teszi annak „átolvasását” és ezen keresztül a második leolvasási szakasznak

megfelelő, az előbbinél hosszabb fehérjeszakasz (183 kD) szintézisét eredményezi (71. ábra). E fehérje 5‟ vég

felőli része szekvenciájában teljesen azonos a 126 kD fehérjével. Az átírt szakasz, ami a harmadik leolvasási

szakasznak felelne (ORF3) meg, elvileg egy önálló (54 kD) fehérje lehetne, ezt a fehérjét azonban a fertőzött

növényekben nem találták meg. Mind a 126, mind a 183 kD fehérje RNS-től függő RNS-polimeráz, tehát maga

a replikáz enzim.

A belső gének további kifejeződése szubgenomi RNS-ekhez kötött. Az I2 szubgenomi RNS két leolvasási

szakaszt (ORF4 és ORF5) is tartalmaz, amelyek közül csak az első (ORF4) nyilvánulhat meg. Ennek terméke a

30 kD nagyságú peptid, transzport-fehérje, tehát a sejtről sejtre történő terjedésben van szerepe. A belső

leolvasási szakasz (ORF5) transzlációja csak egy újabb, egycisztronos, kis szubgenomi RNS (sRNS) révén

valósul meg. Az ORF5 a köpenyfehérje (17,6 kD) kódját foglalja magában. Mindkét szubgenomi RNS-t (I2 és

sRNS) a fertőzött növényekből izolálták. Érdekes, hogy a két szubgenomi RNS közül csak az sRNS metilált. A

rövid sRNS gyors és nagy tömegű köpenyfehérje szintézisét teszi lehetővé. A köpenyfehérje szerepe többoldalú,

egyrészt védi a nukleinsavat a káros külső hatásoktól, másrészt részt vesz a kompatibilitási viszonyok

kialakításában is.

A vírusreplikáció általános menete a A vírusnukleinsav replikációjának általános menete című fejezetrészben

ismertettek szerint történik. A sejtbe került virionokról – valószínűleg több pontból kiindulva – a köpenyfehérje

elemésztődik, szabaddá válik az RNS 5‟ vége, ahonnan a 80S riboszómákon megindul az első két ORF-termék

szintézise. Mindkét fehérje részt vesz annak a replikációs komplexnek a kialakításában, amiben a gazdanövény

által kódolt fehérjéknek is meghatározó szerepük van. A vírusspecifikus RNS-től függő RNS-polimeráz a

membránhoz kötött poliriboszómákhoz (30 000 g frakció) kötődik. Ez katalizálja mind a pozitív, mind a negatív




szál szintézisét. E frakcióból mind a replikatív forma (RF), mind a replikatív intermedier (RI) jelenléte

kimutatható.

A szubgenomi RNS-ek szintézisének szabályozási mechanizmusa kevésbé ismert. A replikáció végén

felszaporodó köpenyfehérje felismeri az RNS 3‟ véghez közeli (5290–5527 nukleotid közötti), speciális

bázispárosodású szakaszait (felismerési régió), és megkezdődik mindkét irányban a köpenyfehérje-korongok

nukleinsavval történő összeépülése (assembly) és az új virionok kialakítása. A reakció in vitro körülmények

között is végbemegy, egyes esetekben a kötőhelyek a rokon vírusok fehérjéit is felismerik.

A vírusszintézis helye a citoplazma, az endoplazmatikus retikulum speciális része (viroplazma). Felmerült

annak a lehetősége is, hogy a kloroplasztiszok is a vírusbioszintézis helyei. Valószínűbb azonban, hogy a vírus-

köpenyfehérje és a virionok csak később épülnek be a színtestekbe. A képződött új virionok a citoplazmában és

a vakuolumokban halmozódnak fel igen nagy mennyiségben, s gyakran hexagonális parakristályos formába

rendeződnek.

A tobamovirusokhoz hasonló expressziót követnek az egyéb tulajdonságaikban távol álló luteovirusok is.

3.5. A pararetrovirusok replikációja: fordított transzkripció

A caulimovirusok a kettős szálú DNS-vírusok egyedüli képviselői. Típustagjuk a karfiol mozaik vírus

(cauliflower mosaic caulimovirus). Gazdasági kárt nem okoz, tudománytörténeti szempontból mégis jelentős.

Kezdetben a magasabbrendű szervezetekre jellemző génállománya miatt került a molekuláris biológiai, majd a

biotechnológiai, génsebészeti kutatások homlokterébe. Később a replikációs stratégia különlegessége keltette fel

iránta azt a tudományos érdeklődést, amely mind a mai napig tart. Nukleinsav-újratermelése ugyanis egy RNS-

től függő DNS-polimeráz, a reverz transzkriptáz enzim működésén alapul. E replikációs mód az állat- és

humánpatogén retrovirusokra jellemző, ezért is használják a caulimovirusokra a pararetrovirus elnevezést.

A karfiol mozaik vírus több törzsének a teljes nukleinsavsorrendje már viszonylag korán ismertté vált (Franck et

al., 1980; Gardner et al., 1981; Balázs et al., 1982). A genom két, bázispárosodással pontosan illeszkedő, kör

alakú DNS-szálból áll (72. ábra). A bázispárok száma kb. 8000. A külső (alfa) szál egy helyen szakad meg (gap

1 = kapu), míg a belső (béta) szálon két kapu is van (gap 2 és 3). A genom hat gént, de nyolc elvi lehetőséget

tartalmaz.

Az első nyitott leolvasási szakasz (ORF I) terméke a 37 kD nagyságú fehérje, amit a fertőzött levelek

sejtfalfrakcióiból lehet kimutatni. Szerepe a plazmodezmák átjárhatóságának biztosítása, tehát transzlokációs

fehérjének tekinthető. A második és harmadik gén (ORF II és ORF III) termékei hasonló (18, ill. 15 kD)

nagyságúak. Az első (18 kD) a levéltetűvel történő vírusátvitelt segíti (helper protein), az utóbbi (15 kD)

strukturális fehérje a virion belsejében van. A negyedik fehérje (57 kD) az ORF IV terméke, a köpenyfehérje

előanyaga, belőle származik proteolízissel a köpenyfehérje (42 kD). Az ORF V a leghosszabb leolvasási

szakasz, egy RNS-től függő DNS-polimeráz (reverz transzkriptáz) enzimet kódol. A hatodik, az ORF VI

génterméke a viroplazma-fehérje, szerepe a betegség indukciójában és a tünetek kifejlődésében van. Az utolsó

két kis molekulatömegű fehérje (ORF VII és OFRF VIII) szerepe nem kellően ismert.

A caulimovirusok nukleinsav-szintézise különleges módon történik (73. ábra). A sejtbe jutott virionok

köpenyfehérje-burkukat elveszítve jutnak el a sejtmagba. Itt a két DNS-szálról a kapukat átfedő RNS-végek

leoldódnak és a genom teljes (megszakítás nélküli) kettős kört formál, ún. minikromoszómát alkot. A

továbbiakban a szálak közötti kötés fellazul. Az egyik (alfa) szálról mRNS-ek szintézise (19 S és 35 S RNS)

indul meg. Közülük a 35S RNS a genom teljes információit hiánytalanul tartalmazza. A replikáció második

szakaszában mindkét RNS-szál elhagyja a sejtmagvat és a citoplazmába jut. Itt a 19S RNS a viroplazma

fehérjeszintézisét irányítja.

A 35S RNS a viroplazmában kezdi meg egy új DNS- (–) szál szintézisét, tehát egy fordított transzkripciót, azaz

RNS-től függő DNS-szintézist (Guilley et al., 1983; Hull és Covey, 1983). A reakciót katalizáló enzimet reverz

transzkriptáznak nevezzük. Ehhez hasonló különleges enzim csak az állatpatogén retrovirusokban fordul elő.

Így, ha rövid időre is, de egy RNS-templát és a neki megfelelő DNS- (–) szál együtt fordul elő. A későbbiekben

a mRNS-t RNázok elemésztik (egy rövid rész megmarad a gap-ek borítására), és a (–) DNS-szálról mint

primerről másik (+) DNS-szál képződik (Hull et al., 1987).

Az új DNS-szálak szintézisével lépést tartva történik a köpenyfehérje-szintézis. Az új DNS-szálak a

köpenyfehérjével komplett virionokat alkotnak, amelyek elsősorban a viroplazmában vagy azok közvetlen

közelében halmozódnak fel.




3.6. Geminivirusok: kétirányú transzkripciós stratégia

A geminivirusok különlegessége, hogy a genom az amúgy is jellegzetes (18 × 30 nm nagyságú)

ikerpartikulumokban egyszálú, kör alakú DNS. Ez lehet egyetlen szál [pl. búza törpülés vírus (wheat dwarf

monogeminivirus)], vagy két szál [pl. bab aranysárga mozaik vírus (bean golden mosaic begomovirus)]. A

bigeminivirusok két DNS-szála különböző. A harmadik csoport (hybrigeminivirus) nukleinsava mindkét

alaptípusra hasonlít; a két szál hasonló, de nem azonos. Típus képviselőjük pl. a répa levélcsúcs fodrosodás

vírus (beet curly top hybrigeminivirus, újabban: beet curly top curtovirus). A geminivirusok replikációs

stratégiája több hasonlóságot mutat. Minden geminivirusban megtalálható egy arginin–timin gazdag hurok, és

egy rövid, kb. 200 nukleotid nagyságú, fehérjét nem kódoló, közös szakasz.

A replikáció módját legismertebb képviselőjük, a kukorica csíkosság vírus (maize streak monogeminivirus,

újabban: maize streak mastrevirus) példáján (Stanley, 1985; Stanley és Davies, 1989) mutatjuk be. Az egyszálú,

cirkuláris genom 2687 nukleotidból áll (Mullineaux et al., 1984). A nukleinsavszálon négy nyílt leolvasási

szakasz van, kettő a pozitív polaritású, ún. „virionszálon” (V1 és V2), kettő pedig a negatív, ún. „komplementer

szálon” (C1 és C2). E két szálrészt egy rövid intergenikus szakasz választja el egymástól. Az első (V1)

fehérjetermék (10,9 kD) szerepe ismeretlen, a második (V2) a köpenyfehérje (27 kD). A másik leolvasási

szakaszon is két fehérje kódolt (C1 és C2), ezek a replikációhoz szükségesek (74. ábra). A transzláció

egyszerre, két irányban megy végbe. Maga a nukleinsav-replikáció kétszálú formák (dsDNS) képzésével, ún.

„forgó kerék” (rolling circle) formában valósul meg, amely folyamatban a gazdanövény fehérjéi is szerepet

kapnak. A fehérjeszintézis ún. naszcens RNS-primerek segítségével történik (Dhar és Singh, 1995).

74. ábra - A geminivirusok génszerveződése és lehetséges géntermékei. Magyarázat a

szövegben [Mullineaux et al., 1984 után]

A replikáció a sejtmagban történik, ugyanitt halmozódnak fel a kész virionok is, gyakran kristályos

elrendeződésben. A citoplazmában granuláris zárványok figyelhetők meg. Számos geminivirus a floem

parenchima szöveteiben található nagyobb mennyiségben (Harrison, 1985).

A kétszálú geminivirusok [pl. a bab aranysárga mozaik vírus (bean golden mosaic bigeminivirus, újabban: bean

golden mosaic begomovirus)] szekvenciái – a közös régiótól eltekintve – eltérőek. Elnevezésük szerint a két

szál: DNS-A és DNS-B. Ezek felépítése is elkülönül virion részre és komplementer szálra, tehát a transzkripció

itt is egyszerre két irányban valósulhat meg. A DNS-A szálon átfedésben a replikációs fehérjék (AC1, AC2,

AC3) olvasódnak le. Ezek közül az AC1 elég a replikációhoz, a többi termék csak a hatásfokot növeli. A DNS-

A komplementer szál két fehérjét (AV1 és AV2) kódol. Az első szerepe nem ismert, a második a köpenyfehérje.

A DNS-B szál virion része és komplementer régiója is egy-egy transzlokációs fehérjét (movement protein)

kódol (BV1, BC1). A geminivirusok replikációja a sejtmagban megy végbe, itt jellegzetes fibrilláris

citopatológiai elváltozásokat is okoznak. A virionok parakristályok formájában itt halmozódnak fel.




Újabban olyan egyszálú DNS-vírusokat fedeztek fel, amelyek a geminivirusokhoz hasonló felépítésűek,

virionjaik izometrikusak, de nem ikervirionokból állnak. Növénypatogén képviselőik pl. a levéltetvekkel terjedő

banán csúcscsokrosodás vírus (banana bunchy top nanavirus) vagy a kabócák útján fertőző kókusz hajtás

leromlás vírus (coconut foliar decay nanavirus). E víruscsalád (Circoviridae) genomja a geminivirusnak

mintegy fele (kb. 1 kilobázis). A genom szerveződése távoli hasonlóságot mutat a geminivirusokkal. A

hurokképződés itt is megfigyelhető egy fehérjét nem kódoló szakaszon, és feltehetően hasonlóság van a

génkifejeződésben is (Chu et al., 1995).

3.7. A paradicsom bronzfoltosság vírus (tomato spotted wilt tospovirus) replikációja: negatív és ambiszensz nukleinsavak transzlációja

A paradicsom bronzfoltosság vírus (tomato spotted wilt tospovirus) kb. 80–100 nm, változó nagyságú, nem

teljesen gömb alakú (teleomorf) virionjait – a többi növénypatogén vírusoktól eltérően – kettős glükoproteid

burok veszi körül. A virionban három nukleinsavszál foglal helyet. A leghosszabb (L-RNS) szál (8,9 kb) negatív

polaritású. A középső (M-RNS 4,8 kb) és a rövid (S-RNS 2,9 kb) szál kezdeti (5‟ végi) szakasza pozitív, végső

(3‟ felőli) negatív, azaz kettős (ambiszensz) jellegű (75. ábra). A negatív RNS-szál információja csak úgy

nyilvánulhat meg, ha róla egy pozitív, azaz messenger aktivitású komplementer szál képződik. E mRNS terméke

egy nyitott leolvasási szakasznak megfelelő (331 kD nagyságú) protein. A másik két vírus RNS (M és S)

ambiszensz jellege azzal az előnnyel jár, hogy a rajtuk levő gének egyszerre olvasódhatnak le. A pozitív részen

ez közvetlenül megy végbe, míg a negatív részről ugyanúgy mRNS segítségével, mint az L (–) szál esetében is

történik. A leghosszabb RNS-szál (L) fehérjeterméke 331 kD, ami a nukleinsav-szekvencia alapján feltehetően a

polimeráz enzim. Az S-RNS két fehérjét (N 28,8 kD és NSs 54,2 kD) kódol, az M-RNS pedig az NSm-fehérje

(33,6 kD) és a két glükoproteid (G1/G2 127,4 kD) szintézisét irányítja (de Haan, 1994).

75. ábra - A paradicsom bronzfoltosság vírus (tomato spotted wilt tospovirus) osztott

genomja és génkifejeződése. mRNS = messenger RNS, vRNS = vírus-RNS, p = fehérje

(protein), kD = kilodalton. Magyarázat a szövegben [German et al., 1992 után]

A replikáció helye a viroplazmában van. A glükoproteid-membrán vagy az endoplazmatikus retikulumból, vagy

a Golgi-készülékről szakad le és burkolja be a virionokat. Ennek megfelelően a glükoproteid-burok egy része




gazdanövény eredetű, hasonlóan a gerinceseket fertőző bunyavirusokhoz, amelyeknél a glükoproteid-burkokat a

gazdaszervezet szolgáltatja.

A tospovirusok különös érdekessége a defektív részecskék képződése. Sorozatos mechanikai átvitelek után

glükoproteid-burok nem képződik, ami azzal jár, hogy a burok nélküli vírusrészecskék elvesztik tripsz

vektorokkal (Thrips spp., Frankliniella spp. Scirtothrips ssp.) történő átvihetőségüket.

3.8. A vírusok parazitái: a szatellit vírusok és a szatellit RNS-ek replikációja

Szatellit vírusok

Már az 1920-as években felfigyeltek arra, hogy egyes, a dohány nekrózis vírussal (tobacco necrosis necrovirus)

fertőzött növényekben nemcsak a dohány nekrózis vírusra jellemző 30 nm átmérőjű izometrikus virionokat

lehetett kimutatni, hanem azoknál lényegesen kisebb, 18 nm átmérőjű, ugyancsak izometrikus virionokat is.

Ezek a szatellit vírus elnevezést kapták, hasonlóan a nagyobb égitestek mellett előforduló kis bolygókhoz

(szatellitek). Ezek a csak részben vagy egyáltalán nem önálló virionok egymagukban nem fertőzik a

növényeket, csak az őket segítő (helper) vírussal együtt. A satellivirusok jellegzetes képviselője, a szatellit

dohány nekrózis vírus (tobacco necrosis satellivirus) replikációjában az őt segítő helper vírustól specifikusan

függ. E sajátos függés alapja, hogy a szatellit vírus genomja replikációra képtelen, e folyamathoz a segítő vírus

replikáz enzimét használja fel, mintegy a helper vírust parazitálva. A szatellit dohány mozaik vírus mintegy

1200 bázis nagyságú genomja csak egy gént kódol, a saját köpenyfehérje-szintéziséhez szükséges információt

tartalmazza. A helper és szatellit virionok köpenyfehérjéje teljesen eltér egymástól. A hosszú, fehérjét nem

kódoló szakasz szerepe szinte ismeretlen, feltételezhetően a virion stabilitásában van szerepe.

A szatellit vírusok jelenléte egyes esetekben lényegesen befolyásolja a tünetek megjelenését, azok erősségét.

Ennek oka az, hogy a szatellit jelenlétében – feltehetően versengés következtében – visszaszorul a helper vírus

replikációja. Hasonló működésű szatellit vírusokat [pl. szatellit köles mozaik vírus (panicum mosaic

satellivirus)] is leírtak, de ezek nincsenek egymással rokonságban.

Szatellit RNS-ek

Az 1970-es években Elszász tartományban figyeltek fel a paradicsom járványos pusztulására. A fertőzött

növényekből az uborka mozaik vírust (cucumber mosaic cucumovirus) izolálták. A tisztított vírus nukleinsav-

vizsgálata azonban azt mutatta, hogy az uborka mozaik vírus három genomi és egy szubgenomi RNS-e mellett

még egy ötödik, rövid nukleinsav is előfordult a virionokban enkapszidált formában (Kaper és Waterworth,

1977, 1981). Ez az ötödik, az uborka mozaik vírushoz kapcsolt nukleinsavszál (cucumber mosaic virus

associated RNA5, CARNA5) okozta a tünetek súlyosságát, a beteg növények teljes pusztulását. A CARNA5

jelenléte a virionokban nem befolyásolta a levéltetű-átvitelt.

A CARNA5 genom 330–390 bázis nagyságú. A helper vírusához hasonlóan a szatellit RNS 5‟ vége metilált

(m7Gppp), 3‟ végén hidroxilcsoport van. A genomon egytől három nyílt leolvasási szakasz is van, ezek azonban

in vivo fehérjét nem kódolnak. A szatellit vírusokhoz hasonlóan a szatellit RNS-ek jelenléte az inokulumban

jelentősen csökkenti a fertőzőképességet. A helper vírus RNS1 és RNS2 egyes szakaszai komplementerek a

szatellit RNS-sel, illetve maguk is képesek megkötni a helper vírus köpenyfehérjéjét. Ez a térszerkezet teszi

lehetővé a szatellit RNS-ek beépülését a helper vírus virionjaiba.

A helper vírusokhoz hasonló felépítésű szatellit RNS-ek replikációja a helper vírustól függ. Abban az esetben,

ha a szatellit RNS nem hasonlít a helper vírusra, akkor egy negatív templáton alapuló, autokatalitikusan bomló

kétszálú RNS-ről képződnek az új RNS-szálak (forgó kerék mechanizmus). Ez a viroidokra jellemző replikációs

formához hasonló.

Számos vírusnál [pl. földimogyoró satnyulás vírus (peanut stunt cucumovirus)] is megfigyelték a szatellit RNS-

ek jelenlétét, a nepovirusok körében pedig általánosan előfordulnak (Murant és Mayo, 1982; Francki, 1985). Azt

is megfigyelték, hogy a szatellit vírusok jelenléte – a helper vírus replikációjának visszaszorítása révén –

csökkentheti is a tüneteket. Harrison et al. (1987) kimutatták, hogy az uborka mozaik vírus szatellit RNS-sel

transzformált dohánynövényekben az uborka mozaik vírus tünetei mérséklődtek és replikációja is gátlást

szenvedett, a rendszer biológiai védekezésre alkal-mas volt.

A szatellit vírusok annyiban hasonlók a szatellit RNS-ekhez, hogy a) mindkettő genomja rövid, egyszálú RNS;

b) a replikációjuk a helper vírustól függ; c) a replikációjuk visszaszorítja a helper vírus replikációját; d) saját




RNS-templátjukat használják fel; e) jelenlétük a tüneteket befolyásolja (gyengíti vagy erősíti). Különbség, hogy

a szatellit vírusok önálló virionokat alkotnak, míg a szatellit RNS-ek a helper vírussal közösen

enkapszidálódnak.

Szatellit DNS-ek

Újabban a paradicsom levélgöndörödés vírussal (tomato leaf curl bigeminivirus = begomovirus) kapcsolatban

szatellit DNS-t mutattak ki (Dry et al., 1998). Ez az első adat arra vonatkozóan, hogy nemcsak szatellit RNS-

molekulák, hanem szatellit DNS-molekulák is vannak.

3.9. Defektív interferáló RNS-ek: a vírusreplikáció hibás termékei

A paradicsom bokros törpülés vírus (tomato bushy stunt tombusvirus) esetén kimutatták, hogy a fertőzött

növényekben a vírusreplikáció során néha olyan „hibás” virionok is keletkeztek, amelyek nem a teljes genomot,

hanem annak töredékeit tartalmazzák (Hillmann et al., 1987). Ennek megfelelően ezek a nukleinsavak homológ

szekvenciákat mutatnak az eredeti vírus RNS-sel, deléciós mutánsként is felfoghatók. Általában defektív

interferáló RNS-eknek (DI) nevezzük, mert felszaporodásuk a fertőzött növényekben jelentősen gátolja a teljes

genomú vírus replikációját és a betegség tüneteit. A defektív RNS-ek replikációja és enkapszidációja teljesen a

„helper” vírustól függ. Kialakulásával kapcsolatban kétféle feltevés is van: (1) a replikáció során meghatározott

helyeken autokatalitikus vagy enzimatikus hasítással jöttek létre; vagy (2) az RNS-polimeráz a replikáció során

ugyanannak az RNS-nek más pontjára „átugrott”. Ez utóbbi feltételezést több kísérleti érv is támogatja (Roux et

al., 1991).

Defektív interferáló RNS-ek gyakran fordulnak elő a tombusvirus nemzetségben [pl. cymbidium

gyűrűsfoltosság vírus (cymbidium ringspot tombusvirus)] (Burgyán et al., 1989), de az állatpatogén vagy a

gombákat fertőző vírusok között is.

4. A vírusok rokonsága, a vírusok törzsfejlődése

Egyes vírusok teljes nukleinsav-szekvenciájának megismerése azzal a meglepő eredménnyel járt, hogy

egymástól morfológiailag távol eső (pl. izometrikus és helikális) vírusok virionokat nem alkotó fehérjéinek

(tehát nem a köpenyfehérjéknek) a kódjai nagymértékű szekvenciahomológiát mutattak egymással, illetve egyes

állatpatogén RNS-vírusok azonos típusú génjeivel. Az nem volt meglepő, hogy egyes taxonómiai egységekben

(pl. víruscsaládok) a génkifejeződés hasonló utakat követ, az azonban igen, hogy rendszertanilag igencsak távoli

taxonok replikációs stratégiája is azonos megoldásokon alapszik (Matthews, 1985).

Felvetődött, hogy maga a növény- és állatpatogén vírusok merev elkülönítése is mesterséges, és valójában e két

fő – eddig mereven elkülönített – víruscsoport evolúciós rokonságban van egymással. Azoknak a

víruscsaládoknak a megismerése, amelyek egyes tagjai állat-, mások növénypatogének (Reoviridae,

Rhabdoviridae és Bunyaviridae), megerősítették ezt a feltételezést.

4.1. Vírus-„szupercsaládok”

Picornavirusokhoz hasonló növényvírusok

A comovirusok [pl. tehénborsó mozaik vírus (cowpea mosaic comovirus)], a nepovirusok [pl. paradicsom fekete

gyűrűs vírus (tomato black ring nepovirus)], és bizonyos mértékig a potyvirusok [pl. burgonya Y-vírus (potato Y

potyvirus)] közös tulajdonságokat mutatnak a Picornaviridae családba tartozó poliovirusokkal. Közös

tulajdonságaik a következők: 1. az egyszálú (+) RNS genom VPg-t hordoz az 5‟ végen, a 3‟ vég pedig

poliadenilált; 2. a géntermékek egy hosszú poliproteidből transzláció után hasadnak egy vírus által kódolt

proteáz segítségével; 3. a genom több hasonló szerepű, nem-szerkezeti fehérjét kódol, amelyek aminosav-

szekvenciája meglehetősen hasonló (g 20%); 4. az ún. konzervált szekvenciák a genomban hasonló

elrendezésűek (76. ábra).

76. ábra - A tehénborsó mozaik vírus (cowpea mosaic comovirus) és a poliovirusok

fehérjegénjeinek hasonló elrendeződése és konzervált szekvenciái. CPMV = tehénborsó

mozaik vírus (cowpea mosaic comovirus). VP = vírusprotein, VPg = vírusgenomhoz

kötött fehérje. A pontozott részek a homológ szekvenciákat jelölik [Matthews, 1985

után]




Bár az említett vírusok köpenyfehérjegénjei igen különbözőek, mégis mind a comovirusok, mind a poliovirusok

izometrikus virionjai kétféle köpenyfehérjéből hasonló módon épülnek fel (Goldbach, 1986). A potyvirusok

némileg elkülönülő csoportot alkotnak, ezek köpenyfehérje-génje ugyanis az RNS-szál 3‟ végén helyezkedik el.

Sindbisvirusokhoz hasonló növényvírusok

Az elmondottakhoz hasonlóan nagy meglepetést okozott az a felfedezés is, hogy egyes, felépítésükben

ugyancsak eltérő (izometrikus és helikális, osztatlan és osztott genomú) növénypatogén vírusok (Alfamovirus,

Bromovirus, Tobamovirus) hasonló transzlációs stratégiát követnek. Közös jellemzőik az alábbiak: 1. az

egyszálú (+) RNS genom 5‟ végén sapka van, ugyanakkor a 3‟ vég eltérő lehet; 2. a lucerna mozaik vírus és a

rozsnok mozaik vírus RNS1 és RNS2 által kódolt fehérjék három szakaszban (mintegy 250–300 aminosav)

nagy szekvencia-homológiát mutattak egymással, valamint a dohány mozaik vírus 126 és 183 kD fehérjéivel; 3.

e fehérjék szerepe a vírus-RNS-szintézisben van, polimeráz-aktivitásúak; 4. hasonlóság mutatkozik mindhárom

esetben a kb. 30 kD fehérjék és a köpenyfehérjék szintézisében is, ami szubgenomi RNS-ek segítségével valósul

meg (77. ábra). A dohány mozaik vírus átírt fehérje (183 kD) és a rozsnok mozaik vírus RNS2 terméke

aminosav-szekvenciájában, valamint a gének elrendeződésében hasonló a Togaviridae család gerincteleneket és

gerinceseket egyaránt fertőző sindbisvirusokhoz.

77. ábra - A lucerna mozaik vírus (alfalfa mosaic alfamovirus), a rozsnok mozaik vírus

(brome mosaic bromovirus) és a dohány mozaik vírus (tobacco mosaic tobamovirus)

genomszerveződésének hasonlósága a szekvenciában homológ szakaszokkal. AMV =

lucerna mozaik vírus, BMV = rozsnok mozaik vírus, TMV = dohány mozaik vírus, CP =

köpenyfehérje. A vonalazott részek a megfelelő konzervált szakaszok [Matthews, 1985

után]

A luteovirusok szupercsaládja átmeneti típus-e?

Újabban egyre több bizonyíték szolgál annak erősítésére, hogy a luteovirusok is egy önálló szuperfamília alkotói

lehetnek. E csoportba a tombusvirusok, a dianthovirusok, a hordeivirusok és a luteovirusok, esetlegesen a

sobemovirusok tartoznak, részben a szekvencia-homológia, részben a gének működése és elrendezése alapján. A

csoportnak közös vonásai vannak a Sindbis és a Picornavirus szupercsaláddal, lehetséges, hogy összekötő

kapocsként szerepelnek e két taxonómiai csoport között. Mindezek a lehetőségek már a jelenlegi

vírustaxonómiában is tükröződnek.




Pararetrovirusok: a retrovirusokhoz hasonló növényvírusok

Korábban azt gondolták, hogy csak a gerinceseket fertőző, tumort okozó RNS-vírusok replikációja történik

fordított transzkripcióval, azaz a reverz transzkriptáz segítségével. Később igazolták, hogy egyes DNS-vírusok,

mint pl. a hepatitisz B-vírus vagy a növénypatogén karfiol mozaik vírus hasonlóan replikálódnak. A

retrovirusok reverz transzkriptáz enzime hasonló szekvenciákat mutat, mint a hepatítisz B-vírus vagy a karfiol

mozaik vírus reverz traszkriptáz enzim, utalva e vírusok rokonságára. Hasonlóságot fedeztek fel a proteázok és

endonukleázok megfelelő szakaszain is.

4.2. Feltételezések a vírusok törzsfejlődéséről

Az állat- és a növénypatogén vírusok aminosav-szekvenciáiban talált hasonlóságok felvetették a vírusok

evolúciós rokonságának kérdését. Hogyan lehetséges, hogy az állat- és a növényvilág már 1,2 × 109 évvel ezelőtt

olyan elvált, genetikai parazitákkal rendelkezik, amelyek génjei hasonló elrendeződésűek és hasonló fehérjéket

kódolnak?

A vírusok törzsfejlődésére vonatkozólag több hipotézis is van: 1. a vírusok közös eredetűek (monofiletikus

származás), azaz közös őstől erednek, és ökológiai tényezők miatt különültek el az eltérő gazdaszervezetek

alapján; 2. az eredetileg különböző eredetű vírusok párhuzamos evolúció során váltak hasonlókká (polifiletikus

származás), vagyis az azonos feladatot betöltő fehérjék hasonló szerkezetűekké váltak. A 3. feltételezés szerint a

vírusok egymástól függetlenül fejlődtek ki, úgy, hogy a gazdaszervezettől transzdukcióval hasonló, a

replikációhoz szükséges, önálló, konzervált géneket vettek át (Goldbach, 1986).

A lehetséges változatok közül az első feltevés a legvalószínűbb, tehát az, hogy a vírusok közös eredetűek, és a

különböző irányú evolúció következményeként eltérő vírusok fejlődtek ki, amelyek azonban magukon viselték a

rokonság konzervatív bélyegeit. E felosztásnak megfelelően a növénypatogén RNS-vírusok eddig két

szupercsoportba (Picornavirus és Sindbisvirus) sorolhatók, más állatpatogén vírusokkal együtt. Ennek jó

példáját mutatja a comovirusok és a poliovirusok hasonlósága. Ugyanebbe a Picornavirushoz hasonló csoportba

oszthatók az egykomponensű potyvirusok és a kétkomponensű nepovirusok is. A másik szupercsoportot a

Sindbisvirusokhoz hasonló növényi vírusok alkotnák, amelyhez a bromovirusok, cucumovirusok és

tobamovirusok tartoznak. Az említett szupercsoportok bár nagy morfológiai eltéréseket mutatnak, ezek azonban

éppen a belső extracelluláris lehetőségekhez való alkalmazkodást tükrözik. Ennek eredménye lehet az, hogy

különösen a védő szerepet betöltő köpenyfehérje mutatja a legváltozatosabb formákat, a legnagyobb eltéréseket.

Ugyancsak nem meglepő, hogy a vírustörzsek (pl. a potyvirusok esetében) általában a köpenyfehérje-

szekvenciákban térnek el leginkább egymástól.

Hasonlóan szuperfamíliaként lehet kezelni azokat a vírusokat is, amelyek sajátos replikációjuk folytán reverz

transzkripciót követnek. A caulimovirusok e tekintetben a retrovirusokhoz hasonlóak, a pararetrovirusok

csoportját alkotják.

A vírusok újszerű csoportosításában eltűnik a megszokott különbség a genom osztottsága és osztatlansága

között. E tekintetben az evolúciós előny mindenképpen a multikomponens-vírusoké. A genom osztottságából

adódó előnyök a következők: a) az RNS-ek gyors rekombinációs újrarendeződésére adnak lehetőséget; b)

megnövelhető a genom mérete (nincsenek enkapszidációs problémák); c) csökken a mutagén és károsító hatások

lehetősége, javul az RNS-replikáció megbízhatósága; d) könnyebbé válik a transzláció önellenőrzése, a

termékek arányainak önszabályozása; e) a kis virionok vektorokkal történő átvitele könnyebbé válik, egyszerűbb

lesz a virionok mozgása a növényen belül (Goldbach, 1986).

Mindezek az előnyök azonban egy esetben, a mechanikai átvitelben bizonyos mértékig eltűnnek. Míg az

egykomponensű vírusok fertőzéséhez elvben egyetlen virion is elegendő, az osztott genomú vírusoknál ez

többszörös, hiszen a fertőzés helyén, ugyanabban a sejtben egyszerre minden komponensből legalább egynek

jelen kell lennie ahhoz, hogy a fertőzés eredményes legyen. A rovarokkal vagy a maggal történő vírusátvitel

esetén ez biztosított is, ezért lehetséges az, hogy a növénypatogén vírusok körében gyakori a genom osztottsága.

Evolúciós szemszögből tekintve az osztott genom fejlettebb formát jelent (Goldbach, 1986).

Az állat- és növénypatogén vírusok közös eredetének több bizonyítéka van. Több rovarpatogén RNS-vírus is

növényi betegségeket okozhat. Feltehetően ez a csoport a legújabb idők evolúciós terméke. A növénypatogén

vírusok egy részét ugyanis rovarok terjesztik, közülük több (rhabdovirusok, luteovirusok, reovirusok,

marafivirusok, tenuivirusok, tospovirusok) a rovar testében is replikálódik. Ugyanakkor ismertek olyan RNS-

rovarvírusok is, amelyek emlősöket is fertőznek. A rovarpatogén vírusok között több az RNS jellegű.

Feltételezések szerint a növénypatogén comovirusok és a gerincespatogén picornavirusok ilyen közös




rovarvírusoktól származnak. A rovarpatogén RNS-vírusok között osztott genomú is van (nodamuravirusok). Ez

a forma a növénypatogén vírusok esetében gyakori, az állatpatogéneknél azonban nem fordul elő. A

rovarpatogén RNS-vírusok e tekintetben is összekötő láncszemet, evolúciós átmenetet jelentenek a

növényvírusok származására.

Az evolúció mechanizmusa

A vírusok gyors változásokra képesek, hamar alkalmazkodnak a megváltozott körülményekhez. E változások

hosszú evolúció eredményei, és ebben szerepet játszott a gazdaszervezettel való tartós együttélés,

alkalmazkodás, együttes fejlődés, a koevolúció is. Ismert, hogy egyes víruscsoportok melyik földrészen

fordulnak csak elő, vagy az, hogy pl. a tymovirusok Európában vagy Amerikában stb. eltérőek. Egyes vírusok

földrajzi eredete is jól meghatározható (pl. burgonyapatogén vírusok). A vírusevolúció ma is tartó folyamat,

amelynek mozgatórugói a genomot érő külső hatások.

Általában a legnagyobb evolúciós erőt a mutációk, a rekombinációk, a gének újrarendeződése (gene

reassortment), esetenként a gének megkettőződése vagy kiesése jelenti, de lehetséges egyes növényi gének

átvétele is (Roossinck, 1997). A génekben történt kis szekvenciaváltozások összegeződve a vírusok

mikroevolúcióját eredményezik, míg a nagyobb szakaszokat érintő génkicserélődések következménye a

biológiai funkciók erőteljes változásával járó makroevolúció.

A géneket károsító erők minden élő szervezetre egyaránt hatnak. A növényvírusfajok nukleotid szekvenciái

azonban – összevetve más fajokkal – igen nagy eltéréseket mutatnak, bizonyítva, hogy ezek a hatások a vírusok

esetében kifejezettebben érvényesülnek. Ennek okai a növényvírusok jellegéből fakadnak.

A növénypatogén vírusok túlnyomó többségét jelentő (+) RNS-vírusok replikációja az RNS-től függő RNS-

polimeráz enzimhez kötött. Az átírás hibaszázaléka magas, 10–4, ami 10 kilobázisonként átlagosan egy tévedést

jelent. Ennek oka az, hogy az RNS-polimeráz működéséhez nem igényli a bázispárosodást, tehát kevéssé függ a

primer jelenlététől. Káros oxidációs hatások gyakran okoznak a genomban mutációkat. Egy sejtet átlagosan

egyetlen nap mintegy 10 000 „ütés” ér, amit a szervezet reparáló hatásai legtöbbször hatástalanítanak.

Míg a kettős szálú DNS bázispárosodása miatt a DNS-genom jobban védett a mutagén hatásoktól, addig az

RNS-genom ezekkel szemben sokkal érzékenyebb, ami újabb és újabb vírustörzsek kialakulását

eredményezheti. E módosulások az egyes vírustörzseknél a gazdanövénykör szűkülését vagy tágulását egyaránt

eredményezhetik (Roossinck, 1997).

A rekombináció lehetősége mind az RNS-, mind a DNS-vírusoknál egyaránt előfordul. E hatást leginkább a

defektív interferáló (DI) RNS-ek, illetve a vírusok deléciós változatai esetén tanulmányozták, amelyeknél a

homológ rekombináció révén a hiányos szekvenciák regenerálódhatnak. Azonos vírusok törzsei vagy hasonló

vírusfajok kevert fertőzései is gyakran eredményezhetnek rekombinációt, ami fontos eredő pontja lehet új

vírusok, vírustörzsek kialakulásának. A egyes növénypatogén vírusok (luteovirusok, nepovirusok, bromovirusok

és cucumovirusok) változékonyságában bizonyított a rekombináció nagy jelentősége (Nagy és Bujarski, 1995;

Roossinck, 1997). Az új vírus (törzs) életképességét a természetes szelekció dönti el.

Néhány növényvírusnál bizonyítható a génkicserélődés is, mint a génexpresszió ellenőrző mechanizmusa. A

hybrigeminivirusoknál például egyes mesterségesen előállított pszeudo-rekombináns esetén bizonyították egyes

génszakaszok újrarendeződését. Hasonló jelenséget figyeltek meg természetes körülmények között az uborka

mozaik vírus (cucumber mosaic cucumovirus) és a földimogyoró satnyulás vírus (peanut stunt cucumovirus)

nukleinsavai között is, ahol az RNS3-szál cseréje történt meg. Bár a génkicserélődés nem túl gyakori jelenség,

egy új vírus kialakulásában drámai jelentőségű lehet. A vírusok közötti tartós kapcsolat meglepő eredményre

vezethet. Ennek példája a borsó enációs mozaik vírus (pea enation mosaic enamovirus) esete, amelynek RNS1

frakciója a luteovirusokkal mutat rokonságot, míg az RNS2 – amely a replikáz enzim kódját tartalmazza – a

carmovirusokhoz és a tombusvirusokhoz hasonló.

Egyes vírusok esetén a komplex fertőzések az RNS-rekombináció vagy a hetero-enkapszidáció révén új

konstrukciók kialakulását eredményezik, azaz egy vírusfaj a másik vírusfaj köpenyfehérjéjével burkolódik be.

Ez a vektorátvitel megváltozását is jelentheti. E lehetőség kísérletileg bizonyított, így környezetvédelmi

szempontból néha joggal vetődik fel az a félelem, hogy a vírusgének felhasználásával előállított transzgenikus

növények révén új, patogénebb vírustörzsek is keletkeznek. Napjaink génsebészeti törekvései ezért inkább arra

irányulnak, hogy a patogén eredetű rezisztencia kialakítása helyett inkább a növények természetes

rezisztenciagénjeit kutassák fel, és ezeket használják fel a genetikailag módosított szervezetek előállítására.




Az evolúciós vizsgálatok felvetik a vírusok eredetére vonatkozó kérdéseket is. Felmerült az az elképzelés is,

hogy a vírusok egy sejt előtti, precelluláris világ fosszíliái, amelyek a földi élet kialakulásában és a gének

horizontális mobilitásában fontos szerepet játszanak (Roossinck, 1997). Matthews (1991) összefoglaló

véleménye szerint a növénypatogén vírusokon belül négy evolúciós csoport körvonalai bontakoznak ki: 1.

egyszálú pozitív RNS-vírusok; 2. a növénypatogén reovirusok, rhabdovirusok és bunyavirusok; 3.

caulimovirusok és 4. geminivirusok, amelyek feltehetően a prokariotikus szervezetek vírusaiból származnak.


14. fejezet - Szerológiai vizsgálati módszerek

1. Immunológiai alapfogalmak

A növényvírusok többféle (1–10) proteint kódolnak, amelyekből a zárványfehérjék és a köpenyfehérjék

fordulnak elő a legnagyobb koncentrációban a fertőzött növényben. E kettő közül a köpenyfehérjék azok,

amelyeket antigénként a leggyakrabban felhasználnak a vírusfertőzés kimutatására (Matthews, 1957; Siitari et

al., 1986; Brakke, 1990). A szerológiai reakciók alapelve az a felismerés, hogy ha melegvérű állat vérébe nagy

molekulatömegű fajidegen anyag (pl. fehérje) kerül, akkor ez az állat vérsavójában ellenanyag (antitest,

immunoglobulinok) képződését indukálja. Az antitestképzés fajlagos, azaz egy antigén hatására csak a neki

megfelelő antitest képződik. Az antitestek a nekik megfelelő antigéneket felismerik, így létrejön az

immunválasz-reakció, ami lehetővé teszi a kórokozó pontos azonosítását.

1.1. Az immunválasz

Az antigén hatására bekövetkező immunválasz molekuláris magyarázata Harlow és Lane (1988), Long és Kindt

(1988), Ezquerra és Coligan (1988), továbbá Fox (1988) kutatók nevéhez fűződik.

Az antigén-specifikus antitestképződéshez az állatban háromféle, egymással kölcsönhatásban álló sejt (az ún.

antigénhez kapcsolódó sejt, továbbá a T sejt és a B limfocita sejt) összehangolt működése szükséges. Ha az

antigén bekerül az állat testébe, az antigénhez kapcsolódó ún. APC sejtek (APC: antigen-presenting cell) a

makrofágokhoz hasonlóan bekebelezik és átformálják azt (78A ábra). Ezután a „megemésztett” antigén az APC

sejt felszínére kerül, ahol egy speciális, kompatibilis, ún. MHC (MHC: major histocompatibility molecule)

molekulához kapcsolódik. A következő lépésben a T sejt – amely mind az átformált antigén, mind pedig az

MHC molekula kapcsolódásához alkalmas receptorhelyekkel rendelkezik – összekapcsolódik az APC sejttel

(78B ábra). Ekkor az APC sejt felületén létrejön egy három molekulából álló komplex, a T sejt

antigénreceptora, az átformált antigén és az MHC molekula között (78C ábra). Ez a komplex az APC és a T

sejteket oldékony anyagok, ún. interleukinok (IL-1, IL-2) kiválasztására serkenti, amelyek a T sejteket

aktiválják (78D és 78E ábra). Az aktivált T sejtek ezután az antigénhez kapcsolódó B sejtekhez kötődnek.

Ekkor a T sejtek elkezdik az IL-4 és IL-5 anyagok termelését, amelyek a B (limfocita) sejtek osztódását és

differenciálódását stimulálják (78F ábra). Megfelelő serkentés esetén a B sejt immunoglobulin-genomja

közvetlenül antitest képződését indukálja. Ha az állat immunrendszere később ugyanazzal az antigénnel

találkozik, az immunoglobulin genom azon része, amely az antigénmegkötő sajátságért felelős, szomatikus

mutációk sorozatán megy át. Ezek a mutációk pedig antitestek képződését indukálják, melyek többé-kevésbé

affinisak az adott antigénre.

78. ábra - Az antigén, az antigént megjelenítő sejt, a T és a B nyiroksejtek közötti

kölcsönhatás [Hampton et al., 1990 után]

Azok a B sejtek, amelyek az antigénnel szemben nagymértékű affinitással rendelkező antitestet képeznek, több

és több antigént vonzanak, gyorsan növekednek, osztódnak és még több magas affinitású antitestet képeznek. A

T sejtek által kiválasztott IL-5 anyag – más szignálokkal együtt – arra serkenti a B sejteket, hogy vagy rövid (3–

Szerológiai vizsgálati módszerek


4 napos) élettartamú, nagy mennyiségű antitestet kiválasztó plazmasejtekké, vagy pedig hosszú élettartamú, ún.

memory (emlékező) sejtekké differenciálódjanak. Az ún. memory B sejtek elsőrendű feladata, hogy reagáljanak

egy újabb antigénstimulusra, és nem az antitestek kiválasztása, hanem inkább azok megjelenítése történik meg a

felületükön (78F ábra).

Egy anyag akkor antigén, ha egy melegvérű állat sejtjeiben, ill. testnedvében immunválaszt indukál. Antigén

sajátságokkal a nagy molekulatömegű anyagok rendelkeznek. Bár az alacsony molekulatömegű anyagok is (pl. a

10–15 aminosavból álló szintetikus fehérjék) megemésztődnek és kifejezésre jutnak az APC sejt MHC

molekuláján, túl kis méretűek ahhoz, hogy az APC sejt MHC molekulája és a T sejt receptora egyidejűleg

felismerje őket. Egyes esetekben a kis molekulatömegű anyag antigén sajátosságát növelni lehet, ha azt kémiai

úton nagyobb molekulatömegű molekulához rögzítjük (Harlow és Lane, 1988).

1.2. A vírus-köpenyfehérje felépítése és antigén tulajdonságai

Az epitóp fogalma és típusai

A vírus-köpenyfehérjének azt a (minimum 5–7 aminosavból álló) szakaszát, amely az antitesttel kapcsolatba

lép, epitópnak nevezzük. Egy fehérjén egy vagy több ilyen ún. antigén tulajdonsággal rendelkező szakasz lehet.

Az epitópok lépnek kölcsönhatásba az állatok által produkált antitestekkel. Az epitópok különböző típusainak a

meghatározására olyan szintetikus peptideket alkalmaznak, amelyek a természetes fehérjék fragmentumai

(Jerne, 1974; van Regenmortel, 1988). Az epitópoknak többféle típusa van. A véletlenszerűen összecsavarodott

szerkezetű fehérjeszakasz az ún. szekvenciális epitóp. A specifikus szerkezetű fehérjeszakaszt konformációs

epitópnak nevezzük, amelyen belül folyamatos (két vagy több aminosavcsoportba tartozó aminosavak

kapcsolódnak egymáshoz) és megszakított (két különálló peptidlánc kapcsolódásából, vagy egyetlen

összecsavarodott peptidláncból álló fehérjeszakasz) epitópokat különböztetünk meg. A kriptotópok olyan, ún.

„rejtett” epitópok, melyek csak az antigén disszociációja, fragmentációja vagy denaturációja után válnak

immunogénné. Ha az antitest enzimmel kapcsolt szubsztráton lép az epitóppal kölcsönhatásba, akkor neotópnak

hívjuk az epitópot. A metatópok olyan epitópok, melyek a köpenyfehérjének a disszociált és a polimerizált

formáján is jelen vannak. A semleges vagy neutralizációs epitópok olyan antitestek felimerésére képesek,

melyek a vírus fertőzőképességét semlegesítik.

A fehérjealegységek antigén sajátosságának erőssége attól függ, hogy a molekulán hol helyezkednek el. A

hidrofil aminosav-maradványok, amelyek a folyamatos epitópoknak felelnek meg, általában az antigén külső

részén vannak. A hidrofób maradványok kevéssé hozzáférhetőek az immunrendszer számára, hacsak a molekula

nem denaturálódik. A flexibilis (10–20 nm) mozgással rendelkező epitópok szorosabb kölcsönhatásba lépnek az

antitesttel, mint a merev molekulák. Egy molekula hidrofil régiója, mely a szegmentális mobilitásért felelős, a

folyamatos epitópnak felel meg. Egy molekula karboxil- és aminocsoport-végei nagyfokú mobilitást tesznek

lehetővé. Ezek a terminális részek a molekula felületén elhelyezkedve tipikus folyamatos epitópokat alkotnak. A

rövid aminosav-szekvenciával rendelkező fehérjeszakaszok egyedülálló epitópot képviselnek a diagnosztikai

elkülönítésben. Valószínűleg ezek a régiók tolerálják a DNS-mutációkat, mert feltehetőleg nem szerepelnek

abban a kölcsönhatási kapcsolatban, amely a molekula összecsavarodásáért felelős (van Regenmortel, 1988).

1.3. Az antitest (immunoglobulin) felépítése és típusai

Az antitestek immunoglobulin-molekulák, amelyek antigén hatására az állat B limfocitáiban (nyiroksejtjeiben)

termelődnek. Minden molekulán minimum kettő vagy attól több, ún. paratóp helyezkedik el, amely az antigén

epitópját felismerő sajátsággal rendelkezik (Jerne, 1974). Az antitesteket két csoportba soroljuk: 1. a poliklón

antitestek több mint egy epitóppal szemben reaktívak, 2. a monoklón antitestek ezzel szemben csak egy

epitóppal reagálnak. A szakirodalom az antitest-molekulákat öt immunoglobulin (Ig) osztályba (IgG, IgM, IgA,

IgD és IgE), illetve nyolc alosztályba (IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgM1, IgM2, IgA1 és IgA2) sorolja. Az IgA,

IgD és IgE típusú antitestek nem olyan jelentősek, mint az IgG és az IgM antitestek, ezért ezeket a

szerológiában csak ritkán alkalmazzák (Harlow és Lane, 1988).

Az IgG, IgD, IgE és az IgA antitest-molekulák mindegyike egy pár nehéz és egy pár könnyű polipeptidláncot

tartalmaz (79A ábra). A láncokat diszulfid hidak vagy pl. az IgA2 esetében nem kovalens kötések tartják össze.

Az IgM antitestek öt-öt pár könnyű és nehéz láncot tartalmaznak (pentamer szerkezet), míg az IgA két vagy

három ilyen párból áll (Barrett, 1988; 79B és C ábra). Az IgG papainnal történő emésztése során a molekula

három fragmentumra esik szét. Ezek közül két fragmentum egyforma méretű, nehéz és könnyű láncot egyaránt

tartalmaz, és antigénkötő hellyel rendelkezik (Fab fragmentumok). A harmadik fragmentumnak, amely csak a

nehéz láncot tartalmazza, antigénkötő helye nincs (Fc fragmentum) (79E ábra). A Fab és Fc fragmentumok



közti régiót ún. „hinge” régiónak nevezzük, amely a molekula flexibilitását biztosítja, ami ahhoz szükséges,

hogy a Fab szegmensek egymástól függetlenül is tudjanak működni (79D ábra). Az IgG molekula pepszinnel

történő emésztése két Fab fragmentumot eredményez (amelyek egymással diszulfid híddal vannak összekötve),

ezenkívül (F(ab‟)2) és egy Fc‟ fragmentum is keletkezik (79F ábra). A könnyű és a nehéz lánc aminoterminális

részén 3–3, híd vagy keret (Fw: framework) által összekapcsolt determináns régió helyezkedik el. Ezek a CDR

rövidítéssel illetett helyek (CDR: complementary determining region), és bizonyos mértékig a Fw-k is, a

paratópon belül felelősek az antigénhez való kapcsolódásért. A CDR régiók aminosavsorrendje az antigéntől

függően változik, ezért ezeket hipervariábilis résznek is hívjuk (79D ábra). A CDR és a Fw régiókon kívül eső

rész kevéssé változik egy osztályon, ill. alosztályon belül, ezért ezeket konstans régióknak is nevezzük.

79. ábra - Az immunoglobulin- (IgG) molekulák felépítése és típusai enzimes hasítás

után [Hampton et al., 1990 után]

Az immunizált állatokban elsődleges immunválaszként IgM antitestek képződnek, amelynek koncentrációja a

szérumban az immunizálás után 10 nap múlva éri el a maximumát, aztán csökken. Ha az antigén sikeresen

indukálja a T sejtek válaszreakcióját, akkor ezután kb. két hét múlva IgG antitestek képződnek, a maximális

koncentrációban. Ha ugyanazt az állatot másodszorra is immunizáljuk, akkor az IgM- és az IgG-képződéshez

szükséges idő ugyanannyi lesz, mint az első immunválasz során, bár az IgG koncentrációja magasabb lesz

(Barrett, 1988). Ha az MHC molekulák inkompatibilisek egy antigénnel szemben, akkor csak IgM antitestek

fognak képződni.

1.4. Antigén–antitest kölcsönhatások

Az antigén és az antitestek között hidrogénhidak, ionos kötések, elektrosztatikus vonzóerők, Coulomb-,

hidrofób és van der Waal‟s erők által létesül kapcsolat (Harlow és Lane, 1988; Sheriff et al., 1987; van

Regenmortel, 1988).

A kapcsolódás reverzíbilis, és az affinitás erőssége a hőmérséklettől, a pH-tól és az oldhatósági viszonyoktól

függ. Ha ezek a körülmények változnak, az ugyanazon antigénnel és antitesttel végzett vizsgálatok (pl. ELISA)

eltérő eredményeket adnak. A stabil, ill. fél-reverzíbilis immunkomplexek az antigén és az antitest közötti

többszörös kölcsönhatás eredményeként jönnek létre. A stabil immunkomplexek kialakításának képességét

aviditásnak nevezzük. Az IgM típusú antitestek a 10 paratópjukkal többszörös kapcsolat kialakítását teszik

lehetővé, és nagyobb antigén-aviditással rendelkeznek, mint az IgG antitestek a maguk két paratópjával (79A és

C ábra). Az antitest egy paratópja alacsony affinitású egy antigénnel szemben. Ha ez a gyenge kölcsönhatás

megszűnik, akkor az antitest megmaradó paratópjai a közeli epitópokhoz kötődnek és stabilizálják az antitest–

antigén komplexet. Az alacsony affinitású IgM antitestnek még marad 9 paratópja, míg az alacsony affinitású

IgG antitestnek csak egy paratópja marad az antitest–antigén komplexek stabilizálásához. Ebből következik,

hogy az IgM antitestek, amelyek gyenge kapcsolatba lépnek több antigénnel, kevésbé specifikusak, mint az IgG

antitestek, mivel az IgM antitesteknek nagyobb kapacitásuk van ahhoz, hogy az antigén–antitest kapcsolatot

stabilizálják. Ezért egy ugyanolyan antigén-specifitással és gyenge affinitással rendelkező IgG nem marad

kötődve az antigénhez, és ezért nem mutatható ki úgy, mint az IgM antitest. Az antitest paratópját felépítő nehéz

és könnyű lánc hipervariábilis régiójához az antigén úgy kapcsolódik, mint ahogyan a kulcs (antigén) illik a

zárba (antitest) (Harlow és Lane, 1988). A röntgenkristálytan módszerével az antitest–antigén komplex

háromdimenziós szerkezetét már feltárták (Amitt et al., 1986; Colman et al., 1987; Sheriff et al., 1987).

2. Poliklón antitestek előállítása



A szerológiai diagnosztikában a monoklón és a poliklón antitestek közül választhatunk. A poliklón antitestek

előállítása egyszerűbb és a fajlagosságot növelni lehet, ha az antigén tisztaságát fokozzuk. Mind a poliklón,

mind pedig a monoklón antitestek keresztreakcióba léphetnek heterológ antigénekkel, vagy pedig annyira

specifikusak, hogy az ugyanazon vírus eltérő törzseiből származó heterológ antigéneket sem ismerik fel. Azt,

hogy poliklón, ill. monoklón antitesteket használjunk, a vizsgálatok típusa és célja dönti el. A poliklón

antiszérumok az antitestek változatos fajlagosságú vegyes populációját tartalmazzák, és ezért az antitest-

populációk különböző részei lehetnek reaktívak a különböző szerológiai tesztek során. Ezzel szemben a

monoklón antitestek csak egyféle típusú és specifitású homogén populációt tartalmaznak, így a tesztekben csak

egyféleképpen reagálnak. Meg kell azonban jegyezni, hogy a túlzott érzékenység hátrányos is lehet, pl. ha a

vírusban kis változás történik, és ez a változás éppen azt az antigén-determinánst érinti, amely ellen a

hibridómasejt az antitestet termeli. Ekkor a vírus felismerése elmarad, holott az a növényi mintában jelen van.

2.1. A kísérleti állat kiválasztása

Bármely melegvérű állatban (patkány, egér, tengerimalac, nyúl, csirke) immunszérum képződhet. A patkánynak,

az egérnek és a tengerimalacnak kevés a széruma. A csirkék testhőmérséklete magas, és az a vélemény, hogy a

csirkeszérum esetében az antigén–antitest-reakcióhoz magas ozmolaritás szükséges, és ilyen körülmények

között az antigén károsodhat. A nagyobb testű állatok (pl. birka, kecske, ló) véréből nagyobb mennyiségű

szérum nyerhető, de az immunizáláshoz több antigénre van szükség. Immunizálásra a leggyakrabban nyulakat

alkalmaznak, mert kis mennyiségű antigénre is magas titerértékű, megfelelő mennyiségű szérumot lehet nyerni

belőlük. Ha az antigéneket kicsapatjuk (pl. az agargél diffúziós módszer esetében), akkor a csirkék, a nyulak és

a lovak a legjobb szérumforrások, míg a tengerimalac, a patkány és az egér nem megfelelő. A csirke és a nyúl

antiszéruma sokféle koncentrációban ad precipitációs reakciót, míg a juh és a kecske antiszéruma csak szűkebb

koncentrációjú tartományban. Egy szérum előállításakor legalább ugyanazon faj két egyedét szükséges

ugyanazzal az antigénnel immunizálni.

2.2. Az immunizálás

Az immunizálásra használt antigén mennyisége függ az antigén sajátságaitól, az antigén előkészítésétől és a

beoltás módszereitől. A hosszú ideig tartó immunizálási folyamatnál, ahol nagy mennyiségű antigénre van

szükség, többféle és nagyobb mennyiségű antitestek képződnek, mint a rövidebb ideig tartó immunizálásnál, de

az antitestek alacsonyabb specifitásúak. Az immunizálásra gyakran kombinált injektálási módszereket

alkalmaznak. Általában az intravénás és az intramuszkuláris befecskendezés kombinációját alkalmazzák egy 5–

7 hétig tartó immunizálási folyamat során. Az intravénás injektálás után az antitest ugyan gyorsabban szétterjed,

de a szervezet védekező mechanizmusa folytán a véráramban gyorsan hatástalanná válik. Ezért több mint 8

intravénás injekció kell ahhoz, hogy a szérum a megfelelő koncentrációban tartalmazza az antitesteket.

Célszerű a pufferben lévő antigént ún. Freund-féle adjuvánssal 1:1 arányban emulgeálni intramuszkuláris

injektálás céljából. Az adjuváns paraffinolajat és emulgeálószert (mannid monooleát) is tartalmaz. A komplett

Freund-adjuváns hő által elölt baktériumokat is tartalmaz (Mycobacterium tuberculosis, M. butyricum, ill.

egyéb, savnak ellenálló fajokat), míg az inkomplett adjuvánsban nincsenek baktériumok. Az adjuváns feladata,

hogy stabilizálja és raktározza az antigént az izomszövetben, ezért nagyobb mennyiségű antitest képződésével

számolhatunk, mint ha ugyanolyan mennyiségű antigént vizes fázisban fecskendeztünk volna be az állatba. A

leggyakrabban alkalmazott Freund-adjuvánson kívül egyéb adjuvánsok használata is lehetséges, és újabban

jelentős eredmények születtek az adjuvánskutatás terén (Hampton et al., 1990).

2.3. Injektálási módszerek

Alapvetően hatféle befecskendezési módszert különböztetünk meg:

a. Intravénás (nyúlnál a fülén lévő marginális érbe, csirkénél a szárnyba, egérnél a farok-főérbe).

b. Intramuszkuláris (nyúlnál a lábikra vagy a comb izomzatába, csirkénél a lábba, ill. a mellizomzatba).

c. Hasnyálmirigybe (egérnél ez a módszer a legjobb).

d. Bőr alá (nyúl).

e. Bőrbe (nyúl).

f. Talpba (nyúl).



A vírussal történő immunizálás során a megfelelő mennyiségű antitestképzéshez csirkében és nyúlban általában

2 intramuszkuláris és egy intravénás injekció szükséges, hetente 1–2 mg antigén mennyiségben. Az antiszérum

maximális titerértéke az első injektálás után vírustól függően változik, de legtöbbször 5–7 hét múlva várható. A

titerérték az antiszérum azon jellemző sajátossága, amely megmutatja azt, hogy az antiszérumot meddig

hígíthatjuk folyamatosan a kétszeresére, hogy még látható precipitációt kapjunk az antigénnel történő reakció

során.

A befecskendezni kívánt antigén mennyiségét csak akkor célszerű növelni, ha a titerérték hirtelen csökken.

Túlzott mennyiségű antigén használata a titerértéket nem növeli meg jelentősen. E célból előnyösebb az

injektálásának, illetve az antigén stabilizálásának a módján változtatni.

2.4. Vérvétel és szérumnyerés

Vérvétel előtt 12–18 órával az állatokat éheztetni kell, hogy a lipidakkumulációt a vérben megakadályozzuk.

Immunizálásra többnyire nyulakat használnak. A vérvétel a szívből, az artériákból és a vénákból történhet. A

leggyakoribb és a legkevésbé kockázatos a fülben lévő érből kéthetente 20–20 ml vért venni. A kinyert vért egy

óráig szobahőmérsékleten alvadni hagyjuk, majd 30 percig 37 °C-ra tesszük; ekkor a szérum mennyisége

megnő. Egy éjszakára hűtőbe rakjuk, majd a szérumot leöntjük, ill. leszívjuk. A sejtes elemek elkülönítése

céljából centrifugálás, majd szűrés következik. Ezt követi a Na-aziddal és glicerollal történő keverés, majd utána

a –20 °C-on történő liofilezés.

2.5. Az IgG tisztítása az antiszérumból

Az antitestek (IgG) tisztításának többféle módja ismeretes, amelyek egymással kombinálhatók (Hampton et al.,

1990). Az alkalmazott eljárások röviden a következők:

a. Részleges tisztítás ammónium-szulfátos kicsapatással.

b. Ioncserés kromatográfia.

c. Protein A affinitású kromatográfia.

d. Homológ antigén–antitest komplexekből történő disszociáció.

e. Cukorgrádiens-centrifugálás.

f. F(ab‟)2 fragmentumok kinyerése.

g. Magasnyomású folyadékkromatográfia (HPLC).

h. Méretspecifikus membránon történő ultraszűrés.

i. Gélszűrés (IgM osztályba tartozó, nagy molekulatömegű antitestek esetében).

3. Monoklón antitestek előállítása

A növénykórtanban a monoklón antitestek (monoclonal antibodies, Mabs) alkalmazása nem régi keletű (Stern és

Gamble, 1984; Campbell, 1984; Halk és Boer, 1985). Előnyei a következők:

a. Csak egyetlen epitóppal szemben specifikusak.

b. A kívánt fajlagosság a hibridóma-sejtvonalak sorozatvizsgálatával elérhető.

c. A hibridóma-sejtvonalak stabilak a tenyésztés, illetve a fagyasztott tárolás során.

Kohler és Milstein (1975) vezette be azt az eljárást, amelynek lényege, hogy a lép antitestképző nyiroksejtjeit

rákos myelomasejtekkel fuzionáltatva ún. hibridómákat kapunk, amelyben biztosított a specifikus antitest

kiválasztása és a folyamatos növekedés. Immunizálásra egereket vagy patkányokat használnak fel. Ezen állatok

vére kevés, azonban érzékenyek egy olyan tumorra, ami olyan ascites testfolyadékot produkál, amelyben annyi

az antitest, mint a vérszérumban. Az ascites testfolyadék használatának előnyei a következők:



a. Az immunizáláshoz kevés antigén szükséges.

b. A testfolyadék mennyisége (ideális körülmények között) 20 ml.

c. Az antitesteket ugyanúgy lehet tisztítani és tárolni, mint a szérumból kivont IgG-t.

d. Hatékonyan alkalmazhatók egyes diagnosztikai eljárásokban, ahol a kimutatáshoz két, genetikailag

különböző szérumforrásból származó antigénrendszer szükséges.

A hibridómakultúrák klónozása és további szelekciója monoklón antitesteket (Mabs) eredményez, amelyek az

antigénnek csak egyetlen epitópjával szemben mutatnak aktivitást. A monoklón antitestek előállításának

technikai lépései több szerző munkájában megtalálhatóak. A monoklón antitestek előállításának folyamata a 80.

ábrán látható. A módszer fontosabb lépései az alábbiakban foglalhatók össze:

a. Az egerek vagy patkányok immunizálása. Azokból az egerekből, amelyekben az antiszérum titerértéke a

legmagasabb, a lépet eltávolítják, és fúzióra előkészítik.

b. Az egér myeloma-sejtvonalainak tenyésztése. A fagyasztott myeloma-kultúrából a fúzió előtt legalább tíz

nappal életképes, aktív növekedési állapotban (log fázisban) lévő sejtkultúrát kell készíteni.

c. A lépsejtek fuzionáltatása a myelomasejtekkel.

d. A fuzionált sejtek (hibridómák) tenyésztése szelektív táptalajon, amely a nem fuzionált sejtek növekedését

gátolja.

e. A hibridóma-kultúrák szűrése a monoklón antitestek kiválasztása céljából.

f. A hibridómák klónozása a monoklón sejtvonalak biztosítása céljából.

g. Ascites testfolyadék termelése.

80. ábra - A monoklón antitest előállításának folyamatábrája; A: az egér immunizálása,

B: a myeloma- és a légsejtek fúzióra történő előkészítése;C: sejtfúzió; D: a sejthibridek

szelekciója, szaporítása, krioprezerválása és klónozása; E: a hibridómák szkrínelése; F:

monoklón antitest termeltetése és tisztítása [Hampton et al., 1990 után]



3.1. A monoklón antitestek alkalmazásának lehetőségei

A monoklón antitestek (Mabs) felhasználhatók a különböző növénypatogének (vírusok, baktériumok,

spiroplazmák, fitoplazmák) és törzseik meghatározására és jellemzésére, a patogének és az általuk kódolt

termékek lokalizációjának és felhalmozódásának, valamint a kórokozók és génproduktumaik szerkezetének a

jellemzésére (Goding, 1983; Adam et al., 1991; Herscheid, 1992). Jelenleg 19 víruscsoportba tartozó, több mint

60 növényvírusra készítettek monoklón antitesteket (20. táblázat).

20. táblázat - Növényvírusok, amelyekkel szemben monoklón antitesteket állítottak elő

(van Regenmortel és Dubs, 1993 után módosítva)

Angol név Magyar név Akroním

Alfalfa mosaic alfamovirus Lucerna mozaik vírus AMV

Apple chlorotic leaf spot

trichovirus Alma klorotikus levélfoltosság

vírus ACLSV

Apple mosaic ilarvirus Alma mozaik vírus ApMV

Arabis mosaic nepovirus Arabis mozaik vírus ArMV

Banana bunchy top nanavirus Banán csúcscsokrosodás vírus BBTV

Barley yellow dwarf luteovirus Árpa sárga törpülés vírus BYDV

Bean common mosaic potyvirus Bab közönséges mozaik vírus BCMV

Bean pod mottle comovirus Babhüvely foltosság vírus BPMV

Bean southern mosaic sobemovirus Bab déli mozaik vírus SBMV

Bean yellow mosaic potyvirus Bab sárga mozaik vírus BYMV

Beet necrotic yellow vein benyvirus Répa nekrotikus sárgaerűség

vírus BNYVV

Beet western yellows luteovirus Répa nyugati sárgaság vírus BWYV

Carnation etched ring caulimovirus Szegfű karcolatos gyűrűs vírus CERV

Carnation latent carlavirus Szegfű látens vírus CLV

Carnation mottle carmovirus Szegfű foltosság vírus CarMV

Carnation necrotic fleck

closterovirus Szegfű nekrotikus foltosság

vírus CNFV

Cassava African mosaic

bigeminivirus Manióka afrikai mozaik vírus CAMV

Citrus tristeza closterovirus Citrus tristeza vírus CTV

Citrus variegation ilarvirus Citrus tarkaság vírus CVV



Clover yellow vein potyvirus Here sárga erűség vírus ClYVV

Cowpea mosaic comovirus Tehénborsó mozaik vírus CPMV

Cowpea severe mosaic comovirus Tehénborsó súlyos mozaik vírus CPSMV

Cucumber green mottle mosaic

tobamovirus Uborka zöldfoltosság mozaik

vírus CGMMV

Cucumber mosaic cucumovirus Uborka mozaik vírus CMV

Grapevine fanleaf nepovirus Szőlő páfránylevelűség vírus GFLV

Lettuce mosaic potyvirus Saláta mozaik vírus LMV

Maize dwarf mosaic potyvirus Kukorica törpülés mozaik vírus MDMV

Maize streak mastrevirus Kukorica csíkosság vírus MSV

Odontoglossum ringspot

tobamovirus Odontoglossum gyűrűsfoltosság

vírus ORSV

Papaya ringspot potyvirus Papaya gyűrűsfoltosság vírus PRSV

Pea severe mosaic potyvirus Borsó súlyos mozaik vírus PeSMV

Peanut clump pecluvirus Földimogyoró bokrosodás vírus PCV

Peanut mottle potyvirus Földimogyoró foltosság vírus PeMoV

Plum pox potyvirus Szilva himlő vírus PPV

Potato leaf roll polerovirus Burgonya levélsodródás vírus PLRV

Potato A potyvirus Burgonya A-vírus PVA

Potato M carlavirus Burgonya M-vírus PVM

Potato X potexvirus Burgonya X-vírus PVX

Potato Y potyvirus Burgonya Y-vírus PVY

Prune dwarf ilarvirus Szilva törpülés vírus PDV

Prunus necrotic ringspot ilarvirus Prunus nekrotikus

gyűrűsfoltosság vírus PNRSV

Raspberry bushy dwarf idaeovirus Málna bokros törpülés vírus RBDV

Rice dwarf phytoreovirus Rizs törpülés vírus RDV

Rice ragged stunt oryzavirus Rizs érdes törpülés vírus RRSV



Rice stripe tenuivirus Rizs csíkosság vírus RSV

Satsuma dwarf nepovirus Satsuma törpülés vírus SDV

Soybean dwarf luteovirus Szójabab törpülés vírus SbDV

Soybean mosaic potyvirus Szójabab mozaik vírus SMV

Sweet clover necrotic mosaic

dianthovirus Here nekrotikus mozaik vírus SCNMV

Tobacco etch potyvirus Dohány karcolatos vírus TEV

Tobacco mosaic tobamovirus Dohány mozaik vírus TMV

Tobacco necrotic dwarf luteovirus Dohány nekrotikus törpülés

vírus TNDV

Tobacco streak ilarvirus Dohány csíkosság vírus TSV

Tomato mosaic tobamovirus Paradicsom mozaik vírus ToMV

Tomato ringspot nepovirus Paradicsom gyűrűsfoltosság

vírus ToRSV

Tomato spotted wilt tospovirus Paradicsom bronzfoltosság vírus TSWV

Tulip breaking potyvirus Tulipán színtörés vírus TBV

Watermelon mosaic 2 potyvirus Görögdinnye mozaik 2-vírus WMV-2

Wheat soil-borne mosaic furovirus Búza talajlakó mozaik vírus SBWMV

Zucchini yellow mosaic potyvirus Cukkini sárga mozaik vírus ZYMV

A Mabs-ok alkalmazhatók a vírusok mennyiségi és minőségi meghatározására, a vírusok közötti rokonsági

kapcsolat feltárására csakúgy, mint a strukturális és nem strukturális génproduktomok szerkezeti és funkcionális

tanulmányozására. Alkalmazhatók vírusok, vírustörzsek és szerotípusok közötti rokonsági kapcsolat feltárására.

A dohány mozaik vírus (tobacco mosaic tobamovirus) közönséges törzse ellen készült Mab segítségével további

tíz, a tobamovirusokhoz tartozó vírust sikerült elkülöníteni (Briand et al., 1982). Tekintettel arra, hogy a

monoklón antitestek csak egyetlen epitóppal szemben specifikusak, kitűnően alkalmazhatók az antigénszerkezet

molekuláris szintű tanulmányozására (Altschuh et al., 1985). A Mab segítségével lehetővé válik az epitópok

azonosítása, szerkezetük feltérképezése. Mab-ot használtak pl. a bab déli mozaik vírus (bean southern mosaic

sobemovirus), valamint a dohány mozaik vírus szerkezetének a tanulmányozására, valamint a potyvirusok, az

ilarvirusok és a tobamovirusok specifikus epitópjainak a meghatározására. Jelenleg már nemcsak a vírus-

köpenyfehérjével szemben készülnek monoklón antitestek, hanem pl. nukleáris zárványokkal, henger alakú

zárványfehérjékkel, amorf zárványokkal, és potyvirusok esetében a levéltetű-átvitelért felelős, ún. helper

komponensekkel szemben is.

4. A szerológiai reakciók alaptípusai

4.1. Precipitáció

Az elnevezés onnan származik, hogy ha megfelelő mennyiségű antigén és antitest találkozik egymással, akkor a

reakció látható csapadékképződésben nyilvánul meg. A növényi minta szövetnedvét összekeverjük az



antiszérummal. Az inkubálás után szabad szemmel vagy mikroszkóppal értékelünk. Amennyiben az antigén

(azaz a keresett vírus) jelen volt a szövetnedvben, akkor az antigén–antitest reakció következtében apró

pelyhekből álló csapadék keletkezik. A precipitációs tesztek a legrégebben alkalmazott eljárások az antigén–

antitest kölcsönhatások tanulmányozására (Heidelberger és Kendall, 1935; Kleczkowski, 1966). A precipitáció

és az agglutináció elkülönítése a reagáló antigén mérete alapján történik. A precipitáció a makromolekulák és a

vírusrészecskék oldhatatlanságára utal, míg az agglutináció a sejtek, ill. a hozzá hasonló méretű részecskék

összetömörülését jelenti.

Folyékony közegben történő precipitációs teszt

a. Az antiszérumból megfelelő pufferrel hígítási sorozatot készítünk.

b. 0,5 ml antiszérumot ugyanannyi mennyiségű növényi szövetnedvvel kémcsőben összekeverünk és

vízfürdőben 25–40 °C-on inkubálunk.

c. Az a legmagasabb hígítási érték, amelynél az antiszérum a neki megfelelő, ismert koncentrációjú antigénnel

reagálva még látható precipitációt mutat, az antiszérum titerértékeként ismert és az inkubálás után egy, ill. két

órával meghatározható. A precipitációt láthatóbbá lehet tenni, ha a kémcsövet fekete hátterű fényforrás elé

helyezzük.

A precipitációs tesztek eredményességét számos tényező befolyásolja. Fontos tényező az antigén mérete. A

fonál alakú, 500–1000 nm hosszúságú vírusrészecskék már kisebb mennyiségű antitesttel is jól látható

precipitációt eredményeznek, mint a kisebb (izometrikus) virionok vagy a disszociált fehérjealegységek (Van

Slogteren és Dubs, 1993). A titerérték általában 10–3, ill. 10–4 a fonál alakú vírusoknál, míg a disszociált

vírusalegységeknél ritkán magasabb, mint 10–2.

Az antigén–antitest reakció kémcső helyett lejátszódhat tárgylemezen, vagy Petri-csészében is (Wetter, 1965;

Noordam, 1973; Dijkstra és De Jager, 1998). Ezek az ún. mikroprecipitációs tesztek. Tárgylemez használata

esetén az üvegfelületet hidrofóbbá kell tenni szilikonnal vagy 0,1%-os formvarral. Ha a reakció Petri-csészében

történik, akkor az evaporáció elkerülése végett ásványi olajat kell rétegezni a felületre. A lemezeket nedves

kamrában kell tartani. A csapadékképződést szobahőmérsékleten 0,5–1 órás inkubálás után mikroszkóppal lehet

megfigyelni. 4 °C-on hosszabb, mintegy 6 órás inkubációs idő szükséges. A mikroprecipitáció cseppben történő

lejátszódásának fő előnye a reagensek gazdaságos felhasználása.

A precipitációs tesztek másik altípusa az, mikor az antiszérum 10–30%-os glicerines sóoldatban hígítva egy kis

kémcső aljára kerül, amire úgy rétegzik rá az antigént, hogy a kettő között éles határfelület képződjön. Pozitív

reakció esetén a határfelületen precipitációs gyűrű alakul ki. E módszer előnye, hogy a reagensek koncentrációja

kevéssé kritikus. Többféle vírus kimutatására sikeresen alkalmazzák (van Regenmortel, 1982).

A precipitációs teszteket vagy tisztított víruspreparátummal végzik, vagy a fertőzött növény leszűrt

szövetnedvével. Ha a vírus a gazdanövényében csak nagyon kis koncentrációban van jelen, akkor szükséges a

növényi szövetnedvet ultracentrifugálással koncentrálni.

A folyadékprecipitációs tesztek fő alkalmazási területe az antiszérum-titerérték segítségével a vírusok

jellemzése és a nagyméretű, immundiffúziós tesztekkel nem tanulmányozható vírusok közötti szerológiai

rokonság felderítése. Két vírus közötti rokonsági kapcsolat kimutatására jól használható az ún. szerológiai

differenciálindex (SDI).

4.2. Agglutináció

Az agglutinációs reakciókban az antigént vagy az antitestet a vörösvérsejtek vagy egyéb hordozórészecskék, pl.

latex szemcsék felületére kötik. Ebben az esetben a sejtek és a latex partikulák mérete miatt látható szerológiai

reakció képződik még akkor is, ha a reagensek alacsony koncentrációja a látható precipitációt nem tenné

lehetővé. A passzív hemagglutináció esetében a vírusrészecskék vagy az antitestek a vörösvérsejtekhez

különböző kémiai kezelések által kötődnek (Rajeshwari et al., 1981; van Regenmortel, 1982), míg a latex

tesztnél az antitest egyszerű adszorpcióval kötődik a latex partikulákhoz. Ezért a vírussal (antigénnel) történő

pozitív reakció esetén a latex szemcsével megnövelt antitest és a vírusrészecskék aggregálódása következtében a

precipitáció láthatósága megnövekszik. Az antitest-molekulák a latex szemcsékhez egy ún. protein A közbülső

réteggel is kapcsolódhatnak (Torrance, 1980). Az agglutinációs tesztek érzékenysége 2–3-szor nagyobb, mint a

precipitációs vagy az immunodiffúziós teszteké (van Regenmortel, 1982). A zselatinból és különböző színű



gumiarábikumból készült, 3 μm átmérőjű zselatinszemcsék szintén sikerrel alkalmazhatók a növényi vírusok

kimutatásában.

4.3. Immunodiffúziós tesztek

Az immunodiffúziós tesztek gélben lejátszódó precipitációs tesztek. Két fő változatuk ismert.

Az egyszerű géldiffúzió esetében az antigén diffundál abba a közegbe, amely az antitestet tartalmazza. Az

immunodiffúziós teszteknek a növényi virológiában leggyakrabban használt változata a kettős (dupla)

géldiffúzió, amelyben mind az antigén, mind pedig az antitest gélközegbe vágott különálló lyukakban

helyezkedik el és egymás felé diffundál (Shepard, 1972). Az immuno-elektronmikroszkópos módszer az

immunodiffúziós teszteket és az elektronmikroszkópos vizsgálatokat együtt tartalmazza. Ezt a módszert

részletesen az Immuno-elektronmikroszkópos módszer c. fejezet tárgyalja.

Egyszerű géldiffúzió

A reakció kb. 1 cm-es átmérőjű és 7–8 cm hosszú kémcsőben zajlik le. A kémcső aljára kerül az antiszérummal

kevert agar vagy agaróz (szilárd fázis), rárétegezve pedig az antigén folyékony fázisban. A precipitációs gyűrű a

kémcső alja felé mozdul el. A mozgás sebessége az antigén diffúziós állandójától, valamint az antigén és az

antitest koncentrációjától függ. A többszörös zónák kialakulása különböző antigén-komponensek jelenlétére utal

(Oudin, 1952).

Radiál géldiffúzió

Az egyszerű diffúzió másik változata a sugárirányú, ún. radiális géldiffúzió (Vaerman, 1981), ahol az antigén

egy központi lyukban helyezkedik el, és az azt körülvevő, antitestet tartalmazó agargélbe diffundál. A lyuk

körüli precipitációs gyűrű vastagsága az antigén koncentrációjával arányos.

Kettős géldiffúzió

Az immunodiffúziós tesztek közül a növényvirológiában leggyakrabban az Ouchterlony-féle (1968) kettős

diffúziós módszert alkalmazzák. Ennek az a lényege, hogy vékony agarlemezbe lyukakat vágunk úgy, hogy egy

középső lyukat 6–8 másik lyuk vegyen körül. A középső lyukba antiszérumot cseppentünk, míg a szélsőkbe a

vizsgálandó növényi minták szövetnedvei kerülnek. Az antitestek és az antigének is diffundálnak az agarban.

Ahol találkoznak, ott az agarban félhold alakú precipitációs ív keletkezik. A módszer izometrikus és pálcika

alakú vírusokra alkalmazható. A hosszú, fonál alakú vírusokat előbb olyan kezelésnek kell alávetni, amely

biztosítja a köpenyfehérjék szabad diffúzióját. Miután a reagensek a lyukakba kerültek, az antigén diffúziós

együtthatójától függően a diffúzió 24–72 óráig tart. A párolgás gátlása céljából a Petri-csészét nedves kamrában

tartjuk, vagy a gél tetejére könnyű ásványi olajréteget helyezünk. A precipitációs ívek a Petri-csészét

megvilágítva sötét háttér előtt tisztán látszódnak.

Precipitációs minták

Ha a lyukakban a reagensek megfelelő arányban vannak, akkor a precipitációs ív helyzete és görbülete utal az

antigén méretére. Ha az antigén diffúziós koefficiense ugyanakkora, mint az antitestté (5 × 10–7 cm2 s–1), akkor a

precipitációs ív egyenes lesz, és egyforma távolságra helyezkedik el a két lyuktól. Ha a vírusrészecskék

diffúziós együtthatója alacsonyabb (0,3–1,6 × 10–7 cm2 s–1), akkor a precipitációs ív az antigén lyukhoz közel

helyezkedik el, és körbefogja azt (van Regenmortel, 1982). Ha két egymás mel-lett elhelyezkedő antigén

diffundál ugyanazon antitestforrás felé, akkor a precipitációs ívek találkozásánál különböző minták alakulhatnak

ki. Három alapváltozat lehetséges: 1. egybeolvadó (koaleszcens), 2. ívek kereszteződése és 3. sarkantyúképzés

(spur), amelyek a két vírus közötti rokonsági kapcsolat meghatározására jól használhatók. Ha a precipitációs

ívek összeérnek (koaleszcens minta), akkor a két egymás melletti lyukban elhelyezkedő vírus szerológiailag

azonos. Ha a két precipitációs ív keresztezi egymást, a két vírus nincs egymással rokonsági kapcsolatban. A

sarkantyú- vagy spurképződés arra utal, hogy a két összehasonlítandó vírus azonos, de különböző epitópokat is

tartalmaz (81. ábra).

81. ábra - A kettős géldiffúzió precipitációs íveinek értelmezése. Magyarázat a

szövegben [Hampton et al., 1990 után]



Az Ouchterlony-technika alkalmazása Na-dodecil-szulfát (SDS) jelenlétében

A fonál alakú vírusok hosszúságuknak és aggregálódó képességüknek megfelelően a 0,5–1,0%-os agargélben

nem diffundálnak. Ahhoz, hogy a gélben történő diffúziót lehetővé tegyük, a részecskéket ultrahanggal össze

kell törni, vagy kémiai úton, alkáli pufferrel, detergensekkel, pirrolidinnel vagy nátrium-dodecil-szulfáttal (SDS)

kell szétbontani (Purcifull és Batchelor, 1977). Az SDS-t vagy a gélbe keverik, vagy összekeverik az antigénnel,

hogy megkönnyítsék a disszociációt. Az eljárást Gooding és Bing (1970) dolgozta ki a hosszú, fonál alakú

vírusokra, de ma már más morfológiájú vírusokra, valamint fehérje-zárványtestek detektálására is alkalmazható.

A disszociált köpenyfehérje-alegységek már könnyen diffundálnak, és így lehetővé válik bármely méretű vírus

esetében az immunodiffúziós tesztek alkalmazása. A különböző vírusok disszociált alegységei szerológiailag

szorosabb rokonságot mutatnak, mint az intakt vírusok, ezért ezzel a megközelítéssel a rokon vírusok vagy

vírustörzsek között további keresztreakciókat lehet kimutatni (Shepard et al., 1974; Dijkstra és De Jager, 1998).

A burgonya Y-vírus (potato Y potyvirus) meghatározása Ouchterlony-módszerrel SDS jelenlétében

(Purcifull és Batchelor, 1977)

a. Az agar előkészítése: A közeg 0,8% agart, 1% NaN3-t és 0,5% SDS-t tartalmaz. 4 g agarhoz 300 ml

desztillált vizet adunk és 5 perc alatt 100 °C-on felolvasztjuk. A felolvasztott agarhoz 5 g nátrium-azidot

(NaN3) adunk és jól összekeverjük. 2,5 g SDS-t 100 ml forró desztillált vízben feloldunk, ezt hozzáadjuk az

agaroldathoz. A keveréket 500 ml-ig forró desztillált vízzel kiegészítjük és összekeverjük. 11 cm átmérőjű

Petri-csészébe 12–12 ml oldatot öntünk. Miután az agar megszilárdult, a Petri-csészéket 4 °C-on nedves

kamrában tároljuk.

b. Az antigén előkészítése: A fertőzött és az egészséges növény levelét desztillált vízzel 1:1 arányban

homogenáljuk, majd minden gramm levélszövethez 1 ml 3%-os SDS-t adunk. A mintát gézen átszűrjük.

c. Az antiszérum előkészítése: A potyvirusok esetében az SDS-sel nem kezelt vírussal történő immunizálás is jó

eredményt ad. Az antiszérumot általában nem hígítjuk, de ha mégis szükséges, akkor vagy a PBS-pufferrel,

vagy 0,05 M Tris-HCl-lel (pH:7,2), amely 0,85% NaCl-ot és 5% bovin-szérumalbumint is tartalmaz.

d. Az agarba lyukvágóval 7 mm átmérőjű lyukakat vágunk. Egy centrális lyuk körül 6 db perifériális lyuk

legyen egymástól 4–5 mm-re. A középső lyukba az antiszérum, a szélsőkbe pedig a növényi minták

kerülnek.

e. Az inkubálás 24 °C-on történik, és az eredményeket 24–48 óra múlva feljegyezzük. A nem specifikus, nem

antigén–antitest reakció következtében létrejövő precipitációs ívek kialakulása elkerülhető, ha a gélközeghez

bovin-szérumalbumint is adunk.

4.4. Immunoelektroforézis

Az immunoelektroforézis a gélközegben történő elektroforézis és az immunodiffúzió kombinálása. Hatékony

módszer a komplex antigénkeverékek szétválasztására. Technikai leírása és alkalmazhatósága a növényi

virológiában Hampton et al. (1990) munkájában részletesen szerepel. Az immunoelektroforézis egyik változata

az ún. rocket immunoelektroforézis (Tóbiás et al., 1979; Laurell és McKay, 1981), amelyben az antigén az

antiszérumot tartalmazó gélközegben elektromos erőtér hatására diffundál. Ha a két reagens találkozik, a

precipitációs ív egy rakéta, ill. egy kúpszerű alakzat körvonalaihoz hasonló, a körülhatárolt terület nagysága

pedig az antigén koncentrációjával arányos. A módszer 1 mg levélszövetben jelenlévő 1 ng – 0,4 µg

mennyiségű vírus kimutatására alkalmas (Hagen et al., 1982).



A dohány mozaik vírus (tobacco mosaic tobamovirus) meghatározása rocket immunoelektroforézissel

(Tóbiás et al., 1979; Burgyán és Gáborjányi, 1984)

a. Az agarózoldat elkészítése. (Egy 9x12 cm-es nagyságú lemez 15 ml 0,75%-os agarózt tartalmazzon 0,02 M-

os veronál-pufferben (pH 8,6) és 0,1%-os Na azidban.)

b. Ha az agaróz 50–55 °C-ra lehűlt, akkor 2 cm2 agarózhoz 1 µl antiszérumot adunk.

c. Az agarózlemezre lyukakat vágunk, a növényi mintát ezekbe csepegtetjük.

d. A lemezt 24 óráig 4 °C-on, vagy szobahőmérsékleten, vízhűtés mellett, 50 V feszültség alá helyezzük (2

V/cm).

e. A lemezt – általában szűrőpapíros felitatással – megszárítjuk.

f. A megszárított lemezhez annyi foszfát-puffert adunk (pH: 7,0), hogy azt befedje, majd két óráig a pufferben,

egy óráig pedig desztillált vízben áztatjuk.

g. A lemezt „Comassie Brilliant Blue G-250” nevű festékkel színezzük. Fél óráig történő rázatás után a festéket

eltávolítjuk, majd 10 percig újraszínezünk. Ezt követően desztillált vizes áztatás, majd a lemez szárítása

következik.

h. Kalibrációs görbék segítségével a precipitációs csúcsok magasságából következtetni lehet a vírus

koncentrációjára.

4.5. ELISA-módszerek

Az „ELISA” mozaikszó, a vizsgálat angol elnevezésének kezdőbetűiből tevődik össze (Enzyme-linked

immunosorbent assay, enzimhez kötött ellenanyag-vizsgálat). Avrameas (1969) alkalmazta először

növényvírusok kimutatására.

Az enzimhez kapcsolt immunszorbens vizsgálatok (ELISA) olyan, szilárd fázison lejátszódó színreakciók, ahol

a reagensek műanyag felülethez vannak kötve, és a reakciót enzimmel kapcsolt antitest segítségével követjük

nyomon. Mivel az ELISA-módszer igen érzékeny és a reagenseket gazdaságosan lehet tömegvizsgálatokra

felhasználni, az ELISA a precipitációs és az immunodiffúziós tesztek helyébe lépett, és a növényvírusok

diagnosztizálásában a legnépszerűbb szerológiai módszerré vált (Clark és Bar-Joseph, 1984). Direkt és indirekt

ELISA-eljárásokat különböztetünk meg. A direkt eljárásnál az enzimet az antitesthez kapcsolják, míg az indirekt

eljárásnál az enzim olyan molekulához kapcsolódik, amely az IgG-t felismeri. Mindkét csoporton belül többféle

változat lehetséges (82A–F ábra). Az antitest enzimmel történő konjugálása csökkenti az antitest affinitását,

ezért az enzimmel konjugált antitest nem mutat olyan erős reakciót a rokon vírus szerotípusokkal, mint a

konjugálatlan antitest. A direkt eljárás (pl. DAS ELISA, vagy „kettősszendvics-módszer”) igen specifikus,

pontos és érzékeny módszer. Fél nanogramm vírus is kimutatható vele. Az indirekt módszer, ahol az enzim nem

az antitesthez kötődik, nem annyira specifikus. A konjugált antitest specifikusabb a homológ szerotípusokkal

szemben.

82. ábra - A különböző ELISA-eljárások sematikus ábrázolása. A: Y = IgG, • = vírus,

YE = IgG-enzim konjugátum; B: V = F (ab’)2, • = vírus, Y = IgG, EA = Protein A-enzim

konjugátum; C: Y = IgG, • = vírus, Y = IgG, A-E = anti-IgG-enzim konjugátum; D: A =

Protein A, Y = IgG, • = vírus, EA = Protein A-enzim konjugátum; E: • = vírus, YE =

IgG-enzim konjugátum; F: • = vírus, Y = IgG, A-E = anti-IgG-enzim konjugátum

[Hampton et al., 1990 után]



Direkt ELISA

• Kettősellenanyag-szendvics (DAS ELISA) (Clark és Adams, 1977)

A növényvirológiában a leggyakrabban az ún. duplaellenanyag-szendvics (double antibody sandwich) módszert

alkalmazzák (DAS ELISA) a fertőzések kimutatására. A vizsgálatokhoz ún. mikrotitráló lapokat használunk,

amelyek polisztirolból készülnek, és általában 8 × 12 = 96 db 300 μl-es bemélyedéssel (mintahely)

rendelkeznek.

Először az IgG oldatot pipettázzuk a cellákba. Az inkubálás során az IgG molekulák a poliszirolhoz kötődnek,

ezáltal a lap mélyedéseinek felszíne IgG molekulákkal lesz kibélelve. A nem kötődött IgG molekulákat

mosópufferrel eltávolítjuk. Ezután a cellákba a növényi minták szövetnedvei kerülnek. Amennyiben a minta

tartalmazta azt az antigént (vírust), amely ellen a kötődött IgG is készült, akkor a vírus a lemezhez kötött IgG-

hez kapcsolódik, míg a növényi fehérjék és más vírusok nem. Inkubálás után a nem kötődött anyagok a

cellákból pufferrel kimoshatók. Ezután pipettázzuk a cellákba a második, enzimmel jelzett IgG-t, azaz a

konjugátumot. Ha a vírus jelen van (az immobilizált IgG-hez kapcsolódva) a cellában, akkor az enzimmel jelzett

IgG (konjugátum) a vírus másik feléhez kötődik. Ezáltal létrejön az „immunszendvics”. A nem kötődött

konjugátumot pufferes mosással eltávolítjuk, majd az enzim szubsztrátjának oldata kerül a cellákba. A

leggyakrabban alkalmazott enzim, az alkalikus foszfatáz esetében a szubsztrát para-nitro-fenil-foszfát, amely

színtelen vegyület. Az alkalikus foszfatáz enzim a szubsztrátmolekulákról elkezdi hasítani a foszfátcsoportokat,

amelynek eredményeként sárga színű para-nitro-fenol keletkezik. A színváltozás erőssége közvetve a vírus

koncentrációjával arányos. Az enzim addig működik, amíg megfelelő kémiai környezet és szubsztrát jelen van.



A pozitív reakció szemmel is jól látható, de általában ELISA-értékelő fotométerrel (ELISA reader) értékelik az

eredményeket (82A ábra).

• Direkt eljárás

Az antigén kötődik először a mikrotitráló lemez falához (82E ábra). Ebben az esetben az antigén kötődik

először a cella falához, majd megfelelő mosás után az antitest és az enzim konjugátumát, végül pedig az enzim

szubsztrátumát adjuk a cellába, ahogyan az a DAS ELISA eljárásnál is történik.

• Direkt biotin-avidin ELISA

A szokványos ELISA-teszttel szemben, ahol az antitesthez kapcsolják az enzimet, a biotin-avidin rendszer

növeli a reakciók érzékenységét és szélesebb körű szerológiai rokoni kapcsolatok feltárását teszi lehetővé.

Viszonylag régóta ismert, hogy a tojásfehérjében található egy avidinnek nevezett fehérje, amely a biotinhez (H-

vitamin, koenzim R) kapcsolódva megakadályozza a biotinnek a belekből történő felszívódását. Később a

Streptomyces avidini baktérium egyik fehérjéjéről is hasonló tulajdonságot mutattak ki. E fehérjét

sztreptavidinnek nevezik. Mindkét anyag alkalmas a diagnosztikai felhasználásra. A sztreptavidin fizikai

tulajdonságai azonban jobbak, ezért ennek a felhasználása terjed. A módszer alapváltozatában az IgG-t

biotinálják, a sztreptavidint pedig enzimmel konjugálják. Az antitesthez kapcsolt biotin az antitest aktivitását

kevésbé csökkenti, mint az enzim. Az eljárás röviden a következő:

a. A cella falát először IgG-vel érzékenyítjük.

b. Mosás után a mintát hozzáadjuk.

c. Ezután biotinnal kapcsolt antitesttel inkubálunk.

d. Mosás után avidin (sztreptavidin)–enzim konjugátum hozzáadása következik.

e. Végül az enzim szubsztrátjának a bevitele történik.

• A paradicsom bronzfoltosság vírus (tomato spotted wilt tospovirus) kimutatása DAS ELISA módszerrel

Az eljáráshoz szükséges a vírus kimutatására alkalmas ELISA kit (Boehringer, Sanofi, Loewe), amely

tartalmazza az antiszérumot és az antiszérum–enzim konjugátumot, valamint a pozitív és negatív növényi

kontrollmintákat.

a. A lemez IgG-vel történő érzékenyítése: Az antiszérumot fedőpufferrel 500-szorosára hígítjuk. Az oldatból

200-200 μl-t pipettázunk a cellákba, és négy órán át 35 °C-on inkubálunk. Az inkubációs idő eltelte után

mosópufferrel kétszer kimossuk a cellákat, majd ismételten kétszer, de ekkor a puffert 3-3 percig a cellákban

hagyjuk.

b. A növényi minták felvitele: 0,4 g friss súlyú növényi mintát 2 ml homogenálópufferben eldörzsölünk, majd a

felülúszót leöntjük és Eppendorf-csőben 12 000 fordulatszámon (rpm) kb. 5 percig centrifugáljuk.

Nagyszámú minta esetén növényi homogenizálóberendezések is alkalmazhatók. Nemcsak a vizsgálandó

növényi mintákat, hanem pozitív és negatív kontrollmintákat is fel kell vinni a cellákba. A cellákba

pipettázott növényi mintákat egy éjszakán át 4 °C-on inkubáljuk. Ezután kétszer mosópufferrel mossuk a

cellákat, majd ismételten háromszor, a mosópuffer három percig cellákban történő inkubálásával.

c. Az IgG-enzim (alkalikus foszfatáz) konjugátumot konjugátumpufferben 500-szorosára hígítjuk, majd a

cellákba pipettázzuk. A konjugátumot 4 órán át 35 °C-on inkubáljuk a cellákban, majd elvégezzük a mosást a

b pont szerint.

d. A szubsztrát (4-nitrofenil-foszfát) hozzáadása. A szubsztrát elkészítése: Folyamatos keverés mellett 4-

nitrofenil-foszfátot szubsztrátpufferben 1:1 arányban feloldunk. 150–150 μl-t a cellákba pipettázunk. 35 °C-

on kb. 30 percig inkubálunk.

e. A reakciót 50 μl 3N NaOH-oldattal leállítjuk (nem szükségszerű).

f. A színváltozás mértékét ELISA readerrel 405 nm hullámhosszon értékeljük. Ha a minták abszorbciós értékei

a negatív kontroll abszorbciós értékének a kétszeresét meghaladják, akkor tekinthető a vizsgált minta az adott

vírusra nézve pozitívnak.



• A szükséges pufferek összetétele:

g. Fedő (coating) puffer: 1,59 g Na2CO3; 2,93 g NaHCO3; 0,2 g NaN3 1 liter oldatra desztillált vízzel kiegészítve

(pH 9,6).

h. PBS–Tween mosópuffer: 0,5 ml Tween-20 feloldása 1 liter-PBS oldatban, keverés mellett.

i. 10 × PBS-oldat (phosphate-buffer saline) (10-szeres töménységben, ezért közvetle-nül a felhasználás előtt

10-szeres hígítást kell készíteni): 72 g NaCl; 4,3 g KH2PO4; 14,4 g Na2HPO4 × 2 H2O (vagy: 29 g Na2HPO2 ×

12 H2O); 1g Merthiolát (Thimerosal) 1liter oldatra, desztillált vízzel kiegészítve (pH 7,4).

j. Kivonó (homogenáló) puffer: IgG puffer + 2% polivinil-pirrolidon (PVP).

k. IgG puffer: 1% BSA-t (marhabovin-szérumalbumin) vagy sovány tejport tartalmazó PBS–Tween-oldat,

melyet a tejpor szuszpendáltatása után több réteg szűrőpapíron át kell szűrni.

l. Konjugátumpuffer: ugyanaz, mint a kivonó puffer.

m. Alkalikus foszfatáz szubsztrátpuffer: 97 ml diethanol-amin; 0,2 g MgCl2 × 6 H2O; 0,2 g NaN3 1 1iter oldatra,

desztillált vízzel kiegészítve (pH 9,8; 1 N HCl-lel beállítva).

Indirekt ELISA

• Indirekt F(ab’)2 ELISA (Barbara és Clark, 1982)

Az első lépésben csak a specifikus IgG F(ab‟)2 fragmentuma kapcsolódik a lemezhez. Pufferes mosás után a

minta becsepegtetése és az antigén megkötődése következik. Ezt követően ismét mosás következik, majd a

következő műveletben a teljes IgG-t mérik be, amely az immobilizált antigénhez (vírushoz) kötődik. Ez az IgG

nincs enzimmel jelölve. A protein A-nak nevezett sejtfalfehérje – amelyet a Staphylococcus aureus nevű

baktérium termel – jellemző tulajdonsága az, hogy kötődik az IgG molekulák nem antigénspsecifikus F(c)

régiójához. Ezt a protein A-t ugyanúgy lehet enzimmel jelölni, mint az IgG molekulákat. Ha az indirekt ELISA

utolsó előtti lépésekor ilyen enzimmel konjugált protein A-t pipettázunk a lyukakba, akkor az csak a teljes IgG

molekulákhoz kapcsolódik, az antigén hiányában esetleg „csupaszon” maradt F(ab‟)2 fragmentumokhoz nem.

Az utolsó lépés ebben az esetben is az enzim szubsztrátjának a bevitele. E változatnál nem kell minden vírus

ellen termeltetett IgG-t külön-külön enzimmel konjugálni, elég a protein A-enzim konjugátum használata. Az

indirekt módszer elnevezés arra utal, hogy az enzim nem közvetlenül a specifikus IgG-hez van kapcsolva (82B

ábra).

• Indirekt DAS ELISA (van Regenmortel és Burckard, 1980)

E vizsgálatban először a vírus ellen egy állatfajban (1. állat) termeltetett IgG-vel érzékenyítjük a lemezt. Ezután

becsöpögtetjük a növényi mintát. A megfelelő inkubálás és mosások után egy másik állatfajban (2. állat)

ugyanarra a vírusra specifikusan termeltetett IgG kerül a lyukakba. Ezután a 2. állat IgG-je ellen termelt 3. állat

IgG-enzim konjugátuma következik. Végül pedig az enzim szubsztrátja kerül a cellába (82C ábra).

• Indirekt ELISA (Lommel et al., 1982)

Először az antigént kötjük a lemez falához, majd az IgG-t. Ezt követi az első állatfaj IgG-je ellen egy másik

állatfajban termeltetett IgG-enzim konjugátuma, majd a szubsztrátum hozzáadása (82F ábra).

• Módosított F(ab’)2 vagy protein A ELISA

Ennél a változatnál a protein A fehérjét kétszer kell bevinni a cellába (Edwards és Cooper, 1985). Először a

protein A réteget a cella falához kötjük, amihez a továbbiakban az antitest kötődik. A vírussal és a második

antitestréteggel történő inkubáció után enzimmel konjugált protein A-t adunk a második réteg antitest-

detektálása céljából. E módszer legfőbb előnye, hogy csak egyféle antiszérum szükséges hozzá, mivel az

enzimet nem az antitesthez, hanem a protein A-hoz kapcsoljuk (82D ábra).

• A protein A ELISA-eljárás

a. Általában 1 µg protein A-t 1 ml fedőpufferben feloldva 200 µl protein A-oldattal érzékenyítjük a lemezt,

majd kb. négy órán át 35 °C-on inkubálunk. Az inkubációs idő letelte után kétszer desztillált vízzel, majd

egyszer PBS–Tween mosópufferrel történő mosás szükséges.



b. 200–200 μl specifikus IgG antiszérum felvitele az antiszérum titerértékétől függő, de általában 500–1000-

szeres hígításban történik. Négy óráig 35 °C-on történő inkubáció, majd mosás az a lépés szerint.

c. Növényi minták felvitele: 0,4 g friss levél 2 ml kivonópufferben történő homogenálása, majd a felülúszó

Eppendorf-csőben történő centrifugálása 5 percig, vagy a homogenátum vattán történő átszűrése. Inkubálás 4

°C-on egy éjszakán át, majd háromszori desztillált vízzel történő mosás, és kétszeri PBS–Tween

mosópufferrel történő mosás következik. Kiöntés előtt a puffert 3 percig hagyjuk a cellákban.

d. A második IgG réteg felvitele [lásd b lépés].

e. Protein A-enzim konjugátum felvitele. Előtte a konjugátumot ún. konjugátumpufferrel – a konjugátum

minőségétől függően – hígítjuk (pl. 20 ml pufferben 5 µl konjugátumot oldunk). Ezután a lépés után az

inkubáció 4 órán keresztül 35 °C-on történik, majd a c lépés szerinti mosás következik.

f. A szubsztrátum felvitele. Ha az enzim alkalikus foszfatáz, akkor a szubsztrát 4-nitrofenil-foszfát. Ha az

enzim peroxidáz, akkor a szubsztrát o-fenilén-diamin lesz.

g. A szubsztrát felvitele után a reakcióelegyet 35 °C-on inkubáljuk. A pozitív minták esetében rövid idő alatt

kialakul a narancssárga színreakció.

h. Ha az enzim alkalikus foszfatáz volt, a reakciót cellánként 50-50 μl 3N NaOH-oldattal leállítjuk.

i. A lemezt ELISA readerrel 405 nm hullámhosszon értékeljük.

O-fenilén-diamin (OPD) készítése:

a. 1 kapszula OPD-t 50 ml citromsavas foszfátpufferben feloldunk. Az OPD erősen rákkeltő hatású, ezért

gumikesztyű használata kötelező. Az OPD fényérzékeny, ezért feloldásakor a főzőpoharat alufóliába kell

csomagolni és a bemérés után a lemezt is takarni kell.

b. 50 ml bidesztillált vízben 1 tabletta Hyperolt oldunk fel. H2O2 keletkezik.

c. A hidrogén-peroxid (H2O2) oldatból 500 μl-t adunk az 50 ml OPD-oldathoz, és kevertetjük. Az így nyert

elegyből 150 l mennyiséget pipettázunk a lemez celláiba.

Citromsavas foszfátpuffer készítése:

5,6 g citromsav; 11,2 g Na2HPO4 1 liter oldatra desztillált vízzel kiegészítve (pH 5).

A reakcióhoz szükséges egyéb pufferek (fedő-, azaz coating), PBS–Tween mosópuffer, IgG-puffer,

kivonópuffer, konjugátumpuffer – mely ugyanaz, mint az IgG-puffer – elkészítésének módja az előző fejezetben

található.

4.6. Radioimmuno-vizsgálat (RIA)

A radioimmuno-tesztek során az antitestet nem enzimhez kötik, hanem radioaktív izotóppal jelölik. A költséges

számlálószerkezet, valamint a rádioaktív anyagok használata miatt ezt az eljárást a növényi virológiában csak

ritkán alkalmazzák (van Regenmortel, 1982).

4.7. Immunoblotting

Ezen eljárások az ELISA érzékenységét fokozó, annak továbbfejlesztett változatai. Az immunoblotting

eljárásokról nemrégiben kiváló tanulmányok születtek, és alkalmazásuk a növényi virológia területén Koenig és

Burgermeister (1986), Hampton et al. (1990) munkáiban részletesen leírásra kerültek. Az immunoblotting

diagnosztika három részterületet ölel fel. Ezek a következők: Western blot technika, dot-blot immunteszt (DIA)

és a szöveti (tissue) blotting.

A Western blot technika

Ezen eljárás első lépéseként a gélben lévő proteineket először elektroforézissel szétválasztják. Ezután a fehérjék

a gélből egy membránra kerülnek, amihez az antitesteket kötik. A proteinek a gélből a legegyszerűbben passzív

úton kerülnek a membrán felületére. A nagyobb molekulatömegű fehérjék esetében azonban hatékonyabb az ún.



elektroblot immunteszt alkalmazása. Az eljárást Tobwin et al. (1979) fejlesztették ki, melynek lényege röviden a

következő: a gélben lévő proteineket először itt is elektroforézissel választják szét. A gél egyik oldalán

szűrőpapír, a másik oldalán pedig membrán és szűrőpapír van. Ezt a „szendvicset” elektromos áram alá

helyezik, melynek hatására a térerősségtől és a gél vastagságától függően 1–12 óra alatt a fehérjék a szűrőre

kerülnek. A termelődött hő elvezetéséről gondoskodni kell. Az újabban elterjedt, ún. „félszáraz” blottolási

technika esetében kevesebb mennyiségű puffer felhasználására van lehetőség. A fehérjék membránra történő

átjutási ideje nagyon rövid, 0,5–0,75 mm gélvastagság esetén mintegy 30 perc.

Dot-blot immunteszt

Banttari és Goodwin (1985) nyolcszoros érzékenységnövekedést ért el azzal, hogy az ELISA-eljáráshoz nem

polisztirol lapot, hanem nitrocellulóz membránt használt. A membránt apró korongokra darabolva, vagy

műanyag sablonba szorított nagyobb membránszelet formájában használják. Utóbbi esetben a sablonból kivett

membránon színes foltok (dot) formájában láthatók a pozitív reakciók.

A dot-blot technika esetén a tisztított antigént vagy a szövetnedvet közvetlenül a nitrocellulóz membránhoz

kötik, a műveletet megelőző elektroforetikus szétválasztás nélkül (Banttari és Goodwin, 1985; Hibi és Saito,

1985; Dijkstra és De Jager, 1998). A BSA-val (bovin-szérumalbumin) történő telítés után a blottokat sorrendben

antitesttel, IgG-enzim konjugátummal, majd a szubsztrátummal inkubálják, mint a Western blot teszt során. A

technika monoklón és poliklón antitestek esetén is alkalmazható (Rocha-Pena et al., 1991). Ezzel az eljárással az

alkalmazandó reagensek kis mennyisége miatt fél pikogram-mennyiségű vírus is kimutatható.

• A szilva himlő vírus (plum pox potyvirus) kimutatása dot-blot technikával (Moya et al., 1997)

a. Növényi minta előkészítése. Egy gramm levelet 40 ml Tris-HCl-ben homogenálunk (pH 6,8), amely 30 mM

aszkorbinsavat és 0,2% 2-merkaptoetanolt tartalmaz. A keveréket öt percig 100 °C-on történő felmelegítéssel

denaturáljuk.

b. A nitrocellulóz membránt óvatosan a TBS-puffer felszínére helyezve megnedvesítjük.

c. A membránt öt percig szűrőpapíron szárítjuk (ma már olyan membránok is léteznek, melyek használatánál a

b és a c művelet elvégzése nem szükséges).

d. 1 μl növényi mintát csepegtetünk a membránra, majd azt 5 percig szűrőpapíron szárítjuk.

e. A filtert blokkoló oldatban (5% sovány tejport tartalmazó PBS-oldat) egy órán keresztül rázatjuk, majd egy

pillanatra desztillált vízbe mártjuk.

f. Monoklón antitesttel kezeljük a szűrőt (0,1 g/ml PBS-oldatban).

g. Ezután desztillált vízbe történő bemártás, 2 × 10 percig TTBS-oldatban történő mosás, majd ismételten egy

pillanatra desztillált vízbe történő bemártás következik.

h. A szűrőt peroxidázzal jelzett „antiegér“ antiszérumban inkubáljuk.

i. Desztillált vizes bemártás, majd 10 percig TTBS-ben, és 10 percig TBS-ben történő gyenge rázatás

következik.

j. A membránt öt percig az előhívó oldatban előhívjuk.

k. Desztillált vizes öblítés után az értékelés következik.

TBS-puffer: 0,02M-os Tris-HCl; 0,5M-os NaCl (pH 7,5).

TTBS-puffer: 0,05%-os Tween 20 TBS pufferben.

Előhívó oldat: 6 ml dimetil-szulfoxid; 0,1 g 3 amino-9 etil-karbazol; 50 ml 0,02 M-os

nátrium-acetát-puffer (pH 5,1); 0,4 ml hidrogén-peroxid. Frissen készítendő!

Szöveti (tissue) blotting



Ez az eljárás a dot-blothoz hasonló, de nincsen szükség a növényi minta homogenálására. A friss növénymintát

egyszerűen rányomjuk a nitrocellulóz membránra, majd a dot-blot eljárás szerint „előhívjuk” (Lin et al., 1990).

5. A különböző szerológiai eljárások alkalmazása a vírusdiagnosztikában

Több mint két évtizede az ELISA-módszer a legszélesebb körben alkalmazott eljárás a vírusdiagnosztikában. A

monoklón antitesteket is használó ELISA-eljárás nagymértékben hozzájárult a burgonya vírusmentesítési

programjához és a gyümölcsfaiskolák vírusmentesítéséhez (Halk és De Boer, 1985). Az egyes monoklón

antitestek egy-egy vírus csak korlátozott számú szerotípusára alkalmazhatók. Ez a hátrány kiküszöbölhető a

különböző Mabs keverékének használatával. Bár az ELISA-módszer nem annyira érzékeny, mint pl. a vírusok

nukleinsav-tartalmának meghatározásán alapuló ún. nukleinsav-hibridizációs módszerek, nagyszámú minta

tömegteszteléshez jobban alkalmazható. A bioteszt- vagy tesztnövénymódszer szintén érzékenyebb, mint az

ELISA, de a tesztnövények felnevelése sokáig tart és csak kisszámú minta tesztelését teszi lehetővé (Horváth,

1993).

Az ELISA-eljárások mellett a kettős géldiffúzió, a dot-blot és a Western blot módszerek a legnépszerűbbek

(Banttari és Goodwin, 1985; Barnett, 1986; Salazar, 1996).


15. fejezet - A nukleinsavak jellemzésének módszerei

A vírusok genetikai információját hordozó nukleinsav típusa lehet ribonukleinsav (RNS) vagy

dezoxiribonukleinsav (DNS). Ezek egyszálúak (ssRNS, ssDNS) vagy kétszálúak (dsRNS, dsDNS) lehetnek, de

a virionképzésben csak egyféle nukleinsav vehet részt. A vírus-RNS-szál lehet pozitív vagy negatív. Pozitívnak

nevezzük akkor, ha róla közvetlenül transzláció valósul meg, azaz messenger RNS-ként (mRNS) funkcionál. A

növénypatogén vírusok túlnyomó többsége egyszálú pozitív RNS-genomot tartalmaz, az egy-, ill. kettős szálú

DNS vírusok száma csekély. A növényvírusok kisebb része negatív szálú RNS-vírus; ebben az esetben szükség

van egy kiegészítő szál szintézisére is, mielőtt a transzláció megindulna. A vírusokban a nukleinsavbázisok

sorrendje meghatározó, hiszen a nukleinsavakban foglalt információk felelősek a fertőzőképességért, a

vírusreplikációért, a fehérjék szintéziséért, beleértve a köpenyfehérje termelését is. A vírusgenom lehet

egykomponensű, azaz osztatlan és lehet többkomponensű, azaz osztott. A vírusgenom minősége, a nukleinsav-

molekulák száma, a genom szerveződése és kifejeződése alapvető jelentőségű a vírusok rendszerezésében

(Matthews, 1991, 1992).

A nukleinsav jellemzésére alkalmas első technikák kifejlesztését a viroidok felfedezése és későbbi vizsgálatai

motiválták, hiszen a viroidok esetében nincsen lehetőség fehérjék vizsgálatára. Mint ismert, a viroidok csupasz

(naked) RNS-ből állnak. A molekuláris biológia és a biotechnológia területén elért eredmények szintén

nagymértékben hozzájárultak ahhoz, hogy lehetővé vált a vírusnukleinsav mind diagnosztikai, mind

rendszertani célú jellemzése, a genomban kódolt fehérjék szerepének megértése és a genom génsebészeti

célokra történő felhasználása.

A nukleinsavak jellemzésének egyik legáltalánosabban használt technikája a gél-elektroforézis, amely lehetővé

teszi a nukleinsavak elválasztását, méretének meghatározását. A nukleinsav jellemzésére használt, ún.

hibridizációs módszerek különösen olyan növényvírusok vizsgálatában terjedtek el, ahol a szerológia nem ad

megbízható eredményt [pl. dohány rattle vírus (tobacco rattle tobravirus) esetében]. A nukleinsav-hibridizáció

gyors eljárása a dot-blot hibridizáció, amely azonban nem teszi lehetővé a nukleinsav méretének

meghatározását, ehhez DNS esetében Southern-, RNS esetében pedig Northern-hibridizációra van szükség.

A nukleinsav jellemzésének legfontosabb és legalaposabb módszere a teljes genom bázissorendjének, azaz

szekvenciájának meghatározása. A növényvírusok esetében erre azért van lehetőség, mert a genom kis méretű,

általában kisebb, mint 10 000 bázispár. A genom teljes szekvenciájának megismerése új szempontokat adott a

vírusok rendszerezéséhez, hiszen lehetővé tette a rendszerezésben az evolúciós összefüggések figyelembevételét

is. A molekuláris biológiában széles körben alkalmazott polimeráz-láncreakció (polimerase chain reaction,

PCR) használata a növényvírus-diagnosztikában és a molekuláris virológiában egyaránt ismert. A továbbiakban

a nukleinsav jellemzésére alkalmas technikák részletes ismertetésével foglalkozunk. Megemlítjük, hogy e

témával kapcsolatban a könyv kéziratának leadása után jelent meg Dijkstra és De Jager (1998) kitűnő könyve a

vírus-RNS vizsgálati módszereiről.

1. Gél-elektroforézis

A gél-elektroforézis lehetővé teszi a nukleinsavak elválasztását és méretének meghatározását. A technika

lényege az, hogy az elektromos térbe helyezett gélben a molekulák a gél pórusain keresztül az ellenkező töltés

irányába vándorolnak.

A negatív töltésű nukleinsavak gélben történő mozgását sok tényező befolyásolja, de megfelelően standardizált

körülmények között a vándorlás gyorsaságát a legnagyobb mértékben a molekula mérete határozza meg. Minél

kisebb a molekula, annál könnyebben, gyorsabban mozog. Megfelelő méretű ismert anyag (marker)

alkalmazásával a molekula pontos mérete is megállapítható. A technika egyszerű, gyors és olyan fragmentumok

elválasztására is alkalmas, amelyre más úton, pl. sűrűséggradiens-centrifugálással nincs mód.

A vizsgált molekulák a gélen könnyen láthatóvá tehetők egy alacsony koncentrációban használatos fluoreszcens

festék, az ehídium-bromid alkalmazásával. Ennek segítségével ultraibolya fényben már 1–10 ng DNS is

kimutathatóvá válik. A gél agarózból vagy poliakril-amidból készülhet, a feladatnak megfelelő alakban,

sűrűségben és méretben. Az agarózgéleket általában a magasabb mérettartományban alkalmazzák, mintegy 200

bázispártól (bp) egészen 50 kilobázisig (kb). A poliakril-amid gélek kiválóan alkalmasak kisebb méretű

A nukleinsavak jellemzésének

módszerei


molekulák (5–500 bp) elválasztására. Felbontóképességük olyan nagy, hogy különböző DNS-fragmentumok

összehasonlításakor már 1 bp-nyi különbség is észlelhető (Sambrook et al., 1989).

A gél-elektroforézisnek a növényvirológiában elsősorban a vírusgenom (RNS vagy DNS) méretének, illetve a

genom bázissorendjének meghatározásában van szerepe. A 83. ábra az agarózgél-elektroforézis vázlatát

mutatja.

83. ábra - A gél-elektroforézis vázlata [Brown, 1990 után]

2. Nukleinsav-hibridizáció

A hibridizáció egyszálú nukleinsavláncok specifikus bázispárosodását jelenti, a purin és pirimidin bázisok

egymásnak megfelelősége, a komplementaritás szabálya szerint. A kétszálú DNS két szálát hevítéssel vagy

lúgos kezeléssel eltávolítva egymástól (denaturálás) egy egyszálú DNS-molekulákat tartalmazó oldat keletkezik,

és az így kapott DNS-oldat lehűlésekor a kétszálú szerkezet újra kialakul (renaturálódás). Azt a hőmérsékletet,

amelyen a molekulák 50%-a denaturálódik, olvadási hőmérsékletnek (Tm) nevezzük. Az olvadási hőmérsékletet

alapvetően a következő faktorok befolyásolják: 1. a nukleinsav bázisösszetétele, azaz a magas G+C-tartalomnál

magasabb a Tm értéke; 2. a sókoncentráció, ugyanis a magas sókoncentráció növeli az olvadási hőmérsékletet;

3. a hidrogénkötést befolyásoló kémiai anyagok (pl. formamid) jelenléte csökkenti a Tm-et. A hibridizációs

tesztekhez olyan hőmérsékleti körülményeket kell választani, amelyek maximalizálják az asszociáció fokát a

komplementer szálak között. Ez általában 22–27 °C-kal kevesebb a Tm-nél, azaz kb. 65 °C (Matthews, 1991).

A már oldatban levő molekulákhoz komplementer RNS-t vagy DNS-t adva olyan molekulák is képződnek,

amelyeknek egyik szálát a hozzáadott komplementer RNS vagy DNS alkotja. Ha ezeket a molekulákat a

felismerhetőség érdekében radioaktív vagy más módon jelölik, akkor a kapott hibrid molekulák is kimutathatóvá

válnak. A jelölt RNS-t vagy DNS-t próbának nevezik, amely olyan molekulákhoz kapcsolódik (hibridizál),

amelynek vele azonos (homológ) a szekvenciája (Hames és Higgins, 1985).

A hibridizáció megvalósítható úgy is, hogy mindkét nukleinsav oldatban van (folyadék-hibridizáció), de jobban

elterjedt az a gyakorlat, amikor az egyik molekulát egy szilárd mátrixon, filteren immobilizálják (filter-

hibridizáció). A növényvirológiában általánosan alkalmazott dot-blot, Southern- és Northern-hibridizáció


módszerei


mellett érdemes említést tenni az ún. szendvics-hibridizációról is. A nukleinsav-hibridizációs eljárásokról

nemrég Hull (1993) írt összefoglaló tanulmányt.

2.1. Dot-blot hibridizáció

A dot-blot hibridizáció a legáltalánosabban használt módszer nagyszámú minták elemzésére (Dijkstra és De

Jager, 1998). A hibridizáláshoz el nem választott nukleinsavmintát rögzítenek egy megfelelő hordozón

(nitrocellulóz vagy pozitív töltésű nejlonmembránon), és erre radioaktív próbát hibridizálnak. Fő lépései a

következők: 1. a vizsgálandó növényekből kis mennyiségű szövetnedv- vagy össznukleinsav-kivonás; 2. a

nukleinsav denaturálása hevítéssel; 3. a szövetnedvből, ill. a nukleinsavoldatból egy cseppnek a membránra

történő felvitele; 4. a nukleinsav membránhoz kötése; 5. a nem-specifikus kötőhelyek blokkolása a

prehibridizáció során; 6. hibridizálás radioaktívan jelölt nukleinsavpróbával; 7. a filter mosása a nem-, illetve

aspecifikusan hibridizált próba eltávolítására; 8. a filter szárítása, majd kazettában röntgenfilm fölé helyezése; 9.

a film előhívása.

A nukleinsav dot-blot hibridizáció (Hames és Higgins, 1985 után)

• Összes nukleinsav-kivonás

a. A vizsgálandó növényekből egy Eppendorf-tető nagyságú levélkorongot 400 µl kivonó-pufferrel [50 mM

Tris-HCl (pH 7,6); 100 mM NaCl; 1 mM EDTA; 0,5% SDS; 0,3% merkapto-etanol] dörzsmozsárban

homogenálunk.

b. A homogenátumot visszapipettázzuk egy Eppendorf-csőbe, hozzáadunk 400 µl fenolt és 30 mp-ig Vortexben

keverjük.

c. Vortexelés után a homogenátumot 5 percig centrifugáljuk (14 000 rpm, 4 °C).

d. A felülúszót leszívjuk, hozzáadunk 150 µl fenolt és 150 µl kloroformot, majd 30 percig vortexeljük.

e. A fenolos oldatot 5 percig centrifugáljuk (14000 rpm, 4 °C).

f. A felülúszót leszívjuk, hozzáadunk 300 µl kloroformot, összerázzuk, majd 5 percig centrifugáljuk (14 000

rpm, 4 °C).

g. A felülúszót leszívjuk és a nukleinsavakat 200 µl ammónium-acetát jelenlétében 1 ml absz. etanollal

kicsapjuk, az oldatot 20 percig –70 °C-on tartjuk.

h. Az alkoholos oldatot 20 percig centrifugáljuk (14 000 rpm, 4 °C), majd óvatosan leöntjük a felülúszót.

i. A csapadékban lévő nukleinsavakat 1,5 ml 70%-os etanollal mossuk (nem szuszpendáljuk).

j. Centrifugáljuk (14 000 rpm, 4 °C). A felülúszót leöntjük, és a csapadékot beszárítjuk.

k. A csapadékot 30–40 µl steril vízben szuszpendáljuk.

Megjegyzés: Az összes nukleinsav-kivonás során biztosítani kell, hogy az RNS ne degradálódjon, ezért

gondoskodni kell az oldatok és eszközök RNáz-mentességéről. A kivonás folyamán végig kesztyűt kell viselni.

A kivonópuffert, a fenolt és a kloroformot hűtőben (4 °C) tároljuk, a sterilezett Eppendorf-csöveket az egyes

lépések között jégen tartjuk. A kivont nukleinsav minőségét és mennyiségét agarózgélen futtatva

ellenőrizhetjük, illetve a mennyiségét spektrofotométerrel mérhetjük.

• A minták előkészítése és membránra vitele

a. A nukleinsavoldatból 3 µl-t kiveszünk, hozzáadunk 3 µl felvivőpuffert [50% (w/v) deionizált formamid; 6%

(w/v) formaldehid; 4,2% (w/v) glicerin; 0,035% brómfenolkék; 0,035% xiléncianol; 20mM HEPES pH 7,8; 1

mM EDTA pH 8,0].

b. A nukleinsavakat 65 °C-on 5 percig denaturáljuk, majd jég közé tesszük.

c. Az oldatból 4 µl-t pipettázunk a Hybond-N membránra, ügyelve arra, hogy a minták pontszerűen, egymástól

kellő távolságban (kb. 1 cm) helyezkedjenek el.


módszerei


d. A membránt 2 percre UV-transzparensre helyezzük, hogy a nukleinsavakat irreverzibilisen a membránhoz

kössük.

• Előhibridizáció, hibridizáció, autoradiográfia

e. A filtert egy, az egyik oldaláról nyitott műanyag tasakba tesszük, és hozzáadunk 5 ml előhibridizációs oldatot

(5 × SSPE; 5 × Denhard oldat; 1,5% SDS; 50% formamid; 19% H2O; 1 mg élesztő-RNS).

f. A tasakot lezárjuk, és 42 °C-os vízfürdőben rázatva 30 percig előhibridizálunk.

g. A tasak egyik oldalát felnyitva, hozzáadjuk az elkészített próbát (80 µl), és egy éjszakán át 42 °C-os

termosztátban hibridizálunk.

h. A filtert mosófolyadékkal (1 × SSC; 0,1% SDS) 3 × 20 percig mossuk.

i. A filtert megszárítjuk, kazettába helyezzük, tetejére pedig röntgen-filmet teszünk.

j. A filmet 24–48 óra elteltével előhívjuk.

• Próbakészítés (T7 QuickPrime Kit, Pharmacia Biotech)

k. Mérjük össze a következő reakcióelegyet: 17 µl hődenaturált DNS (25–50 ng); 5 µl reagenskeverék (reagent

mix); 0,5 µl T7 polimeráz (Pharmacia, 10 u/µl); 2,5 µl [32P]dCTP (1 MBq).

l. A reakciót 5–15 percig 37 °C-on inkubáljuk.

m. A mintához hozzáadunk 75 µl 1,5%-os SDS-t, és az így kapott 100 µl próbából 25 µl-t használunk egy

hibridizációban, a többit –20 °C-on 2–3 hétig tárolhatjuk.

n. A felhasználandó 25 µl próbát 25 µl 0,5%-os SDS és 10 µl 1 n NaOH hozzáadásával 5 percig

szobahőmérsékleten denaturáljuk, majd 5 percre jégbe tesszük, és hozzáadunk 10 µl 1 n HCl-t és 10 µl 1 n

Tris-HCl-t (pH 7,6).

o. Az így elkészült próbát a prehibridizáló folyadékhoz adjuk.

2.2. Southern-hibridizáció

A Southern-hibridizáció lényege (84. ábra), hogy az agarózgél-elektroforézissel elválasztott DNS-

fragmentumokat változatlan mintázatban egy membránra viszik át. A szokásos módon készített gélt lúgban

áztatva a DNS-t denaturálják, majd savval semlegesítik. Az így előkezelt gélt egy megfelelő oldattal átitatott

szűrőpapírra fektetik, a gél felületére pedig ráhelyezik a membránt. Az egészet lefedik egy vaskos köteg

szűrőpapírral, amely szívni kezdi a nedvességet (blottolás, 85. ábra). Miközben a papír a gélen és a membránon

átszívja a folyadékot, a DNS is az oldattal együtt mozog, amikor azonban eléri a membránt, ott megkötődik,

rögzül. A membránhoz kötött DNS-molekulákhoz radioaktívan jelölt próbát hibridizálnak. A próbával homológ

DNS-molekulák autoradiográfiával kimutathatók (Sambrook et al., 1989). A Southern-hibridizáció a

növényvirológiában általánosan elterjedt a vírusok polimeráz láncreakciós vizsgálatával kapott, ún. PCR-

termékek végső azonosításában. A Southern-hibridizáció (PCR termékek azonosítására) lépései a következők:

polimeráz láncreakció (lásd a Polimeráz láncreakció (PCR) c. fejezetet), elektroforézis, blottolás,

előhibridizáció, próbakészítés, hibridizáció és autoradiográfia.

84. ábra - A Southern-hibridizáció vázlata [Sain és Erdei, 1985 után]


módszerei


85. ábra - A blottolás [Sambrook et al., 1989 után]

• Elektroforézis

a. A vizsgálandó PCR termékeket 1–1,5%-os agarózgélben elektroforézissel elválasztjuk.

b. A gélt denaturáló oldatot (0,6 M NaCl; 0,5 M Tris-HCl; pH 7,0) tartalmazó kádba helyezzük és 30 percig

inkubáljuk.

c. A denaturáló oldat helyére neutralizáló oldatot (1,5 M NaCl; 0,5 M Tris-HCl, pH 7,0) teszünk, majd 30

perces inkubáció következik.

d. A gélt a 85. ábrán látható módon, egy éjszakán át blottoljuk, a blottoláshoz 20 x SSC-puffert kell használni.

e. A filtert szárítjuk, majd 2 percig az UV-transzparensre helyezve fixáljuk.

Az elektroforézis után a blottolás, előhibridizáció, próbakészítés, hibridizáció és autoradiográfia történik, a dot-

blot hibridizációnál leírtak szerint.

2.3. Northern-hibridizáció

A Northern-hibridizáció elve megegyezik a Southern-hibridizációval, de a vizsgálandó anyag itt nem DNS,

hanem RNS. Az RNS-sel való munka sokkal nagyobb elővigyázatosságot igényel, mint a DNS-sel történő

eljárások, mert az RNS nagyon bomlékony. Ezért gondoskodni kell arról, hogy a teszthez használt minden

eszköz és oldat RNáz-mentes legyen. A vizsgálatban az RNS-t olyan, ún. denaturáló agarózgélben választják el,

amely biztosítja az RNS másodlagos szerkezetének bontását. A leggyakrabban használt denaturáló ágensek a

formaldehid és a glioxál. A gélen történő szeparálás után ugyanazon lépések következnek, mint a Southern-

hibridizációban, azzal a különbséggel, hogy itt nincs szükség a gél futtatás utáni denaturálására és

neutralizálására.

A Northern-analízis alkalmazása különösen elterjedt a vírusgenom bizonyos részeivel transzformált

növényekben (transzgénikus növények) a transzgén expressziós szintjének meghatározására.


módszerei


A Northern-hibridizáció (Sambrook et al., 1989 után)

a. Az összes nukleinsav kivonásával nyert oldatból 8 µl-t használunk kiindulási anyagként.

b. Az RNS-mintához hozzáadunk 8 µl mintapuffert, majd a kapott oldatot 65 °C-on 5 percig denaturáljuk,

ezután pedig 2 percre jégbe tesszük.

c. A mintákat (mindig szerepeljen pozitív és negatív kontroll) denaturáló gélen, denaturáló futtató pufferben

elektroforetizáljuk.

d. Futtatás után a gélt 30 percig 10 x SSC-ben áztatjuk, majd a 85. ábra szerint blottoljuk.

e. A filtert szárítjuk, majd 2 percig UV-transzparensre helyezve az RNS-t rögzítjük.

Ezt követően a dot-blot hibridizációnál leírtak szerint következik a prehibridizáció, a hibridizáció és az

autoradiográfia.

2.4. Szendvics-hibridizáció

A szendvics-hibridizáció (86. ábra) során a vizsgálni kívánt vírus genomjából két egymással nem átfedő

szakaszt kiválasztanak, ezeket klónozzák, majd az egyik szakaszt csapdaként használják és egy, az ELISA-

módszernél használatos mikrotiterlemez falához kötik. Ha ilyen mintahelyekbe az adott vírust tartalmazó

szuszpenziót pipettáznak, akkor a csapda megköti a hibridizáló vírusrészecskéket. A nem kötődött anyagot

mosással eltávolítják. Ezután a másik klónt, a másik genomdarabot viszik a lyukakba, de ez a klón már jelölve

van (pl. alkalikus foszfatázzal), így a vírus-RNS koncentrációjával arányos hibridizációs szignál (színreakció)

megfelelő műszer segítségével mennyiségileg is értékelhető.

86. ábra - A szendvics-hibridizáció vázlata [Molnár János szívessége folytán]

2.5. Próbakészítés

A hibridizáció során alkalmazott próba egy olyan RNS- vagy DNS-fragmentum, amely homológ a vizsgálandó

molekulával. Az RNS-sel való bánásmód sok körültekintést igényel, ezért sokkal gyakoribb a DNS-próbák

használata. A virológiában a vírus egy részéről készült komplementer DNS-klón (cDNS) használatos

próbakészítéshez. A cDNS-klón készítésekor (87. ábra) vírus-RNS-ről reverz transzkripció segítségével

„elsőszál” cDNS készül. A keletkező elsőszál-cDNS RNS részét RNáz H segítségével részlegesen bontják, és a

megmaradó RNS-fragmentumok szolgálnak primerként a DNS-polimeráz I működéséhez, amely szintetizálja a

cDNS második szálát. A cDNS-t restrikciós enzimekkel vágva, az ugyanolyan restrikciós enzimmel hasított

vektorba (plazmidba) illesztik, majd a rekombináns plazmidot egy adott baktériumsejtbe transzformálják, és

abban felszaporítják. A plazmid a baktériumból bármikor tisztítható, és a kinyert DNS tetszőlegesen használható

próbakészítéshez, illetve bármely génsebészeti eljáráshoz. Az egyes DNS-fragmentumok in vitro körülmények

között is szaporíthatók polimeráz láncreakció segítségével. Azért, hogy a hibridizáció során keletkező hibridek

detektálhatók legyenek, a próbákat jelölni kell. A jelölés történhet radioaktív és nem radioaktív eljárással

(Brown, 1990).

87. ábra - A cDNS-készítés folyamata [Brown, 1990 után]


módszerei


A radioaktív jelölési módszerek közül a leggyakoribb a „nick”-transzláció és a primer meghosszabbítás. A nick-

transzláció (88. ábra) során a DNáz I-enzimmel kezelt DNS-szálakon nick-ek (nukleinsav-folytonossági

hiányok) jönnek létre, amelyeket az Escherichia coli DNS-polimeráz a komplementaritás elve szerint „befoltoz”

a négy dezoxiribonukleozid-trifoszfát felhasználásával, amelyek közül az egyik alfa helyzetben 32P izotópot

tartalmaz. A polimerizáció mellett az enzimnek 5‟–3‟exonukleáz-aktivitása is van, így az eredeti nick tovább

bővíthető, a polimeráz halad tovább a láncon, és közben beépíti a jelölt dezoxiribonukleozidokat is.

88. ábra - Próbakészítés nick-transzlációval. ↓: Eredeti nick pozíció, ⇓ : Végső nick

pozíció, →→→→ : Jelölt szál [Brown, 1990 után]


módszerei


Az ún. véletlen (random) priming módszerénél a DNS-polimeráz I nagyobb egységét, a Klenow-fragmentumot

vagy a T7 DNS-polimeráz enzimet használják. A reakció során a jelölendő DNS-t denaturálják, majd random

hexanukleotidokat, polimeráz enzimet, alfa-32P dezoxiribonukleozid-trifoszfátokat adnak a reakcióelegyhez. A

hexanukleotidok a denaturált DNS-hez hibridizálnak, és primerként szolgálnak. A polimeráz enzim a

primerekhez kapcsolódik, és a jelölt bázisokat beépítve meghosszabbítja azokat. E módszerrel a nick-

transzlációhoz képest 2–5-szörös specifikus aktivitás érhető el. Napjainkban a PCR-technikával történő

próbakészítés is egyre gyakoribbá válik.

A nem radioaktív jelölési módok közül a legelterjedtebb a biotinálás (89. ábra). Ezekben a reakciókban a

biotint, mint haptént (biotin-II-dUTP) pl. nick-transzlációval beépítik a próbába, majd a szignált Southern-

hibridizáció után két lépésben előhívják. A filtert először a biotinhoz specifikusan kötődő olyan streptavidinnel

reagáltatják, amelyhez jelző (reporter) molekulaként alkalikus foszfatáz enzimet kötöttek. Így egy DNS-enzim

komplex jön létre. Ha az enzim szubsztrátjával inkubálják a nitrocellulóz filtert, színes csíkok mutatják a

hibridek helyét.

89. ábra - A biotinálás vázlata [Molnár, 1991 után]

3. Nukleinsav-szekvencia meghatározása

A nukleinsavak bázissorrendjének meghatározására a Maxam és Gilbert (1977)-féle kémiai degradáló és a

Sänger és Coulson (1975)-féle láncterminációs módszer ismert, amelyek közül jelenleg a láncterminációs

módszert használják. Ahhoz, hogy egy vírus teljes genomjának szekvenciáját meghatározzák, először cDNS-

klónokat kell készíteni, mégpedig úgy, hogy ezek a klónok a teljes vírusgenomot átfedjék. A vírusok esetében a

kisméretű genom megkönnyíti a szekvencia meghatározását. Nagyobb genomok bázissorrendjének

meghatározása már komolyabb feladat, de az automatizált (gépi) szekvenálás terjedésével egyre inkább

megvalósítható.

A láncterminációs módszer során a vizsgálandó DNS-t először egyszálúvá teszik. A folyamat kulcsenzime, a

DNS-polimeráz I alkalmas arra, hogy az egyszálú DNS kiegészítő szálát elkészítse, de ehhez szükség van egy

rövid kétszálas szakaszra is, amely az indító szerepét játssza. Az egyszálú DNS-hez tehát egy rövid


módszerei


oligonukleotid primert hibridizálnak, amelytől kezdődően elindulhat a második szál szintézise. A

szekvenáláshoz négy reakció készül, ezek mindegyike tartalmazza a mintául szolgáló egyszálú DNS-t és a hozzá

hibridizált primert, valamint tartalmazzák a négyféle nukleozid-trifoszfátot (dATP, dCTP, dGTP és dTTP) is. A

nukleozid-trifoszfátok közül az egyiket radioaktívan jelölik, hogy a termék később kimutatható

legyen.Tartalmaznak az elegyek továbbá didezoxi-NTP-t (ddNTP), de mindegyik elegy csak egyfélét. A DNS-

lánc felépülését katalizáló polimeráz enzim jelenlétében megindul a mintának megfelelő komplementer szál

szintézise. Azok a mesterségesen felépülő szálak azonban, amelyekbe nem dezoxi-nukleozid-trifoszfát (dNTP),

hanem ddNTP épül be, nem tudnak tovább gyarapodni, mert a „rossz” nukleozid-trifoszfát ribóz részének 3‟-

helyzetű szénatomján nincs hidroxilcsoport, így ehhez nem tud kapcsolódni a következő nukleotid. Ha a ddNTP

és a dNTP aránya megfelelő, akkor a ddNTP beépülésekor létrejövő lánctermináció statisztikusan úgy oszlik el,

hogy az összes lehetséges vég képviselve lesz. A négyféle reakciót párhuzamosan végzik, és az elegyeket

poliakril-amid gélre viszik, ahol elektroforézist végeznek. A gél felbontóképessége maximális, azaz már egy

nukleotid különbséget is ki tud mutatni. A négy elegynek megfelelően négy oszlop fut párhuzamosan, s a kapott

csíkok magasságából megállapítható, hogy melyik szakasz zárult adeninnel, melyik guaninnal, melyik timinnel

és melyik citozinnal; ebből pedig összeállítható a vizsgált DNS bázissorendje. A szekvencia-adatokat

nemzetközi számítóközpontokban, ún. génbankokban helyezik el. A saját szekvencia gyors komputeres

programok segítségével összehasonlítható a génbankban levő ismert szekvenciákkal (Sain és Erdei, 1985).

A Maxam és Gilbert (1977)-féle szekvenálás során a radioaktív végjelölésű egyszálú DNS-mintát négyfelé

osztják, és négy roncsolási reakciót végeznek. Ezek során elbomlik a G-, az A- és a G-, a T- és a C-, illetve a C-

bázis. A roncsolási reakciót úgy végzik, hogy a reakció részleges, azaz minden lehetséges köztes termék

egyidejűleg jelen legyen. A keletkezett fragmentumokat elektroforézissel választják el, és a jelölt részeket

autoradiográfiával azonosítják (Sain és Erdei, 1985).

A nukleinsav-szekvencia meghatározásának módszertanát Sambrook et al. (1989) részletesen tárgyalja.

4. Polimeráz láncreakció (pcr)

A vizsgálandó nukleinsavmintát a polimeráz láncreakció segítségével in vitro körülmények között

szaporíthatjuk fel (amplifikálhatjuk). Ez azért alapvető jelentőségű, mert a vizsgálatokhoz sok esetben nem áll

rendelkezésre megfelelő mennyiségű kiindulási anyag, RNS vagy DNS. A szekvencia-specifikus amplifikáció

lehetőséget ad arra, hogy igen kis mennyiségben jelenlevő (vírus-)nukleinsavat is kimutathassunk (Saiki et al.,

1985; Dijkstra és De Jager, 1998). A PCR-reakció lényege (90. ábra) az, hogy a denaturált DNS két láncához

két ismert szekvenciájú, kb. 20 bázispár hosszúságú primert hibridizálunk, melyek a felszaporítandó szakasz két

végét jelölik ki, majd DNS-polimeráz segítségével megtörténik a primerek meghosszabbítása. Ez a reakciósor

ciklikusan ismétlődik, újabb és újabb minta-DNS-szekvenciák keletkeznek. A reakció tehát exponenciális lesz,

azaz 20–30 ciklus után a célszekvencia 106-szoros mennyiségi növekedése érhető el. Ezért az amplifikációhoz

pikogramm (10–12 g) mennyiségű vizsgálati anyag is elegendő lehet. A PCR fő lépései: 1. denaturáció általában

94 °C-on; 2. anel-lálás a primerek olvadási hőmérsékletétől kb. 5 °C-kal alacsonyabb hőmérsékleten (45–60 °C-

on); 3. polimerizáció 68 vagy 72 °C-on (Sambrook et al., 1989).

90. ábra - A polimeráz láncreakció. A és B: az eredeti DNS-szálak, A’ és B’: a két

oligonukleotid primer. A szaggatott vonal az in vitro szintetizált DNS-t jelöli [McInnes

és Symons, 1991 után]


módszerei


A reakció kulcsa a rendkívül hőstabil Taq-polimeráz enzim, amely lehetővé teszi a reakciósor automatizálását.

Az amplifikációra gyárilag előállított készüléket használnak, amelyekben a ciklus egyes lépéseinek paraméterei

előre programozhatók.

A felszaporított DNS-t általában agarózgélben, etídium-bromidos festés után teszik láthatóvá és hasonlítják

össze megfelelő méretmarkerrel, illetve a PCR-termék specifikus azonosítására a Southern-hibridizáció is

alkalmazható.

A PCR során keletkező termék kívánság szerint klónozható, illetve közvetlenül szekvenálható is.

Megjegyzés: A PCR-technika nagy előnyei az érzékenység, a fajlagosság és a gyorsaság. Magas fokú

érzékenysége miatt speciális laboratóriumi körülmények biztosítását igényli azért, hogy az idegen,

nemkívánatos szekvenciák felszaporítása elkerülhető legyen (egyszer használatos eszközök, reagensek

ellenőrzése, jól ismert pozitív és negatív kontrollok alkalmazása stb.). A vírusdiagnosztikában azért előnyös a

PCR használata, mert rendkívül specifikus, és a mintavételtől számított 4–6 órán belül eredményt ad. A

növényvírusok jelentős része RNS-genomot tartalmaz, ezért a polimeráz láncreakciót itt megelőzi egy reverz

transzkripciós lépés, amelynek terméke az az első szál komplementer DNS-e lesz, amely az ezt követő PCR

templátjául szolgál (91. ábra). A polimeráz láncreakció alkalmazását korlátozó tényező azonban az, hogy az

oligonukleotid primerek megtervezéséhez pontos szekvencia-adatokra van szükség.


módszerei


91. ábra - Az RNS-vírusok detektálása RT-PCR reakcióval. Elsőszál komplementer

DNS (cDNS) készítése reverz transzkripcióval (RT) RNS templátról, majd a cDNS

felszaporítása polimeráz láncreakcióval (PCR) [McInnes és Symons, 1991 után]

A reverz transzkripció–polimeráz láncreakció (RT–PCR)

A reverz transzkripció–polimeráz láncreakció (RT–PCR) a dot-blot hibridizációnál említett összes nukleinsav-

kivonással kezdődik. Ezt követi a reverz transzkripció (elsőszál-cDNS-készítés) és a polimeráz láncreakció.

• Reverz transzkripció

a. Mérjük össze az alábbi reakcióelegyet mintánként, majd helyezzük a mintákat 1 órán át 42 °C-os vízfürdőbe:

2,0 µl nukleinsavoldat (össznukleinsav-kivonásból); 4,4 µl H2O; 2,0 µl 5 × M-MuLV-puffer; 0,1 µl 0,1 M

DTT; 0,1 µl RNáz-inhibitor; 1,0 µl 5mM dNTPk; 0,2 µl oligo dT (20 pmol) vagy 3‟-vég primer (20 pmol);

0,2 µl M-MuLV Promega (200 u/µl) reverz transzkriptáz.

b. Egy óra elteltével helyezzük a mintákat jégre, vagy tárolás esetén –20 °C-ra.

• Polimeráz láncreakció

c. Mérjük össze az alábbi reakcióelegyet mintánként egy-egy 0,5 ml-es Eppendorf-csőbe: 38,7 µl H2O; 2 µl

cDNS; 5µl 10 × Taq-puffer; 2µl 5mM dNTPk; 1 µl Primer 1 (100 ng); 1 µl Primer 2 (100 ng); 0,3 µl Taq

polimeráz Promega (5 u/µl); 30 µl paraffinolaj. Az olajat csak a végén kell rácseppenteni.

d. A reakciót egy előre programozott PCR-készülékbe helyezzük, amikor az már a 94 °C-ot elérte.


módszerei


e. A reakció befejezése után az olaj alól óvatosan kipipettázzuk az oldatot, és az olajat kloroformos extrakcióval

eltávolítjuk.

f. A mintákból 6–6 µl-t 1%-os agarózgélen elektroforetizálunk.

Ajánlott program egy kb. 1000 bp hosszúságú DNS szakasz kiemelésére, ha a primerek olvadási hőmérséklete

kb. 60 °C:

Program Kezelés Hőmérséklet Időtartam Ciklusszám

a) denaturálás 94 °C 4 perc 1

b)

denaturálás

annelálás

polimerizálás

94 °C

55 °C

72 °C

1 perc

1 perc

1 perc

35

c) polimerizálás 72 °C 10 perc 1

d) tárolás 4 °C állandó


16. fejezet - Növényi vírusbetegségek és növekedést szabályozó anyagok

1. A növényi hormonok jellemzése

A növények növekedését szabályozó anyagok, más néven a fitohormonok élettani szerepük alapján két

csoportra oszthatók: juvenil- és szeneszcenciahormonokra. A növények élettani állapotát a növekedésszabályzó

anyagok közösen, egymásra is kölcsönhatást gyakorolva alakítják ki.

1.1. Juvenilhormonok

Hatásukra általában az jellemző, hogy a növény anyagcsere-folyamatait, sejtosztódását és a tápanyagok

felhalmozódását serkentik, a generatív fázisba történő átmenetet viszont késleltetik, tehát juvenilis (fiatal)

állapotban őrzik meg a növényt.

Auxinnak tekinthetünk minden olyan növekedésszabályozó anyagot, amelyek biológiai hatása az indol-3-

ecetsavéval megegyezik (pl. fenil-ecetsav, naftil-ecetsav, indol-vajsav). A felsorolásból kitűnik, hogy nem csak

indolszármazékok lehetnek auxinok, de a növényi szervezetben az indol-3-ecetsav (92. ábra) bizonyosan a

legáltalánosabb auxin hatású növekedésszabályozó. Ez a fejezet az auxin hatású vegyületek széles köréből

csupán az indol-3-ecetsav meghatározásának módszertani kérdéseivel foglalkozik.

92. ábra - Az indol-3-ecetsav szerkezeti képlete

Az indol-3-ecetsav szintézise a fiatal levelekben és hajtáscsúcsokban történik triptofánból, bazipetális

transzportja a floemben zajlik. Érdemes megjegyezni, hogy a növény szöveteiben található nagyszámú

indolvegyület egy részéről közismert, hogy az indol-3-ecetsav bioszintézisének köztes termékei (triptamin,

indol-3-piroszőlősav, indol-3-acetaldehid stb.), míg másoknak az indol-3-ecetsav raktározásában és

szállításában lehet szerepe. Így az indol-3-etanolnak, továbbá sok indol-3-ecetsav konjugátumnak (glükóz, mio-

inozit, cellulóz-glükán, glükoprotein és polipeptid észtereknek) hasonló szerepe van.

Az auxinok legnyilvánvalóbb hatása a megnyúlásos növekedés serkentése. A sejtek szintjén ez úgy valósul meg,

hogy a növényi sejtfal a hormon hatására fellazul, rugalmassá válik, majd a sejtekbe víz diffundál, ezáltal a

sejtek kiterjedése megnő.

A gibberellinek csoportjához sok hasonló szerkezetű (tetraciklikus diterpenoidsav) vegyület tartozik (93. ábra).

Az ismert gibberellinek száma meghaladja a 110-et (Kende és Zeevaart, 1997). Elsősorban az érett

kloroplasztiszokban képződnek. A gibberellinek két nagy csoportra oszthatók: a C19 és a C20 típusú

gibberellinekre (molekulavázuk 19, ill. 20 szénatomot tartalmaz). A C19 típusú gibberellinek biológiailag

Növényi vírusbetegségek és

növekedést szabályozó anyagok


aktívak, a C20 típusúak pedig – ismereteink szerint – a C19 gibberellinek metabolikus prekurzorai. A gibberellinek

bioszintézisének kiinduló vegyülete a mevalonsav.

93. ábra - A G3 gibberellinsav szerkezeti képlete

Hatásukat a merisztematikus szövetekre fejtik ki, egyrészt a sejtosztódás fokozásával, másrészt a már nem

osztódó, de még nem differenciálódott sejtek megnagyobbodásának indukálásával. Aktivitásuk eredménye sok

tekintetben az indol-3-ecetsavhoz hasonló, ami arra utal, hogy részben az auxinszintézis serkentésén keresztül

fejtik ki hatásukat.

A citokininek a sejtosztódás szabályozásáért elsősorban felelős növényi hormonok. A szabad citokininbázisok

többsége izopentenil oldalláncot viselő adeninszármazék. Két alaptípusuk a zeatin (Z) és az izopentenil-adenin

(iP) (94. ábra). A purinváz 9. nitrogénatomjához gyakran kapcsolódik ribóz vagy glükóz gyűrű, ilyen például a

9-zeatin-ribozid ([9R]Z), vagy a 9-izopentenil-adenin-ribozid ([9R]iP), amelyeket citokinin-nukleozidoknak

neveznek. A cukor-molekulához foszfátcsoport is kapcsolódhat, ezek a citokinin nukleotidok.

94. ábra - A: a citokininbázisok, B: nukleozidok és C: nukleotidok általános szerkezeti

képlete




Szintézisük a gyökerek osztódó szöveteiben, csúcsirányú szállításuk a xylemben történik. A citokininek

sejtosztódást fokozó hatásuk mellett a sejtek differenciálódását is serkentik, továbbá indukálják a növényi

szövetben a tápanyagok felhalmozódását, viszszatartását.

1.2. Szeneszcenciahormonok

Jellemző élettani hatásuk a növény szintézisfolyamatának gátlása, a légzés fokozódása és a generatív fázisba

(virág- és termésképzésbe) történő átmenet serkentése, amelyek a növények szeneszcenciája (öregedése)

irányában hatnak. A növényt ért stresszek következtében aktivitásuk megnő.

Az etilén (95. ábra) a növekedést serkentő hormonok antagonistája, a megnyúlásos növekedés fékezője.

Szintézise a metioninciklusból vezethető le, de telítetlen zsírsavak peroxidációja során is képződik. További

élettani hatásai: a légzés fokozódása, a virágképzés indukciója, a termésérés serkentése és a levelek leválása. A

növényre ható biotikus és abiotikus stresszek szintén megnövekedett etiléntermelést okoznak.

95. ábra - Az etilén szerkezeti képlete

Az abszcisszinsav a növényi szintetikus folyamatok széles körének gátló hormonja, mely a gibberellinekhez

hasonlóan diterpenoid vegyület (96. ábra). A plasztidokban szintetizálódik, hatását az intenzív anyagcserét

folytató szövetekre fejti ki. A növekedés gátlása mellett szabályozza a levelek leválását, valamint a rügyek




nyugalmi állapotát. Szárazság- és hidegstressz hatására a növények abszcisszinsav-tartalma fokozódik, és így

emelkedik ezekkel a stresszekkel szembeni ellenálló képességük.

96. ábra - Az abszcisszinsav szerkezeti képlete

2. A vírusfertőzött növények hormonváltozásai

Vírusfertőzött növények auxinszintjét vizsgálva ellentétes eredmények születtek: bizonyos esetekben csökkent

az auxinszint, más esetekben viszont nőtt. További nehézséget jelent a vírusok által okozott auxinkoncentráció-

változás hatásának értékelésében az, hogy az auxin kis mennyiségű jelenléte serkenti a növekedést, nagyobb

töménységben pedig gátolja azt, sőt az egyes növényi szervek növekedése számára optimális

auxinkoncentrációk között is nagyságrendi különbségek vannak. Smith et al. (1968) szerint cukorrépa, bab és

paradicsom levélszöveteiben a répa levélgöndörödés vírus (beet leaf curl ? rhabdovirus) szisztemikus fertőzése

után az auxintartalom csökkent ugyan, de ez nem volt arányos a tünetek mértékével, mert a rezisztens

növényekben, ahol a vírus szaporodása korlátozott mértékű volt és a tünetek is csak minimálisan fejlődtek ki, az

auxin mennyisége ugyanúgy csökkent, mint a fogékony növényekben, ahol a tünetek súlyosak voltak. A dohány

mozaik vírus (tobacco mosaic tobamovirus) fertőzésére hiperszenzitíven reagáló dohánynövényekben Van Loon

(1979) vizsgálatai során az inokulált levelek auxinszintjének nagymérvű növekedését tapasztalta a léziók

kifejlődése alatt. A vírusfertőzés iránt szisztemikusan fogékony gazdanövény beteg leveleiben viszont a hormon

koncentrációjának csökkenését észlelték (Rajagopal, 1977).

Olyan esetekben, amikor a vírusfertőzést törpüléses tünet kíséri, a fertőzött növényekben a gibberellinek

tartalma gyakran csökkent. Ezt tapasztalták uborka mozaik vírussal (cucumber mosaic cucumovirus) fertőzött

uborkában (Bailiss, 1977). Ez a folyamat külsőleg adott gibberellinekkel visszafordítható (Fernandez és

Gáborjányi, 1976), bár számításba kell venni azt, hogy a gibberellines kezelés mindenképpen serkenti a szár

megnyúlását, akár fertőzött volt a növény, akár nem. Meg kell továbbá azt a tényt is említeni, hogy a törpüléssel

járó vírusbetegségek, így a paradicsom magtalanság vírus (tomato aspermy cucumovirus) fertőzése

paradicsomon (Bailiss, 1968) vagy az árpa sárga törpülés vírus (barley yellow dwarf luteovirus) árpán (Russel

és Kimmins, 1971) sejtszámcsökkenést (mitózisgátlást) indukálnak. A gibberellinek viszont inkább a sejtek

kiterjedését fokozzák (Russel és Kimmins, 1971), jóllehet egészséges növényekben a sejtosztódásra is hatásuk

van (Bailiss, 1968). Feltételezhető tehát, hogy a gibberellin-aktivitás gátlása nem az elsődleges oka a vírusok

által előidézett törpülésnek. A gibberellinek törpülést enyhítő hatása a peroxidáz jellegű auxin-oxidáz gátlásával

magyarázható (Gáborjányi et al., 1973).

A vírusfertőzött növények citokinin-tartalmára vonatkozó vizsgálatok eredményei az auxinokhoz hasonlóan

ellentmondásosak. A dohány gyűrűsfoltosság vírus (tobacco ringspot nepovirus) fertőzése csökkentőleg hat a

citokinin-tartalomra tehénborsó gyökérszöveteiben (Kuriger és Agrios, 1977) és Nicotiana glutinosa inokulált

leveleiben (Tavantzis et al., 1979). Ezzel ellentétben Balázs et al. (1977) dohány mozaik vírussal fertőzött

„Xanthi-nc‟ hiperszenzitív dohány félleveleiben az összcitokinin szintjének emelkedését mérték. Ugyanezt

tapasztalták olyan „Xanthi-nc‟ növények nem fertőzött felső leveleiben is, ahol az alsó leveleket előzőleg

dohány mozaik vírussal inokulálták. Ez a megfigyelés felveti azt a lehetőséget, hogy a megemelkedett citokinin-

aktivitás öszszefügg a szisztemikus szerzett rezisztencia kialakulásával. A citokininszint a dohány mozaik

vírussal szisztemikusan fertőzött ‟Samsun‟ dohánylevelekben is megemelkedett (Sziráki és Balázs, 1977).




Vírusfertőzés esetén a hiperszenzitív dohányok fokozott etiléntermelését mutatták ki (Balázs et al., 1969). A

nekrózisok száma, nagysága és az etilénprodukció között egyenes összefüggés figyelhető meg (Nakagaki et al.,

1970). Tekintettel arra, hogy az etiléntermelés emelkedése csak néhány órával előzi meg a nekrózisok

megjelenését, ráadásul az eredetileg fertőzött sejtek elhalása már kissé előbb bekövetkezik, mint ahogy a látható

léziók kialakulnának, valószínűnek látszik, hogy az etilén nem kiváltó oka a lézióképződésnek. Ezt támasztja alá

az is, hogy a lokális klorózist okozó vírusfertőzés szintén megemelkedett etiléntermeléssel jár együtt

(Gáborjányi et al., 1971). A dohány mozaik vírussal szisztemikusan fertőzött dohánylevelekben az etilén

termelése nem növekszik (Balázs et al., 1969).

Az abszcisszinsav növekedést gátló tulajdonsága jól ismert, mégis viszonylag kevés vizsgálatot végeztek

vírusfertőzött növények abszcisszinsav-tartalmára vonatkozóan (Balázs et al., 1973). A legtöbb kísérletet

dohánynövényeken végezték, és azt tapasztalták, hogy vírusfertőzés hatására a hormon képződése fokozódik.

Whenham és Fraser (1981) a dohány mozaik vírus közönséges törzsével szisztemikusan fertőzött „White

Burley‟ dohányok szöveteiben hatszoros abszcisszinsav-koncentrációt mértek a kontrollnövényekhez képest.

Lokális léziót adó dohány–dohány mozaik vírus kapcsolatában a hormon koncentrációja szintén megnőtt. Az

abszcisszinsavszint az inokulált növények nem fertőződött leveleiben is megemelkedett, és a levelek növekedése

gátlást szenvedett. Tekintve, hogy mind az abszcisszinsav, mind a vírusfertőzés gátolja a sejtosztódást, a

tanulmány készítői arra a következtetésre jutottak, hogy a fertőzött levelek csökkent növekedését a

hormonaktivitás serkentése okozta.

3. A növényi hormonok meghatározása

A növényi hormonok meghatározása azért bonyolult feladat, mert 1. a szövetekben nagyon alacsony (ng)

koncentrációkban fordulnak elő, 2. a növények nagy változatossággal termelnek hasonló kémiai szerkezetű

molekulákat, amelyek nem rendelkeznek hormonaktivitással, 3. kis molekulatömegűek, kémiai szerkezetük nem

nagyon specifikus, 4. az extrakciós és a tisztítási lépések során könnyen bomlanak, 5. a hormonok több

csoportja nem egységes (pl. az izopentenil-adenin és a zeatin típusú citokininek két fajtája vagy a C19 és a C20

szénvázú gibberellinek nagy száma ismert), a meghatározásukra használt analitikai módszerek ezért többnyire

egy-egy adott kémiai szerkezettel bíró vegyületre irányulnak és nem az azonos biológiai aktivitással rendelkező

vegyületcsoport összes tagjára, továbbá 6. a növényen belül az egyes szervek hormontartalma igen eltérő.

A növényi hormonok kvantitatív meghatározásának alapjai

A növényi növekedésszabályozó anyagok meghatározása a biológiai aktivitáson alapuló biotesztekkel,

fizikokémiai módszerekkel vagy immunanalitikai módszerekkel történik (Brenner, 1981; Hedden, 1993). A

biotesztekre csak az etilén esetében térünk ki. A fizikai-kémiai módszerek lépései a következők: mintavétel,

kivonatkészítés v. extrakció, minta-előkészítés (tisztítás, elválasztás) és mennyiségi analízis.

• Mintavétel

Vírusfertőzött és egészséges növények összehasonlító vizsgálatakor a mintákat azonos körülmények között

nevelt, ugyanolyan élettani állapotú növények megfelelő szervéből és szövetéből kell venni.

• Kivonatkészítés vagy extrakció

A metanol 80%-os vizes oldata a legelterjedtebb extrahálószer. Lényeges, hogy a kivonás során a vizsgálni

kívánt hormonvegyületek ne hidrolizáljanak, más kémiai reakciókban vagy enzimes úton ne károsodjanak.

Célszerű nagy tisztaságú kivonószerrel dolgozni, érdemes továbbá egy olyan mintát is készíteni és a többivel

azonos módon tisztítani és mérni, amelybe növényi anyagot nem teszünk, csak extrahálószert.

• Minta-előkészítés (tisztítás, elválasztás)

Lehetséges lépései a folyadék–folyadék-megoszláson alapuló elválasztás, a szilárd fázisú extrakció, a

hagyományos oszlopkromatográfiás, a vékonyréteg-kromatográfiás, a nagyhatékonyságú

folyadékkromatográfiás és a gázkromatográfiás elválasztás.

A folyadék–folyadék-megoszláson alapuló elválasztás a különböző polaritású oldószerekben való eltérő

megoszláson alapul. Az oldószer kioldóképességének a megadott körülmények (pH stb.) mellett optimálisnak

kell lennie a megfelelő hormonra nézve. A két fázis elválását gátló anyagok (pl. foszfolipidek) rontják a

hormonok kioldásának hatékonyságát. A hormonokat kioldó szerves fázis (pl. 1-butanol, etilacetát) tartalmazhat

kismértékben vizes puffert, ami az oldószer elpárologtatása során töményebbé válik, és ez szélsőséges pH-




viszonyokat eredményezhet. Ezért érdemes a szerves fázist a bepárlás előtt vízzel extrahálni, vagy a pH-ját

semlegesíteni.

A szilárd fázisú extrakció lényege, hogy a nyers növényi kivonatot egy kisméretű, eldobható oszlopon tisztítják,

aminek töltetén a vizsgálni kívánt anyag, egyéb mintakomponensekkel együtt, megkötődik. A

szennyezőkomponenseket azután különféle oldószerekkel eltávolítják az oszlopról, majd egy alkalmas

oldószerrel a vizsgálandó mintaalkotót is kinyerik. A módszer előnyei a gyors és egyszerű kivitelezhetőség, a

kérdéses mintaösszetevő kedvezően magas kinyerhetősége (kicsi az elválasztási veszteség) és az alacsony

oldószerigény. Az oszlop töltete a leggyakrabban szilikagélhez kémiailag kötött oktadecil-szilán (= ODS vagy

C18), de kation- és anioncserélő töltetek, valamint egyszerű szilikagél-adszorpciós töltetek használata is elterjedt.

A hagyományos oszlopkromatográfiás elválasztás főként fenolszármazékok és pigmentek eltávolítására

alkalmas. Az oszlopok töltete lehet oldhatatlan polivinil-pirrolidon (PVP), Sephadex LH-20, DEAE-cellulóz,

továbbá Dowex-50, Duolit és cellulóz-foszfát ioncserélő töltetek, aktív szén, Cellit vagy szilikagél-adszorpciós

töltetek.

A vékonyréteg-kromatográfiás elválasztás mind hatékonyságában, gyorsaságában, mind mintakapacitásában

elmarad a nagyhatékonyságú folyadékkromatográf teljesítményétől, alkalmazását gazdasági megfontolások

tehetik indokolttá. Növényi hormonok elválasztására cellulóz- és szilikarétegek használatosak.

A nagyhatékonyságú folyadékkromatográfiás elválasztás (HPLC) az előzetes tisztítási lépéseken átesett növényi

minta összetevőit nagy hatékonysággal elválasztó, gyors módszer. Az oszlop töltete fordított fázisú HPLC

esetén – aminek alkalmazása igen elterjedt – a legtöbbször oktadecil-szilán (ODS).

A gázkromatográfiás elválasztás (GC) hatékony, gyors kromatográfiás módszer. Korlátozott mintakapacitása

miatt többlépéses minta-előkészítési folyamat esetén általában az utolsó kromatográfiás művelet. A

hagyományos, töltött gázkromatográfiás kolonnákat a kapilláris oszlopok váltják fel. A növényi hormonok (az

etilén kivételével) nem eléggé illékonyak, ezért származékképzéssel alakítják át szerkezetüket, hogy

gázkromatográffal elválaszthatóak legyenek. Ilyen származékképző eljárás a metilezés vagy a trimetil-szililezés.

• Mennyiségi meghatározás

A növényi hormonok kvantitatív meghatározása hatékony elválasztást biztosító kromatográfhoz (HPLC, GC)

kapcsolt, megfelelő szelektivitású detektorokkal vagy immunanalitikai módszerekkel (RIA, ELISA) történhet. A

nagyhatékonyságú folyadékkromatográf detektorok két típusa terjedt el növényi hormonok mérésére: a

fluoreszcens detektorok és az elektrokémiai detektorok. A fluoreszcens detektorokat elsősorban in-dol-3-ecetsav

mérésére használják, mert az indolvegyületek mérésére minden kémiai származékká történő átalakítás nélkül

alkalmasak. Az elektrokémiai detektorok oxidatív üzemmódban használva szintén indol-3-ecetsav mérésére

alkalmasak, ha az aminocsoport nitrogénmolekulája nem kötött.

A növényi hormonok gázkromatográfiás meghatározása a következő detektorokkal történhet: elektronbefogásos

detektor, nitrogén–foszfor detektor és tömegspektrométer. Az első kettő alkalmazása szórványos, a

tömegspektrométer használata azonban széles körben elterjedt.

Az elektronbefogásos detektor erősen elektronegatív vegyületekre, tehát halogénezett származékokra és

bizonyos aromás molekulákra szelektív detektor. Az abszcisszinsav metil-észterének, illetve más növényi

hormonok halogénezett csoportot tartalmazó mesterséges származékainak meghatározására alkalmas. A

nitrogén–foszfor detektort nitrogén- vagy foszfortartalmú molekulák szelektív detektálására használják, tehát

indol-3-ecetsav- és citokinin-származékok mérésére. A tömegspektrométer a gázkromatográfhoz kapcsolható

legnagyobb szelektivitással rendelkező detektortípus. A minta elválasztott komponensei egy ionforrásban

ionizált töredékekre hasadnak. Minden vegyület egyedi szerkezetéből adódóan azonos ionizáló energia hatására

következetesen ugyanazokra az ionizált töredékekre hasad, és az egyes töredékek képződésének aránya is

állandó marad. A berendezés analizátora a töredékeket tömeg/töltés arányuk alapján elválasztja, a detektor pedig

érzékeli mennyiségüket, amelyet az ún. tömegspektrumban különböző magasságú függőleges vonalak

formájában láthatunk. A töredékek képződése (azonos ionizáló energia mellett) állandó, ezért egy bizonyos

komponens tömegspektrum-mintázata (a töredékek egymáshoz viszonyított intenzitása, azaz mennyiségük) is

azonos.

• Immunanalitikai vagy szerológiai módszerek

Kiváló szelektivitásuk mellett megfelelő érzékenységet biztosító módszerek, melyek alacsony tisztaságú

növényi minták esetében is alkalmazhatóak. A növényi növekedésszabályozók kis molekulatömegük miatt nem




immunogének, ezért nagyméretű fehérjékhez (marha-szérumalbumin vagy tojásfehérje) kötik őket, alkalmassá

téve melegvérű állatok (többnyire nyulak) immunizálására. A termelt antiszérum érzékenysége és egyéb

vegyületekkel szemben adott keresztreakciója nagymértékben függ az immunizálás során használt

hormonfehérje komplex kötésétől. Lényeges feltétel, hogy a fehérjemolekula ne a vizsgálni kívánt hormon

valamelyik fő funkcionális csoportjához kötődjék, ami az antitestképződés során epitópként szerepelne. Több

vizsgálati módszer ismert.

A radioaktív immunanalitikai módszerek (RIA) közös elve a radioaktív izotóppal jelzett hormonvegyületek és a

növényi mintában jelen lévő, azonos típusú hormonmolekulák versengése a specifikus antiszérum-

kötőhelyekért. Az elegyben mérhető radioaktív izotóp koncentrációja fordított arányban áll a minta

hormontartalmával.

Az enzimhez kötött immunanalitikai módszerek (ELISA) alapja az, hogy a vizsgálatok során a növényi

mintában lévő hormonmolekulák peroxidáz vagy alkalikus-foszfatáz enzimhez kötött hormonvegyületekkel

versengenek az antiszérum-kötőhelyekért. Az egyensúlyi állapot kialakulását követően az enzim szubsztrátját az

elegyhez adva színreakciót kapunk, amelynek intenzitása fordítottan arányos a minta hormontartalmával.

• Belső standardok használata

A növényi hormonok meghatározását többlépéses minta-előkészítési művelet előzi meg, ami a vizsgálni kívánt

vegyületre nézve veszteséggel jár. A folyadék–folyadék megoszlás tökéletlensége, a foszfolipidek vagy a

fehérjék általi megkötés, a kémiai átalakulás és az üvegeszközök felületén való megkötődés egyaránt rontja a

kinyerhetőség hatékonyságát. A kivonatkészítés során a mintához adott – ismert mennyiségű – standard

vegyület koncentrációja azonban az utolsó (analitikai) lépésnél visszamérhető, aminek ismeretében

következtethetünk a tisztítási-elválasztási lépcsők együttes kinyerési hatékonyságára és a növényi minta eredeti

hormontartalmára. A belső standardot célszerű úgy megválasztani, hogy kémiai szerkezete nagyon közel álljon

ahhoz a mintaalkotó vegyülethez (növényi hormonhoz), amit vizsgálni szeretnénk. A hozzáadott belső standard

mennyiségének megválasztásakor törekedni kell arra, hogy a mintaelegyben lévő koncentrációja a minta várható

hormontartalmával megközelítőleg egyezzen. A leggyakrabban használt belső standardok a 14C vagy 3H

radioaktív izotóppal jelzett abszcisszinsav, az indol-3-ecetsav, a G3-gibberellin vagy a zeatin, valamint

tömegspektroszkópiás detektálás esetén a 2H és 15N nem radioaktív nehéz izotópokkal egyszeresen vagy

többszörösen jelzett hormonvegyületek.

3.1. Az auxin (indol-3-ecetsav) meghatározása

Az indol-3-ecetsav kivonása növényi mintákból

Az indol-3-ecetsav (IES) kivonása történhet hagyományos módon, metanol 80%-os vizes oldatával, vagy egyéb

IES kivonására alkalmas módszerekkel. Ilyen a növényi minta 65% i-propanolt tartalmazó 0,2 M-os imidazol-

pufferben (pH 7,0) történő homogenálása (4 ml kivonószer/g minta arányban). A belső standard hozzáadása

után a homogén növényi macerátumot 1 órán át 4 °C-on tartjuk, majd 10 000 g fordulatszámon 5 percig

centrifugáljuk, a továbbiakban pedig a felülúszóval dolgozunk (Chen et al., 1988).

Az indol-3-ecetsav elválasztása

• Folyadék–folyadék megoszláson alapuló elválasztás

Az IES oldékonysága, megoszlása a szerves és vizes fázis között a pH függvényében változik. Semleges vagy

lúgos kémhatású közegben a karboxilcsoport protonja disszociál, a molekula negatív töltést hordoz,

oldékonysága poláros oldószerekben (pl. desztillált vízben) sokkal jobb. Savas kémhatású közegben azonban a

hidrogénion nem disszo-ciál, a molekula töltés nélküli állapotban van, ezért ilyenkor apoláros oldószerekben

jobban oldódik. A kivonás során kapott minta IES-tartalmát tehát gyengén lúgos (pH 8,0), 0,1 M-os foszfát-

pufferben oldva, etilacetáttal szemben el lehet választani a semleges indolvegyületektől (pl. indol-3-etanol,

indol-3-metanol, indol-3-aldehid). Az oldat pH-ját csökkentve (pH 3,0) az IES oldékonysága megváltozik,

etilacetáttal kivonható a vizes fázisból. Az IES mellett a szerves oldószer tartalmazza majd az 5-hidroxil-indol-

ecetsavat, a 4-klór-indol-ecetsavat, az indol-piroszőlősavat, a fenil-ecetsavat és más savas karakterű

indolvegyületeket, míg a konjugált indolvegyületek és az amfoter összetevők (pl. triptofán) a vizes fázisban

maradnak. Az etil-acetát helyett dietil-éter is használható, mely még kevésbé poláros oldószer.

• Hagyományos PVP-oszlopkromatográfia




Oldhatatlan polivinil-pirrolidonnal (PVP) töltött oszlopokat széles körben alkalmaznak IES tisztítására. Az

oszlop mérete a minta térfogatától függően igen változatos lehet. Hatásukat alacsony pH mellett a

fenolvegyületek visszatartása által fejtik ki, H-kötéseken keresztül. A pH csökkentésével fokozódik az oszlop

IES-megkötő képessége, az elválasztás időtartama azonban ezáltal nagyon kitolódik. Kompromisszumként

célszerű 4–5 közötti pH-tartományban, citromsav/0,1 M-os Na-foszfát-puffer mozgó fázissal végezni az

elválasztást.

• Az indol-3-ecetsav ioncsere-kromatográfiás elválasztása

A savas karakterű indolvegyületek anioncserélő oszlopokon megköthetőek. A DEAE cellulóz (OH–)

anioncserélő töltet előkészítése 30 percnyi vízzel való duzzasztással, azután 0,5 M-os H2SO4 oldatos mosással

kezdődik. Ezután vízzel mossák, majd 0,5 M-os NaOH-oldatban 10 percig inkubálják. A töltetet ezt követően

desztillált vízzel alaposan átmossák, míg a pH-ja tartósan 7,5 alatt nem marad. A nedves DEAE cellulóz

ioncserélő anyagot az ismertetett lépések után megfelelő méretű oszlopba töltik (30 g mintából származó

növényi kivonat elválasztására egy 100 mm × 20 mm-es oszlop alkalmas), majd rátöltik az IES-t tartalmazó

vizes oldatot, és 300 ml vízzel eluálják. Az IES a töltet kationos csoportjain megkötődik, a minta semleges és

bázikus összetevői az oszlopról az eluenssel eltávoznak. Az IES és egyéb savas indolszármazékok 200 ml 50

mM-os Na2SO4-oldattal átmosva választhatók le az oszlopról.

DEAE Sephadex A-25 (acetát–) anioncserélő oszlopot is használnak IES tisztítására. A gél típusú töltetet vízben

duzzasztva készítik elő; 0,5 M-os sósavoldattal, majd 0,5 M-os NaOH-oldattal mossák, azután 1 M-os nátrium-

acetát-oldatban inkubálják több órán keresztül. Ezt követően desztillált vízzel mossák mindaddig, amíg pH-ja

már nem változik. A töltetet ezután 2-propanol/víz (1:1 térfogatarányú) elegyébe áztatják, és nedvesen oszlopba

töltik. Az 50%-os propanolban oldott növényi kivonatot az oszlopra töltik, mozgó fázisként szintén 50%-os

propanolt használnak. Az elválasztás után a savas karakterű indolszármazékok oszlopról való leválasztása a 2-

propanol/víz mozgó fázishoz adott ecetsavoldattal történhet. Az ecetsav koncentrációja a mozgó fázisban

növekedhet lépcsőzetesen, vagy 0 és 10% között gradiens módon. Ez a preparatív célú elválasztás viszonylag

rövid, 100–200 mm-es oszlopokon elvégezhető. A szükséges oldószertérfogatok és az egyes indolvegyületek

retenciós ideje tapasztalati úton állapítható meg (Momonoki et al., 1983; Nonhebel és Bandurski, 1984).

• Az indol-3-ecetsav elválasztása szilárd fázisú extrakcióval

A különféle gyári kiszerelésű, egyszer használatos, eldobható oszlopok széles skálája szerezhető be poláros

szilikagél- vagy apoláros oktadecil-szilán- (ODS-) töltettel. HPLC- vagy GC-analízis előtt használják őket. Jó

hatékonyságuk alapvető feltétele, hogy a következő analitikai lépés elválasztási mechanizmusa eltérjen az itt

használt oszlopétól.

Az ODS-oszlopon történő mintatisztítás egyik lehetősége az oszlop aktiválása 2 ml 1%-os ecetsavval, majd a

növényi mintát 1% ecetsavat tartalmazó, 5-10%-os metanololdatban viszik az oszlopra. A mintában lévő

szennyezőanyagokat a minta oldószerének további részleteivel távolítják el az oszlopról. Az állófázison

megkötődött indolvegyületeket azután 1% ecetsavat tartalmazó, lépcsőzetesen növekvő koncentrációjú (max.

70%-os) metanololdat 2–2 ml-es részleteivel eluálják. Szilikagéltöltet esetében 5 ml 0,5 M-os ecetsavval, azután

5 ml 1% ecetsavat tartalmazó, n-hexán/etilacetát (99:1 térfogatarányú) elegyével kezelve tehetik aktívvá az

oszlopot. A minta felvitele után az indolszármazékok 1% ecetsavat tartalmazó, hexánban oldott növekvő

koncentrációjú (max. 60%-os) etilacetát-oldat 2–2 ml-es részleteivel nyerhetők vissza az oszlopról. Ezek az

oszlopok kevesebb mint 1 g töltetet tartalmaznak, ezért mintabefogadó képességük erősen korlátozott.

• Az indol-3-ecetsav elválasztása HPLC-vel

Fordított fázisú HPLC-rendszerekben az állófázis 5 mm átmérőjű gömb vagy szabálytalan alakú szilikagél

hordozószemcsékhez kémiailag kötött szénhidrogénlánc; alkil- (C2, C6, C8, C18) vagy fenilcsoport. Ezek közül az

oktadecil-szilán (ODS, ill. C18) terjedt el leginkább a gyakorlatban. Az elválasztás során a mozgó fázis lehet

izokratikus (állandó összetételű) és gradiens (az elúció alatt egyre töményebb). Ez utóbbi a csúcselhúzódás

kialakulását gátolja. Az eluens valamilyen szerves oldószer, többnyire metanol, etanol vagy acetonitril vízben,

illetve vizes pufferben oldva.

Az IES állófázishoz való kötődését a mozgó fázis pH-ja nagymértékben befolyásolja. Mivel savas pH-jú

közegben (pH 3,5) az IES karboxilcsoportján lévő hidrogénion nincs disszociált állapotban, tehát a molekula

nem hordoz töltést, jobban kötődik az apoláros állófázishoz és lassabban halad át az oszlopon. Az

indolvegyületeket ezért rendszerint savas pH-jú mozgó fázissal eluálják. Ezt a módszert ion-visszaszorításnak

nevezik. Ha a mozgó fázis pH-ja nem eléggé alacsony, az IES mennyiségének jelentős része ionos állapotba




kerül. Ilyenkor a nem-disszociált és disszociált molekulák retenciós ideje nem egyforma, ami csúcselhúzódást

okoz.

Az IES meghatározását fordított fázisú HPLC-ionpár változatával is végezhetik. Ennél a módszernél a mozgó

fázis pH-ját pufferrel kb. 6,5-re állítják, és hozzáadnak egy lipofil elleniont, pl. tetrabutil-ammonium-ot (TBA+),

amelynek töltése ellentétes az elválasztani kívánt molekula töltésével. Semleges pH mellett az IES disszociált

állapotban van és a poláros mozgó fázishoz kötődik. A TBA+ ellenion jelenlétében azonban IES––TBA+

ionpárok alakulnak ki, amelyek eltérő polaritásuk miatt inkább az apoláros ODS állófázishoz kötődnek, ezáltal

az oszlop IES-visszatartó képessége nagymértékben megnő.

• Az indol-3-ecetsav gázkromatográfiás elválasztása

A gázkromatográfiás elválasztást megelőző lépés a származékképzés. Az IES éterben diazometánnal

metilezhető. A diazometán sárga, erősen mérgező, robbanékony gáz! Éteres oldata N-metilén-N-nitrozo-p-

toluénszulfonamidból Schlenk és Gellerman (1960) módszerével, a Cohen (1984) által kifejlesztett egyszerű

berendezéssel állítható elő. A mintát teljesen megszárítják, azután metanolban feloldják, majd az éteres

diazometánból annyit adnak hozzá, amennyi az oldatot tartósan sárgára színezi. A származékképzés ideje alatt

az éter mennyisége legalább ötszöröse kell, hogy legyen a metanol mennyiségének. A reakció igen rövid idő

alatt végbemegy, tehát 5 perc múlva a reagenst nitrogéngáz átáramoltatása közben eltávolítják.

Az indolvegyületek másik gyakori származékképzési típusa a trimetil-szililezés (TMS), ami többféleképpen

végezhető, ezek közül Badenoch-Jones et al. (1982) módszerét ismertetjük. A száraz mintát kevés metanolban

feloldották, majd üvegfiolába töltötték, amelyben szárazra párolták. Ezután diklór-metánt adva a mintához

azeotropos bepárlással szárították tovább. A származékképző lépésben az előkészített száraz anyagot 30 μl

acetonitril/BSTFA (bisz-trimetilszilil-trifluoracetamid) (1:1 térfogatarányú) elegyében feloldották, a fiolát

lezárták, és 70 °C-on tartották 10 percig. A mintát ezután közvetlenül vizsgálhatták gázkromatográffal, vagy

nitrogén átáramoltatása mellett megszárították és apoláros oldószerben (hexán, etilacetát) feloldották. A TMS-

származékképzés legfőbb nehézségét a mintában nyomnyi mennyiségben jelenlévő víz okozza. Ez gátolja a

származék képződését, valamint elősegíti a szililezett termék bomlását. A TMS-származékokat ezért nem lehet

HPLC-vel tovább tisztítani.

GC-kolonnák és az elválasztás körülményei: Az indolvegyületek gázkromatográfiás elválasztása két különböző

típusú megosztó fázison történhet; a gyakorlatilag apoláros dimetil-szilikon alapú SE-30, OV-101 és DB-1

nedvesítő folyadékokon, valamint a kissé polárosabb OV-7, OV-17, DC-550 és SP-2250 folyadékfázisokon,

amelyek fenil-metil-szilikon és dimetil-szilikon keverékén alapulnak. Mindkét nedvesítőfolyadék-típus alkalmas

szinte az összes indolszármazék vizsgálatára. Nagy csúcskapacitásuk (a kromatográfia során elválasztható

komponensek nagyobb száma) és nagy érzékenységük miatt a kapilláris kolonnák egyre inkább tért hódítanak az

indolvegyületek minőségi és menynyiségi meghatározása terén.

Az IES gázkromatográfiás elválasztására példaként egy Dunlap és Binzel (1996) által közölt módszert

ismertetünk. A megtisztított növényi mintából 2 μl mennyiséget automatikus, megosztás nélküli (splitless)

módszerrel egy 10 m-es, 0,18 mm belső átmérőjű kapilláris oszlopba injektáltak. Az oszlop belső felületét 0,4

μm vastagságú DB-1701 nedvesítőfolyadék-film borította. Az elválasztást 1 ml/perc hélium vivőgáz térfogati

sebesség mellett, 70 kPa oszlopnyomással végezték. Az elválasztás alatt az oszlop hőmérsékleti programja a

következő volt: 0,5 percig 65 °C, majd 15 °C/perc ütemben az értékét 225 °C-ra emelték, amit 3 percig tartottak,

azután 250 °C-ra emelve a hőmérsékletet 5 percig tartották ezt az értéket. Az elválasztás összesen mintegy 20

percet vett igénybe, az IES retenciós ideje ilyen körülmények mellett 11 perc volt.

Az indol-3-ecetsav kvantitatív meghatározása

• Az indol-3-ecetsav meghatározása HPLC-vel

Az IES meghatározása HPLC-vel különböző detektorok (fluoreszcens és elektrokémiai detektorok) segítségével

történhet. A két detektortípus közül a fluoriméterek IES-sel szemben mutatott érzékenysége a jobb (Sandberg et

al., 1987).

A különféle növényi szövetekben az egyes indolvegyületek mennyisége nagymértékben eltérhet. Nagy

különbségek lehetnek az egyéb összetevők koncentrációjában is, amelyektől az elválasztás során meg kell

tisztítani a mintát. Egy új növényi szövet IES-tartalmának meghatározásakor ezért célszerű a tisztítási lépések

több kombinációjának kipróbálása, majd egy HPLC-vel való elválasztás és detektálás után a kérdéses




csúcsokhoz tartozó komponensek felfogása és más független HPLC-módszerrel történő újraelválasztása és

mérése.

Az előkészített növényi minta IES-tartalmát a HPLC-vel történő elválasztás után határozzuk meg, ún. belső

standard hígulási módszerrel. A belső standard radioaktív izotóp atomot tartalmaz, amely vagy az indolváz

ötödik szénatomján lévő trícium (3H) izotóp, vagy a karboxi-metil csoport első vagy második szénatomját

helyettesítő 14C radioaktív izotóp lehet. Először ismert mennyiségű tiszta belső standardot analizálunk HPLC-

vel. A detektor által képzett csúcsot kalibrációs görbéhez hasonlítjuk, a csúcshoz tartozó belső standard IES-t

összegyűjtjük, és folyadékszcintillációs számlálóval megmérjük az oldat radioaktív sugárzásának mértékét. A

következő lépésben az extrahált növényi mintához ismert mennyiségű belső standardot adunk. Az előző

fejezetekben leírt módszereket alkalmazva a mintát tisztítjuk, HPLC-vel elválasztjuk, az IES-t detektáljuk, végül

ennek is mérjük a radioaktív sugárzását, mely kisebb lesz, mint a tiszta belső standardban mért érték. Azért lesz

ez az érték kisebb, mert a minta természetes IES-tartalma és a sugárzó belső standardként hozzáadott indol-3-

ecetsav a HPLC-oszlopon nem válik el egymástól, közös csúcsot képez, mely összegyűjtve, a nem sugárzó,

természetes IES-tartalom miatt, alacsonyabb egységnyi IES-re jutó radioaktív tevékenységet mutat. A növényi

kivonat eredeti, endogén IES-tartalma a következő képlettel számítható ki (Sandberg et al., 1987):

Y = [(Ci /Cf) – 1]X

amelyben

Y: a növényi kivonat IES-tartalma (ng),

X: a mintához adott belső standard mennyisége (ng),

Ci: a tiszta belső standardban mért radioaktív sugárzás (dpm/ng); dpm: percenkénti hasadások száma (=

disintegrations per minute),

Cf: a minta természetes IES-tartalmával hígított belső standard radioaktív sugárzása (dpm/ng).

• Az indol-3-ecetsav meghatározása gázkromatográfhoz kapcsolt tömegspektrométerrel (GC-MS)

A GC-MS hatékony és elterjedten használt eszköz indolvegyületek minőségi és menynyiségi meghatározására.

A kapilláris GC-kolonnák közvetlenül kapcsolhatók tömegspektrométerhez, a töltött kolonnákból kiáramló gázt

azonban előzőleg egy gázelválasztón kell keresztülvezetni, ami a vivőgázt (rendszerint héliumot) eltávolítja a

mintából. Az IES-t és származékait leggyakrabban elektronütköztetéssel ionizálják, 70 eV ionizációs potenciál

energiaszinten. Ilyen ionizáló energia hatására a bázision következetesen a 130 m/z értékkel rendelkező

kvinolínium-ion lesz, mely az oldallánc lehasadásával képződik. A legtöbb szerves molekula ionizálásához

szükséges energiamennyiség mindössze 10 eV (kb. 1000 kJ/mol). Ezen az energiaszinten pozitív molekulaionok

keletkeznek. Ennél nagyobb ionizáló energia következtében a molekula különféle hasadásokat szenved. A

gyakorlatban elterjedt 70 eV hatására a különböző indolvegyületekből a töredékek széles skálája képződik,

amely jellemző az eredeti molekula szerkezetére. Maga az eredeti molekula azonban ilyen magas ionizációs

energiaszinten a töredékképződés miatt gyakran nem is jelenik meg a tömegspektrumban. Ezért olyan

tömegspektroszkópiás vizsgálatokban, amelyekben a molekulaion detektálása is szükséges (pl. egy ismeretlen

vegyület molekulatömegének meghatározása), kíméletesebb ionizációs módszert kell alkalmaznunk. Ez lehet

pozitív vagy negatív kémiai ionizáció, mely érzékenyebb az elektronütköztetéses ionizációs eljárásnál.

Indolszármazékok kémiai ionizálása pozitív töltésű metánionokkal vagy negatív töltést hordozó

ammóniaionokkal 5–10-szer erősebb ionintenzitást eredményez, mint az elektronütköztetéses módszer (Rivier

és Saugy, 1986). A 21. táblázat az IES és származékai tömegspektrumában megjelenő molekula- és

bázisionokat, valamint jellemző töredékeiket tartalmazza.

21. táblázat - Az indol-3-ecetsavnak és különböző származékainak tömegspektrumában

előforduló jellegzetes ioncsúcsok m/z értékei és a bázisionhoz viszonyított relatív

intenzitásuk (zárójelben). IES = = indol-3-ecetsav, Me = metil, TMS = trimetil-szilil,

Mi+(Mi-) = molekulaion, Bi+(Bi-) = bázision.

Elektronütköztetéses ionizáció (70 eV)

IES és A tömegspektrum jellegzetes Irodalom




származékai ioncsúcsai

IES Mi+ 175 (36), 131 (12), Bi+ 130

(100), 103 (11), 77 (13). Vebrel et al.

(1983)

IES Mi+ 175 (33), 131 (12), Bi+ 130

(100), 103 (12), 77 (17). Wurst et al.

(1984)

IES Mi+ 175 (63), 131 (25), Bi+ 130

(100), 103 (19), 77 (26). Feung et al.

(1975)

Me IES Mi+ 189 (30), 131 (12), Bi+ 130

(100), 103 (9), 77 (13). Vebrel et al.

(1983)

Me-TMS IES Mi+ 261 (28), Bi+ 202 (100), 200

(5), 170 (2), 145 (3), 130 (4). Sandberg et

al. (1987)

di-TMS IES Mi+ 319 (47), Bi+ 202 (100), 130

(9), 129 (6), 75 (12), 73 (38). McDougall

és Hillman

(1980)

Pozitív kémiai ionizáció

IES

származékai Reagens

gáz A tömegspektrum

jellegzetes ioncsúcsai Irodalom

Me IES amónia 208 (7), 207 (61), 191

(13), Mi+(Bi+) 190

(100), 130 (10).

Rivier és

Saugy

(1986)

Me IES metán 218 (11), Mi+ 190 (84),

189 (20), 158 (18),

Bi+130 (100).

Rivier és

Saugy

(1986)

Me IES i-bután 228 (3), 191 (12),

Mi+(Bi+) 190 (100), 189

(8), 130 (5).

Rivier és

Saugy

(1986)

di-TMS IES ammónia 393 (4), 392 (16), 323

(7), 322 (25), Mi+(Bi+)

321 (100)

Rivier és

Saugy

(1986)

di-TMS IES metán 348 (17), Mi+(Bi+) 320

(100), 304 (15), 230

(1), 202 (3).

Badenoch-

Jones et al.

(1984)

Negatív kémiai ionizáció

IES

származékai Reagens

gáz A tömegspektrum

jellegzetes ioncsúcsai Irodalom

Me IES ammónia 189 (15), Mi–(Bi–) 188

(100), 175 (3), 174 (1),

161 (29).

Rivier és

Saugy

(1986)

Me IES metán Mi–(Bi–) 188 (100). Rivier és




Saugy

(1986)

Me IES i-bután 194 (60), Mi–(Bi–) 188

(100), 178 (48), 162

(50), 150 (67).

Rivier és

Saugy

(1986)

di-TMS IES ammónia 389 (12), Mi–(Bi–) 319

(100), 299 (11), 289

(9), 213 (8).

Rivier és

Saugy

(1986)

3.2. A gibberellinek meghatározása

A gibberellinek meghatározásakor a fő nehézséget az jelenti, hogy a növényekben nagyon sok gibbánvázas

vegyület fordul elő, amelyek egymástól csak kis szerkezeti eltéréseket mutatnak, a szövetekben lévő összes

koncentrációjuk mégis igen alacsony. A gibberellinek többségének molekulaszerkezetére az erősen oxidált

funkcionális csoportok nagy száma jellemző, ami stabilitásukat lényegesen csökkenti. Ezért tisztításuk és

elválasztásuk során célszerű a 2,5–8,5 pH tartományon belül maradni és vizes oldatban 40 °C alatti

hőmérsékleten dolgozni. A gibberellintartalmú növényi kivonatok és a különböző tisztítási lépéseken átesett

minták mélyhűtőben lefagyasztva, –20 °C-on tárolhatók.

A gibberellinek kivonása növényi mintákból

A különböző növényi szervek és szövetek gibberellintartalma nagy különbségeket mutathat. A termésekben lévő

magok gibberellintartalma például 1000-szerese is lehet a vegetatív részek hormontartalmának, amit a

gibberellinek tisztítása során figyelembe kell venni.

A gibberellinek kivonását leggyakrabban tiszta hideg metanollal vagy metanol 80%-os vizes oldatával végzik.

Egységnyi tömegű növényi mintát 4–5-szörös térfogatú kivonószerrel homogenálnak, majd 4 °C-on több órán át

állni hagynak. A folyadék és szilárd fázist ezután szűréssel szétválasztják és a szilárd növényi maradékot újra

extrahálják. A két extrahálószer-részletet egyesítik, a metanolt azután vákuumban 40 °C alatti hőmérsékleten

bepárolják.

A gibberellinek tisztítása

• Folyadék–folyadék-megoszláson alapuló tisztítás

Az extrakciót követő bepárlás maradékát, a gibberellint tartalmazó vizes fázist 0,1 M-os foszfátpufferben oldják.

A pH értékét 2,5-re kell beállítani. Az első oldószeres kirázási lépésben a vizes fázissal megegyező térfogatú

etil-acetáttal háromszor kirázzák a gibberellintartalmú oldatot, ami a legtöbb gibberellin típusú molekulát átoldja

a szerves fázisba ezen a pH értéken. A következő lépésben gyengén lúgos (pH 8,5) foszfátpuffer egyenlő

térfogatú egységeivel ismét háromszor rázzák ki a szerves gibberellintartalmú oldatot, ez a lúgos pH miatt

disszociációra készteti a gibberellineket, ami poláros jelleget kölcsönöz a molekuláknak, tehát poláros-vizes

fázisba viszi a gibberellinsavakat. A vizes gibberellinoldat pH-ját ezután ismét 2,5-re állítják, és etil-acetát

egyenlő térfogatú mennyiségeivel újra szerves fázisba viszik a gibberellineket. Végül a szerves fázisban

nyomokban előforduló foszforsav eltávolítása érdekében 2,5-ös pH-érték mellett, négyszer 5 térfogat% vízzel

mossák a gibberellint tartalmazó etilacetát-fázist, mert az elkövetkező bepárlás során az oldatban maradt

foszforsav betöményedik és szélsőséges pH-viszonyokat eredményez.

• Fenolok eltávolítása polivinil-pirrolidonnal

A folyadék–folyadék-megoszlásos módszerrel nyert gibberellintartalmú oldatot leggyakrabban szennyező

vegyületek a zsírsavak, a fenolok és a cukrok. A fenolok (főleg pigmentek) stabil komplexet képeznek a

gibberellinekkel. A polivinil-pirrolidon (PVP) azonban jó hatékonysággal köti meg a fenolokat, ezért hormonok

tisztítása során gyakran használják. Az etil-acetátban oldott, majd bepárolt frakciót 0,1 M-os foszfátpufferben

(pH 8,5) feloldják, azután egy 0,5–1,0 g PVP-vel töltött rövid oszlopra töltik. Az elúciót az oszloptérfogat

kétszeresének megfelelő mennyiségű oldószerrel (foszfát-pufferrel) végzik. A fenolok kötődése fokozható a

töltet savanyú (pH 3,0) pufferrel való előmosásával.

• A gibberellinek tisztítása szilárd fázisú extrakcióval




A gibberellintartalmú növényi kivonatok kis mennyiségeinek gyors és jó minőségű elválasztása valósítható meg

egyszer használatos, eldobható oktadecil-szilán (fordított fázisú) oszlopokon. Az oszlop előkészítését 5 ml

metanollal, majd 5 ml 5%-os ecetsavval mosva (fecskendővel injektálva) végzik. A növényi kivonatot 0,1 M-os

foszfát-pufferben (pH 2,5) juttatják az oszlopra, ezt is injektálva. A rendszert ezután 5 ml 5%-os ecetsavval,

majd 5 ml desztillált vízzel mossák. A gibberellineket végül 80%-os metanollal viszik ismét oldatba és

távolítják el az oszlopról.

• A gibberellinek tisztítása anioncsere-kromatográfiával

Anioncserélő oszlopon (DEAE-Sephadex A-25, Dowex 1X1-100) a gibberellinek csoportja hasonló

saverősségük miatt egyöntetűen elválasztható. Az egyik lehetőség a 0,2 M-os ecetsav-metanol 1:1

térfogatarányú elegyében feloldott növényi mintát acetát típusú Sephadex anioncserélő oszlopra vinni, az

oszlopot az oldószer azonos térfogatú mennyiségeivel négyszer mosni, majd a gibberellineket 2

térfogategységnyi 2 M-os ecetsav/metanol 1:1 arányú elegyével eluálni (Crozier és Durley, 1983). A másik

bevált módszer a Dowex 1X1-100 anioncserélő gyantával töltött oszlopon való elválasztás (Browning és

Saunders, 1977). A vizes növényi kivonatot (pH 8,0) az oszlopra viszik, amit azután vízzel mosnak, végül

etanol/1M-os hangyasav (4:1 térfogatarányú) elegyével eluálják a gibberellineket. Az anioncsere-kromatográfiát

követő szilárd fázisú extrakció (ODS-oszlopon) két lépésben jobb megoldás, mint a folyadék–folyadék-

megoszláson alapuló kirázás.

A gibberellinek elválasztása

A gibberellineket tisztításuk során hasonló szerkezetük miatt egy csoportként kezeltük, elválasztásukkor

azonban az egyes gibberellinvegyületeket különválasztjuk egymástól.

• Vékonyréteg-kromatográfia

A kereskedelmi forgalomban kapható kész szilikagélrétegek, pontosan beállított oldószerek használata mellett,

megfelelnek a gibberellinek elválasztására (MacMillen és Suter, 1963). Felbontóképességükben és a

szétválasztott gibberellinek visszanyerhetősége tekintetében azonban elmaradnak a HPLC-től. A

szilikagélrétegen való elválasztás rendszerint savas kémhatású oldószerben (ecetsav- vagy hangyasavoldatban)

történik, ami biztosítja a gibberellineken lévő karboxilcsoport protonált állapotát. Ezáltal javul a gibberellinek

mobilitása és a komponensek élesebb sávban válnak el egymástól. A gibberellinek etil-acetát telített vizes

oldatával vagy acetonnal eluálhatók a rétegről.

• A gibberellinek elválasztása HPLC-vel

A HPLC a mintaösszetevők elválasztásának igen jó hatékonysága mellett, a retenciós értékek pontos

megismételhetőségében és az elválasztás kis időigényében is felülmúlja az egyéb kromatográfiás módszereket.

Az oszlop töltete rendszerint 5–10 μm nagyságú szabálytalan vagy gömb alakú szilikagél hordozószemcsékből

áll, amelyhez valamilyen funkciós csoportot kötnek állófázisként. A funkciós csoport lehet poláros karakterű

(normál fázisú HPLC), vagy egy hosszabb, apoláros szénhidrogénlánc (fordított fázisú HPLC). A minta a

mozgó fázisban feloldva jut az oszlopra, 40 MPa körüli magas nyomáson, amit egy pumpa biztosít. A preparatív

célra használt HPLC-oszlopok általában 5–10 mm belső átmérőjűek, de nagy mennyiségű mintákhoz nagyobb

méretű kolonnák is szóba jöhetnek.

A mozgó fázis rendszerint metanol vagy etanol vizes oldata, amely kis mennyiségben (kb. 50 μl/l) tartalmaz

valamilyen savat (foszforsavat, ecetsavat vagy hangyasavat), biztosítva a gibberellinek protonált állapotát.

Jensen et al. (1986) a gibberellinek széles skáláját választották el, és mérték a retenciós idejüket egy 250 x 4,6

mm belső átmérőjű 5 μm szemcseméretű Supercosil LC18 fordított fázisú HPLC-oszlopon. A mozgó fázis 1

ml/perc folyadékáramlási sebességű izokratikus metanololdat volt, kémhatását foszforsavval állították be (pH

3,0).

• A gibberellinek gázkromatográfiás elválasztása

Származékképzés: A gibbánvázon lévő karboxilcsoport(ok) diazometánnal metil-észterré alakítható(k). A

diazometánnal veszélyessége miatt csak elszívófülke alatt lehet dolgozni. A metilezésre szánt mintát metanolban

oldják, majd az éteres diazometán-oldatot cseppenként adagolva végbemegy a metileződés folyamata. A

reagenscseppek hozzáadását akkor hagyják abba, amikor az elegyből nem szabadul már fel további nitrogén, és

az oldat megtartja sárga színét. A felesleges diazometán néhány perc elteltével eltávolítható az oldat szárazra

párlásával nitrogén alatt. Nagy mintamennyiség esetén a felesleges diazometán ecetsavval elbontható és az oldat

szárazra párolható. A metil-észterré alakított gibberellinek kevésbé polárosak, mint a szabad gibberellinsavak,




ezért a nem metileződött frakció eltávolítható, ha a kivonatot valamilyen viszonylag apoláros oldószerben (pl.

diklórmetánban) feloldjuk, majd egy tiszta üvegcsébe töltjük. A minta ebben a formában is használható

gázkromatográfiás elválasztásra, de a gyakorlatban többnyire még egy származékképző lépést beillesztenek,

trimetil-szilil-éterré alakítva a hidroxilcsoportot tartalmazó gibberellineket. Ez a lépés a gibberellin-metil-

észterek polaritását tovább csökkenti, valamint a tömegspektrométer által képzett spektrumban javítja a

molekulacsúcsok intenzitását. A trimetil-szililezésre használt két leggyakoribb reagens a BSTFA (bisz-trimetil-

szilil-trifluoracetamid) és az MSTFA (N-metil-O-trimetil-szilil-trifluoracetamid). A növényi mintakivonat kis

mennyiségeit üvegcsébe töltik és nitrogén alatt vagy deszikkátorban alaposan szárazra párolják. Ez azért

elengedhetetlenül szükséges, mivel mind a reagensek, mind a kész trimetil-szilil-származékok nedvesség

hatására bomlanak. Az üvegcsék lezárása után a reakcióelegyek hőmérsékletét 90 °C-ra emelik, és ezen tartják

30 percig. A BSTFA és az MSTFA egyaránt illékony vegyületek, ezért a GC-kolonnán jól elválnak a

meghatározni kívánt gibberellinektől, de vákuum alatt deszikkátorban is elpárologtathatók és más illékony,

nedvességnyomoktól mentes oldószerrel helyettesíthetők.

GC-kolonnák és az elválasztás körülményei: A gibberellinek elválasztására leginkább a kvarc kapilláris

oszlopok felelnek meg. Hedden (1987) metil-TMS gibberellinszármazékokat analizált kapilláris kolonnán (25 m

× 0,2 mm i.d.), ami kb. 0,3 μm vastagságú BP-1 – kémiailag kötött – apoláros megosztó fázissal volt bevonva.

A kolonna az injektálást követő 1 percig 60 °C-os volt, majd 240 °C-ig 20 °C/perc, 300 °C-ig 4 °C/perc

intenzitással emelték a hőmérsékletet. A hélium-vivőgáz nyomása 90 kPa volt. Az ilyen típusú oszlop

mintakapacitása erősen korlátozott (kb. 0,1 μg). A gibberellinek gázkromatográfiás analízisére a hagyományos

GC-detektorok nem alkalmasak, tömegspektroszkópiás detektálásuk terjedt el.

A gibberellinek mennyiségi meghatározása

• A gibberellinek GC-MS analízise

A gibberellinek GC-MS mennyiségi vizsgálatát többszörös ionmegfigyeléssel (multiple ion monitoring; MIM)

végzik, amelyben a tömegspektrométer a teljes spektrum felvétele helyett csak néhány, az adott vegyületre

nagyon jellemző töredékion intenzitását méri. Két mintában lévő azonos gibberellinvegyület relatív mennyisége

a molekulacsúcsok abszolút értékeinek összehasonlításával kapható meg, ha azonban a molekulacsúcs

intenzitása nagyon kicsi, az összehasonlítás valamelyik jellegzetes töredékion értéke alapján is elvégezhető. A

gibberellinek extrakciós, tisztítási és elválasztási veszteségeit belső standardok felhasználásával lehet korrigálni,

amit rögtön a szövet eldörzsölése után kell a mintához adni. Célszerű olyan standard vegyületet választani, ami

kémiailag nagyon hasonló a vizsgált gibberellinmolekulához. A tömegspektrométer a részecskéket tömegük

alapján választja szét, ezért GC-MS vizsgálathoz használhatunk (nem radioaktív) nehéz izotóppal jelzett

gibberellin-analógokat, amik a növényben lévő gibberellin molekuláktól mindössze annyiban különböznek,

hogy vázukban egy, illetve néhány H-, C- vagy O-atomot 2H-, 13C- vagy 18O-izotóp helyettesít. Megbízható

eredményt kalibrációs görbe segítségével kaphatunk. Ennek lényege az, hogy a belső standardként használt

szintetikus gibberellin-analóg vegyületből és magából a vizsgált gibberellinhormonból olyan oldatsorozatot

készítenek, amelynek tagjai a két komponenst különböző arányban tartalmazzák. (Például 0,0; 0,05; 0,1; 0,25;

0,5; 1,0; 2,0 mól gibberellin/mól belső standard gibberellin-analóg sorrendben.) Az oldatsor tagjait ezután

tömegspektrométerrel analizálják, megkapva így az egyes mólarányokhoz tartozó csúcsintenzitás-arányokat,

majd az értéksorhoz görbét illesztenek. A belső standardot tartalmazó minták mérése során kapott

csúcsintenzitás-arány alapján a kalibrációs görbe segítségével meghatározható a minta gibberellin/belső

standard gibberellin-analóg mólaránya, amiből a kérdéses gibberellin fiziológiás mennyisége kiszámítható, mert

a hozzáadott belső standard mennyisége általunk választott, ismert érték.

• A gibberellinek kvantitatív szerológiai meghatározása

A növényekben található gibberellinek széles skálája miatt szerológiai meghatározásuk nagy körültekintést

igényel. A vizsgálathoz használt antiszérum szelektivitása alapvető fontosságú. Atzorn és Weiler (1983) a

gibberellinek (G3, G4 és G7) rendkívül érzékeny mennyiségi meghatározására alkalmas (0,2–0,5 pg

küszöbértékű!) kompetitív ELISA-módszert fejlesztettek ki. A liofilezett antiszérumokat 50 mM NaHCO3-t

tartalmazó oldatba (pH 9,3) vitték, a G3-ra specifikus IgG-antiszérumot 10 mg/l hígításban, a G4 és G7-re

specifikus IgG-t pedig 25 mg/l hígításban alkalmazták. A mikrotálca üregeibe 0,2 ml antiszérumoldatot mértek,

majd 3 napon keresztül, 4 °C-on inkubálták. Az IgG-oldatot ezután leöntötték, az üreg falához nem kötődött

IgG-molekulák maradékát háromszori desztillált vizes mosással távolították el, az így érzékenyített

mikrotálcákat legalább két hétig lehetett tárolni 4 °C-on. Az érzékenyített üregekbe a következőkben bemérték a

kompetíciós elegyet, ami 50 μl TBS- (Tris-buffered saline) puffert [50 mM 2-amino-2-(hidroximetil)-1,3-

propándiol (=Tris), 1 mM MgCl2, 0,01 M NaCl, pH 7,5], 100 μl standard gibberellinoldatot vagy megfelelően

hígított növényi extraktumot és 50 μl TBS-pufferben oldott gibberellin-alkalikus-foszfatáz konjugátumot




tartalmazott. A kompetíciós elegyben vetélkedés folyt az alkalikus-foszfatáz jelzőenzimhez kötött

gibberellinmolekulák és a mintában, ill. a standard oldatban található gibberellinek között az IgG-kötőhelyekért.

Amennyivel magasabb volt a növényi mintában a kérdéses gibberellinvegyületek (G3, valamint G4 és G7) szintje,

annyival több kötődött belőlük az üreg falán található specifikus helyekre, visszaszorítva az alkalikus-

foszfatázzal jelölt gibberellinmolekulák megtapadását. Az ELISA-tálcákat ezután 16 órán át 4 °C-on inkubálták,

majd a folyadékot leöntötték és a lapokat desztillált vízzel ismét háromszor mosták. Az utolsó lépésben a

jelzőenzim szubsztrátját, a p-nitrofenil-foszfátot – üregenként 0,2 ml oldatot – mértek az egyes reakcióterekbe

(1 mg/ml szubsztrát 50 mM-os NaHCO3 oldatban, pH 9,6). A mikrotálcákat ezt követően 6 órán át 37 °C-on

tartották, míg az enzim által katalizált színreakció – ami sárga színt eredményez – ki nem fejlődött. Az

üregekben lévő folyadék színintenzitása arányos a reakcióterek falához kötött alkalikus-foszfatáz-gibberellin

konjugátum mennyiségével és fordítottan arányos a növényi minta, ill. standard oldat gibberellintartalmával. A

reakciót 50 μl 5 M-os KOH-oldattal állították le, abszorbanciáját (A: 405 nm) ELISA-mikrotálcák mérésére

használt spektrofotométerrel állapították meg. A gibberellin standard hígítási sorának abszorbanciaértékei

alapján kalibrációs görbe szerkeszthető, ami lehetővé teszi a növényi minták gibberellintartalmának

meghatározását.

3.3. A citokininek meghatározása

A citokininek kivonása növényi mintákból

A citokininek extrakciójának hagyományos módszere szerint a növényi mintát 80%-os hideg metanolban

homogenálják, majd a citokinineket tartalmazó oldószert bepárolják. Ez a kivonási módszer azonban magas

foszfatáz-aktivitással jár együtt, ezért a citokinin-nukleotidok nagy része elbomlik. Bieleski (1964) extrakciós

módszerével a növényi foszfatázok aktivitása gátolható: a mintát folyékony nitrogénben megfagyasztjuk, majd

metanol/kloroform/90%-os hangyasav/desztillált víz (12:5:1:2 térfogatarányú) elegyében 18 órán keresztül –15

°C-on tartjuk. A kivonószert többrétegű gézen leszűrjük, és a növényi szövetet hideg metanol/90%-os

hangyasav/desztillált víz (6:1:4) elegyében homogenáljuk, azután –15 °C-on, 4 órán át tároljuk. A felülúszót

többrétegű gézen, majd szűrőpapíron leszűrjük és egyesítjük az előző extrakciós lépés kivonószer-elegyével. A

minta kezdeti folyékony nitrogénben való megfagyasztása fontos része a kivonási módszernek.

A citokininek elválasztása

• Folyadék–folyadék-megoszláson alapuló elválasztás

A bázikus citokininek (szabad bázisok, ribozidok és glükozidok) 1-butanollal kirázva a szerves fázisba oldódnak

át, miközben a citokinin-nukleotidok a vizes fázisban maradnak. A pH-t 7,0 és 8,2 közötti értékre kell beállítani,

hogy a bázisok a kevésbé poláris protonált állapotban legyenek. Lehetséges, hogy 1-butanol esetében az első

kirázás alkalmával a két fázis nem válik el rögtön, akár egy éjszakát is igénybe vehet a szerves és vizes fázis

kialakulása.

• A citokininek ioncsere-kromatográfiás elválasztása

Kationcserélő oszlopon a bázikus citokininek eredményesen tisztíthatók. A vizes növényi kivonatok pH-ját

ecetsavval beállítjuk (pH 3,0), majd azonos pH-jú NH4+ típusú cellulóz-foszfát-oszlopon tisztítjuk. Az oszlopot

pH 3,0-ra beállított ecetsavoldattal mossuk, amely a citokinin-nukleotidokat eltávolítja az oszlopról. A

következő lépésben a pozitív töltésű molekulákat (így a bázikus citokinineket is) 2 M-os ammónium-hidroxid-

oldattal választjuk le az oszlopról.

• A citokininek elválasztása HPLC-vel

Számos kvantitatív vizsgálati módszer előtt (tömegspektrometria, immunanalitikai mérések stb.) jó

hatékonysággal alkalmazható, nagy mintakapacitással rendelkező citokinintisztítási eljárás. Az oktadecil-szilán-

(ODS) töltetek elterjedése nagymértékben hozzájárult a HPLC-citokininek elválasztása terén elért sikeréhez. A

citokininek preparatív célú elválasztására egy 150 × 10 mm i.d., fordított fázisú HPLC-oszlop, 1 ml injektálható

mintakapacitással jól megfelel. Mozgó fázisként 5 ml/perc áramlási sebességű acetonitril (7–11%-os)

egyenletesen növekvő koncentrációjú, gradiens oldata vált be, előzetesen TEAB-bal (trietil-ammónium-

hidrogénkarbonát) a pH-ját semlegesre állítva.

• A citokininek gázkromatográfiás elválasztása




Származékképzés: A bisz-(trimetil-szilil)acetamid (BTMSA) kétszeres mennyiségű acetonitrilben feloldva 60

°C-on, 5 perc alatt trimetil-szilil (TMS)-származékká alakítja a vizsgált citokinineket (izopentenil-adenin,

zeatin, izopentenil-adenin-ribozid, zeatin-ribozid). Elterjedtebb azonban a bisz-(trimetil-szilil)trifluoracetamid

(BSTFA) származékképző reagens alkalmazása. Számos oldószerben (piridin, dimetil-formamid, acetonitril)

feloldva használják, szobahőmérséklettől 120 °C-ig, 30 perc reakcióidő-tartamtól több óráig, a

reakciókörülmények széles skáláját alkalmazva. A TMS-származékképzés legfőbb hátránya, hogy az egyes

citokininek gyakran többféle származékot is képeznek a reakció során – pl. a zeatin kétszeresen és

háromszorosan, a zeatin-ribozid négyszeresen és ötszörösen szubsztituált származékok képzésére is hajlamos –,

a reakció körülményeitől függően. Úgy tűnik, hogy a szobahőmérsékleten (néhány órán keresztül) végzett TMS-

származékképzés és a minta gondos kiszárítása (hogy vizet még nyomokban se tartalmazzon) következetesen a

legkevésbé szubsztituált származék képződését eredményezi.

A permetil-citokinin-származékok képzése jóllehet bonyolultabb, mint a TMS-származékoké, mégis számos

előnyük van azokkal szemben: nem bomlékonyak, ezért HPLC-vel vagy más elválasztási módszerrel tovább

tisztíthatók, és nem képeznek többféle szubsztituált származékot. A permetilezés folyamata során a

citokinineket egy erős bázissal, azután metil-jodiddal reagáltatjuk. A bázisok közül a metil-szulfinil anion vált

be, melyet kálium-t-butoxid és száraz dimetil-szulfoxid reakciójával állítunk elő. A kálium-t-butoxid hozzáadása

után az elegyet nitrogén alatt 10 percig kevertetjük, majd centrifugálással tisztítjuk. A szulfinil-anion-

koncentrációt sósavval titrálva – fenolftalein indikátor jelenlétében – határozzuk meg. A gyakorlatban leginkább

bevált aniontartalom kb. 0,1 M, amihez 20 mg kálium-t-butoxid szükséges 1ml dimetil-szulfoxidban feloldva. A

néhány μg tisztított és szárazra bepárolt mintát 50 μl metil-szulfinil aniont tartalmazó reagenssel visszük ismét

oldatba. Ezután 10 μl metil-jodidot adunk az oldathoz, szobahőmérsékleten 30 percig inkubáljuk, majd 50 μl

desztillált vízzel hígítjuk, végül a permetilezett citokinineket átoldjuk 100 μl kloroformba. A mintát nitrogéngáz

átáramoltatása mellett szárazra pároljuk, szükség esetén vákuumdeszikkátor alatt tovább szárítjuk.

GC-kolonnák és az elválasztás körülményei: A citokinin-származékok gázkromatográfiás elválasztására

apoláros, magas hőmérsékleten is stabil megosztó fázissal rendelkező oszlopokkal dolgoznak (pl. SE-30, SE-52,

OV-1, OV-17). A tapasztalatok szerint egy 1,5 m × 4 mm i.d., 100–120 mesh szemcseméretű, 3%-os OV-1

nedvesítőfolyadék-filmmel bevont Gas Chrom Q hagyományos töltött kolonna jól bevált. Az elválasztás

hatékonysága tovább fokozható, ha kapilláris kolonnát használunk (pl. SGE 25QC2/BP 10–0,25), amelynek

mérete 25 m × 0,2 mm i.d.. Ez az oszloptípus kiválóan bontja fel a TMS és a permetilezett citokinin-

származékokat. Használatakor az ajánlott felső hőmérsékleti határ: 270 °C. A citokinin-származékok

elválasztásának mindennapi gyakorlatához jól megfelel egy rövidebb, szélesebb kapilláris kolonna is (12 m ×

0,3 mm i.d.), nagyobb hőstabilitású nedvesítő folyadékkal párosítva (SGE BP-1 vagy BP-5). Ez a kolonna a

citokininek gyorsabb elválasztását teszi lehetővé, és felbontóképessége is még elég jó. Az oszlop 80 kPa

héliumvivőgáz-nyomás mellett működtethető, de nagy molekulasúlyú anyagok gyorsabb elválasztására a

nyomást, legfeljebb 200 kPa-ig, emelni lehet (Horgan és Scott, 1987).

A citokininek mennyiségi meghatározása

• A citokininek GC-MS analízise

A gázkromatográffal elválasztott különféle citokininek (citokinin-származékok) a tömegspektrométer ionizációs

kamrájában töredékekké (fragmentumokká) alakulnak. A különböző citokininek azonos körülmények között

végzett ionizáció hatására, egyedi molekulaszerkezetüknek megfelelően, következetesen ugyanazokra az

ionizált töredékek-re hasadnak, az egyes töredékek képződésének arányát is megőrizve. Tehát egy adott

szerkezetű citokinin-molekula azonos ionizáló energia hatására megismételhető módon ugyanazt a

tömegspektrumot adja.

Az elválasztott vegyületek ionizálását többnyire gáz halmazállapotban, elektronok-kal ütköztetve végzik.

Változtatva az ütköző elektronok energiáját, különböző energiamennyiséget közölhetünk a vizsgálandó

molekulákkal, aminek következtében azok hasadásokat szenvednek (különféle töredékeket képezve). Az

ionizálás további lehetősége a kémiai ionizáció, ami kíméletesebb az elektronütköztetésnél. Citokininek kémiai

ionizálására leginkább megfelelő reagens ion az NH4+, amely csak fokozatosan veszít energiájából a minta

molekuláival való sokszoros ütközés során. Így nem a minta egyetlen molekulája veszi fel a teljes

energiamennyiséget, ezért a vizsgált molekulák kevésbé töredeznek.

A tömegspektrumot koordináta-rendszerben ábrázolva a vízszintes tengelyen szerepel az ionizált molekula,

illetve a molekulatöredékek tömegének és töltésének hányadosa (m/z érték). Rendszerint egyszeres töltéssel

rendelkező ionok keletkeznek, ezért a különböző molekula- és molekulatöredék-ionok m/z értékét csak a

tömegük befolyásolja. A függőleges tengelyen az ionizált részecskék előfordulásának egymáshoz viszonyított




relatív gyakoriságát, intenzitását ábrázoljuk (0 és 100% között). Így egy citokinin-vegyület tömegspektrumát

tekintve (97. ábra) az egymást követő függőleges vonalak az egyes töredékekre vonatkoznak – növekvő

részecsketömegüknek megfelelő sorrendben elhelyezkedve –, a vonalak magassága pedig az ionizált töredékek

egymáshoz viszonyított relatív mennyiségét jelöli. A vízszintes tengelyen az origótól legtávolabbra eső vonal az

eredeti molekula ionizációjával képződő (tehát hasadást nem szenvedő) molekulaiont ábrázolja, amelynek

tömege egyenlő a minta nem ionizált molekulájának tömegével. Azt az iont (töredéket), amely a fragmentumok

között a legnagyobb mennyiségben van jelen, tehát amely a legintenzívebb (legmagasabb) spektrumvonalat

mutatja, bázisionnak nevezzük, és a függőleges tengelyen feltüntetett skála alapján ezt jelöljük 100%-kal. Az

összes többi fragmentum mennyiségét ehhez viszonyítjuk.

97. ábra - A zeatin (Z) elektronütköztetéses tömegspektruma (a spektrumban csak a

legjellegzetesebb fragmentumok szerepelnek). Bi+ = bázision; Mi+ = molekulaion; R.I.

= relatív intenzitás; m/z = tömeg/töltés arány

Egy adott citokinin (pl. zeatin) különböző mintákban vizsgálva azonos ionizáló energia hatására ugyanazt a

spektrumot hozza létre. Két minta zeatinkoncentráció különbségét a bázision vagy más megfelelő töredékion

abszolút intenzitásának összehasonlításával kaphatjuk meg. Mivel elvileg minden ion abszolút intenzitása

arányos a mintában jelen lévő vegyület mennyiségével, ezért az ismert m/z érték alapján akár mindössze egy

töredékion (vagy a molekulaion) mérésével is meghatározhatjuk a vizsgálni kívánt hormonvegyület

koncentrációját (tehát nincs szükség teljes tömegspektrumra). Ezt a módszert szelektív ionmegfigyelésnek

(selective ion monitoring; SIM) nevezzük. Különösen kisebb tömegű töredékek esetében előfordulhat azonban,

hogy egyéb – szennyező anyagból származó – azonos tömegű töredékion jelenléte torzítja (látszólagosan növeli)

a kiválasztott ion intenzitását, és ez egyéb fragmentumok vizsgálata hiányában rejtve marad. Ezért SIM-

vizsgálatkor igyekeznek minél nagyobb tömegű és minél egyedibb (csak az adott citokininre jellemző) töredéket

kiválasztani. Ez a hibaforrás kiküszöbölhető úgy, hogy egyszerre több jellemző töredékion intenzitását mérik

(multiple ion monitoring; MIM), így a normális hasadási aránytól esetleg eltérő, relatív töredékion-intenzitásra

rögtön fény derül.

Akár teljes tömegspektrumot vizsgálunk, akár SIM- vagy MIM-módszerrel dolgozunk, a mintában egy adott

citokinin tényleges koncentrációját kalibrációs görbe segítségével állapíthatjuk meg. Célravezetőbb azonban, ha

a tisztítási műveletek megkezdése előtt ismert mennyiségű hormon-analóg vegyületet, belső standardot mérünk

a mintához. Erre a célra 2H vagy 15N izotóppal egyszeresen vagy többszörösen jelzett citokinin-vegyületeket

használnak. A meghatározás utolsó lépésében – a tömegspektroszkópiás detektálás során – a tömegspektrométer

analizátora, az izotópatomok nagyobb tömege miatt, elválasztja egymástól a mintában természetesen jelenlévő

citokinin-vegyületből származó töredékeket és az izotóppal jelzett belső standard töredékeit. A

tömegspektrumban így számos fragmentumnak megtalálható lesz az izotóppal jelzett párja. Egy töredéknek és

izotóppal jelzett párjának a relatív intenzitáskülönbsége alapján – a bemért belső standard ismert koncentrációja

miatt – kiszámíthatjuk a minta fiziológiás hormontartalmát, kiküszöbölve a minta-előkészítés során bekövetkező

veszteségeket is! A leggyakrabban használt belső standardok az N6 oldallánc első szénatomján két 2H-atomot

vagy a két terminális szénatomon öt 2H-atomot hordozó deutériummal jelzett, illetve a purin váz négy

nitrogénatomját 15N izotóppal helyettesítve kapott szintetikus citokininek. A SIM-módszer nyilvánvalóan nem




alkalmas arra, hogy egyszerre vizsgáljuk egy természetes citokinin-vegyület töredékének és izotóppal jelzett

analógjának mint belső standardnak az intenzitását.

A trimetil-szilil- és permetilszármazékok képzése nem befolyásolja a belső standardok alkalmazását. Az

izotópos belső standardok használata során két tényezővel számolnunk kell, amelyek zavarhatják a

tömegspektrométerrel való mennyiségi meghatározást. Egyrészt a növényi minta természetes citokinin-

vegyületei is tartalmazhatnak izotópatomokat, amelyek a tömegspektrumban látszólagos növekedést okozhatnak

a belső standard intenzitásában. Célszerű ezért minél több izotópatomot tartalmazó hormon-analógot választani,

tehát például két 2H helyett inkább öt 2H-t tartalmazó szintetikus citokinineket használni, mert ezek tömege több

egységgel haladja meg a nehéz izotópot nem tartalmazó, illetve egy-két nehézizotóp-atomot tartalmazó

természetes citokininek tömegét, tehát a spektrumban jobban elkülöníthetőek.

Hasonló problémát okoz az is, ha a belső standardként használt, jelzett vegyületünk számottevő mennyiségben

tartalmaz izotóppal nem jelzett hormonmolekulákat, amelyek a tömegspektrometriás vizsgálat során nem

választhatók el a mintában jelen lévő (meghatározni kívánt) citokininektől. A belső standard kiváló minősége

tehát alapvető feltétele a megbízható kvantitatív vizsgálati eredményeknek.

A citokininek és származékaik elektronütköztetéssel nyert fontosabb töredékeit a 22. táblázat tartalmazza

(Horgan és Scott, 1987).

22. táblázat - Citokininvegyületek és származékaik elektronütköztetéses

tömegspektrumát alkotó fontosabb ioncsúcsok m/z értékei és relatív intenzitásuk a

bázision százalékában (zárójelben). iP = izopentenil-adenin, [9R]iP = izopentenil-

adenin-ribozid, Z = zeatin, [9R]Z = zeatin-ribozid, TMS = trimetil-szilil, perMe =

permetil, Mi+ = molekulaion, Bi+ = bázision.

Citokinin vagy

citokinin-

származék típusa A tömegspektrumban megjelenő jellegzetes ioncsúcsok

iP Mi+ 203 (54), 188 (65), 161 (13), 160 (96), 148 (17),

136 (15),

Bi+ 135 (100), 119 (22), 108 (33), 93 (10), 84 (18).

[9R]iP Mi+ 335 (22), 203 (60), 202 (22), 188 (51), 161 (12),

160 (80), 148 (23),

136 (27), Bi+ 135 (100), 119 (21), 108 (27).

Z Mi+ 219 (20), Bi+ 202 (100), 201 (41), 188 (75), 186

(28), 160 (50),

136 (53), 135 (37), 120 (25), 119 (39), 108 (32).

[9R]Z Mi+ 351 (8), 201 (95), 200 (61), 199 (86), 198 (50), 188

(53), 160 (60),

148 (40), 136 (60), Bi+ 135 (100), 119 (46).

di-TMS iP Mi+ 347 (24), 332 (38), 305 (22), 304 (83), 274 (20),

264 (30), 247 (22),

207 (30), 192 (15), 160 (14), 135 (15).

tri-TMS [9R]iP Mi+ 551 (13), 245 (21), 232 (51), 230 (25), 217 (24),

204 (10), 203 (27),




202 (25), 188 (10), 160 (15), 147 (15), 103 (30).

di-TMS Z Mi+ 363 (6), 348 (15), 274 (39), 273 (51), 272 (26), 260

(70), 258 (17),

232 (28), 192 (21), 188 (17), 156 (36).

tri-TMS Z Mi+ 435 (6), 420 (14), 347 (20), 346 (72), 332 (27), 306

(11), 305 (16),

304 (61), 272 (15), 264 (19), 156 (11).

tetra-TMS [9R]Z Mi+ 639 (3), 536 (17), 320 (16), 245 (14), 230 (16), 217

(18), 201 (30),

188 (24), 156 (32), 147 (13), 103 (29).

di-perMe iP Mi+ 231 (70), 216 (57), Bi+ 188 (100), 176 (16), 163

(18), 162 (34),

135 (21), 134 (38), 133 (30), 107 (25), 98 (26).

tetra-perMe

[9R]iP Mi+(Bi+) 391 (100), 348 (20), 218 (28), 217 (76), 216

(83), 202 (80),

175(32), 174 (95), 148 (30), 101 (29), 98 (25).

tri-perMe Z Mi+ 261 (7), Bi+ 230 (100), 216 (6), 188 (22), 176 (4),

162 (7), 134 (8),

107 (7), 67 (7), 42 (11), 41 (10).

penta-perMe

[9R]Z Mi+ 421 (6), 390 (71), 348 (6), Bi+ 216 (100), 174 (17),

148 (6), 101 (11),

71 (10), 67 (8), 45 (45), 41 (17).

• A citokininek kvantitatív szerológiai meghatározása

Vonk et al. (1986) nőszirom szöveteiben mérték kompetitív, indirekt ELISA-módszerrel a Z, a [9R]Z, az iP és a

[9R]iP koncentrációját. A növényi kivonatot anioncsere-kromatográfiával, majd szilárd fázisú extrakcióval

(oktadecil-szilán oszlopon) tisztították. A szabad citokinin-bázisokat (Z, iP) HPLC-vel választották el a

ribozidszármazékoktól ([9R]Z, [9R]iP). Az elválasztást követően a frakciókat bepárolták, majd PBS-Tween-

pufferrel ismét oldatba vitték a komponenseket, ezt használva az ELISA-vizsgálatokhoz [PBS-Tween-puffer

(Phosphate-buffered saline + Tween): 0,01 M-os foszfát puffer, 0,15 M NaCl, 0,05% Tween 20; pH 7,4]. A 96-

lyukú ELISA-mikrotálca érzékenyítését üregenként 200 μl [9R]Z- és [9R]iP- KHLH-konjugátumoldattal

végezték [KHLH (keyhole limpet hemocyanin) = egy tengeri kagylóból származó fehérje], aminek töménysége

20 μg/ml coating puffer volt. (Coating puffer: 0,05 M Na2CO3/NaHCO3; pH 9,6). Az érzékenyített lemezeket

hűtőszekrényben, 4 °C-on, egy éjszakán keresztül inkubálták. Felhasználás előtt a lapokat egyszer desztillált

vízzel, ötször PBS-Tween-pufferrel mosták. A különböző hígításban elkészített mintákat és a citokinin-

standardokat PBS-Tween-ben oldva mérték az üregekbe (100 μl). Azután a [9R]Z-vel és a [9R]iP-vel szemben

termelt antiszérumot PBS-Tween-ben megfelelően hígítva hozzáadták az üregekhez (100 μl). Az így elkészített

kompetíciós elegyben a növényi anyagból származó citokininek és az érzékenyítéssel az üregek falához kötött

citokinin-konjugátumok vetélkednek egymással az elegyhez adott antiszérum-kötőhelyekért. Az

immunkomplexek kialakulása egy éjszakát igényel, 4 °C-on inkubálva az ELISA-tálcákat. Ezután a lemezeket

PBS-Tween-nel ötször mosták, amivel eltávolították a lemez falához nem kötődött antigén-antitest komplexeket.

Az ELISA-rendszer antitestkötő kapacitásának felső határát (B0) olyan üregek beállításával vizsgálták, amelyek

nem tartalmaztak mintát, csak antiszérumot és PBS-Tween-t, tehát nem jött létre kompetíció. Az antitestkötő

képesség alsó határát (Bu) olyan kompetíciós elegyben határozták meg, ami a nem kötött antigént (Z, iP, stb.)




nagy túlsúlyban tartalmazta, gyakorlatilag megakadályozva ezzel, hogy az antitestek az üreg falához kötődjenek.

A következő lépésben alkalikus-foszfatáz jelzőenzimmel konjugáltatott, nyúl-IgG-re specifikus antiszérumot

adtak az üregekhez PBS-Tween-ben oldva (200 μl; 1500 ×-os hígításban), amely hozzákötődött az üregekben

maradt, citokininekre specifikus nyúl-IgG- (antitest-) molekulákhoz. A tálcákat 3 órán át, 35 °C-on inkubálták,

PBS-Tween-nel ötször mosták, végül szubsztrát-pufferben oldva (coating puffer + 0,5 mM MgCl2) az üregekhez

mérték az enzim szubsztrátját, a p-nitrofenil-foszfátot (200 μl; 1 mg/ml). A tálcákat 35 °C-on inkubálva a

szubsztrátból színes termék képződött az alkalikus-foszfatáz katalitikus hatására. A színintenzitást 405 nm-en

mérték ELISA-lapok leolvasására kifejlesztett spektrofotométerrel. A kalibrációs görbét a következő képlet

segítségével szerkesztették meg:

amelyben

B: az üreg falához kötődött antiszérum-jelzőenzim konjugátum mennyisége,

B0: a bemért antiszérum-jelzőenzim konjugátum mennyisége,

AB: a standardot (ill. mintát) tartalmazó üregben mért extinkció-érték,

ABu: a minimális antitestkötődés mellett mért extinkció-érték,

AB0: a maximális antitestkötődés mellett mért extinkció-érték.

A B/B0 értékeket egy koordináta-rendszer y-tengelyén vették fel (0–100%), aminek x-tengelyén az egyes B/B0

értékekhez tartozó Z, iP, [9R]Z és [9R]iP értékeket ábrázolták (pmol, pg). Az ismeretlen citokinintartalmú minta

extinkcióját ismerve a B/B0-t kiszámították, és a szigmoid kalibrációs görbével egybevetve leolvasták a minta

hormontartalmát.

3.4. Az etilén meghatározása

Az etilén biológiai aktivitását ismereteink szerint 0,1–10 nl/ml koncentrációtartományban fejti ki, ezért

analitikai meghatározása során legalább 0,01 nl/ml érzékenységű módszerrel célszerű dolgoznunk. Az etilén gáz

halmazállapotú, ezért növényi szövetből történő kivonása lényegesen egyszerűbb, mint a többi növényi

növekedésszabályzóé: a szövetekből vett gázminta vagy a szövetek által kibocsátott gáz felfogva közvetlenül

vizsgálható. A vizsgálati eredmények értékelésekor azonban figyelembe kell vennünk azt, hogy a növényi

szövetek különböző mértékben megkötik a termelődő etilén egy részét. Ez a pufferhatás főként a gyors

etilénkoncentráció-változások mérését zavarja.

Etilén-mintavételi módszerek

• Mintavétel növényi szövetekből

Olyan növényi mintákból, melyek belső üregeket, gáztereket tartalmaznak (pl. almatermések, paprikabogyó),

fecskendőre illesztett injekciós tűvel közvetlenül vehetünk gázmintát. A mintavétel ideje alatt a vizsgálni kívánt

növényi részt tarthatjuk folyadék alatt, vagy a mintavevő tűt bevonhatjuk zsírral, nehogy a minta külső légköri

gázokkal szennyeződjön. A gázmintát óvatosan vegyük a fecskendővel, mert a hirtelen nyomáscsökkenés

szintén külső gázok bejutását okozhatja a mintavételi térbe. Ez a módszer ismételt mintavételre nem alkalmas.

A különböző termések és gumók által termelt etilént vákuummal is kivonhatjuk. Olaj- vagy vízlégszivattyúra

köthető deszikkátort 2/3-ig feltöltünk vízzel vagy telített sóoldattal (amely gátolja a minta által kibocsátott,

valamint egyéb, levegőből származó gázok oldódását). Egy felfordított tölcsért vagy a tetején nyitott harangot a

folyadékba süllyesztünk, ügyelve arra, hogy a tölcsér csúcsa is a folyadékréteg színe alatt legyen, de alul ne

tapadjon a deszikkátor fenekéhez (esetleg súlyokkal rögzíthetjük). A harang, illetve tölcsér belső felülete




buborékmentes kell, hogy legyen. A tölcsér nyakába belül vízszintesen egy rácsot erősítünk, amely a folyadék

felhajtóerejével szemben leszorítja a mintát, megakadályozva, hogy az, alulról nekinyomódva a tölcsér

szárának, elzárja a gázok útját. Végül a mintát behelyezzük a harang alá, amelynek tetejét, illetve tölcsér

esetében a tölcsér szárának végét gumimembránnal lezárjuk, és vákuumot hozunk létre az edényben. A

szövetekből kiszabaduló gázok a tölcsér szárának csúcsában gyűlnek össze. Rövid idő múlva a szivattyút

leállítjuk, az edényt felnyitjuk, és a gumimembránon keresztül fecskendővel gázmintát veszünk. A minta a

kivonás során folyadékba merül, ezért légzése, etiléntermelése fokozódik, tehát a kibocsátott gázok összetétele

változik. A felsoroltak miatt a lehető legrövidebb ideig és a legkisebb vákuummal dolgozzunk. Tekintettel kell

arra is lennünk, hogy túl erős vákuum esetén a folyadékban oldott gázok felszabadulnak, keveredve a minta által

termelt gázeleggyel, ami teljesen eltorzíthatja a mintavétel eredményét.

• Mintavétel a növény által kibocsátott gázokból

Ezek a módszerek alkalmasak a teljes növény etiléntermelésének a mérésére is. A mintavétel típusa és az általa

nyert adat információtartalma alapján a módszerek két fajtáját különböztetjük meg: a statikus és a dinamikus

módszereket. A statikus módszerek esetében a meghatározás egy adott időtartam alatt kibocsátott gázok összes

mennyiségéből történik. A folyamatos módszerek esetében a növényi mintát tartalmazó gáztéren folyamatosan

ismert összetételű gázkeverék vagy levegő áramlik át. Mind a bemenő, mind a kimenő gázkeverékből mintát

veszünk, és etiléntartalmukat összehasonlítjuk.

Statikus módszerek: Előnyük, hogy felépítésük és működtetésük egyszerű, rövid időtartamú mérésekre, alacsony

mintaszám mellett, jól alkalmazhatóak. A teljes növényt vagy a növény egy eltávolított részét légmentesen

lezárható tárolóedénybe helyezzük. Az edény tartalmazhat akár levegőt, akár egy általunk beállított, ismert

gázkeveréket. Az edény lezárása után mintát veszünk a gáztérből, ezt az időpontot tekintjük a vizsgálat

kezdetének. A vizsgálat végén ismét mintát veszünk a gáztérből. A termelt etilén menynyiségét a következő

képlettel számítjuk ki:

amelyben

A: a gáztér kezdeti és végső etilénkoncentrációjának a különbsége (nl),

B: a bemért növényi anyag (g),

C: a vizsgálat ideje (h).

A növényi anyag által termelt etilén mennyiségének kiszámításához ismernünk kell a méréshez használt edény

térfogatát. Kisméretű edényeket vízzel megtöltve mérhetjük tömegnövekedésüket. Nagyobb tartályok esetében

ismert térfogatú gázt befecskendezve és koncentrációját visszamérve, a hígulás mértéke alapján

meghatározhatjuk térfogatukat. A gáztér valódi térfogatát jobban közelíthetjük azonban, ha figyelembe vesszük

a minta által kitöltött teret, számolva azzal is, hogy a növényi szövetek szintén tartalmaznak gáztereket. A

legtöbb friss növényminta 1 g-ja mintegy 1 ml szilárd-folyékony fázist tartalmaz (a többi gáz) (Saltveit és Yang,

1987). Pontosabb eredményt kapunk tehát, ha 1 g növényi mintát 1 ml térfogattal számítunk, és az így kapott

térfogatértéket levonjuk az edény térfogatából.

Dinamikus (átáramló rendszerű) módszerek: Felépítésük és működtetésük bonyolultabb a statikus

módszereknél, de hosszú távú vizsgálatok esetében, sorozatos mintavétel mellett szükséges az alkalmazásuk. A

dinamikus berendezésekre általában jellemző, hogy az etilénvizsgálatra szánt növényt vagy növényrészt

tartalmazó zárt edényen ismert összetételű gázkeverék áramlik át, ismert mennyiségben. A berendezés alapvető

része a gázkeverő cső, amelynek bevezető csonkjaihoz kapcsolódnak a különböző gáztartályok (levegő, N2, O2,

CO2, C2H2). Minden csonkba beépítenek két szelepet, az egyik a beáramló gázok mennyiségének pontos

beállítására, a másik az adott gáz áramlásának gyors megszakítására való, a beállított értékek megőrzése mellett.




A beállított gázkeverék teljes átáramló mennyiségét is mérik. A vizsgálati eredményeket befolyásoló szennyező

gázok (etilén, széndioxid) eltávolítására gáztisztítókat építenek be a rendszerbe. A levágott növényrészek vagy

szövetdarabok kiszáradását a rendszerbe iktatott gáznedvesítő küszöböli ki. Dinamikus módszerek esetében a

termelt etilén mennyiségét a következő képlet segítségével számíthatjuk ki:

amelyben

A: az átáramló gáz mennyisége (ml/h),

B: a bemenő és kimenő gázkeverék etilénkoncentrációjának különbsége (nl/ml),

C: a bemért növényi anyag mennyisége (g).

A fenti egyenlet azonban csak akkor érvényes, ha a növényminta etiléntermelése egyenletesen állandó és a

rendszerünk egyensúlyi állapotban van. Az egyensúlyi állapot kialakulásának időigénye a tárolóedény

térfogatától és a gázáram sebességétől függ. A rendszer állapotát (egyenletes etiléntermelés mellett) akkor

tekinthetjük egyensúlyinak, ha az edény össztérfogatának a háromszorosát kitevő gázmennyiség áramlott már át

rajta (ilyenkor a bemenő gázkeverék és a növény által kibocsátott gáz keveredése tökéletes). Amennyiben a

növényminta etiléntermelése gyorsan változik, értékének kiszámítása nem egyensúlyi rendszerekre kidolgozott

matematikai módszerekkel történhet (Marynick és Marynick, 1975).

Az etilén mennyiségi meghatározása

• Biotesztek

Bizonyos növényfajok igen érzékenyek a levegő etiléntartalmára: adott etilénkoncentráció hatására jellegzetes

tüneteket mutatnak. Sötétben nevelt borsó-csíranövények (7 napos korban) 0,1–1,0 nl/ml levegő-etiléntartalom

mellett szárrövidülést, szárvastagodást, a szár meggörbülését és vízszintes növekedést mutatnak (Knight et al.,

1910). A tünetek magasabb etilénkoncentráció mellett kifejezettebbé válnak. Fiatal (5–6) leveles

paradicsomnövények 0,1 nl/ml etilénkoncentráció hatására levélhervadást és levélhullást mutatnak.

Ismeretlen összetételű gázminta etiléntartalmát biotesztek segítségével úgy becsülhetjük meg, ha a gázmintába

helyezett tesztnövények reakcióját összehasonlítjuk olyan növények tüneteivel, amelyeket előzetesen standard

etiléntartalmú gázsorozatban tartottunk.

• Az etilén gázkromatográfiás meghatározása

A gázkromatográfia messze a legelterjedtebb módszer az etilén mérésére. Az oszlop töltete lehet egyszerű,

szilárd Al-oxid vagy Porapak, illetve gáz-folyadék kromatográfia esetében szinte bármilyen nedvesítő folyadék

– Chromosorb, Porapak vagy egyéb szilárd hordozószemcse-felületen. Az etilén elválasztására megfelel egy 0,5

m × 3,0 mm i.d. rézkolonna, 40–60 mesh szemcseméretű Al-oxid töltettel. Az oszlop 30–80 °C hőmérsékleten,

20 ml/perc nitrogén vivőgáz térfogati sebesség mellett működtethető. Gyakran szükséges lehet az oszlop egy

éjszakán keresztül történő hevítése 150–180 °C körüli hőmérsékleten, alacsony intenzitású vivőgáz-

átáramoltatás mellett, így fokozva az oszlop hatékonyságát. Ez a lépés megismételhető, ha az oszlop

szennyezetté válik, és az etilén már nem megfelelően válik el más gázoktól (például az etántól). Kvarc kapilláris

oszlop (15 m × 0,2 mm i.d.), apoláros szilikonolaj típusú nedvesítő folyadékkal (pl. SE-30) párosítva szintén jól

használható etilén meghatározására. Ezen az oszlopon az etilén retenciós ideje 0–10 °C között mintegy 4,5 perc;

ilyen körülmények között más gázoktól jól elválasztható csúcsot ad. A kolonnán elválasztott etilén detektálására

három detektortípus terjedt el: a lángionizációs, a fényionizációs és a félvezető detektor.

3.5. Az abszcisszinsav meghatározása




Az abszcisszinsav kivonása növényi mintákból

Az abszcisszinsav (ABS) kivonása friss növényi anyagból vagy folyékony nitrogénben mélyhűtött, majd –20

°C-on tárolt növényi mintából egyaránt elvégezhető. Egy vizsgálathoz kb. 5–10 g anyagra van szükség.

Legelterjedtebb extrahálószerei a 80%-os metanol, vagy a 80% acetont és 20% 0,1 M-os ecetsavat tartalmazó

oldószerelegy, de más szerves oldószerek, így etanol, etil-acetát, kloroform, hangyasav, illetve ezek különböző

arányú keverékei is használhatók (egységnyi tömegű növényi anyaghoz 5–10 térfogategységnyi oldószert adva).

Antioxidáns vegyület jelenléte javítja a kivonatkészítés hatékonyságát. A növényi szövet oldószeres extrakcióját

porcelánmozsárban eldörzsölve vagy géppel homogenálva végzik, majd a felülúszót centrifugálással választják

el a szilárd szövetmaradványoktól. A kivonatot a következő tisztítási lépés előtt (folyadék–folyadék-

megoszlásos, ill. kromatográfiás elválasztás) a vizes fázis térfogatára vagy teljesen szárazra párolják.

Az abszcisszinsav elválasztása

• Folyadék–folyadék-megoszláson alapuló elválasztás

Az ABS gyenge sav. Savas közegben, pH 3,0 alatt disszociálatlan állapotban van, és apoláros oldószerekben (pl.

éter) nagyságrendekkel jobban oldódik, mint vízben. Lúgos kémhatású közegben (pH 9,0) viszont disszociációja

csaknem teljes, vízben való oldékonysága ekkor sokkal jobb, mint szerves oldószerekben. Ezek ismeretében

tehát lúgos közegben (pH 8,0) éterrel rázatva a vizes növényi extraktumot, megtisztíthatjuk a mintát a bázikus és

semleges – éterben oldódó – komponensektől, miközben az ABS a vizes fázisban marad. Ha az oldat

kémhatását ezután megváltoztatjuk (pH 3,0), éterrel szerves fázisba vihetjük az ABS-t, egyéb éterben oldódó

szerves savakkal együtt (ilyenkor az erősen poláros komponensek a vizes fázisban maradnak).

• Hagyományos oszlopkromatográfia és szilárd fázisú extrakció

A legelterjedtebb – ABS elválasztására használt – oszlopkromatográfiás töltet a polivinil-pirrolidon (PVP),

amely jó hatékonysággal köti meg a mintában lévő fenolvegyületeket, és az ABS kevés veszteséggel nyerhető

vissza az elúció végén. A mintát legtöbbször közel semleges (pH 6,0) foszfát-pufferrel nyerik vissza az

oszlopról.

Az ABS-tartalmú növényi kivonat szilárd fázisú extrakciója különféle gyári kiszerelésű (Sep-Pak, Waters

Associates stb.) előre töltött, egyszer használatos oszlopokkal végezhető. Leggyakoribb a fordított fázisú,

oktadecil-szilán töltet alkalmazása. Az elúció metanol és ecetsav, vagy metanol és foszforsav keverékével

történhet.

• Az abszcisszinsav vékonyréteg-kromatográfiás elválasztása

A folyadék–folyadék-megoszláson alapuló elválasztási lépés eredményeként az ABS az éteres fázisba kerül,

amelyet szárazra párolva egy, még viszonylag heterogén kivonatot nyernek, amit vékonyrétegen, vagy HPLC-

vel tisztíthatnak tovább. Vékonyréteg esetében a száraz extraktumot kb. 100 μl metanolban feloldják, és ezt

viszik fel a rétegre. Az ABS vékonyréteg-kromatográfiás elválasztására fluoreszcens indikátort tartalmazó, 0,5

mm vastag szilikagélrétegek terjedtek el. Az ABS foltja a vékonyrétegen elnyeli az UV-sugárzást, így UV-fény

alatt kimutatható. A vékonyréteget használat előtt célszerű metanol/ecetsav (98:2 térfogatarányú) elegyével

mosni a szennyeződések eltávolítása érdekében. A rétegre a minták mellett tiszta abszcisszinsav markert is el

kell helyezni, gondosan ügyelve arra, nehogy a minták valamelyikével érintkezzen. Mintafelvitel előtt érdemes

az egyes sávokat tűvel megkarcolva elválasztani. A futtatáshoz több oldószerkombináció használható:

toluol/etil-acetát/ecetsav (különböző arányú elegyei), kloroform/ecetsav (98:2) vagy kloroform/metanol/víz

(75:22:3). Kifejlesztés után az abszcisszinsav markerrel egy magasságban futó foltokat 1–2 ml etil-acetát telített

vizes oldatával, vagy aceton/metanol (1:1) elegyével eluálják a rétegről. Az eluátumból a szilikagélszemcséket

centrifugálással vagy szűréssel távolítják el.

• Az abszcisszinsav elválasztása HPLC-vel

A folyadék–folyadék-megoszlásos elválasztással, illetve a szilárd fázisú extrakcióval nyert, félig tisztított

növényi mintát szárazra párolják, majd 1 ml 20% metanol/80% 0,1 M-os ecetsav elegyében feloldják, ezt

injektálják a HPLC-oszlopra. A HPLC-oszlopok közül a fordított fázisú oktadecil-szilán (ODS) töltetű oszlopok

használata gyakori eleme az ABS-elválasztásnak. Nagyméretű (150 x 10 mm i.d.), tipikus szemipreparatív

ODS-oszlopra 100 mg éteres kivonat (Horgan, 1981), illetve 5 g friss növényi anyagból készített tisztítatlan

extraktum injektálható (Neill és Horgan, 1987). Kisebb, analitikai célra használt oszlopok (150 × 4,5 mm i.d.)

mintakapacitása jóval kevesebb, de felhasználási területük is alapvetően más: részben már megtisztított növényi

minták további szétválasztására alkalmasak. Ez utóbbi oszloptípusra vonatkoznak a következő konkrét




elválasztási paraméterek (Neill és Horgan, 1987): a gradiens-elúciót 0,1 M-os ecetsavban oldott metanollal

végezték (0–100% között, lineárisan növekvő koncentrációban), 30 percen keresztül, 2 ml/perc eluensáramlási

sebesség mellett. Ebben az esetben az abszcisszinsav retenciós ideje 10–13 perc között változott.

• Az abszcisszinsav gázkromatográfiás elválasztása

Származékképzés: Az ABS metil-észterének előállításához szükséges diazometánt Schlenk és Gellerman (1960)

módszerével állítják elő. A diazometán nemcsak robbanékony, de rákkeltő is, előállítását és a metilezés

folyamatát elszívófülke alatt kell végezni! A diazometánból kis mennyiséget (max. 20 ml-t) fejlesztve, felfogják

éter/metanol (4:1 térfogatarányú) elegyében, és így, oldott állapotban tárolják –20 °C-on tárolják. A metilezésre

szánt száraz mintához kevés, (kb. 1 ml) diazometán-oldatot adnak, amelyben a mintát mintegy 10 percig

hagyják állni. Ha a diazometán sárga színe hamar eltűnik, akkor további reagens hozzáadása szükséges.

GC-kolonnák és az elválasztás körülményei: Apoláros és poláros megosztó fázisú oszloptöltetek egyaránt

elterjedtek metilezett ABS GC-analízisére. Apoláros nedvesítő folyadékok például a metil-szilikon OV-1, SE-

30, DC-200 vagy SP-2100. Poláros megosztó fázisként az Epon-1001, az XE-60, az Ultrabond-PEGS és a

Carbowaxok használata javasolható. Neill és Horgan (1987) az abszcisszinsav és két metabolitjának

gázkromatográfiás elválasztását egy 1 m × 4 mm i.d. töltött kolonnán végezték, 3% OV-1 megosztó fázissal,

210 °C oszlophőmérsékleten. A nitrogén vivőgáz térfogati sebessége 40 ml/perc volt. Az oszlopból távozó

komponensek mennyiségét elektronbefogásos detektorral mérték. A hagyományos töltött kolonnák mellett kvarc

kapilláris kolonnák alkalmazása is gyakori (pl. BP-1 kémiailag kötött megosztó fázissal). Mintakapacitásuk

azonban lényegesen kisebb, mint a töltött kolonnáké. Rosher et al. (1985) az abszcisszinsav metilezett

származékát mérték GC-MS-sel, kapilláris GC-kolonnán választva el az egyes mintaösszetevőket. A metilezett

mintákat metanolban oldva injektálták (1 μl mennyiségben) a 40 °C-os oszlopba, (50:1 arányú) megosztásos

módszerrel. Az oszlop hőmérsékletét az injektálás után 1 perccel kezdték el növelni, 200 °C-ig ballisztikus

görbét követve, majd 5 °C/perc intenzitással 250 °C-ig. Az injektor hőmérséklete 250 °C, a hélium vivőgáz

nyomása 0,2 MPa volt. Az elválasztott, oszlopból kiáramló komponenseket tömegspektrométer ionforrásába

vezették.

Az abszcisszinsav mennyiségi meghatározása

• Az abszcisszinsav GC-MS analízise

A tömegspektrométer gázkromatográfhoz kapcsolva rendkívül érzékeny és sokoldalú mérési lehetőséget nyújt.

Teljes tömegspektrum felvétele helyett – más növényi növekedésszabályzók méréséhez hasonlóan – az ABS

esetében is csak egy vagy néhány, adott m/z értékű töredékion intenzitását követik nyomon (SIM- és MIM-

módszer). Szelektív ion megfigyeléskor (SIM) a készülék csak azt az intenzitást méri, amit az ABS

metilészterének egy bizonyos töredékionja ad. Erre leginkább a 190 m/z értékű részecske alkalmas. A Me-

abszcisszinsav – elektronütköztetéssel ionizálva – a következő m/z értékeken ad jellemző fragmentumokat (70

eV ionizációs potenciál hatására): 190, 162, 146, 134, 125, 112, 91. Az ionok által adott jel intenzitása arányos a

beinjektált ABS mennyiségével, ezért kalibrációs görbe készíthető, ami lehetővé teszi ismeretlen abszcisszinsav-

tartalmú minták mennyiségi vizsgálatát.

• Az abszcisszinsav kvantitatív szerológiai meghatározása

Rosher et al. (1985) gyenge vízellátással stresszelt almafacsemeték és csemegepaprikatövek leveleiben

radioaktív szerológiai módszerrel (RIA) határozták meg az ABS menynyiségét. A növényi extraktumokat

először folyadék–folyadék-megoszlással (éterrel), azután PVP-oszlopon, majd szilárd fázisú extrakcióval (ODS-

oszlopon) tisztították, végül a mintákban lévő komponenseket HPLC-vel választották szét. A RIA-vizsgálatokat

5 ml-es polietilén szcintillációs csövekben végezték. A csövekbe 400 μl 0,2 M-os Na-acetát/ecetsav-puffert (pH

4,0) pipettáztak. Hozzáadtak 100 μl tríciummal jelölt ABS-t (kb. 670 Bq; 0,635 TBq/mmol), továbbá 100 μl

ABS standard oldatot, megfelelő hígításban (0,19–100 pmol tartományban; 2-szeres hígítási lépésekben), vagy

100 μl mintát, továbbá 100 μl 1,5%-os PVP-oldatot, vagy ugyanennyi desztillált vizet. Az elegyet Vortex-szel

kevertették, végül hozzámérték a 100 μl ABS-antiszérumot (250-szeres hígításban). Az említett kompetíciós

elegyek mellett olyan csövet is beállítottak, amellyel a maximális izotóppal jelölt ABS-kötődést (Bmax-ot)

mérhették (nem adtak hozzá sem mintát, sem ABS-standardot). A nem specifikus kötődés mértékét olyan

elegyben határozták meg, ami nem tartalmazott antiszérumot, ezt az értéket minden mérési eredményből

levonták. Az így elkészített csöveket 4 °C-on 90–120 percig tartották. Az antitestekhez (immunglobulinokhoz)

specifikusan kötődött ABS-molekulákat az IgG-fehérjék kicsapásával választották el a nem kötődött frakciótól.

Ezt telített ammónium-szulfát 90%-os oldatával (1 ml) végezték, majd 30 perc inkubációs idő után a kicsapódott

szilárd fázist centrifugálták (10 percig, 2500 g-vel) és a felülúszót leöntötték. A precipitátumot telített




ammónium-szulfát 50%-os oldatával (1 ml) ismét elegyítették, centrifugálták és a kicsapott fehérjefrakciót 150

μl vízbe visszaoldották. Az oldathoz ezek után hozzáadták a szcintillációs koktélt (ezt kereskedelmi

forgalomban árusítják), ami segít elkerülni azt, hogy az oldat fázisokra váljon szét. Ez alapvető feltétele a

megbízható szcintillációs számlálásnak. A szcintillációs számlálóval végül megállapították az oldat által

kibocsátott radioaktív sugárzás mértékét, amely minél kisebb volt, annál kevesebb tríciummal jelölt ABS

kötődött, tehát a minta (ill. a standard) annál több ABS-t tartalmazott. Az ABS-standardsor alapján kalibrációs

görbét szerkesztettek, ami lehetővé tette ismeretlen ABS-tartalmú növényminták kvantitatív vizsgálatát. A

számítást a következő (logit transzformációs) képlettel végezték:

amelyben

B: az egyes minták vagy standardok esetében mért radioaktivitás,

Bmax: kompetíciómentes – mintát, ill. standard oldatot nem tartalmazó – elegy radioaktivitása.

Az adatokat koordináta-rendszerben ábrázolva az x-tengelyre került az ABS mennyisége (pmol), az y-tengely

mutatta a logit(B/Bmax) értéket.


17. fejezet - Aktív oxigénformák és antioxidáns enzimrendszerek

A növények, mint ahogyan minden élőlény, életük során számos környezeti hatásra (szárazság, hőmérséklet-

változás, légszennyeződés, kórokozókkal történő fertőződés stb.) reagálnak. E környezeti hatások gyakran az

optimális életkörülmények megváltozását okozzák, ezzel alkalmazkodásra kényszerítik a növényeket. A hatás

erősségétől függően látható vagy mérhető stressz-szimptómák jelennek meg a növényen. A „stressz” a Selye

János által megfogalmazott definíció szerint nem más, mint a szervezet nem fajlagos válasza különböző

stresszorok károsító hatása ellen. A stresszor hatására jelentkező tünetegyüttes pedig a generális adaptációs

szindróma, amely magában foglalja a vészreakciót, a rezisztencia és a kimerülés szakaszát (Selye, 1975). Ezt a

definíciót azonban manapság nem követik a kutatók, ma a stressz a stresszor fogalmával azonos fogalom. A

stressz tehát a károsító tényező, a növény nem fajlagos válaszreakciója pedig a stressz-szimptóma. A

növényekben fellépő stressz pontos meghatározása azonban igen nehéz. A különböző genetikai arculattal

rendelkező organizmusok más-más módon reagálnak a környezet változásaira. Nehéz meghatározni az egyes

környezeti tényezők (98. ábra) hatásának a stressz kiváltásához elegendő szintjét, ahol az anyagcsere-

folyamatok stressz-anyagcsere-folyamatokba váltanak át (Elstner és Osswald, 1994).

98. ábra - A növényeket befolyásoló hét „stresszhatás” [Schlee, 1992 után]

A számos stressz közül a kórokozók (gomba, baktérium, vírus) fertőzése a legváltozatosabb és legbonyolultabb

hatású. A behatoló mikroorganizmus érzékelésén és azonosításán túl a növény képes koordinált rendszerben egy

vagy több védekező mechanizmust felmutatni, amelyek segítségével megpróbálja megakadályozni a kórokozó

behatolását, szaporodását, és végül annak elpusztítására törekszik.

A védekezés lehetőségei egyrészt adottak, másrészt indukálhatók. Az indukálható védekező reakciók két típusát

különböztetjük meg: a) specifikusan, valamint b) nem specifikusan indukálható védekező reakciók. Ez utóbbiak

előidézésére számos biotikus és abiotikus stresszor (stressz) képes. A többnyire összetett védekezés során a

növény egyrészt kémiai „fegyverzettel” (fitoalexinek, aktív oxigénformák és antimikrobiális fehérjék termelése)

rendelkezik, másrészt szerkezeti gátak kialakítására (sejtfal megszilárdítása, ligninképződés és a sejtfalfehérjék

immobilizációja) képes (Dixon et al., 1994).

A gazda–parazita kapcsolat kimenetelét jelentősen befolyásolja a specifikus felismerés, amely specifikus

elicitor–receptor kölcsönhatáson keresztül történhet. A gazda–parazita kapcsolat kimenetelét azonban gyakran

nem specifikus, hanem általánosan aktiválható reakciók döntik el.

A védekezési folyamatok egy része a növényi sejt felületén játszódik le, de itt történik egyéb folyamatok

indukálása is, amelyek tagjai annak a folyamatláncolatnak, amely mint jelátadó rendszer működik. A

Aktív oxigénformák és antioxidáns

enzimrendszerek


válaszreakciók egy része rezisztenciát idéz elő, míg többségük inkább a kórokozó sikeres fertőzésének a

kísérőjelensége, esetleg az abiotikus stresszhatás által kiváltott stressz-anyagcserefolyamat része [aktív

oxigénformák (AOF) termelődése, az exocelluláris és intracelluláris pH-változás, a membránpotenciál

megváltozása, az ion-kiáramlás, a fehérjék foszforiláltsági mintázatának a változása stb].

A fent említett AOF termelődése a gazda–parazita kapcsolatok, valamint számos abiotikus stressz által

előidézett folyamat során fokozódik. Ez a reakció az állatvilágban és a humán patológiában több mint 30 éve

ismert. A növényekben később fedezték fel. Az azóta született biokémiai és genetikai kutatási eredmények

alátámasztják az AOF-nak a sejthalálban betöltött kulcsszerepét, bár a mai napig vitatott, hogy vajon az AOF

közvetlen hatása mennyire irányul a növény és mennyire a kórokozó ellen. Az is kérdés, hogy jelmolekulaként

szerepet játszanak-e az egyes védelmi szerepet kódoló gének transzkripciójának indukálásában (Dangl et al.,

1996).

1. Az aktív oxigénformák

A legtöbb látható vagy mérhető stressztünet kapcsolatos az oxigénanyagcsere-folyamatok megváltozásával,

melynek során a heterolitikus (két elektron átvitelével járó) folyamatok helyett megnövekszik a homolitikus

(egy elektron átvitelével járó) folyamatok mennyisége, és emiatt ún. szabad gyökök keletkeznek. Az AOF

részben szabad gyökök, mint a szuperoxid (•O2–) és a hidroxil gyök (•OH), amelyek párosítatlan (extra)

elektronnal rendelkeznek, részben olyan molekulák, amelyek reakcióik során szabad gyök képzésére képesek,

mint pl. a hidrogén-peroxid (H2O2) és a szinglet oxigén (1O2).

Ezek a gyökök és molekulák a molekuláris oxigénből sorozatos redukcióval keletkeznek.

Képzésükre így minden aerob sejt képes, kis mennyiségű termelődésük az egészséges növényi szövetek

sejtjeiben természetes folyamat. AOF keletkeznek kloroplasztiszokban a fotoszintetikus elektrontranszport

során, mitokondriumokban, ahol az oxigén 4%-a alakul át szuperoxiddá, továbbá a citoplazmában lejátszódó

enzimreakciók során. Az így keletkező AOF semlegesítésére a sejt antioxidáns-kapacitással rendelkezik,

amelyet antioxidáns enzimek és nem enzimatikus antioxidánsok képviselnek.

A molekuláris oxigén önmaga nem nagyon reakcióképes, a fent említett redukciók során elektronszerkezete

azonban megváltozik, s ezáltal rendkívül reakcióképessé válik. Számos, élettani szempontból jelentős

makromolekulát képes károsítani (membránokat, fehérjéket, aminosavakat, nukleinsavakat stb.). Ha a sejt

antioxidáns-kapacitását felülmúlja az AOF gyors, nagy mennyiségű átmeneti képződése, ún. „oxidatív

robbanás” (oxidative burst) következik be. Ez utóbbi jelentős károsításokat okozhat, és bekapcsolódhat a sejt

jelátviteli rendszerébe, ezáltal szerves részévé válik számos folyamatnak.

1.1. Szuperoxid gyök (•O2–)

Molekuláris oxigénből egyelektronos redukcióval szuperoxid (•O2–) anion keletkezik. Ennek a reakciónak a

végbemeneteléhez csekély energiabevitelre van szükség. Ezt az energiát az élő rendszerekben legtöbbször a

redukált nikotinamid-adenin-dinukleotid-foszfát (NADPH) szolgáltatja. A további redukciókhoz már nincs

szükség extra energiára, a megfelelő reakciópartner jelenlétében spontán módon is lejátszódnak. Az élő

sejtekben a szuperoxid (•O2–) sav–bázis egyensúlyt alkot protonált formájával, a hidroperoxil gyökkel (•O2H),


enzimrendszerek


ez utóbbi forma lipofil, könnyebben behatol a membránok lipid kettősrétegébe, és így képes a káros lipid-

peroxidáció előidézésére.

A szuperoxid (•O2–) jelenléte a növényi szövetekben pH-függő (fiziológiás pH esetén a szuperoxid nem nagyon

reaktív). Az 1,0 × 10–6 M-os szuperoxid (•O2–) oldatban a molekula felezési ideje (t1/2) 6,5 pH esetén 0,5

másodperc, míg 8,5 pH esetében 50 másodperc. Vizes oldatban annak kissé savas és semleges pH-ja esetén a

szuperoxid (•O2–) és protonált formája

hidrogén-peroxiddá (H2O2) és oxigénné (O2) alakul át (Sutherland, 1991). Ez a reakció lejátszódhat spontán

dizmutáció útján, vagy szuperoxid-dizmutáz enzim katalizációja segítségével. Az enzim gyorsan katalizálja a

reakciót, jelenlétében 1010-szer gyorsabb a reakció. Megjegyzendő, hogy a spontán dizmutáció is nagyon gyors,

mégis csaknem minden szervezet rendelkezik olyan speciális enzimmel vagy rendszerrel, amely a dizmutációért

felelős. Az enzim megtalálható a citoplazmában, a kloroplasztiszokban, a mitokondriumokban, sőt a

plazmamembránon kívül is. A szuperoxid (•O2–) keletkezését jelentős mennyiségű hidrogén-peroxid (H2O2)

keletkezése kíséri:

1.2. Hidrogén-peroxid (H2O2)

A hidrogén-peroxid (H2O2) aránylag stabil AOF. Elektromosan semleges és kevésbé reaktív, képes tehát

áthatolni a membránokon, így a keletkezési helyéről más sejtekbe vándorolhat. A sejtekben keletkezett

hidrogén-peroxid (H2O2) spontán módon vagy kataláz segítségével

átalakulhat vízzé (H2O) és molekuláris oxigénné (O2), vagy szubsztrátja lehet különböző peroxidázoknak,

amelyek segítségével a ligninszintézis alapjául szolgáló fenoxil gyökök keletkeznek,

de átalakulhat a Halliwell-Asada-cikluson (lásd az Aszkorbát c. alfejezetet) keresztül is. A hidrogén-peroxid

(H2O2) közvetlen oxidálására képes néhány átmeneti fém, ilyen a Fe2+ és a Cu2+ is.


enzimrendszerek


1.3. Hidroxil gyök (•OH)

A legaktívabb az itt tárgyalt formák közül a hidroxil gyök (•OH), amely hidrogén-peroxid (H2O2) és a szuperoxid

(•O2–) direkt reakciójával (Haber-Weiss-reakció) keletkezhet:

A növényi sejtben, a sejt természetes állapota mellett ez a reakció lassan játszódik le, és nem termelődik általa

jelentős mennyiségű hidroxil gyök (•OH), 4,8-as pH-optimuma miatt gyakorisága elhanyagolható.

Jelentős mennyiségű hidroxil gyök keletkezik átmeneti fémek – Fe2+ és Cu2+ – oxidációja

során (Fenton-reakció). Ez olyan ciklusreakció, ahol az oxidált ionok redukáló formájukat szuperoxiddal (O2-)

való reakció útján visszanyerik.

A hidroxil gyökök (•OH) sejten belüli keletkezését elsősorban az átmeneti fémek hozzáférhetősége határozza

meg (Gutteridge és Halliwell, 1994). A hidroxil gyök (•OH) az egyik legerősebb redukáló ágensként

irreverzíbilis változásokat idéz elő a sejt makromolekuláiban és megtámadja az organellumokat. Felezési ideje

10–9 másodperces tartományba esik, így meghatározása és szerepének vizsgálata nem sok sikerrel járt ez idáig. A

hidroxil gyök (OH) jelenléte a növény–kórokozó kapcsolatokban feltételezhető.

1.4. Egyéb aktív oxigénformák

A biológiai membránokhoz kapcsolt elektrontranszport-láncok és a szolubilis fázis kémiai reakciói révén

számos más, az előző fejezetekben nem említett AOF keletkezik. Ezek részben gyökök, mint pl. a szerves

ligandumot (R) tartalmazó fenoxil gyökök (RO2•), alkoxil gyökök (RO•), nitrogén-monoxid gyökök (NO•),

nitrogén-dioxid gyökök (NO2•), részben pedig molekulák, pl. szinglett oxigén (1O2), ózon (O3), hipoklórossav

(HOCl), szerves peroxidok (ROOH), salétromossav (HNO2) stb. Az utóbbi évek kutatási eredményei a nitrogén-

monoxid gyök (NO•) kiemelkedő szerepét bizonyítják. A nitrogén-monoxid szintáz által termelt nitrogén-

monoxid gyök (NO•)

szuperoxid gyökkel reagálva további AOF-at hoz létre (Millar és Day, 1997):


enzimrendszerek


Delledonne et al. (1998) és Durner et. al. (1998) munkáikban a nitrogén-monoxid gyök (NO•) hiperszenzitív

reakcióban, valamint az egyes védelmi szerepet betöltő gének transzkripciójának aktiválásában betöltött

szerepét bizonyítják.

2. Antioxidáns folyamatok, enzimek, enzimrendszerek és nem enzimatikus antioxidánsok

Az egészséges növény szöveti sejtjeiben aktív oxigénformák keletkeznek, amelyek akkumuláció folytán

toxikussá válhatnak a sejt számára. A sejtek azonban több antioxidáns tulajdonságú molekulával és jellegű

folyamattal rendelkeznek. Ide tartoznak a kismolekulájú, nem enzimatikus antioxidánsok (aszkorbát, glutation,

E-vitamin stb.), az egyes enzimek (aszkorbát-peroxidáz, dehidroaszkorbát-reduktáz, glutation-S-transzferáz,

glutation-reduktáz, szuperoxid-dizmutáz, kataláz, peroxidáz stb.), valamint több összetett enzimrendszer, amely

képes hatékonyan védelmezni azokat a sejtalkotókat, amelyekben lokalizáltak.

2.1. Szuperoxid-dizmutáz (SOD)

A szuperoxid-dizmutáz fémtartalmú enzim. A növényvilágban három alapvető formáját azonosították. Attól

függően, hogy milyen fémet tartalmaz és hol fordul elő, megkülönböztetünk Cu/Zn-SOD-t, Mn-SOD-t, Fe-

SOD-t. A Cu/Zn-SOD elsősorban az eukarióta szervezetek citoplazmájában és/vagy a kloroplasztisz

sztrómájában található. A Mn-SOD a prokarióta szervezetekre jellemző, de megtalálható az eukarióta

szervezetek mitokondriális mátrixában is. A Fe-SOD a prokariótákon kívül néhány eukarióta család

kloroplasztiszában is megtalálható.

Az enzim a szuperoxid (•O2–) dizmutációját katalizálja. Az így keletkezett hidrogén-peroxid (H2O2) az előbb leírt

módokon, pl. kataláz segítségével alakul át vízzé (H2O) és oxigénné (O2). A szuperoxid dizmutázt jelentős

antioxidánsnak tekintik. Azonban állati és baktérium-sejtekben, ahol megemelkedett aktivitását észlelték, a

sejtek halálát okozta, ha a kataláz nem volt képes semlegesíteni a keletkezett hidrogén-peroxidot (H2O2). Egyes

feltételezések szerint a SOD képes a hidrogén-peroxidból (H2O2) hidroxil gyök (•OH) keletkezését is katalizálni;

feltehetően ez a mechanizmus magyarázza a hidroxil gyöknek a membránkötött átmeneti fémektől távol eső

károsítását (Yim et al., 1990).

2.2. Aszkorbát

Jelentős antioxidáns, az egész sejten belül megtalálható. Képes közvetlenül reakcióba lépni a szuperoxiddal (•O2–

) és a hidroxil gyökkel (•OH), valamint képes a hidrogén-peroxidot (H2O2) aszkorbát-peroxidáz segítségével –

Halliwell-Asada-ciklus – átalakítani.


enzimrendszerek


Az oxidált aszkorbát dehidroaszkorbát-reduktáz segítségével, glutation terhére regenerálódik; ez utóbbi

regenerálódását a glutation-reduktáz és a NADPH biztosítja.

2.3. Glutation, α-tokoferol, flavonoidok

A glutation redukált (GSH) és oxidált (GSSG) formája, valamint a glutation-reduktáz (GR) jelentős szerepet

játszik a hidrogén-peroxid (H2O2) lebontásában a citoszolban és a kloroplasztiszban szerveződött összetett

rendszerben, a Halliwell-Asada-ciklusban. A glutation-S-transzferáz a xenobiotikumok méregtelenítésében vesz

részt. Hasonlóan az aszkorbáthoz, a glutation is képes közvetlen reakciókra.

Fontos még megemlíteni mint nem enzimatikus antioxidánst, az E-vitamint (α-tokoferol), amely a membránok

kettős lipidrétegében található, és védelmet nyújt a lipid-peroxidáció ellen. Az oxidált vitamin az aszkorbát-

glutation ciklusban nyeri vissza redukáló képességét.

Az alábbi antioxidáns-rendszereken kívül számos flavonoid komplex képes antioxidánsként működni, gátolva a

lipid-peroxidációt.

2.4. Kataláz

A hidrogén-peroxidot (H2O2) vízzé (H2O) és oxigénné (O2) katalizáló vasporfirin prosztetikus csoportot

tartalmazó enzim megtalálható a legtöbb aerob élő szervezetben. Jelentős szerepet játszik a peroxiszómák és a

glioxiszómák hidrogén-peroxid- (H2O2) szintjének csökkentésében. Szerepe a növény–kórokozó

kölcsönhatásokban is jelentős. A kataláz disszociációs állandója magas, így kis mennyiségű hidrogén-peroxid

(H2O2) átalakításának katalizálásánál nem túl hatékony, pl.: ha 1 mg katalázt elegyítünk 10 mM-os hidrogén-

peroxid- (H2O2) oldattal, akkor 4000 mol H2O2/perc teljesítménnyel katalizálja a reakciót, míg ugyanennyi

kataláz 10 μM-os hidrogén-peroxid- (H2O2) oldatban csak 2 μmol/perc. Ebben az esetben az előzőleg leírt

rendszer jóval hatékonyabb, mint a kataláz. Az is lehetséges, hogy bizonyos stresszhelyzetekben, amikor a

NADPH-igény nagy, a kataláz szerepe megnövekedik.

3. Az aktív oxigénformák lehetséges keletkezési helye és módja

Miután számos tudományos dolgozat született az AOF kémiájáról, keletkezésükről és a sejt antioxidáns-

folyamatairól, kézenfekvővé vált a kérdés, hogy hol és hogyan keletkezik nagy mennyiségben az AOF.

A legvitatottabb dolgozatok a mai napig az AOF eredetének tanulmányozása során születnek. A részben

bizonyított és részben feltételezéseken alapuló modellek közül a részleteiben legjobban ismert „NADPH-

oxidáz” rendszer számos analógiát mutat az állati fagocita sejtekben található rendszerrel. Egy másik, részben

hipotetikus modell, a pH-függő „sejtfal-peroxidáz” rendszer. AOF-termelő képességet tulajdonítanak a

„csíra/oxalát oxidáz” rendszernek, amely hidrogén-peroxidot termel a behatoló kórokozó ellen, de nem történik

oxidatív robbanás, valamint a xantin-oxidáznak, amely enzim oxigént használ fel a xantin oxidálására,

szuperoxid és húgysav keletkezése közben. A „lipoxigenázt” szintén lehetséges AOF-forrásnak tekintették,

azonban kiderült, hogy az AOF termelődése megelőzi a lipoxigenáz aktiválódását.

Az oxidatív robbanás során keletkező aktív oxigénformákat képző NADPH-oxidáz rendszer a

plazmamembránban található (99. ábra), aktiválódását számos egyéb folyamat előzi meg. Ezek a folyamatok

részei a jelátadási rendszernek, amelyen keresztül a NADPH-oxidáz is aktiválódik. Az így keletkező aktív

oxigénformák egyéb anyagcsere-folyamatokat aktiválnak, amelyek bizonyos rezisztenciagének

transzkripciójának aktiválásához és sejthalálhoz is vezethetnek. A modell hipotetikus, leegyszerűsített működési

elve a következő: a plazmamembránban található receptormolekula (Rp) egy elicitor- molekulát ismer fel, ezt a

guanozin-trifoszfát (GTP)-kötött ún. „G-fehérje” aktiválása, az ioncsatornák megnyitása (a Ca2+ és a H+

beáramlása, valamint a K+ kiáramlása és ezáltal a citoplazma savasodása) követi. A protein-kinázok és protein-

foszfatázok, valamint a foszfolipázok is valószínűsíthetően részt vesznek az aktív oxigénformákat létrehozó

NADPH-oxidáz rendszer aktiválásában.

99. ábra - Az aktív oxigénformák szerepe a növényben lejátszódó folyamatok

aktiválásában. RP = receptormolekulák, G = G-protein, SA = szalicilsav, SA• = szalicilát


enzimrendszerek


gyök, BA2H = benzoesav-2-hidroxiláz, + = pozitív hatás, – = negatív hatás [Hammond-

Kosack és Jones, 1996 után módosítva]

A hidrogén-peroxid (H2O2) keletkezésének egy másik lehetősége, a pH-függő sejtfal peroxidáz-modellje, bár

ellentmond az előbbinek, ugyanúgy nem zárja ki a jelátadási ösvényen keresztüli aktiválódást, hangsúlyozva a

plazmamembrán és a sejtfal közötti felület komponenseinek fontosságát. Összegezve megállapítható, hogy az

elicitormolekulát itt is ugyanúgy egy receptor molekula érzékeli, ezt követi az ionoknak az ioncsatornákon

keresztüli áramlása (Ca2+, K+, H+, Cl–), ami a plazmamembrán külső felületének átmeneti alkalizációját

eredményezi, ezt pedig már a sejtfal kötött peroxidáz-aktiválódása követi.

Az AOF termelődéséről szóló első növénybiológiai tanulmány 1983-ban látott napvilágot, ahol egy

burgonyagumó szövetében végbemenő hiperszenzitív reakció (HR) során észlelték a szuperoxid (•O2–)

termelődését. Továbbá megállapították, hogy az ilyen reakció csak az inkompatibilis gazda–parazita kapcsolatra

jellemző (Doke, 1983).

Az AOF keletkezésének módját növény–baktérium sejtszuszpenzióban sikerült vázolni, egy inkompatibilis és

egy kompatibilis gazda–parazita kapcsolat összehasonlításával. Megállapították, hogy az AOF keletkezésének

két fázisát, hullámát lehet megkülönböztetni. Az első fázis egy aránylag rövid, nem specifikus reakció

következtében jön létre, mind a kompatibilis, mind az inkompatibilis gazda–parazita kapcsolatban, míg a

második fázis hosszabb és specifikusan jellemző az inkompatibilis kapcsolatra (100. és 101. ábra). Az inokulum

baktériumszámának növelése (107 ⇒ 108 cfu/ml) maga után vonta az AOF mennyiségének növekedését az első

fázisban, ugyanakkor a második fázisban azok csökkenése következett be (Baker et al., 1991). Ez a

ellentmondás az első fázisban megnövekedő antioxidáns-kapacitás következménye.

100. ábra - Az aktív oxigénformák kétfázisú termelődése kórokozó–növény

kapcsolatban [Baker és Orlandi, 1995 után]


enzimrendszerek


101. ábra - Az AOF termelődése (A, B) és sejthalál (C, D) a P.s. tabaci (Pseudomonas

syringae pv. tabaci) és P.s. gly. (Pseudomonas syringae pv. glycinea) 4-es és 6-os

rasszával fertőzött dohány- és szója-sejtkultúrákban. Inkompatibilis (teli szimbólumok)

és kompatibilis (üres szimbólumok) gazda–parazita kapcsolatok [Baker és Orlandi,

1995 után]


enzimrendszerek


4. Az aktív oxigénformák kórfolyamatban betöltött szerepe

4.1. Antimikrobiális aktivitás

Az AOF antimikrobiális aktivitása régóta ismert (lásd fagocitózis). A növényi sejtek képtelenek mozgást

végezni, körülvenni és beburkolni a kórokozót, ellenben AOF termelésére képesek. A szuperoxid és a hidrogén-

peroxid baktériumok és gombák elleni antimikrobiális aktivitása in vitro kísérletekben igazolt, in vivo betöltött

szerepük azonban nem bizonyított (Király et al., 1997).

A stacionáris fázisban lévő baktériumok több katalázt termelnek, mint a log fázisban lévő baktériumok, ezáltal

ellenállóbbak a hidrogén-peroxid magas koncentrációjával szemben. Baker és Orlandi (1995) munkájából

kitűnik, hogy magas hidrogénperoxid-koncentráció mellett (1,0–50 mM) a baktériumpopuláció túlélését a

baktériumsejtek koncentrációja határozza meg, nem pedig az egyes baktériumsejtek antioxidáns-aktivitása.

4.2. Fitoalexinek termelődése

Az AOF és a fitoalexinek termelődése között számos összefüggést találtak az elmúlt évtizedben. A

szójanövények hipokotiljában a hidrogén-peroxid hatására keletkező zsírsav-hidroperoxidok gliceollin-

akkumulációt váltottak ki (Apostol et al., 1989). Ezek az adatok közvetlen ok-okozati összefüggésre utaltak, ám

ugyanezen laboratóriumban később arra a következtetésre jutottak, hogy a növényben két különböző

elicitormolekula van jelen, amelyek képesek mindkét reakció párhuzamos és független indukciójára. Más

dolgozatok is megkérdőjelezik az összefüggést. Pl. dohánysejteket tisztított fehérje-elicitorral kezelve fitoalexin-

termelődést észleltek, azonban AOF termelődését nem. Az utóbbi évek eredményei azt valószínűsítik, hogy ez a

két jelenség párhuzamosan indukálható, feltehetőleg különböző felismerő és jelátadó rendszer által.

4.3. Hiperszenzitív reakció

A hiperszenzitív reakció (HR), mint a növényi rezisztenciával kapcsolatos válaszreakció, régóta vizsgált

növény-kórélettani jelenség (Klement, 1982). Levine et al. (1994) tanulmányában az AOF termelődését mind a

virulens, mind az avirulens baktériumtörzsek előidézték. A gazdasejtek halála azonban csak az avirulens

törzsnél észlelhető. A HR előidézésében a hidrogén-peroxidnak tulajdonították a kulcsszerepet. Glazener et al.

(1996) mutáns baktérium alkalmazásával bizonyították, hogy bár a baktérium képtelen HR-t előidézni a növényi

sejtekben, az AOF kétfázisú termelődése mégis megtörténik. A hozzáadott (exogén) hidrogén-peroxid, bár

valóban képes sejthalál előidézésére, csak jóval nagyobb mennyiség esetén (2–10 mM) hatásos, mint amennyi in

vivo a növényben az AOF keletkezésekor termelődik. Egyes mutánsokkal végzett kísérletek a hidrogén-peroxid

helyett a szuperoxidnak tulajdonítanak iniciáló szerepet a sejthalál indukálásában.

4.4. Szisztemikus szerzett rezisztencia

A szisztemikus szerzett rezisztencia és az AOF termelődésének összefüggését több dolgozat részleteiben

vizsgálja. Léon et al. (1995) megállapították, hogy a hidrogén-peroxid növeli a benzoesav-2-hidroxiláz enzim

aktivitását, amely enzim benzoesavból szalicilsav (SA) képződését katalizálja, mindez SA-akkumulációhoz

vezet. Bizonyított tény, hogy a SA elengedhetetlen a szisztemikus szerzett rezisztencia kialakulásához. Fodor et

al. (1997) vizsgálatai szerint a SA különböző antioxidánsokat aktivál és ezzel alapvetően hozzájárul a nekrotikus

tünetek visszaszorításához, vagyis a szisztemikus szerzett rezisztencia kialakulásához.

A hidrogén-peroxid mennyisége jelentősen megnő a fertőzési helyeken, feltételezhető a SA mellett egy

másodlagos hírvivő szerepe a jelátadási rendszerben, amely során szisztemikus szerzett rezisztencia alakul ki,

valamint kórfolyamat-függő fehérjék génjei aktiválódnak. Ez utóbbi szerepét számos szerző megkérdőjelezi

(Klessig és Malamy, 1994).

4.5. Indukált sejtfal-megszilárdítás

Régóta ismert és bizonyított jelenség a kórfolyamat kezdetén bekövetkező sejtfal-megszilárdítás, amely során a

sejtfalfehérjék peroxidáz által katalizált keresztkötődéssel megszilárdítják a sejtfalat, és lassíthatják a kórokozó

behatolását. Ez az oxidatív robbanás során keletkező hidrogén-peroxid által befolyásolt folyamat. A sejtfal


enzimrendszerek


megszilárdításában részt vevő egyéb folyamatok létezésére utal az is, hogy indukálására képes pl. a glutation is,

ami köztudottan antioxidáns.

5. Mérési módszerek és értékelésük

Az aktív oxigénformák instabil természetűek, spontán és enzim katalizálta reakcióik nagyon gyorsak, felezési

idejük a másodperces időintervallumba esik. Mindez megnehezíti közvetlen mérésüket a növényben. Ugyan a

leegyszerűsített gazda–parazita kapcsolatok, pl. a növényi sejtkultúra-szuszpenzió és baktérium-szuszpenzió,

esetleg a kórokozóból izolált elicitor-molekula és a növényből izolált organellumok áthidalják a módszertani

nehézségeket, de vajon mennyire tükrözik a növényben lejátszódó eseményeket?

Az AOF kórélettani szerepéről eddig felgyülemlett ismeretanyag többsége, pl. a védekezési folyamatok,

bizonyos gének expressziójának, valamint a sejtfal megszilárdításának indukálása, a hiperszenzitív reakcióban

betöltött szerepük stb. főleg a fent említett modell-kapcsolatokból származik. Az AOF meghatározására szolgáló

mérési módszereket és indikátorokat, valamint előnyeiket és bizonyos hátrányaikat a 23. táblázat foglalja össze

(Schroeder et al., 1996).

23. táblázat - Az AOF mérési módszereinek összefoglalása (Schroeder et al., 1996 után

módosítva)

Jelzőanyag Alkalmazott

módszer Kimutatot

t anyag Kimutatás

i határ Módszerek előnyei (+),

hátrányai (–)

Keményítő/KI agarlemezek

szövetlenyomat

H2O2 500 µM + lokalizácó

– szükséges a mért anyag

kiválasztódása a növényből

– a háttér elszíneződése a

levegő okozta

oxidáció miatt

– nehéz alkalmazhatóság az

ún.

„száraz” szövetrészeknél,

mint pl. a levelek

CeCl3 elektronmikros

z-

kópos vizsgálat

H2O2

+ sejtszintű és szubcelluláris

lokalizáció

– anyag- és eszközigény

(IV)Cl4 növényi

kivonattal

végzett kolori-

metriás mérés

H2O2 50 µM + mennyiségi meghatározás

+ növényi pigmentek zavarják

a

meghatározást; aktív szénnel

vagy

erős anioncserélővel

színteleníteni

kell a mérést megelőzően


enzimrendszerek


4-nitro-tetrazó-

lium-kék (NBT)

infiltráció •O2–

+ lokalizáció

+ •O2–-ra specifikus

Diamino-benzidin

(DAB)

infiltráció

lumineszcencia

H2O2

+ lokalizáció

Luminol növényi

kivonatokban

H2O2 l 1 µM + mennyiségi meghatározás

5.1. KJ / keményítő módszer

A H2O2 termelődésének megállapítására szolgáló legkönnyebb módszerek közé tartozik. A módszer a jodidionok

H2O2 általi oxidációjára épül, a keletkezett jód komplexképződés közben reagál a keményítővel és színes,

kékeslila elszíneződést okoz. Ez az egyszerű reakció több módszer alapja. A módszerek előnye, hogy anyag- és

műszerigénye kicsi, valamint lehetővé teszik a H2O2 lokalizációját. Hátrányaik: a degradálódási folyamatok, a

háttér elszíneződése, amely a jódnak a levegő általi oxidációjából fakad, valamint a kiválasztási folyamatok

fizikai akadályai, így a kis víztartalmú szöveteknél, mint pl. a levelek, nehezen alkalmazható, másrészt

érzékenysége csak az 500 μM-os érték körül mozog.

A H2O2 meghatározása növényi szövetben (agarlemezes módszer)

A növényi szövet H2O2-tartalmának meghatározása Olson és Varner (1993) módszere alapján történik. A fiatal

növények gyökereit vagy a levelekből kivágott korongokat (esetleg burgonyagumó-szeleteket) 1%-os

agarózlemezre helyezzük, amely 50 mM KI-ot és 2–5% keményítőt tartalmaz. A mintákat az elszíneződés

megjelenéséig (függ a H2O2 mennyiségétől) szobahőmérsékleten tároljuk (102. ábra).

102. ábra - A H2O2 kimutatása agarlemezes módszerrel. A: gyökereken a baloldali

növény a kontroll, B és C: burgonya-levélkorongokon felül a kontroll látható mindkét

esetben [Wu et al., 1995 után]


enzimrendszerek


A H2O2 meghatározása növényi szövetben (szövetlenyomat-készítéssel)

a. A „H2O2-nyomtató papír” elkészítése nitrocellulózmembrán- (0,2 μm) darabkák áztatásával történik.

b. Az áztató oldatot desztillált vízből 100 g/l oldható keményítő és 0,5 mol/l KI hozzáadásával készítjük. A

keményítő oldása forralással történik, a KI-ot csak kihűlés után adjuk az oldathoz.

c. A nitrocellulóz-darabkákat 30 °C-on megszárítjuk, használat előtt sötétben tároljuk, ezzel is megelőzve az

esetleges oxidációt. Az áztató oldat tárolhatósága 5 óra, a lenyomatkészítő papíré pedig 2 óra.

d. A szövetlenyomatok készítése szobahőmérsékleten történik (18–20 °C) Cassab és Varner leírása alapján

(1989).

e. A H2O2-nyomtató papír darabkáit öt réteg vastagságú kromatográfiás papírra helyezzük.

f. A szövetmetszeteket steril borotvapengével, kézzel metsszük (vastagságuk 0,5–1,0 mm) és azonnal a

lenyomatkészítő papírra helyezzük. A műveletet 15 másodpercen belül végezzük, egy papírra 3–6

szövetmetszetet helyezünk.

g. Ezt követően a metszeteket 16-rétegű steril gézzel betakarjuk, és finoman 60 másodpercig ujjal nyomjuk (a

leghatásosabb terhelés 200–300 g között van).

h. A szeleteket óvatosan (csipesszel) eltávolítjuk, a lenyomatokat 5–10 perces szárítást követően (103. ábra)

sztereomikroszkóppal vizsgáljuk (16-szoros nagyítás). A lenyomatok megjelenése a papírokon 5–10 percet

igényel, ez elsősorban a H2O2 mennyiségétől függ. Mivel a lenyomatok idővel erősödnek,

összehasonlíthatóságuk érdekében az értékelést azonos időközönként végezzük. A lenyomatok 2 óráig

tárolhatók sötétben (bár így is látható kevés háttérelszíneződés).


enzimrendszerek


i. A hozzávetőleges mennyiségi meghatározáshoz kalibrációs sort készítünk. A H2O2-oldat 2,5 μl-es cseppjeit

0–0,125–0,25–0,5–1–2–4–8 mmol/l-es koncentrációban helyezzük a papírra. Minden értékeléshez friss

kalibrációt készítünk (ügyeljünk az azonos időközökre).

j. Az eredményeket mikroszkópra szerelhető fényképezőgéppel rögzítjük.

103. ábra - H2O2 szöveti meghatározása csíranövényből szövetlenyomatok készítésével

[Schopfer, 1994 után]

5.2. CeCl3 módszer

A CeCl3 elektronsűrű nehézfém, vizes közegben oldott állapotú, a H2O2 cérium-peroxiddá oxidálja. Amíg más

módszerek segítségével az AOF jelenlétének meghatározása csak szöveti és sejtszinten lehetséges, addig ezen

módszer lehetővé teszi az egyes sejtorganellumokban történő meghatározást. A módszer hátránya, hogy műszer-

és költségigényes.

A H2O2 meghatározása növényi szövetben (transzmissziós elektronmikroszkóppal)

A minták előkészítése hagyományos módon történik: fixálás, beágyazás, metszés és festés (Bestwick et al.,

1995) alapján. A H2O2 lokalizálására szolgáló módszer a cérium-peroxid keletkezésén alapul.

a. Az inokulált szövetből 1–2 mm2-es darabokat vágunk, ezeket 1 órán keresztül a frissen készített 5 mM-os

CeCl3-oldatban (pH-ja 7,2) inkubáljuk.

b. A CeCl3-ot 50 mM-os 3-(-morfolino) propán-szulfonsavban (MOPS) oldjuk.

c. Ezt követően a szöveteket 50 mM-os nátrium-kakodilát- (CAB) pufferben 1 órán keresztül fixáljuk, a puffer

1,25% (v/v) glutár-aldehidet és 1,25% (v/v) p-formaldehidet is tartalmaz (pH-ja 7,2).

d. A fixáció után a szöveteket 2 × 10 percen át mossuk CAB-pufferben, és 45 percen keresztül utófixálást

végzünk 1% (v/v) ozmium-tetroxidot tartalmazó CAB-pufferben.

e. A szöveteket újra 2 × 10 percig CAB-pufferben mossuk.

f. Növekvő töménységű etanol-sorozatban dehidratálást végzünk 30, 50, 70, 80, 90% (v/v). A mintákat minden

etanololdatban 15 percig tartjuk, majd 3 × 20 percre 100%-os etanolba helyezzük (a dehidratálást esetleg

acetonnal is végezhetjük, ebben az esetben aceton–gyanta keverékbe ágyazzuk a mintákat).

g. A további eljárás során a mintákat 2 × 20 percre propilén-oxidba helyezzük, majd folyamatosan beágyazzuk

Eponaralditba.


enzimrendszerek


h. A szövet 12 órára tiszta gyantába, majd újabb 4 órára friss gyantába helyezzük.

i. Ezt követően 48 órára a 60 °C-os polimerizáló blokkokba kerül.

j. A mikrotómos metszést gyémántkéssel végezzük (70–90 nm).

k. A metszeteket bevonatlan rézrácsra (Cu-grid, 300 mesh) helyezzük és transzmissziós elektronmikroszkóppal

vizsgáljuk (75 kV-os gyorsító áram).

5.3. Ti(IV)Cl4 módszer

A módszer perhidroxid komplex képződésén alapul. Bár a növény levélszövetének számos pigmentje ugyanazon

a hullámhosszon abszorbeál, mint a titániumkomplex, a módszer mégis alkalmazható, de csak aktív szenes

derítés, esetleg anioncserélő gyanta alkalmazása mellett. A levelek folyékony nitrogénben való fagyasztása, az

5%-os triklór-ecetsav, az aktív szén alkalmazása és az ammónium-hidroxiddal való semlegesítés megfelelő

elszíntelenítést eredményeznek. A módszer hátránya a pigmentek interferenciáján kívül az, hogy bár kvantitatív

meghatározásra nyújt lehetőséget, érzékenysége csak 50 μM-os határ körül mozog, ennél ugyanis jóval

érzékenyebb módszerek is léteznek.

A H2O2 meghatározása növényi szövetben (spektrofotometriásan)

Az itt részletezett két mérési módszer kolorimetrián alapuló spektrofotometriás mérés. Az A-módszer Patterson

et al. (1984), míg a B-módszer Okuda et al. (1991) nevéhez fűződik.

A-módszer

Az első módszer a semlegesített TCA-s kivonáson és a Ti(IV)-PAR komplexképződésen alapul.

a. A leveleket (2 g) folyékony nitrogénben fagyasztjuk, majd 1 ml 5%-os triklór-ecetsavval és 0,7 g aktív

szénnel együtt eldörzsöljük.

b. Az extraktumot centrifugáljuk (18 000 g, 10 perc, 0 °C-on) és egyben szűrjük (0,45 μm). Mindaddig

ismételjük a szűrést, amíg az összes aktív szenet és kicsapott fehérjét el nem távolítottuk.

c. A szűrlethez a 8,4-es pH eléréséig 7 M-os NH4OH-oldatot adunk.

d. Újabb szűrést végzünk, és az így kapott szűrletet 1 ml-es egyenlő részekre osztjuk, a minták felébe 1 μg

katalázt teszünk.

e. Az összes mintát 20 °C-on 10 percig inkubáljuk, majd kolorimetriás reagenst adunk hozzá.

f. A mintákhoz ismert mennyiségben és egyenlő arányban 4-(2-piridilazo)-rezorcinol (PAR) és kálium-

titánium-oxalát komplexét adjuk hozzá.

g. Mindkét oldatot 6 × 10–4 töménységben készítjük, és úgy elegyítjük, hogy pH-ja 8-as legyen.

h. A szín 45 °C-on egy óra múlva jelenik meg. A spektrofotometriás méréseket 508 nm-en végezzük.

B-módszer

a. A leveleket (0,2 g) előhűtött (0 °C) dörzsmozsárban 2 ml 0,2 N-os HClO4-ban 0,1 g kvarchomokkal

eldörzsöljük.

b. A mintákat 5 percig 20 000 g-n centrifugáljuk, majd a felülúszót 4 N-os KOH-dal 7,5-ös pH eléréséig

lúgosítjuk.

c. Az így kapott oldatot 1 percig 1000 g-n centrifugáljuk.

d. A felülúszó 200 μl-ét 1 ml-es anioncserélő oszlopra (0,8 × 2 cm, AG-1) visszük fel.

e. Az oszlopot 800 μl desztillált vízzel mossuk, és az így nyert oldatot alkalmazzuk a H2O2 meghatározására.


enzimrendszerek


f. A reakcióelegy 1,5 ml végtérfogatában 1 ml felülúszót, 400 μl 12,5 mM-os 3-N,N-dimetil-amino-

benzoesavat (0,375 M-os foszfát-pufferben oldva, pH-ja 6,5), 80 μl 3-metil-2-benzotiazolin-hidrazont és 20

μl peroxidázt (0,25 egység) tartalmaz.

g. A peroxidáz hozzáadása után az abszorbancia változását 25 °C-on, 590 nm-en (két fényutas)

spektrofotométerben követjük nyomon.

h. A mért értékeket korrigáljuk 15 percig 20 °C-on inkubált 10 egység kataláz hozzáadásával készült minta

abszorbanciájával.

5.4. 4-nitro-tetrazóliumkék (NBT) módszer

Amíg az indikátorok egy része a H2O2-ra specifikus, addig az NBT a •O2–-ra szelektív. A redukción kívül a sárga

NBT lilás-barnás formazánná csapódik ki. A növényi szövetekbe történő bejuttatásának több lehetősége van. A

szukkulens szövetekbe felszívással juttatható be, de vákuminfiltrálni is lehetséges. A felszívás során a xilém és a

floém azonban jelentős mennyiségű festéket emészt, valamint az ott felhalmozódott csapadék elzárhatja a

transpiráció útját. Ez a bejuttatási módszer amellett, hogy anyagigényes, a csapadék feltorlódása miatt sem

tökéletes. Ezért a vákuminfiltrálással történő bejuttatás jobban ajánlható. A módszer előnye, hogy sejtszintű

lokalizációt tesz lehetővé.

A •O2– meghatározása növényi szövetekben (specifikus indikátor alkalmazásával)

A •O2– szöveti festése tehát az NBT-vel való speciális reakción alapszik (Doke és Ohashi, 1988).

a. 10 mM-os kálium-foszfát-pufferben (pH 7,8) 0,5% (w/v) NBT-t, 10 M NADPH-t és 10 M EDTA-t oldunk.

Az oldat fényérzékeny, készítésekor a lombikot fóliával takarjuk, oldás után szűrjük.

b. A növényi részt (pl. levélkorongokat) az oldattal vákuminfiltráljuk.

c. Ezt követően 25 °C-on inkubáljuk, 15 perc múlva a szövet azon részeiben, ahol •O2- termelődés észlelhető,

megjelenik a formazán lilás-barnás elszíneződése.

d. A szöveteket mikroszkóppal vizsgáljuk, bár a reakció szabad szemmel is jól látható. Mikroszkópra szerelhető

fényképezőgéppel felvételeket készítünk (104. ábra).

104. ábra - Nekrotikus léziók körül keletkező szuperoxid és a NBT reakciója során

keletkező formazán elszíneződése, dohány mozaik vírussal (tobacco mosaic

tobamovirus) inokulált Nicotiana tabacum cv. Samsun NN dohány levélkorongjain

[Doke és Ohashi, 1988 után]

5.5. Diaminobenzidin (DAB) módszer

A H2O2-ra specifikus reakció elsősorban keletkezési helyének meghatározására alkalmas. Bár az irodalomban

elsősorban gomba–gazda kapcsolatoknál alkalmazták ezt a módszert (Thordal-Christensen et al., 1997),

egyszerű és nem túl műszerigényes volta révén vírus–gazda kapcsolatra is átdolgozható.

A H2O2 meghatározása növényi szövetben (specifikus indikátorral)

a. A levágott inokulált leveleket 8 órán át 3,3‟-diaminobezidin-HCl 1 mg/ml-es 3,8-as pH-jú oldatában

inkubáljuk (az alacsony pH a DAB oldódásához szükséges). A DAB-oldatot készíthetjük aszkorbinsav

(10mM) hozzáadásával is.


enzimrendszerek


b. A H2O2 keletkezésének helyén vörösesbarna elszíneződés jelenik meg. A minták vizsgálata különböző

időpontban történik.

c. A reakció megjelenését követően a vizsgált epidermisznyúzatokat fixáljuk, ami történhet 30%-os glicerin és

30%-os tejsav oldatával vagy 96%-os forró etanol-oldatban (10 perc).

d. A szöveteket mikroszkóppal vizsgáljuk, majd fényképezőgéppel felvételeket készítünk.

5.6. Kemilumineszcenciás módszer

A módszer H2O2 növényiszövet-kivonatokban történő meghatározására alkalmas. Amellett, hogy specifikus,

igen érzékeny. Összehasonlítva a Ti(IV)Cl4-os módszerrel, érzékenysége legalább 50-szeres (l 1 μM).

Ugyanazon kísérleti beállítás során a két módszert összehasonlítva ez utóbbival, szignifikáns eltérések

mutathatók ki, míg Ti(IV)Cl4-dal nem. A H2O2 mennyisége luminométerrel mérhető és a kibocsátott fény

intenzitásával arányos. A növényi kivonat készíthető HClO4-val is (Chen et al., 1993). A lumineszcenciás

módszerek (peroxidáz katalizálta lumineszcencia) jól alkalmazhatók sejtszuszpenzióban is, mind az AOF

képződésének, mind a H2O2-elbontó aktivitás meghatározására (Glazener et al., 1991). Az itt részletezett

módszer Warm és Laties (1982) munkájából származik.

A H2O2 meghatározása növényi szövetben (luminol segítségével)

a. A H2O2 meghatározásához vett növényi mintákat (egyenként 5 g-ot) folyékony nitrogénben fagyasztjuk.

b. 20 ml 5%-os, 4 °C-os triklór-ecetsavban (TCA) előhűtött dörzsmozsárban homogenáljuk.

c. A növényi kivonatot tartalmazó minták mellett belső standardot és vakmintát is készítünk. A belső

standardhoz és a vakmintához 3 μmol H2O2-ot (1–5 μmol H2O2) adunk a homogenálást megelőzően. A

vakminta 25 ml 5%-os TCA, amely nem tartalmaz növényi kivonatot.

d. A mintákat 30 percig 12 000 g-n centrifugáljuk.

e. A felülúszók 1 ml-ét, a növényi kivontaban lévő színes vegyületek kiszűrése érdekében, anioncserélő

oszlopon engedjük át, mintánként kétszer (0,7 × 4 cm, 100 mg Dowex AG 1-X8).

f. A vak- és standard mintákkal ugyanígy járunk el.

g. Az így kapott kivonatok 50 μl-ének H2O2-tartalmát 50 μl 0,5 mM-os luminol (3-aminoftálsav-hidrazid)

segítségével mérjük. A luminolt 0,2 M-os NH4OH-ban oldjuk (pH 9,5).

h. A kemilumineszcenciát 100 μl 0,5 mM-os K3Fe(CN)6 (0,2 M-os NH4OH-ban oldva) injektálásával

indukáljuk.

i. Az emittált fotonokat 5 másodpercig pulzusintegrátorral számláljuk.

j. A H2O2-specifikus kemilumineszcencia megállapítására az elszíntelenített növényi kivonat 1 ml-éhez (Tris-

HCl-pufferben, pH-ja 7) 500 egység katalázt adunk, ezt 10 percig 30 °C-on inkubáljuk, majd ismételten

mérést végzünk. A két mérés különbsége (ΔCL) a H2O2-specifikus kemilumineszcencia.

k. A H2O2 egyéb lebomlásának, esetleg más komponensek interferenciájának kiszűrésére szolgál a belső

standard és a vakminta, a levonásuk után kapott kemilumineszcencia, a nettó kemilumineszcencia (net CL)

arányos a minta H2O2 mennyiségével, amit kalibrációs görbe segítségével határozunk meg.

5.7. Egyéb mérési módszerek

Az aktív oxigénformákat fluoreszcenciás és elektronspínrezonanciás módszerekkel is mérhetjük; ezek igen

gyakori mérésformák. A fluoreszcenciás módszerek kitűnően alkalmazhatók sejtkultúrákban az AOF

keletkezésének detektálására, elsősorban a H2O2 meghatározására. A H2O2 keletkezése szkopoletin fogyásával

határozható meg, spektrofluoriméter (460/350 nm) segítségével (Levine et al., 1994). Fluoreszcenciás módszer

alkalmazható a membrán-lipidfázisok változásának meghatározására. A fluoreszcein-diacetát apoláros

molekula, amely könnyen áthatol a membránok lipidfázisán, ott elveszíti acetát részét, és poláros fluoreszcein

keletkezik, amely már nem tud a membránokon áthatolni. Így a plazmamembránok permeabilitásának változása


enzimrendszerek


jól nyomon követhető a fluoreszcein-diacetát akkumulációjával, a sejtek észterázaktivitásával, valamint a

fluoreszcein kiáramlásával (Keppler et al., 1988).

Fluoreszcens mikroszkópia is alkalmazható a sejthalál detektálására, ahol az élő sejteket fluoreszcens festékkel,

neutrálvörössel festjük (Koga et al., 1988). Ez utóbbi két módszer az egyéb közvetett mérési lehetőségek közé

tartozik.

Az elektonspínrezonancia-spektroszkópia (ESR) paramágneses tulajdonságú anyagok tanulmányozására

alkalmas spektroszkópiás módszer. Ilyenek a párosítatlan elektronú atomok, szabad gyökök, néhány molekula,

mint pl. NO, O2– , olyan féminok, amelyek d és f elektronhéja csak részlegesen betöltött stb. A módszer többek

között alkalmas paramágneses anyagok koncentrációjának meghatározására, 10–9–10–10 mol/l határokig. Ez az

intervallum lehetőséget nyújt az AOF mennyiségének pontos megállapítására. A módszer az AOF-nak izolált

membránban és mikroszómafrakcióban történő meghatározására alkalmas.

Egyéb (közvetett) mérési lehetőségek

A fertőzött növényi szövetekben az AOF mérésén kívül számos más mérési lehetőség is van, amely mérések

eredményei közvetve utalnak az AOF megnövekedett mennyiségű, a természetestől eltérő jelenlétére. Ide

tartoznak az enzimatikus és nem enzimatikus antioxidánsok meghatározásai. Az enzimaktivitások és a nem

enzimatikus antioxidánsok változásának mérésére több módszer is lehetőséget nyújt. Mérhetők

spektrofotometriásan, gélelektroforézis segítségével és kemilumineszcenciásan.

Az AOF által okozott és befolyásolt kórélettani folyamatok szintén számos alternatívát nyújtanak. A nekrotikus

foltok megjelenésével járó gazda–parazita kapcsolatok esetében egyszerű indikátoros festéssel meghatározhatók

az elhalt sejtek, akár az egysejt-nekrózisok is. A nekrózisok során bekövetkező sejthalál egyik jellemző

folyamata a sejtmembránok szétesése, amely a membránpotenciál változásával, valamint elektrolit- (ion-)

kiáramlással jár. Az ilyenkor lejátszódó lipidperoxidáció az egyik legjellemzőbb folyamat. Mérése mind

spektrofotometriásan, mind termolumineszcenciásan elvégezhető.

Enzimaktivitások mérése spektrofotometriás módszerrel

A Halliwell-Asada-ciklus antioxidáns enzimeinek mérése spektrofotometriásan történik.

• Mintavétel

A mintavétel során ügyelni kell arra, hogy a fertőzött növény folyamataira jellemző mintát vegyünk. Az egyes

folyamatok erőssége levélszintenként különbözhet, mint ahogy a vírussal való fertőzhetőség is változó

levélszintenként. A különböző vírus–gazda kapcsolatok tüneti megnyilvánulása befolyásolja a mintavétel

időpontját és helyét. Az enzimaktivitások a lokális nekrotikus és klorotikus tünetek esetében a fertőzési

helyekhez közel eső szövetrészekben változnak jelentősebben, így a foltokat közvetlenül körülvevő, még zöld

szövetrészekből vegyük a mintát. Az egészséges növény példányai között is lehetnek jelentős eltérések az

élettani folyamatokban, ezért a nagyszámú mintavétel ajánlott.

• Nyers enzimkivonatok készítése

a. A levélszövetet, mintánként 0,5 g-ot, 3 ml hideg homogenáló pufferben, előhűtött dörzsmozsárban

eldörzsöljük. A homogenáló puffer 0,05 M-os TRIS-HCl-puffer (7,8 pH), amely 7,5% (w/v) polivinil-

pirrolidont (vízoldható) és 1 mM EDTA-Na2-t tartalmaz.

b. A homogenizátumot centrifugáljuk (5000 g, 20 perc, 4 °C), és a felülúszót alkalmazzuk az aktivitások

méréséhez.

• Aktivitások meghatározása

A spektrofotometriás méréseket ellenőrzött hőmérsékletű küvettaházban, 25 °C-on végezzük (Shimadzu-

CPS240A spektrofotométer).

• Aszkorbát-peroxidáz (AP) aktivitásának mérése

Az AP aktivitásának mérése Nakano és Asada (1981) módszere alapján történik.


enzimrendszerek


a. Az aktivitásmérő elegy 2,25 ml végtérfogatában 2 ml 0,2 M-os TRIS-HCl-puffert (7,8 pH), 100 μl 5,625

mM-os aszkorbinsav-oldatot, 50 μl nyers növényi enzimkivonatot és 100 μl 11,25 mM-os hidrogén-peroxid-

oldatot tartalmaz.

b. Az abszorpcióváltozást kvarc küvettában 290 nm-en 3 percig mérjük.

c. Ezt követően újabb aktivitásmérő elegyet készítünk, amely nem tartalmaz hidrogén-peroxidot, és újabb 3

percig követjük az aszkorbinsav fogyását. Az aszkorbinsav moláris extinkciós koefficiense 290 nm-en 2,8

mM–1 cm–1. Az aktivitás kiszámolásánál a két mérés különbségét alkalmazzuk:

• Dehidroaszkorbinsav-reduktáz (DHAR) aktivitásának mérése

A DHAR aktivitásának mérése Asada (1984) módszere alapján történik.

a. Az aktivitásmérő elegy 2,3 ml végtérfogatában 2 ml 0,05 M-os nátrium-foszfát-puffert (a puffer tartalmaz

0,1mM EDTA-Na2-t, pH 6,5), 100 μl 0,5 mM-os dehidroaszkorbinsav-oldatot (a dehidroaszkorbinsavat és a

glutationt pufferben oldjuk), 100 μl 1 mM-os redukált glutationoldatot és 100 μl nyers növényi

enzimkivonatot tartalmaz.

b. Az abszorpcióváltozást 3 percig 265 nm-en kvarc küvettában mérjük, majd újabb aktivitásmérő elegyet

készítünk növényi enzimkivonat nélkül, és újabb mérést végzünk. Az aszkorbinsav moláris extinkciós

koefficiense 14 mM–1cm–1. Az aktivitás számításánál a két mérés különbségét alkalmazzuk.

• Glutation-reduktáz (GR) aktivitásának mérése

A GR aktivitásának mérését Halliwell és Foyer (1978) módszere alapján végezzük, figyelembe véve Klapheck

et al. (1990) módosításait.

a. Az aktivitásmérő elegy 2,5 ml végtérfogatában 2 ml 0,2 M-os TRIS-HCl-puffert (7,8 pH), 100 μl 2,4 mM-os

NADPH-t, 300 μl 5 mM-os oxidált glutationoldatot és 100 μl nyers növényi enzimkivonatot tartalmaz.

b. Az abszorpcióváltozást 3 percig 340 nm-en mérjük, majd új reakcióelegyet készítünk, melyhez nem adunk

glutationt, és ismételjük a mérést. A glutation moláris extinkciós koefficiense 6,2 mM–1cm–1. Az aktivitást itt

is a két mérés különbségéből számoljuk.

Elhalt sejtek festése Evans-kék indikátorral


enzimrendszerek


A fertőzött növény leveleiből levélkorongokat vágunk, amelyeket Evans-kék biológiai indikátor 1%-os

desztillált vizes oldatával infiltrálunk, és 15 percig inkubáljuk. Az infiltrálást a gazda-parazita kapcsolattól

függően különböző időközönként végezzük. Az Evans-kék csak az elhalt sejteket festi meg. A szöveteket

fénymikroszkóppal vizsgáljuk, fényképezőgéppel felvételeket készítünk.

Az ionkiáramlás mérése levélkorongokból

A sejthalál jól jellemezhető az ionkiáramlás mérésével. A módszer az oldatok vezetőképességének változásán

alapul. A fertőzött növény leveleiből az egyes mérésekhez 5–5 levélkorongot vágunk (∅ = 9 mm). A

levélkorongokat fonákjukkal felfelé, 5 ml desztillált vízben úsztatva, szobahőmérsékleten 3 órán át inkubáljuk.

Ezt követően konduktivitásmérővel mérjük az úsztatóoldat vezetőképességét (Mittler et al., 1996).

A lipidperoxidáció mérése

A lipidperoxidáció mérését spektofotometriásan végezzük Heath és Packer (1968) módszere alapján, figyelembe

véve Dhindsa et al. (1981) módosításait. A módszer elve a malondialdehid (MDA) mérésén alapul, amely a

lipidperoxidáció során keletkező korai termék.

a. Mintánként 0,5 g levelet folyékony nitrogénben fagyasztunk, majd dörzscsészében elporítunk.

b. Az így előkészített mintákat 2 ml 0,2 M-os citrát-foszfát-pufferben (6,5 pH) – ami tartalmaz 0,5% Triton-X

100 detergenst is – szuszpendáljuk, majd a homogenátumot centrifugáljuk (20 000 g, 15 perc).

c. A felülúszó 1 ml-ét 2 ml, hűtött, 0,5%-os (v/v) 2-tiobarbitursavat (TBA) tartalmazó 20%-os (w/v) triklór-

ecetsavval elegyítjük, és 95 °C-os vízfürdőn 45 percig inkubáljuk, végül 15 percig olvadó jégben hűtjük.

d. Centrifugáljuk, s az így kapott felülúszó abszorbanciáját 532 nm-en mérjük.

e. A nem specifikus abszorbanciát 600 nm-en mérjük, és a kapott adatot kivonjuk az előző mérésből. Az így

kapott adatot használjuk az MDA extinkciójának számításánál. Az MDA moláris extinkciós koefficiense 155

mM–1cm–1.


18. fejezet - A vírus-ellenállóságra nemesítés hagyományos módszerei

A nemesítés évezredes tudatos emberi tevékenység, amelynek során valamely kedvező tulajdonságot homogén

populációkban alakítanak ki. Erre a tradicionális nemesítésben két lehetőség van: (1) keresztezés, amely a

mendeli öröklődés ismeretében a megfelelő szülőpárok kiválasztásán alapuló szexuális hibridizálás és (2)

kiválogatás, amely megadott szempontok szerinti elkülönítést jelent. A nemesítés fő célja a piacképes, jó

minőségű, kórokozókkal és kártevőkkel szemben ellenálló, jó termőképességű fajták előállítása. A növényi

kórokozók terméscsökkentő és minőségrontó hatásának felismerésével a betegség-ellenállóság kialakítása egyre

fokozottabb elvárás lett. A vírusbetegségek elleni kémiai védekezés eredménytelensége miatt a vírus-

ellenállóságra nemesítés különösen nagy jelentőségű (Kappert és Rudorf, 1958; Wiersema, 1972; Horváth,

1983, 1984, 1988; Spaar és Kleinhempel, 1985; Burton, 1989; Ross, 1986; Huisman et al., 1992; Foxe, 1992;

Kegler és Friedt, 1993; Kyle, 1993; Bradshaw and MacKay, 1994).

1. A rezisztenciára nemesítés fő irányai

A rezisztencia formáit a növényben meglévő természetes ellenálló képesség szerint csoportosíthatjuk aszerint,

hogy a rezisztencia a kórokozó megtelepedése vagy a betegség kialakulása ellen hat (Gáborjányi és Tóbiás,

1984). Az így kialakított ellenálló képesség lehet nem specifikus (horizontális), ami egy adott kórokozó minden

törzse ellen védettséget ad, és lehet törzsspecifikus (vertikális), ahol az ellenálló képesség a kórokozó egy-egy

törzsével szemben eredményes. A genetikailag ellenőrzött vírusrezisztencia két csoportba osztható: 1. a

monogének vagy poligének által szabályozott kvalitatív lokalizált rezisztencia, és 2. a többnyire poligének által

szabályozott kvantitatív, nem lokalizálódó rezisztencia (Fraser, 1986; Spaar et al., 1992).

1.1.

1.1.1.

1.1.1.1.

1.1.1.1.1. Fertőzéssel szembeni ellenálló képesség

A fertőzéssel szembeni ellenállóság kialakításának célja a kórokozó távol tartása az egyébként fogékony

növénytől. A növény fertőzés előtti tulajdonságán (axenia) alapul: vastag kutikula, szőrözöttség stb. (ezek

meggátolják a fertőzést és a vektorok tevékenységét). Ez a képesség ugyan nem nyújt tartós védelmet, de

gyakran az ún. „szabadföldi ellenállóságot” eredményezi. Többnyire vad fajokkal való keresztezés útján

alakítható ki. Jelentősége alárendelt.

1.1.1.1.2. Túlérzékenységre (hiperszenzitivitásra) irányuló nemesítés

Mint ismert, a növények egy része a fertőzéssel szemben túlérzékeny, azaz hiperszenzitív. A fertőzést követő

túlérzékenységi reakció (HR) nyomán gyors lokális nekrózis fejlődik ki, ami az esetek nagyobb részében a

biotróf kórokozó lokalizálását is eredményezi. A HR-t a fertőzött levelek szeneszcenciája követheti, és a

leválasztó szövetréteggel rendelkező növényfajoknál a levelek lehullanak (amputációs rezisztencia). Mindez azt

jelenti, hogy a HR-rel rendelkező növények nem fertőzött részei egészségesek maradnak (sőt, bizonyos

mértékben egy újabb fertőzés elleni indukált szisztemikus rezisztenciára tesznek szert). A hiperszenzitivitásra

irányuló nemesítés igen elterjedt, általában egy gén által szabályozott. Eredményessége nagyrészt a környezeti

tényezőktől befolyásolt, és új, a rezisztenciát áttörő patotípusok, vírustörzsek kialakulását eredményezi. Ismert a

szisztemikus nekrózisképzés is (Foxe, 1992). Ebben az esetben a fertőzött növény elpusztul.

1.1.1.1.3. A betegséggel szembeni ellenálló képesség kialakítása

Szintén örökletes tulajdonságon alapul. Kialakítása szempontjából a vírus replikációja és növényen belüli

elterjedése, azaz transzlokációja a döntő tényező, ezekre összpontosul a nemesítés fő iránya. Célja a teljes és

tartós ellenálló képesség (extrém rezisztencia vagy immunitás) kialakítása minden ismert törzs fertőzésével

szemben. Az öröklődés általában egy (vagy kevés) gén jelenlétén alapul.

A vírus-ellenállóságra nemesítés

hagyományos módszerei


1.1.1.1.4. Toleranciára nemesítés

A legtöbbször, kultúrnövényekhez közel álló vad fajokból származó rezisztenciát biztosító gének hiányában,

meg kell elégedni a toleranciával. A toleráns fajok ugyanarra a fertőzésre gyengébb tünetekkel vagy kisebb

termésveszteséggel válaszolnak, tehát hasznos tulajdonságok hordozói. Ugyanakkor a kórokozó a toleráns

növényben is replikálódik, ezért másodlagos fertőzési forrást jelent.

2. A rezisztenciagének működése egyes növényfajokban

Jelenlegi ismereteink szerint 101 vírusrezisztencia-gén ismert a potyvirusokkal és 24 gén a cucumovirusokkal

szemben. A legtöbb ismert gén a Solanum fajokban (25) és a Nicotiana fajokban (22) található (Kegler és Spaar,

1993).

A dohány N-gén működése és a hiperszenzitivitás

A vírusfertőzéssel kapcsolatos hiperszenzitivitás felfedezése Holmes (1929) nevéhez fűződik. Amikor az enyves

dohányt (Nicotiana glutinosa) a dohány mozaik vírus (tobacco mosaic tobamovirus) közönséges (U1) törzsével

fertőzte, akkor az inokulált leveleken lokális léziók képződését (HR) figyelte meg. A helyi nekrózisok a

fertőzést teljesen lokalizálták, a rezisztencia minőségi jellegű, azaz teljes volt. A N. glutinosa és a kultúr

dohányfajták (N. tabacum) keresztezésével olyan hibrideket állított elő, amelyek szintén hiperszenzitivitáson

alapuló rezisztenciát mutattak a vírus fertőzésével szemben. A hiperszenzitív rezisztenciát biztosító „nekrotikus”

N-gén dominánsan öröklődik. Az N-gén hőmérsékletfüggő, 32 °C felett nem működik, és a korábban lokalizált

fertőzés szisztemikussá válik. A hiperszenzitív rezisztenciagén nemcsak dohány–dohány mozaik vírus (tobacco

mosaic tobamovirus) kapcsolatban hőmérsékletfüggő, hanem ismert az is, hogy pl. 32 °C felett a Gomphrena

globosa vagy a Capsicum chinense (PI 152225) hiperszenzitív reakciója (nekrotikus lokális léziók) a

paradicsom bokros törpülés vírussal (tomato bushy stunt tombusvirus), ill. a paradicsom bronzfoltosság vírussal

(tomato spotted wilt tospovirus) szemben szisztemikussá válik, tehát a magas hőmérséklet képes a

hiperszenzitív rezisztencia áttörésére (Redolfi et al., 1977; Roggero et al., 1996). Az N-gén rezisztenciáját a

virulensebb tobamovirusok (pl. paprikáról izolált Ob törzs) áttörik (Csilléry et al., 1983). A legtöbb

információval az N-gén működésével kapcsolatosan rendelkezünk. Számos dohányfaj és vad Nicotiana faj

(közöttük legjelentősebb a N. sylvestris, N. suaveolens) tartalmazza az N’-gént (105A ábra). Két dohány mozaik

vírus törzsből készített hibrid nukleinsavak fertőzésével izolálni lehetett a vírus azon nukleotid szekvenciáit,

amelyek a nekrózis kialakulását szabályozzák, és a dohány genomjában is sikerült már azonosítani HR-felelős

géneket.

105. ábra - Nicotiana tabacum cv. Xanthi-nc (A), Nicotiana suaveolens (balról fertőzött,

jobbról egészséges, kontroll növény) (B) és Datura stramonium (C) hiperszenzitív

rezisztenciája a dohány mozaik vírussal (tobacco mosaic tobamovirus) szemben.

Burgonya Y-vírussal (potato Y potyvirus) fertőzött Capsicum annuum cv. Bogyiszlói

szisztemikus tünetei (D)




Az N-gén eredményessége a sejtfaltól függ. Az N-gént tartalmazó dohányok protoplasztjai ugyanúgy

fertőzhetők vírussal, mint a fogékony fajták protoplasztjai, bennük a vírusreplikáció azonos mértékű, bár a

rezisztens növény protoplaszt-kultúrszűrletéből vírusreplikációt gátló anyagot (IVR) izoláltak (Loebenstein és

Gera, 1981). Ma már számos vírusrezisztencia-hordozó dohányfajta, ill. -törzs ismert (24. táblázat).

24. táblázat - Nicotiana tabacum fajták és törzsek vírusrezisztenciája

Rezisztenciahordozó

növények

Vírusok1

TMV PVY CMV TSW

V TEV TNV

TVM

V

CV + +

Zlatolist + + +

Bulgáriai törzs +

+

Kentucky-hibrid

(71698) +

+

Ky 15 + +




T1 245 + +

+

Trapezond + +

TI1 406 +

+

1 TMV, tobacco mosaic tobamovirus (dohány mozaik vírus); PVY, potato Y potyvirus (burgonya Y-vírus);

CMV, cucumber mosaic cucumovirus (uborka mozaik vírus); TSWV, tomato spotted wilt tospovirus

(paradicsom bronzfoltosság vírus); TEV, tobacco etch potyvirus (dohány karcolatos vírus); TNV, tobacco

necrosis necrovirus (dohány nekrózis vírus); TVMV, tobacco vein mottling potyvirus (dohány érfoltosság

vírus).

A paradicsom Tm-gén és a kvantitatív rezisztencia

A paradicsom mintegy negyven vírussal szemben fogékony. A paradicsom mozaik vírus (tomato mosaic

tobamovirus) tüneteit paradicsomon a Tm-gének szabályozzák. A Tm-O típusú izolátumokkal szemben a Tm-1

gén nyújt bizonyos fokú ellenálló képességet. A rezisztencia nem a fertőzés blokkolásán (HR), hanem a

replikáció visszaszorításán és ezáltal a szisztemikus tünetek kifejlődésének gátlásán alapul. Ilyen szempontból

tehát toleranciagén, mennyiségi jellegű. Ilyen esetben a kórokozó – csökkent mértékben – a rezisztens fajtákban

is szaporodhat. A Tm-1 gén az O típusú izolátumok replikációját homozigóta fajtákban 95%-ban gátolta, míg a

heterozigótáknál ez az érték csak 70% volt (Fraser és Loughlin, 1980, 1982). Ez a körülmény kedvez az új

vírustörzsek kialakulásának, annál is inkább, mert a magas hőmérséklet a rezisztenciát megszünteti.

Magasabb fokú, extrém rezisztenciát adnak a Lycopersicon peruvianum növényből származó Tm-2 és a Tm-22

gének. A rezisztens növények normális hőmérsékleten tünetmentesek, vagy alig látható nekrózissal reagálnak a

fertőzésre. Jelenlegi ismereteink szerint hatvan olyan paradicsomfajta, ill. hibrid ismert, amely tartalmazza a

Tm-1 és Tm-22 rezisztenciagéneket. A Tm-22 gént eddig még egyetlen vírustörzs sem volt képes áttörni.

Vírusokkal szemben az alábbi rezisztenciahordozók ismertek (25. táblázat).

25. táblázat - A paradicsom vírusrezisztenciája (Spaar és Kleinhempel, 1985 után

módosítva)

Vírusok1 Lycopersicon spp. rezisztenciahordozók

CMV2 L. cheesmanni, L. hirsutum, L. penelli

TMV Craigella-vonalak

TMV + CMV L. esculentum, L. peruvianum

PVY L. esculentum cv. Angela, L. pimpinellifolium, L.

peruvianum var. dentatum,

L. peruvianum var. humifusum

TMV L. peruvianum

PVX Lycopersicon-vonalak

PVY P.I. 13782-46-I-I-m, L. chilense

TSWV3 L. pimpinellifolium, L. peruvianum, L. esculentum cvs Rey

de los Tempranos,

Pearl Harbour, Manzana




1 TMV, tobacco mosaic tobamovirus (dohány mozaik vírus); CMV, cucumber mosaic cucumovirus (uborka

mozaik vírus); PVY, potato Y potyvirus (burgonya Y-vírus); PVX, potato X potexvirus (burgonya X-vírus);

TSWV, tomato spotted wilt tospovirus (paradicsom bronzfoltosság vírus).

2 A CMV [cucumber mosaic cucumovirus (uborka mozaik vírus)] rezisztenciahordozóinak meddőségi problémái

miatt a rezisztencia öröklődése biztonságosan nehezen tanulmányozható.

3 A TSWV [tomato spotted wilt tospovirus (paradicsom bronzfoltosság vírus)] L. peruvianum növény esetében

módosító gének jelenlétében fő domináns génnel öröklődik (Watterson, 1993).

A paprika inkomplett rezisztenciáját biztosító L1-gének

A paprikát fertőző vírusok száma 40 felett van, és eddig több mint 20 vírus spontán előfordulását állapították

meg (Horváth, 1986a). A paprika vírusokkal szembeni affinitására jellemző, hogy a virológiai irodalomban a 8

új Capsicum faj számos vírusra fogékony (Horváth, 1986b) (105D ábra). A paprikapatogén vírusok közül az

egyik legveszélyesebb vírus a dohány mozaik vírus (tobacco mosaic tobamovirus). A dohány mozaik vírus

ellenállóságát a Li-gének (inkomplett) szabályozzák (Lippert et al., 1965). Ezek a gének a vírusfertőzést elvileg

hiperszenzitív reakcióval lokalizálják, de ez nem nyújt teljes körű védelmet minden tobamovirus fertőzés ellen.

A vírus U1 törzsével szemben a L1 rezisztenciagént hordozó fajták (L1/L1) lokális rezisztenciát nyújtanak, amit

más tobamovirusok [paradicsom mozaik vírus (tomato mosaic tobamovirus), paprika enyhe foltosság vírus

(paprika mild mottle tobamovirus)] áttörnek. A Capsicum frutescens növényből származó L2 gén a paradicsom

mozaik vírussal szemben nyújt ellenálló képességet, míg a teljesebb védelmet a Capsicum chinense L3 génje

jelenti (Csilléry et al., 1983; Gáborjányi és Tóbiás, 1984; Moór és Zatykó, 1995; Zatykó és Moór, 1995). A

Capsicum chacoense L4 rezisztenciagén átvitele paprikafajtákba is eredményesnek ígérkezik. Már van olyan

paprikafajta (Himes), amely a legnagyobb rezisztenciával tűnik ki (Csilléry, 1995; Sági és Salamon, 1998). A

26. táblázat a Capsicum genotípusok és a tobamovirus patotípusok közötti kapcsolatot mutatja be.

26. táblázat - A Capsicum genotípusok rezisztenciája és a tobamovirus patotípusok

közötti kapcsolat (Boukema, 1984 után)

Capsicum fajták és

származékok Rezisztenci

a genotípus

Tobamovirus patotípusok1

P0 P1 P1, 2 P1, 2, 3

C. annuum cv. Early

Calwonder L+ L+ + + + +

C. annuum cv. Bruinsma

Wonder L1 L1 – + + +

C. frutescens cv. Tabasco L2 L2 – – + +

C. chinense PI 159236 L3 L3 – – – +

C. chacoense PI 260429,

SA 185 L4 L4 – – – –

1 + = Fogékony (szisztemikus mozaik), – = lokális léziók (nem szisztemikus), rezisztens.

Újabb kutatások során megállapítást nyert, hogy a Capsicum annuum (C. annuum cvs Avelar, Criollos de

Morelos, Jupiter, RNaky), C. annuum var. minimum, C. annuum var. piramidale, a Capsicum chinense (PI

152225, PI 159234, PI 159236), a C. frutescens (BG2814-6) fajtákban, ill. fajokban és származékaiban

rezisztenciát állapítottak meg néhány potyvirussal, a paradicsom bronzfoltosság vírussal (tomato spotted wilt

tospovirus), az uborka mozaik vírussal (cucumber mosaic cucumovirus) és a dohány nekrózis vírussal (tobacco

necrosis necrovirus) szemben (Horváth, 1986c; Valkonen et al., 1996; Grube et al., 1998). Hiperszenzitív

rezisztenciát állapítottak meg néhány fajban: Capsicum annuum var. longum [uborka mozaik vírus (cucumber

mosaic cucumovirus)], C. barbatum var. pendulum [burgonya Y-vírus (potato Y potyvirus), paradicsom

magtalanság vírus (tomato aspermy cucumovirus)], C. praetermissum [paradicsom mozaik vírus (tomato mosaic




tobamovirus)], C. pubescens [uborka mozaik vírus, burgonya Y-vírus, paradicsom mozaik vírus, dohány mozaik

vírus (tobacco mosaic tobamovirus)] (Horváth, 1986c).

Figyelemre méltó a Capsicum annuum növényekben kimutatott komplex vírusrezisztencia (27. táblázat).

27. táblázat - A paprika komplex vírusrezisztenciája (Spaar és Kleinhempel, 1985 után)

Vírusok1 Rezisztenciahordozók

CMV + TMV C. annuum – K 2002 törzsek 97, 157, 187

PVY + TEV C. annuum – P 11, S.C. 46252, C. chinense

PVY + TMV Agronomico 9, 10, 11, 12

CMV + TMV + PVY C. annuum – Yolo Y, Agronomico 8,

Quadrato d‟ Asti,

Corno di Bue

PVY + TMV + TEV C. annuum – Florida VR-2, S.C. 46252,

C. frutescens – Tabasco

PVY + TEV + PepMoV C. annuum – Avelar 234, Delray Bell

TRSV + PVBV + PVMV C. annuum – DH 2-4, DH II-5

PVY + TEV + TMV +

PepMoV C. annuum – Tam mild Jalapeno I

PVY + PVBV + PepMoV +

TRSV C. annuum – Byadgi × Puri Orange

1 CMV, cucumber mosaic cucumovirus (uborka mozaik vírus); TMV tobacco mosaic tobamovirus (dohány

mozaik vírus); PVY, potato Y potyvirus (burgonya Y-vírus); TEV, tobacco etch potyvirus (dohány karcolatos

vírus); PepMoV, pepper mottle potyvirus (paprika foltosság vírus); TRSV, tobacco ringspot nepovirus (dohány

gyűrűsfoltosság vírus), PVBV, pepper vein banding virus (paprika érszalagosodás vírus); PVMV, pepper veinal

mottle potyvirus (paprika érfoltosság vírus).

A Capsicum annuum cv. CM 334 (mexikói paprika vonal) növény genetikai szegregációs analízise során

megállapították, hogy a burgonya Y-vírussal (potato Y potyvirus) és a paprika foltosság vírussal (pepper mottle

potyvirus) szembeni rezisztenciájáért két gén felelős. A pr4 gén a domináns, és mindkét vírus eddig ismert

patotípusaival szemben aktív. A pr5 gén recesszív, és csak a burgonya Y-vírussal szemben érvényes (Dogimont

et al., 1996). Legújabban uborka mozaik vírussal (cucumber mosaic cucumovirus) szembeni rezisztenciát

mutattak ki a Capsicum annuum cv. French Perennial és a C. frutescens BG 2814-6 fajtában (Grube et al., 1996,

1998).

Az ellenőrzés módszere

• Paprikafajták tobamovirus-ellenállóságának vizsgálata mechanikai inokulációval

a. Kifejlett szikleveles paprikanövények szikleveleit mechanikai módszerrel különböző patotípusú

tobamovirusokkal (28. táblázat) inokuláljuk. Az inokulumforrás leveleit 1:5 arányban (g/cm3), 0,1 M

Sörensen-féle foszfát-pufferrel (pH 7,0) hígítjuk, a leveleket celittel vagy karborundumporral finoman

beszórjuk. A levelek inokulációját üvegspatulával végezzük. Az inokulációt követő két hétig a növényeket

ellenőrzött hőmérsékleten (25 °C), termosztátszobában tartjuk (Anonymous, 1994).




28. táblázat - Paprikafajták tobamovirus-ellenállósága

Fajták

Vírusok1

Rezisztenci

a jellege

TMV-U1

P0

ToMV-

Ob P1, 2 PMMV-

SL P1, 2, 3

Tünetek2

Fecske –/SMo –/SMo –/SMo L+

Keszthelyi

rezisztens NLL/– –/SMo –/SMo L1

Greygo NLL/– –/SMo –/SMo L2

Novares NLL/– NLL/– –/SMo L3

Himes NLL/– NLL/– NLL/– L4

1 TMV-U1, dohány mozaik vírus U1 törzse (U1 strain of tobacco mosaic tobamovirus); ToMV-Ob, paradicsom

mozaik vírus Ob törzse (Ob strain of tomato mosaic tobamovirus); PMMV-SL, paprika enyhe foltosság vírus SL

törzse (SL strain of pepper mild mottle tobamovirus).

2 A tünetek rövidítései és magyarázata A biotesztek virológiai alkalmazása c. fejezetben található

b. A fertőzött növényeket rovarmentes üvegházban neveljük legalább két hétig. A lokális tüneteket az első

héten naponta, majd a szisztemikus tüneteket hetenként egyszer értékeljük.

Megjegyzés: A legalacsonyabb, P0 patotípusú dohány mozaik vírus U1 törzs (tobacco mosaic tobamovirus U1

strain = TMV-U1) (Siegel és Wildman, 1954) fertőzésére fogékony (L+ genotípusú) Fecske fajta inokulált

levelein nincsenek tünetek, de a fertőzést követő két hét múlva szisztemikus mozaikfoltosság alakul ki a csúcsi

leveleken. Ez a fajta minden paprikapatogén tobamovirus fertőzésére fogékony. A Rezisztens Keszthelyi fajta

már a P0 patotípusú TMV-U1 törzs fertőzésével szemben rezisztens, az inokulált leveleken a lokális nekrózisok

gátat szabnak a kórokozó szisztemizálódásának, ugyanakkor fogékony a magasabb patogenitású vírustörzsekkel

(P1, P1, 2, P1, 2, 3) szemben (L1 rezisztenciatípus). A Greygo fajta már magasabb rezisztenciaszintet mutat (L2), de

rezisztenciáját elveszti egy magasabb patogenitású törzs (P1) fertőzésével szemben. A Novares már az L3

rezisztenciagént is hordozza, tehát reziszens a P1, 2 patotípusú paradicsom mozaik vírus (tomato mosaic

tobamovirus) Ob törzs (Csilléri et al., 1983) fertőzésére, de fogékony a P1, 2, 3 patotípusú paprika enyhe foltosság

vírus (paprika mild mottle tobamovirus) SL-törzs (McKinney, 1952; Wetter et al., 1984) fertőzésével szemben.

Az L4 gén védettséget ad az eddig ismert valamennyi patotípus fertőzésére. Eltérő patogenitású törzsek

inokulációjával elvileg minden paprikafajta tobamovirus-rezisztenciaszintje megállapítható.

2.1.

2.1.1.

2.1.1.1.

2.1.1.1.1. A burgonya rezisztenciagénjeinek szerepe a vírusellenállóságban

A burgonya biológiai leromlása – amelyet a kedvezőtlen környezeti feltételek is elősegítenek – az egyre inkább

fokozódó vírusfertőzésekre vezethető vissza. A leromlásban mintegy 30 vírus vesz részt, de ismert, hogy a

burgonyát mintegy 266 kórokozó és kártevő károsítja (Mendoza, 1986). A fontosabb vírusok a következők:

burgonya levélsodródás vírus (potato leafroll polerovirus), burgonya Y-vírus (potato Y potyvirus), burgonya X-

vírus (potato X potexvirus), burgonya S-vírus (potato S carlavirus), burgonya M-vírus (potato M carlavirus),

burgonya A-vírus (potato A potyvirus), dohány rattle vírus (tobacco rattle tobravirus). E kórokozókkal szemben




a különböző vad Solanum fajok eltérő magatartást mutatnak. Jelenlegi ismereteink szerint ma már több mint 150

vad gumós Solanum faj ismert, és mintegy 5 ezerre becsülhető a primitív burgonyaklónok száma (Huaman,

1986; Ochoa, 1990). Igen jelentős azoknak a fajoknak a szerepe, amelyek vírusrezisztencia-tulajdonságaiknál

fogva az európai burgonyafajtákban mint keresztezési partnerek vesznek részt. A Solanum demissum 335, a S.

tuberosum ssp. andigena 298, a S. stoloniferum és a S. vernei 41–41, a S. acaule 39, a S. phureja 27, a S.

spegazzini 11, a S. chacoense 10 fajtában található meg (Hermsen, 1989). A legfontosabb genetikai anyagok

(vad Solanum fajok) rezisztenciatulajdonságát a 29. táblázatban foglaltuk össze.

29. táblázat - A genetikai bázis (Solanum fajok) vírusrezisztenciája (Horváth, 1988

után) 1, 2, 3

Solanum fajok/fajták Fertőzéssel

szembeni

rezisztencia

Túlérzékenys

égi

rezisztencia

(HR-rezi

sztencia)

Immunitás

Solanum acaule PLRV PVX, PVY PVX

S. cardiophyllum PVM

S. demíssum PLRV, PVY PVA, PVX,

PVY

S. megístacrolobum,

EBS 1787

PVM, PVS

S. microdontum PVM, PVS

S. phureja PVY

S. stoloniferum PVY, PVA PVY, PVA

S. tuberosum ssp.

andigena

PVS PVX, PVY

S. tuberosum ssp.

tuberosum

PVX

S. vernéi PVY PVY, PVA

S. tuberosum cv. Arran

Pilot

TRV

1 PLRV, potato \safro\\polerovirus (burgonya levélsodródás vírus); PVA, potato Apotyvirus (burgonya

A-vírus); PVM, potato M carlavirus (burgonya M-vírus); PVS, potato S carlavirus (burgonya S-vírus); PVX,

potato X potexvirus (burgonya X-vírus); PVY, potato Y potyvirus (burgonya Y-vírus);TRV, tobacco rattle

tobravirus (dohány rattle vírus).

2 A Solanum phureja rezisztens a Pseudomonas solanacearum baktériummal szemben is.

3 Barker (1996) újabban a Solanum stoloniferum vad fajból származó dr. Macintosh és Maris Piper

burgonyafajtákban - amelyek immunitást (Ry-gén) mutattak a burgonya Y-vírus (potato Y potyvirus) törzseivel

(PVY°, PVYN, PVYNTN) szemben - egy korábban nem ismert Ra-gént is kimutatott; ez a gén a burgonya A-vírus

(potato Apotyvirus) rezisztenciájáért felelős.




A burgonya vírusrezisztenciáját szabályozó fő géneket a 30. táblázat tartalmazza.

30. táblázat - Fontosabb rezisztenciaszabályozó gének (Foxe, 1992 után)

Vírus1 A rezisztencia típusa Gén

PLRV intolerancia NI

PVY lokális hiperszenzitivitás

extrém rezisztencia Ny

Rysto

Ryadg

PVX lokális hiperszenzitivitás

extrém rezisztencia Nx,

Nb

Rx

PVS lokális hiperszenzitivitás Ns

PVM lokális hiperszenzitivitás

extrém rezisztencia Na

Rysto

TRV intolerancia Nt

1 PLRV, burgonya levélsodródás vírus (potato \eafro\\polerovirus); PVY, burgonya Y-vírus (potato Y

potyvirus); PVX, burgonya X-vírus (potato X potexvirus); PVS, burgonya S-vírus (potato S carlavirus); PVM,

burgonya M-vírus (potato M carlavirus); TRV, dohány rattle vírus (tobacco rattle tobravirus).

• A burgonya Y-vírussal (potato Y potyvirus) szembeni ellenálló képesség kialakítása

A vírusnak négy törzstípusa ismert: PVYN = PVYO, PVYR = PVYN, PVYC = PVYC és PVYAn = PVYAn (Horváth,

1966a,b, 1967a,b). A leggyakoribb a közönséges PVYO vagy normál törzs, amely mozaikfoltossággal, a levelek

elszáradásával vagy lehullásával jellemezhető. A nekrotikus PVYN törzs fertőzése ugyan enyhébb tünetekkel jár,

de dohányon érnekrózist okoz. A vírus legújabb törzse (PVYNTN) pedig a burgonyán gumónekrózist vált ki

(Beczner et al., 1984). A PVYC törzs levéltetű-átviteli képességét elveszítette. Ez utóbbi fertőzését az Nc gén

jelenlétében a hiperszenzitív reakció legyőzi. A rezisztenciára nemesítés iránya egyrészt az N és az R fő gének

bevitelén, másrészt a Solanum chacoense, S. demissum, S. microdontum, S. stoloniferum vad burgonyafajok

hibridizálásán alapul. Az Ny gén expressziója változó, és a domináló vírustörzstől függő, míg az Ry gén stabil és

nem vírustörzs-specifikus. Az extrém rezisztenciát adó gént a Solanum stoloniferum és a S. tuberosum spp.

andigena vadburgonyában találták meg. A rezisztenciát egyetlen domináns gén biztosítja az összes törzs

fertőzésével szemben. Ma már a legtöbb burgonyafajtában jelen van az Ry gén, amely egyéb vírusellenálló

képességgel kombinálódik (Horváth és Wolf, 1991; Barker, 1996). A kvantitatív, nem lokalizálódó és extrém

rezisztenciáért (immunitás), valamint a HR-reakcióért, ill. a kvalitatív lokalizált rezisztenciáért felelős gének a

Solanum alandiae (BGRC 27326), Solanum stoloniferum (Ryston2, Rystorna, Rystona) növényben találhatók

meg a burgonya Y-vírussal (potato Y potyvirus) és a burgonya A-vírussal (potato A potyvirus) szemben (106A

ábra). A burgonya Y-vírussal szemben további rezisztenciagének vannak a Solanum andigenum (Ryadg), S.

chacoense (Nychc), S. hougashi (Ryhou), S. pinnatisectum, S. polytrichon, S. simplicifolium, S. vernei, S. tuberosum

(Ntbr) növényekben.

106. ábra - A: a burgonya Y-vírussal (potato Y potyvirus) szembeni hiperszenzitív

reakció (az inokulált leveleken kialakuló nekrotikus léziók) Solanum tuberosum

növényen. B: Solanum venturi (BGRC 8237) vad faj reakciója (szisztemikus mozaik) a

burgonya X-vírussal (potato X potexvirus) szemben




• A burgonya X-vírus (potato X potexvirus) rezisztenciára nemesítés eredményei

A vírusrezisztenciát nyújtó fő gének a következők: Nb, Nx, Rx, Rxacl és Rxadg. A vírustörzsek csoportosítása annak

megfelelően történik, hogy mely rezisztenciagéneket képesek áttörni (31. táblázat).

31. táblázat - A burgonya X-vírus (potato X potexvirus) törzsek csoportosítása (Foxe,

1992 után)

Gén Törzstípus1

1 2 3 4

nxnb + + + +

Nxnb – + – +

nxNb – – – +

NxNb – – – +

Rx – – - –

1 + = Fogékony; – = Rezisztens.

A leggyakoribbak a 3. csoportba tartozó törzsek, a legritkábbak a 4. típusúak. Az Rx gén minden vírustörzs ellen

hatásos, kivéve a HB bolíviai törzset. Ezeket a géneket már több fajtába sikeresen beépítették. A

vírustörzscsoportok eltérő földrajzi elhelyezkedésének nagy jelentősége van (Valkonen et al., 1994).

• A burgonya levélsodródás vírussal (potato leafroll polerovirus) szembeni ellenállóság kialakítása

Némely fajta esetében a vírusrezisztenciát adó NI fő gén jelenlétében (amit kisebb gének módosíthatnak) a

növények szisztemikus hiperszenzitivitás miatt elpusztulnak. Emiatt a nemesítési programok jó részében ez a fő

gén nem szerepel. A betegség-ellenállóság kialakítása poligénikus úton történik, amelynek kifejeződése

mennyiségi jellegű, nehezen, csak évekig tartó, magas infekciós nyomásnak kitett szabadföldi kísérletekkel

ellenőrizhető. Az ellenálló képesség kialakítása részben a fertőzés elleni védelemre, részben a vírusszintézis

csökkentésére, részben a transzlokáció megakadályozására irányul. A vírusszintézis gátlásáról több diploid

burgonyafaj (Solanum etuberosum és S. brevidens) esetén beszámoltak. Ez utóbbi fajokat a biotechnológiai

védekezés során fel is használták protoplasztfúziókra, tekintettel arra, hogy szexuális úton nem keresztezhetők a

kultúr burgonyafajtákkal. Ezek a fajok burgonya Y-vírus (potato Y potyvirus), burgonya A-vírus (potato A

potyvirus) és burgonya X-vírus (potato X potexvirus) ellenállósággal is rendelkeznek (Fehér et al., 1990;

Valkonen et al., 1991, 1992; Horváth et al., 1993b, 1996).

• Egyéb burgonyapatogén vírusok




A burgonya A-vírus (potato A potyvirus), a burgonya M-vírus (potato M carlavirus) és a burgonya S-vírus

(potato S carlavirus) gazdaságilag kevésbé jelentősek, ennek ellenére a nemesítési programokban szerepel a

rezisztencia kialakítása. Ismert, hogy a burgonya A-vírussal szemben hiperszenzitív az Na gén, míg az Ry gén

extrém ellenálló képességet nyújt (Barker, 1996). A burgonya M-vírus fertőzését a Gm domináns gén

szabályozza, amelynek működését kisebb gének kontrollálják. A burgonya S-vírus ellen az Ns gén nyújt

védelmet. A dohány rattle vírus (syn.: burgonya szártarkulás vírus; tobacco rattle tobravirus) elleni védelmet

egyetlen fő gén (Nt) adja (Foxe, 1992; Swiezynski, 1994).

3. Az extrém rezisztencia kialakítása és ellenőrzési módszerei

A burgonya Y-vírussal (potato Y potyvirus) szembeni extrém rezisztencia

• A szülőpartnerek kiválasztása és vizsgálata

A nemesítési cél meghatározását követően ki kell választani azokat a keresztezési partnereket, amelyekkel a

kitűzött cél várhatóan a leghatékonyabban és a leggyorsabban érhető el (Horváth, 1968; Ross, 1986; Foxe,

1992). Rendszerint meglévő fajtába vagy értékes nemesítési vonalba próbálják bevinni a kiválasztott

rezisztenciagént. A burgonya Y-vírussal (potato Y potyvirus) szemben extrém rezisztenciát nyújtó, dominánsan

öröklődő Ry gént Solanum stoloniferum (Rysto) és S. tuberosum ssp. andigenum (Ryadg) növényekben

azonosították. Az Rysto extrém rezisztenciát ad a burgonya A-vírussal (potato A potyvirus) szemben is, míg az

Ryadg nem. A S. stoloniferum növénnyel történő keresztezés eredményeként citoplazmatikus hímsterilitás (CMS)

lép fel az utódokban, ami a S. tuberosum sejtmagi és a S. stoloniferum citoplazmai genetikai állománya

összeférhetetlenségének a következménye. Ennek eredményeként az extrém rezisztenciát hordozó utódok csak

anyaként használhatók fel, ami a visszakeresztezési programok hatékonyságát csökkenti. A vad, illetve primitív

fajokkal történő keresztezés esetén számítani kell arra, hogy a felhasznált genotípusok kedvezőtlen tulajdonságai

(egyes morfológiai bélyegek, a kívánatosnál több gumókötés, sérülésérzékenység, rossz íz, magas

alkaloidtartalom stb.) megjelenhetnek az utódokban, ezért ha mód van rá, kultúr genotípusokat kell használni.

Ma már számos, kiváló kultúrtulajdonsággal rendelkező burgonyafajta tartalmazza az Ry gént. A nemesítési

programot a CMS figyelembevételével célszerű megtervezni. Meg kell azonban jegyezni, hogy a

fajtaszabadalom bevezetése óta a szabadalmaztatott fajták genetikai állományának felhasználásához a nemesítő,

illetve fajtatulajdonos hozzájárulása szükséges. Amennyiben valamilyen fontos ok miatt a nemesítési

programban vad fajokat használunk fel, azok különböző nemzetközi génbankokban hozzáférhetők (Horváth,

1988). Itt azonban figyelembe kell venni, hogy a vad Solanum fajok különböző származékainak rezisztenciája

eltérő lehet, ezért pontosan azonosítható vonalakat kell használni, vagy a nemesítő csoport virológusának kell

megvizsgálnia a rezisztenciaszintet (Horváth és Hoekstra, 1989; Bősze et al., 1996). A nemesítési alapanyag

külföldről, különösen más kontinensről történő beszerzése komoly veszélyeket rejt magában (Howell, 1981;

Horváth et al., 1993a). Éppen a burgonya Y-vírus (potato Y potyvirus) dohány érnekrózis törzsének (PVYN)

nemesítési alapanyaggal Dél-Amerikából Európába kerülése igazolja ezt a veszélyt. Ezért alapvető

követelmény, hogy a beérkezett genotípusok kórokozó-mentességét karantén körülmények között – e könyv más

fejezeteiben ismertetett – in vitro és in vivo módszerekkel igazoljuk. Mielőtt egy kiterjedt nemesítési

programban szülőpartnerként felhasználnánk valamely fajt vagy fajtát, célszerű vele megfelelő számú

tesztkeresztezést végezni, a kombinálni kívánt tulajdonságok öröklődése, valamint a fertilitási viszonyok

megállapítása céljából. Az apai vonalak pollenjének fertilitása kárminecetsavas festéssel egyszerűen

megállapítható.

• Kárminecetsavas festés

a. 5 g kármint horzsakő jelenlétében, 100 ml 45%-os ecetsavban 30 percig forralunk.

b. A festékoldatot kihűlés után leszűrjük.

c. A vizsgálandó pollenből vett mintát (min. 200 pollen) tárgylemezre helyezzük, és 2 perces kárminecetsavas

festést követően megvizsgáljuk a megfestődött pollenszemek arányát.

d. Ha a mintában 10%-nál kevesebb pollen festődik meg, akkor a vizsgált fajt (fajtát) apai szülőpartnerként

alkalmatlannak kell tekinteni.

Megjegyzés: A módszer gyors és egyszerű, megbízhatósága azonban nem minden esetben kielégítő.




• Fluoreszcein-diacetátos (FDA) festés

a. 0,5 ml szacharózoldathoz 1 ml acetonban feloldott 2 mg FDA-t kell adni.

b. A pollenmintát 30 percig inkubálni kell az oldatban, majd vízzel kimosni.

c. Az enzim hatására keletkezett fluoreszcinmennyiséget UV-lámpa alatt lehet vizsgálni.

Megjegyzés: Ez a módszer a legbiztonságosabb.

A partner-előállító (genetikai) vagy a közvetlen fajta-előállító program céljainak megfelelő szülőpartnerek

kiválasztása során figyelembe kell venni, hogy a keresztezés során előállított magoncokat és azok utódait

mintegy 50 tulajdonságra kell vizsgálni. Ehhez megfelelő számú magonc előállítása és megfelelő számú

keresztezési kombináció alkalmazása szükséges. A jelenleg elfogadott álláspont szerint a keresztezési

kombinációk számának növelése hatékonyabb megoldás, mint egy keresztezési kombináción belül a magoncok

számának növelése. Az egy nemesítési program (nemesítő intézet) számára évenként javasolt keresztezési

kombinációk száma 150–300, az egy kombinációban előállított magoncok száma pedig 400–500.

3.1.

3.1.1.

3.1.1.1.

3.1.1.1.1. Keresztezési technikák

A nemesítési tervnek megfelelő számú magonc előállításához mindenekelőtt a szülőpárok felneveléséről kell

gondoskodni. A szülőpartnerek mind üvegházban, mind szabadföldön felnevelhetők. A virágzás szempontjából

a környezeti tényezők közül a fénynek és a hőmérsékletnek van jelentős szerepe. A burgonya (S. tuberosum ssp.

tuberosum) a virágfejlődés szempontjából hosszúnappalos növény. A fajták között a megvilágítás időtartama

iránti érzékenység szempontjából különbségek vannak, azonban általánosan elfogadott, hogy az optimális

virágfejlődéshez legalább 16 órás megvilágítás szükséges. A túl magas és túl alacsony hőmérséklet szintén

gátolja a virágzást. Az optimális hőmérséklet 16–22 °C között van. A virágzás jelentős csökkenéséhez vezet, ha

az elültetett gumó fiziológiailag öreg (a nyugalmi időszak letelte és az ültetés között túl hosszú idő telik el).

Vannak olyan fajok és fajták, amelyek megfelelő környezeti feltételek biztosítása mellett is csak gyenge

virágzási hajlamot mutatnak. Ilyen esetben alkalmazhatók a különböző, virágzást indukáló módszerek.

A vegyszeres kezelések kivételével – amelyek hatékonyságáról eltérőek a vélemé-nyek – a módszerek többsége

a képződő fiatal gumók eltávolításán vagy a gumóképződés megakadályozásán alapul. A „téglára ültetés”

módszere esetén a téglára helyezett gumóból fejlődő növény gyökereit a mélyebb talajrétegbe vezetik. A növény

gumó feletti részéről a talajréteget lemosva a képződő fiatal gumók folyamatosan eltávolíthatók. Az

asszimiláták gumóképződéshez történő felhasználását azzal is akadályozhatjuk, ha a burgonya hajtását

paradicsom alanyra oltjuk. A keresztezések végrehajtására alkalmazott egyszerű módszer az, amikor a

szántóföldön begyűjtött, még ki nem nyílt virágzatot a kasztrálást és beporzást követően antibiotikumot

tartalmazó vízzel töltött edényekbe helyezik és üvegházi körülmények között nyerik a bogyótermést.

A szülőpartnerként kiválasztott anyai és apai vonalak virágzásának szinkronizálása nehéz feladat. Célszerű az

apai vonalak pollenjét előre begyűjteni és a keresztezésig tárolni.

• A pollen begyűjtése és tárolása

a. Az érett, de még fel nem nyílt portokokat tartalmazó virágokat szitára helyezzük és 24–48 óráig szárítjuk

szobahőmérsékleten.

b. A pollenszemek a szita rázogatásával a portokokból kinyerhetők.

c. A pollenszemek a portokokból vibrátorral frissen is kinyerhetők.

d. A pollen hűtőszekrényben, 4 °C-on 10 napig tárolható. Hosszabb tárolás estén a pollenszemeket 24–48 óráig

30 °C-on szárítjuk, majd fiolákban légmentesen lezárva –20 °C-on tároljuk. Az így tárolt pollenszemek

csírázóképességüket hosszú ideig megőrzik (a vizsgálatok szerint 19 hónap után a pollenszemek 87%-a még

csírázóképes).




A nemesítők véleménye megoszlik abban a kérdésben, hogy szükséges-e a kiválasztott anyai szülőpartner

éretlen portokjainak eltávolítása (kasztrálás) a keresztezés előtt. Egyesek véleménye szerint az önmegporzás,

valamint a rovar- és szélmegporzás valószínűsége olyan kicsi, hogy a kasztrálás elhagyható, míg mások a biztos

keresztezési kombináció létrejötte érdekében javasolják elvégezni. A kasztrálás akkor végezhető el káros

következmények nélkül, amikor a még ki nem nyílt bimbóból a bibe kibújik.

A keresztezéseket a biztosabb megtermékenyülés érdekében célszerű a délelőtti órákban elvégezni, mert a

környezeti feltételek ebben az időszakban a legkedvezőbbek.

• Keresztezés

a. A pollen felvitelének egyszerű módja egy olyan cső alkalmazása, amelybe a bibe belefér (pl. szívószál). A

csövet a végétől néhány mm-re lezárjuk.

b. A csövet a pollenbe mártva a pollenszemek berakódnak és a bibére húzva azon megtapadnak.

c. A keresztezéskor a nem megtermékenyített (éretlen vagy elöregedett) virágokat lecsípjük, és a virágzatot a

keresztezési kombináció azonosítására alkalmas jelöléssel látjuk el.

d. A bogyók érés után gyorsan leválhatnak a kocsányról, ezért időben kell begyűjteni őket, vagy hálóból

készült, megfelelő szellőzést biztosító zacskót kell kötni köréjük.

e. A magokat keresztezési kombinációként a bogyóból kiszedjük, és mosással a bogyóhús-maradványokat

eltávolítjuk (a bogyóhús csírázásgátló anyagokat tartalmazhat). A magok a mosás és szárítás után

gyakorlatilag csírázóképesek.

f. A magokat jó nedvességtartó képességű szaporítóközegbe vetjük, 1–2 cm mélyen. A talajt folyamatosan

nedves állapotban kell tartani, esetleg a csíranövények megjelenéséig a kiszáradás ellen le lehet takarni. Ha

az elsődleges nemesítési célok között a burgonya Y-vírus elleni rezisztencia szerepel ebben a fázisban, a

magoncok 4–6 leveles fejlettségénél a tömeges inokulációt szórópisztollyal elvégezhetjük.

g. A magoncokat ezt követően olyan térállásba ültetjük ki, hogy a gumótermés tövenként elkülöníthető legyen.

Minden magonc alól 1 gumót gyűjtünk be anyatő céljára.

h. Az anyatövek, valamint a további nemzedékek (A, B és C klónok) között erős szelekciót végzünk a kívánatos

tulajdonságokra (32. táblázat).

32. táblázat - Új burgonyafajták nemesítésének vázlata (Ross, 1986 után módosítva)

Év1 Klónok

száma

Gumószá

m

klónonkén

t

Feladatok2

1

400–500 keresztezési kombináció előállítása,

legalább az egyik szülőpartner Ro-1- és

PVY-rezisztens

2 140 000

Tömeges magvetés és korlátozott negatív

szelekció

3 100 000 1 Erős szelekció a növények között

vírusfertőzésre, a gumók között termésre,

alakra, rügymélységre, hússzínre. Téli

vizsgálat Ro-1- és vírusrezisztenciára. A

késői érésű genotípusok kiszűrése érdekében

kémiai szártalanítás csak augusztus elején

végezhető




4 7000 7 A klónok számozása. A növekedési típus, az

érésidő és a betegségek felvételezése. Téli

vizsgálat ízre, főzési típusra,

keményítőtartalomra, elszíneződésre és

feldolgozási alkalmasságra. Ismételt vizsgálat

fonálféreg-rezisztenciára

5 1400 50 Ugyanaz, mint a negyedik évben

6

7

7

500

(100)

10

250

250

1250

Kisparcellás kísérletek. Rezisztenciavizsgálat

varasodásra, rákra, vírusokra és mindkét

nematóda faj patotípusaira. A hetedik év

végén döntés a megfelelő hivatalos

intézményeknél történő bejelentésekről

8 4 5000 Hivatalos vizsgálatok

9 4 0,75 ha Hivatalos vizsgálatok. Vetőburgonya-

termelés indítása

10 1 5 ha Hivatalos vizsgálatok. Vetőburgonya-

termesztés

1 A 6. évtől kezdve a kétséges klónok ismételt vizsgálata.

2 Ro-1, Globodera rostochiensis rassza; PVY, potato Y potyvirus (burgonya Y-vírus).

• Extrém rezisztencia ellenőrzése burgonyafajtákon (Wiersena, 1972)

Az extrém rezisztencia megléte mesterséges körülmények között is lehetővé teszi a fajták vizsgálatát már

palántakorban.

a. Magról nevelt fiatal burgonyapalántákat burgonya X-vírussal (potato X potexvirus) vagy burgonya Y-

vírussal (potato Y potyvirus) – esetleg mindkettővel – inokulálunk, felső festéktartályos magasnyomású

festékszóró pisztoly segítségével. A távolság 2–5 cm, a nyomás 1,5–2 kg/cm3.

b. A fertőzött növényeket 20–22 °C-os fóliaházban tartjuk legalább három hétig. A tünetes növényeket

eltávolítjuk, a tünetmenteseket kiválogatjuk, átültetjük. A módszer a hiperszenzitivitás ellenőrzésére kevésbé

alkalmas. A túlélő, tünetmentes növényeket szerológiailag ellenőrizzük.

c. Ha a kiválasztott növényanyag rezisztenciájáról két- vagy több év után is meg akarunk győződni, a

burgonyanövényekről hajtást szedünk, és azt burgonya X-vírussal vagy burgonya Y-vírussal (vagy

mindkettővel) fertőzött paradicsomnövényekre oltjuk kertészeti oltással. Az ellenőrzést ELISA-

vizsgálatokkal egészítjük ki.

Megjegyzés: A vírusfertőzésekhez célszerű a nekrózist okozó törzseket használni, ami a fiatal, fogékony

növényeket egy hét múlva elpusztítja, illetve azokon három héten belül tüneteket okoz. Az inokulumot használat

előtt nejlonszűrőn átszűrjük, vagy centrifugáljuk. Az inokulumhoz karborundumport keverünk, de az abrazívum

ülepedését a szórópisztoly tartályának enyhe kevergetésével meg kell akadályozni.

Multiplex rezisztenciával rendelkező genotípusok kiválasztása és tesztelése

A multiplex tulajdonságot tesztkeresztezésekkel lehet megállapítani. Ennek során a vizsgálandó genotípust

ismerten fogékony (nulliplex) partnerrel keresztezik. Az utódokat mesterségesen fertőzik, és a fertőződött

egyedek számából következtetni lehet arra, hogy a rezisztenciagént a genotípus hány lokuszon hordozza.

Számos burgonya-kórokozó, különösen a Phytophthora infestans esetében a rezisztenciát áttörő rasszok

megjelenésének nagyobb a jelentősége, mint a vírusoknál. Ilyen törzsek megjelenésének lehetősége, mint




számos példa mutatja, a vírusoknál sem zárható ki (Jones, 1985; Van den Heuvel et al., 1994; Feigelstock et al.,

1995). Ezért inkább a nemesítési program hatékonyságának növelése szempontjából van jelentősége olyan

szülőpartnerek előállításának és felhasználásának, amelyek a rezisztenciagéneket több lokuszon hordozzák. A

tetraploid burgonya esetében az érzékeny genotípusokat (rrrr) nulliplexnek, a rezisztenciagént egy lokuszon

hordozót (Rrrr) simplexnek, a két lokuszon hordozót (RRrr) duplexnek, a három lokuszon hordozót (RRRr)

triplexnek, míg a négy lokuszon hordozót (RRRR) quadriplexnek nevezik. Szülőpartnerrel történő keresztezés

esetén az utódok között az ellenálló:fogékony genotípusok aránya simplex esetén 1:1, duplex esetén 5:1. Triplex

és quadriplex szülőpartner esetén a mendeli szabályok szerint valamennyi utód rezisztens, de ennél kisebb

mértékű eltérés is lehetséges. A multiplex szülőpartnerek felhasználása lehetővé teszi, hogy az előállított

genotípusok szelekcióját más, lényeges tulajdonságra végezzük el, így a nemesítési program gyorsítható,

hatékonysága növelhető.


19. fejezet - A vírus-ellenállóságra nemesítés biotechnológiai módszerei

A vírusbetegségek elleni védekezés leghatékonyabb módja a vírusmentes szaporítóanyag előállítása és a

rezisztenciára történő nemesítés. A korszerű biotechnológiai módszerek alkalmazása mindkét területen igen

sikeres és kifizetődő. Ide szűkebb értelemben azokat az eljárásokat sorolják, amelyekben a növényi sejt

genetikai programját az ember megváltoztatja az így kialakított tulajdonságok technológiai felhasználása

érdekében. Tágabb értelemben azonban ide tartoznak a különböző szövettenyésztési módszerek is.

A laboratóriumokból kikerülő növényfajtajelölteknek természetesen a szabadföldi kísérletekben is sikeresen kell

szerepelniük, hogy azokból engedélyezett növényfajta lehessen. 1987 és 1994 között az Amerikai Egyesült

Államokban 1700 helyen végeztek szabadföldi kísérleteket genetikailag módosított, transzgénikus növényekkel.

Ezek 31%-a herbicidrezisztens (toleráns), 21%-a rovarrezisztens, 14%-a vírusrezisztens, 3%-a gombarezisztens

volt (Schiemann és Casper, 1995). Európában az ilyen szabadföldi kísérletek száma lényegesen kisebb. 1992–

1994 között Franciaországban 95, Belgiumban 59, Angliában 58, Hollandiában 51, Olaszországban 23,

Németországban 22, Spanyolországban 13, Dániában 11 és Portugáliában 4 szabadföldi kísérletet végeztek

transzgénikus növényekkel (Landsmann és Shah, 1995).

Napjainkra már több génsebészeti úton előállított, engedélyezett növényfajtát hoztak forgalomba. Az európai

piacon hímsteril (kukorica, olajrepce), herbicid- és rovarrezisztens (dohány, szója, kukorica), valamint

vírusrezisztens (burgonya, cukorrépa, dohány, paradicsom) fajták vannak. Hazánkban magyar nemesítésű

transzgénikus fajta, ill. fajtajelölt nincs (Heszky et al., 1999).

Általában elmondható, hogy a biotechnológiai módszerekkel olcsóbban és rövidebb idő alatt lehet előállítani

egy adott betegséggel szemben toleráns vagy rezisztens fajtát, mint a hagyományos, „klasszikus”,

növénynemesítési eljárásokkal (Tepfer és Balázs, 1997; Foster és Taylor, 1998). Fontos azonban megállapítani,

hogy a rezisztenciára nemesítés a modern és látványos eredményeket jelentő módszerek bevonásával is csupán

versenyfutás marad a növénynemesítő és a kórokozók újonnan megjelenő törzsei, biotípusai vagy rasszai között.

1. Szomatikus hibridizáció

Termesztett növényeink vad rokonai és ezek különböző származékai számos, jelentős gazdasági károkat okozó

vírussal szemben rezisztenciát mutatnak. Ezek a növényfajok és származékaik értékes alapanyagot jelentenek a

növénynemesítők számára. Ilyen értékes nemesítési alapanyag pl. a Solanum stoloniferum dél-amerikai vad faj

több származéka (PI. 255548, 275245, 275247, 545800 stb.), amelyek extrém rezisztenciát (immunitást)

mutatnak a rezisztenciaáttörő képességgel (resistance breaking) rendelkező burgonya Y-vírus (potato Y

potyvirus) NTN törzsével szemben (Horváth és Wolf, 1995; Bősze et al., 1996). A hagyományos nemesítési

eljárás során a kultúrnövényeket ivaros úton keresztezik a vad fajokkal (származékokkal), hogy a betegség-

ellenállóságot a kultúrfajba (fajtába) bevigyék. Az ivaros keresztezés azonban számos faj között nem lehetséges.

A protoplasztfúzió új utat nyitott a rezisztenciára nemesítésben, mert lehetővé tette, hogy a szexuális szaporodás

megkerülésével olyan fajok egyedeit is keresztezzük, amelyek ivaros módon nem hibridizálódnak és nem

hibridizálhatók egymással (Puite et al., 1988; Filippone et al., 1992; Marchant et al., 1993). A módszer azokban

az esetekben alkalmazható, melyekben protoplasztokból növényegyedeket tudnak regenerálni. A protoplaszt a

növényi sejtfal kíméletes eltávolítása után megmaradó „csupasz” – sejtfal nélküli – sejt. A protoplasztfúzió a

(szomatikus eredetű) protoplasztsejtek egyesítését jelenti. Ennek során – ellentétben a szexuális

rekombinálódással – a szülői sejtek citoplazmája is egyesül. Mivel a kórokozókkal szembeni rezisztenciát

néhány esetben a plasztidok genomja kódolja, a fúziós technikák utat nyitottak olyan egyedek létrehozására,

amelyek a citoplazmás genetikai determinánsok új kombinálódásai (cibridek) (Wenzel, 1985). A szomatikus

hibridizáció előnye, hogy a többgénes öröklődésű reziszten-ciák is átvihetők a vad fajból a termesztett fajtába. A

módszer hátránya azonban szintén abból adódik, hogy egyszerre nagy mennyiségű örökítő anyag kerül át, így

azokkal nem kívánt tulajdonságok jelenhetnek meg a nemesített fajtában. A szomatikus hibridek előállítása

három lépésben történik: 1. a protoplasztok izolálása, 2. a sejtek egyesítése (fúzió), 3. regeneráció és szelekció.

1.1.

1.1.1.


biotechnológiai módszerei


1.1.1.1.

1.1.1.1.1. A protoplasztok izolálása

A növények szomatikus sejtjeiről eltávolítják a sejtfalat. Ez úgy történik, hogy egy növényi szervdarabot egy

sejtfalbontó enzimeket (pektináz, celluláz, hemicelluláz – Trichoderma, ill. Rhizopus gombákból) tartalmazó

folyékony ozmotikum (általában mannitol- vagy szorbitololdat) felszínére helyeznek, és steril körülmények

között inkubálják. A sejtfaluktól megfosztott sejteket, a protoplasztokat elválasztják a törmeléktől, és

tápanyagokat tartalmazó tápoldatba helyezik.

A sejtek egyesítése (fúzió)

Jelenleg erre kétféle módszert alkalmaznak: a protoplaszt-szuszpenziókat összekeverik, és ehhez polietilén-

glikolt (PEG) adnak, vagy pedig elektromos impulzussal kezelik a sejteket. Ezekre a lépésekre azért van

szükség, hogy a negatív töltéssel rendelkező plazmalemma töltésviszonyait megváltoztassák, és így

létrejöhessen a protoplasztok összetapadása, illetve egyesülése.

A PEG-gel történő kezelés úgy történik, hogy Petri-csésze aljára csöppentett protoplaszt-szuszpenzióhoz lassan,

2–3 lépésben adják hozzá a PEG-oldatot. A végső PEG-koncentráció 15–20%, de ez növényfajoktól függ. A

PEG-es inkubálás időtartama általában 20–30 perc. Ezután a Petri-csésze felületére ülepedett protoplasztokról

óvatosan leszívják a PEG-oldatot, és a tenyészetet többször átmossák a táptalajjal. Végül ebben a táptalajban

veszik fel a sejteket.

Az elektrofúzióhoz a kis vezetőképességű mannitol- vagy glükóz-ozmotikumban szuszpendált protoplasztokat

elektromos küvettába helyezik. Ebben a technikában váltóáramnak és egyenáramnak egyaránt szerepe van.

Váltóáram hatására a sejtek – összetapadva – láncot alkotnak az elektródok közötti elektromos erővonalak

mentén, egyenáramú impulzus hatására pedig szakadások jönnek létre az érintkező membránokon. A

protoplasztok fúziója a membránok újrarendeződésekor jön létre.

1.1.1.1.2. Regeneráció és szelekció

A sejtfúziót követően a hibrid sejteket kiemelik a vad típusú protoplasztok közül. Ez mikroszkópos technikák

segítségével, illetve antibiotikumok alkalmazásával történhet. A hibrid sejtvonalakból azután hormonkezeléssel

növényeket regenerálnak. In vitro szövetkultúrákban a növényi sejtekből – a totipotenciának köszönhetően –

teljes növények regenerálódnak. A regenerált növények között nagyok lehetnek a különbségek (szomaklonális

variabilitás). Az öntermékenyülő homozigóta kultúrfajoknál a transzgénikus növények szaporítása

önbeporzással vagy az eredeti fajtával történő visszakeresztezéssel lehetséges. Az ilyen keresztezések

eredményeképpen a szomaklonális variabilitás előfordulási esélye csökken. A vegetatív úton szaporított

növényfajoknál – amelyek általában idegentermékenyülők és heterozigóták – a szomaklonális variabilitás

előfordulását a minimálisra csökkenthetjük, ha az elsődleges transzgén növények közül szelektáljuk a

fajtaazonos transzgén növényeket. A burgonya a szövettenyésztés során magas szomaklonális variabilitásra

képes. Ezért e faj esetében azokat a transzformánsokat kell szelektálni, amelyekben a szomaklonális variabilitás

nem fordul elő (Huisman et al., 1992).

A protoplasztfúzióval előállított szomatikus hibridek sokszor a további ivaros szaporításra alkalmatlannak

bizonyulnak, illetve nemkívánatos tulajdonságok is átkerülhetnek a vad fajokból. A szomatikus sejtgenetika

számos biztató eredménye ellenére is a rezisztenciára nemesítés legígéretesebb útja jelenleg mégis a

transzgénikus növények előállítása.

Protoplasztok izolálása és növények regenerálása dohányból [Nagy (1992) által módosítva]

a. Dohány (Nicotiana tabacum) hajtáskultúráit hormonmentes MS táptalajon, 26 °C-on, 2000 lux fényintenzitás

mellett, 16 órai megvilágítási idő után 8 óráig sötétben tartjuk.

b. Steril Petri-csészébe 8 ml sejtfalbontó enzimoldatot (lásd Táptalajok és oldatok) teszünk.

c. A 4–6 hetes növényekről kifejlett leveleket szedünk.

d. A leveleket fonákukkal fölfelé steril Petri-csészébe helyezzük.

e. A levelekre kevés Cellitet szórunk, és ecsettel óvatosan kenegetve megsértjük az epidermiszréteget.




f. A levelet sértett felületével lefelé az enzimoldat felszínére helyezzük.

g. A Petri-csészét lezárjuk, és egy éjszakán át 26 °C-on, sötétben inkubáljuk.

h. A protoplasztokat enyhe, keverő mozdulatokkal szuszpendáljuk, majd 80 μm-es nejlon szűrőn átszűrjük. A

szűrőre a sejtszuszpenziót széles szájú pipettával átvisszük.

i. A szuszpenziót 10 ml-es centrifugacsőbe helyezzük.

j. A 10 percig történő centrifugálás (60 g) után az intakt protoplasztok a folyadékoszlop felszínén sötétzöld

gyűrűt képeznek.

k. A protoplasztokat Pasteur-pipettával 8 ml-es W5 ozmotikumot tartalmazó centrifugacsőbe visszük át úgy,

hogy a táptalajból minél kevesebbet szívjunk fel, majd két percig centrifugáljuk.

l. A leülepedett protoplasztokról leszívjuk az ozmotikumot és a sejteket 1 ml K3-as táptalajban

reszuszpendáljuk.

m. Egy csepp szuszpenziót Fuchs-Rosenthal- vagy Bürker-kamrába teszünk, és mikroszkóp alatt megszámoljuk

a protoplasztokat. Ha a szuszpenzióban túl sok a sejttörmelék, a W5-tel történő mosási lépést meg kell

ismételni. Optimális esetben a protoplasztkinyerés 2–3 millió sejt/g friss növényanyag. A protoplasztfúzió

vagy a transzformálás PEG-es kezelés, illetve elektromos impulzus hatására következik be.

n. A protoplasztokat a táptalajjal 105 sejt/ml koncentrációra higítjuk. Ebből a keverékből 4 cm-es átmérőjű

Petri-csészékbe 2,5–2,5 ml-t mérünk, majd a Petri-csészéket lezárjuk és 26 °C-ra, sötétbe helyezzük.

o. A protoplaszttenyésztés, illetve a növényregenerálás a 33. táblázatban leírtak szerint történik.

33. táblázat - Protoplaszt-tenyésztés és a növényregenerálás körülményei

Idő

(nap) Táptalaj

Ozmotik

um Növekedésszab

ályzó Kezelés Fejlődési állapot

0–5 K3 0,4 M 2 mg/1 NAA,

1 mg/1 BAP

tenyésztés sötétben protoplasztok,

sejtfal-

regenerálódás,

első sejtosztódás

6–14 K3 0,4 M 1 mg/1 BAP,

0,1 mg/1 NAA

átoltás új táptalajba

10-szeres hígítással

(fény)

fejlődő kolóniák

(50–70 sejtesek)

15–28 K3 0,2 M 0,5 mg/1 BAB,

0,05 mg/1

NAA

átoltás 5-szörös

hígítással (fény) 1–2 mm-es, zöldes

kolóniák

28–50 B5

0,8% agár

3%

szaharóz

– 0,5 mg/1 BAP,

0,01 mg/1

NAA

kolóniák átoltása

agár táptalajra (fény) hajtásprimordia

40–60 MS

0,8% agár

– 0,1 mg/1 BAP,

vagy

hormonmentes

fejlődő hajtások

áthelyezése

zöld hajtások,

gyökérkezdeménye

k




2%

szaharóz új táptalajra

60-tól MS

0,8% agár

2%

szaharóz

hormonmentes fejlődő hajtások

áthelyezése új

táptalajra

10-15 naponként

gyökeres

növénykék

1.1.1.1.3. Táptalajok és oldatok

a. Sejtfalbontó enzimoldat: 0,7% celluláz és 0,25% macerozim (Sigma) 0,4 M szaharóz-tartalmú K3

táptalajban.

b. K3-as táptalaj: Makroelemek: 2500 mg/l KNO3; 250 mg/l NH4NO3; 250 mg/l MgSO4 × 7 H2O; 300 mg/l

CaCl2 × 2 H2O; 150 mg/l NaH2PO4 × H2O; 134 mg/l (NH4)2SO4; 50 mg/l CaHPO4; 27,8 mg/l FeSO4 × H2O;

37,3 mg/l Na2EDTA. Mikroelemek: 2 mg/l ZnSO4 × 4 H2O; 3 mg/l H3BO3; 0,75 mg/l KI; 0,25 mg/l Na2MoO4

× 2 H2O; 0,025 mg/l CuSO4 × 5 H2O; 0,025 mg/l CoCl2 × 6 H2O. Vitaminok: 10 mg/l tiamin-HCl; 1 mg/l

piridoxin-HCl; 1 mg/l nikotinsav; 100 mg/l inozit. Cukrok: 250 mg/l xilóz; 0,4 M szaharóz (protoplaszt-

izoláláshoz); 0,4 M glükóz (sejtkultúrához). Hormonok: lásd 33. táblázat.

c. B5 táptalaj: Makroelemek: 2500 mg/l KNO3, 150 mg/l CaCl2 × 2 H2O, 250 mg/l MgSO4 × 7 H2O, 134 mg/l

(NH4)2SO4, 150 mg/l NaH2PO4 × H2O. Mikroelemek: 2 mg/l ZnSO4 × H2O, 3 mg/l H3BO3, 0,75 mg/l KI, 0,25

mg/l Na2MoO4 × 2 H2O, 0,025 mg/l CuSO4 × 5 H2O, 0,025 mg/l CoCl2 × 6 H2O, 13,2 mg/l MnSO4 × H2O,

27,8 mg/l FeSO4 × 7 H2O, 37,3 mg/l Na2EDTA × 2 H2O. Vitaminok:1 mg/l nikotinsav, 1 mg/l piridoxin HCl,

10 mg/l tiamin HCl, 100 mg/l mio-inozit. Hormonok: lásd 33. táblázat.

d. W5 ozmotikum: 9000 mg/l NaCl, 18 400 mg/l CaCl2 × H2O, 400 mg/l KCl, 1000 mg/l glükóz (pH 5,8).

1.2. A burgonya és a Solanum brevidens szomatikus hibridjeinek sajátosságai

A Solanum brevidens, nem gumóképző vad burgonyafaj egyes származékai ellenállóak a különböző

burgonyavírusokkal [burgonya levélsodródás vírus (potato leafroll luteovirus), burgonya Y-vírus (potato Y

potyvirus), burgonya X-vírus (potato X potexvirus), burgonya andeszi látens vírus (potato Andean latent

tymovirus), burgonya A-vírus (potato A potyvirus), burgonya M-vírus (potato M carlavirus), burgonya S-vírus

(potato S carlavirus)] szemben (Jones, 1979; Austin et al., 1985; Horváth et al., 1987; Gibson et al., 1988, 1990;

Pehu et al., 1990; Fehér et al., 1990; Valkonen et al., 1991, 1992, 1995; Horváth et al., 1993, 1996). A S.

brevidens ivaros úton nem keresztezhető a Solanum tuberosum kultúrnövény fajtáival. A két faj

protoplasztfúzióval előállított vegetatív sejthibridjeiből életképes, gumóval rendelkező fajhibridek nevelhetők

fel (Austin et al., 1985; Gibson et al., 1988; Fehér et al., 1990; Pehu et al., 1990). A vegetatív hibridek még

természetesen nem rendelkeznek a kultúrburgonya-fajták összes jó tulajdonságával, de már alkalmasak arra,

hogy további keresztezési partnerek legyenek és új, vírusnak ellenálló burgonyafajtákat lehessen belőlük

előállítani (Dudits és Heszky, 1990).

Austin et al. (1985) után Helgeson (1992) szintén a S. brevidens (PI 218228) és a S. tuberosum (PI 203900)

származékaival állított elő sejthibrideket. A S. brevidens fenti származéka fertilis diploid, és rezisztens a

burgonya levélsodródás vírussal szemben, viszont rendkívül fogékony a Phytophthora infestans 0 és 4-es

rasszára. A S. tuberosum fenti származéka tetraploid, és fogékony a burgonya levélsodródás vírusra, valamint a

P. infestans 4-es rasszára, viszont rezisztens a gomba 0 rasszával szemben. A szomatikus hibridizáció olyan

fertilis hibrideket eredményezett, amelyek mindkét szülő rezisztenciáját magukban foglalták. A rezisztencia a

szexuális úton létrejövő utódokban is megnyilvánult, és a gumók minőségében is javulás következett be.

2. Molekuláris genetikai módszerek

Molekuláris genetikai módszerek segítségével olyan tulajdonságok vihetők be a növényekbe, amelyekért

egyetlen gén vagy géncsoport a felelős. E beavatkozás attól függetlenül végezhető, hogy mi az eredete

(származási helye) a beültetni kívánt gén(ek)nek. Ily módon egészen új típusú rezisztenciák alakíthatók ki,




mégpedig irányítottan, azaz anélkül, hogy számunkra kedvezőtlen tulajdonságok jelennének meg a fajtában. A

védettséget kialakító gén vagy gének örökíthető módon történő bejuttatása egy növénybe – mind a szomatikus

hibridizáció, mind pedig az itt tárgyalandó növénytranszformálások esetében – akkor lehetséges, ha annak

sejtjeiből egész egyedeket tudunk regenerálni.

A transzgénikus növények előállításával történő vírusok elleni védekezést a bevitt gének forrása alapján

csoportosítjuk: 1. növényi eredetű, természetes vírusellenállóság-gének, 2. vírus eredetű gének, 3. egyéb

vírusellenállóság-gének.

2.1. Védekezés növényi eredetű rezisztenciagének beépítésével

Mivel egy betegségre nézve számos fajta ellenálló, az e tulajdonságért felelős gének legkézenfekvőbb forrását

maguk a növények jelentik. E gének megtalálása és izolálása a 102–104 Mbp (megabázispár) méretű növényi

genomból nem könnyű feladat. A molekuláris genetikai módszerek (PCR alapú technikák, genomtérképezés)

rohamos fejlődése azt eredményezte, hogy napjainkban mind több rezisztenciagén azonosításáról és

klónozásáról számolnak be a szakirodalomban. Ez, elsősorban a korábbi években, a transzpozon „tagging”

módszer (transzpozon nyomon követés) (Osborne és Baker, 1995), míg újabban a molekuláris térképezési

eljárások (Tanksley et al., 1995; Paterson, 1996) sikeres alkalmazásának köszönhető. Az azonosított

rezisztenciagén-családok növekvő számának, valamint azok konzervatív régióinak köszönhetően (Ronald, 1998)

legújabban ún. degenerált oligonukleotidok felhasználásával, PCR technika segítségével emelik ki a

rezisztenciagéneket a különböző növényfajokból.

2.1.1. Transzpozon mutagenezisen alapuló génizolálás

A prokarióta és az állati sejtekhez hasonlóan a növényekben is találhatók ugráló genetikai elemek, úgynevezett

transzpozonok (Shepherd, 1988). Ezeknek az a tulajdonságuk, hogy bizonyos gyakorisággal megváltoztatják a

genomon belüli helyüket. Az integrálódott transzpozon „knock out” mutációt okoz az adott lókuszon, azaz a

gén, amelybe az elem épült, elveszti funkcióját. Az egyes növényfajokban fölfedezett transzpozonrendszerek

jelentős része két elemből áll: egy autonóm és egy nem-autonóm elemből. (Ilyen például a kukoricában

fölfedezett Ac/Ds rendszer.) A nem-autonóm elem csupán akkor képes a helyváltoztatásra, ha az autonóm elem

is egyidejűleg jelen van a genomban. A transzlokáció további feltétele, hogy a sejtben a genom replikációja

végbemenjen (S fázis). Ez csak az osztódó – merisztematikus, illetve embrionális – sejtekre jellemző. Az ugráló

genetikai elemek széleskörű felhasználását az tette lehetővé, hogy azok más növényfajokba átvihetők anélkül,

hogy tulajdonságaikat elvesztenék.

A transzpozon „tagging” módszerrel olyan gének izolálása lehetséges, amelyek fenotípusos hatása egyértelműen

nyomon követhető. Ez a rezisztenciagének esetében általában lehetséges, mivel e tulajdonságok sokszor

egygénes, domináns öröklődésűek. Ilyenek a Tm-1 és Tm-2 gének a paradicsomban, a Rx és Ry gének a

burgonyában, az N és N‟ gének a dohányban. A módszer előnye, hogy nem szükséges a keresett gén

fehérjetermékének az előzetes ismerete, illetve a magas szintű génexpresszió. Az eljárás során a transzpozonok

segítségével mutánsokat állítanak elő, majd a betegséggel szemben érzékennyé vált növényeket szelektálják.

A mutagenezis kétféle genotípusú növény keresztezésével történik (107. ábra). Az egyik a rezisztenciagénre

nézve homozigóta-domináns és nem-autonóm transzpozont tartalmaz, a másik homozigóta-recesszív és a

transzpozon autonóm párját hordozza. A két növény keresztezése után minden utódnövény heterozigóta lesz a

rezisztenciagénre nézve. Mivel azonban az utódok embrionális fejlődése során megtörténik a transzpozonok

áthelyeződése, azok a növények, melyekben az ugráló genetikai elem a keresett gén domináns alléljába

integrálódott, fogékony fenotípust mutatnak. Mivel a transzpozont molekuláris térképezés segítségével, DNS-

hibridizációs és PCR alapú módszerekkel meg tudják keresni az ilyen növények genomjában, az általuk mutált

gén velük együtt kiemelhető. Ez a DNS-fragmentum baktériumvektor-plazmidba klónozva már „kézben van”,

azaz felhasználható a legkülönfélébb molekuláris biológiai alkalmazásokra. Ilyen például a génnek, illetve a

betegséggel szembeni ellenállóképességnek más növénybe történő átvitele (növénytranszformálás).

Transzpozon nyomon követéses módszerrel izolálták a Nicotiana glutinosa növényből származó N gént, mely a

dohány mozaik vírussal (tobacco mosaic tobamovirus) szembeni rezisztenciagén (Dinesh-Kumar et al., 1995).

107. ábra - A transzpozon nyomon követés lépései. Az első lépésben a domináns

rezisztenciagént (R gén) homozigóta formában tartalmazó, nem-autonóm transzpozont

hordozó növényt olyan növénnyel keresztezik, amely a transzpozon autonóm párját

tartalmazza. A nem-autonóm elem az „A” marker gént hordozza annak érdekében,




hogy biztosítsák jelenlétét a növényekben. Az F1 hibridben a nem-autonóm elem

transzlokációját a „B” marker gén meginduló expressziója jelzi. Ezután további

keresztezésekkel eliminálják a riporter gént és az autonóm elemet tartalmazó

kromoszómarészt, illetve szelektálják a mutáns, vírusfogékony növényeket. P =

promóter régió

2.1.2. Térképezésen alapuló génizolálás

A növényi genomtérképezés szédítő fejlődése lehetővé tette, hogy ma már ún. pozicionális vagy genomtérkép

alapú klónozással keressék a rezisztenciagéneket. Ez az eljárás gyorsabb és kevésbé fáradtságos a transzpozon

„tagging” módszernél. Az ugráló elemek ugyanis véletlenszerűen integrálódnak a genomba, így annak

valószínűsége igen csekély, hogy éppen az általunk keresett rezisztenciagént inaktiválják.

A pozicionális klónozás ezt a nehézséget küszöböli ki. Az eljárás a növényfajták egyre részletesebb genomi

térképeit használja fel. E térképeken molekuláris markereknek (jellemző DNS-szekvenciarészleteknek) a

kromoszómákon elfoglalt helyét tüntetik fel. A pozicionális klónozás során a keresett vírusellenállóság-génnek

az azonos kromoszómán lévő markerekhez viszonyított helyét állapítják meg. Ennek érdekében sokszoros

keresztezéseken keresztül nyomon követik és összevetik az utódok betegség-ellenállóságát, valamint a

molekuláris markerek pozícióit (108. ábra). Az utóbbit elsősorban olyan nagy hatékonyságú (nagyszámú

polimorf jelet előállító) „marker-technológiák” alkalmazásával végzik, mint a „random amplified polymorphic

DNAs” (RAPD) vagy az „amplified fragment length polymorphisms” (AFLP). A rezisztenciagéneket azután

molekuláris „környezetük” ismeretében genomi könyvtárakból izolálják. E módszer segítségével azonosították

Arabidopsis thaliana növényből a tarlórépa göndörödés vírussal (turnip crinkle carmovirus), illetve a dohány

karcolatos vírussal (tobacco etch potyvirus) szembeni rezisztenciáért felelős géneket (Dempsey et al., 1997;

Mahajan et al., 1998).




108. ábra - Rezisztenciagén-izolálás molekuláris térképezés segítségével. A: majdnem

izogén vonalak analízise (Nearly Isogenic Lines – NIL). A domináns rezisztenciagént

hordozó, vírusellenálló növényt (P1) keresztezik a fogékony fenotípusú fajtával (P2). A

heterozigóta F1 hibridet a fogékony (P2) szülővel visszakeresztezik. Az utódnövények

közül kiválogatják a rezisztens fenotípusúakat (heterozigóták), majd azokat újból a

homozigóta recesszív (P2) szülővel keresztezik. Ezt a visszakeresztezést több generáción

keresztül ismétlik, és mindig a domináns, vírusellenálló fenotípusra szelektálnak. A

kromoszómapárok rekombinációja („crossing over”) következtében a hetedik

nemzedékben szinte a teljes genom – a rezisztenciagént tartalmazó szűk régió

kivételével – a fogékony szülőtől (P2) származik. Ezek tehát majdnem tökéletesen izogén

vonalak. B: hasadópopuláció-analízis (Bulked Segregant Analyzis – BSA). A domináns

(rezisztens), illetve recesszív (fogékony) homozigóta szülők keresztezéséből származó F1

hibridet önmagával keresztezik. A hasadó F2 nemzedék egyedeit fenotípusuk alapján

két csoportra osztják. A kromoszómapárok rekombinációja („crossing over”)

következtében a rezisztenciagénnel azonos kromoszómán lévő molekuláris markerek

átrendeződnek. C: a molekuláris markereket (polimorfizmusokat) összehasonlítják a

hibrid vonalak fenotípusával, és megkeresik a rezisztenciával együtt hasadó

markereket. Ezek a keresett lókusz közvetlen környezetéből származó

szekvenciarészletek, amelyek segítségével a genomi könyvtárból izolálhatók a

rezisztenciagének




2.2. A kórokozótól származtatott rezisztencia

A patogéntől származtatott rezisztencia (pathogen derived resistance, PDR) felfedezését a keresztvédettség

jelenségének a felismerése tette lehetővé. Viszonylag régóta ismeretes a növényvirológiában, hogy ha egy

növényt megfertőznek egy vírussal, majd később ugyanannak a vírusnak egy súlyosabb tüneteket okozó

törzsével inokulálják a leveleket, akkor a súlyosabb tünetek már nem alakulnak ki; a második vírussal a növény

már nem fertőzhető meg. Ez a jelenség a keresztvédettség (cross protection) (McKinney, 1929; Horváth, 1969;

Matthews, 1992; Fraser, 1998). Feltételezték, hogy a második vírustörzszsel szembeni rezisztencia annak

köszönhető, hogy a sejtekben már jelen van az első vírustörzs köpenyfehérjéje. Az 1980-as évekre lehetővé vált,

hogy ez utóbbit ne vírusfertőzéssel biztosítsák, hanem a növények transzformálásával. Olyan transzgénikus

növényeket állítottak elő, amelyek a vírus köpenyfehérjét kódoló génjét megfelelő promóter mögött hordozták.

Ezek a növények saját maguk „termelték” a vírus köpenyfehérjéjét. A keresztvédettséggel kapcsolatos kísérleti

feltételezés 1986-ban beigazolódott. Powell et al. (1986) beszámoltak arról, hogy a dohány mozaik vírus

(tobacco mosaic tobamovirus) köpenyfehérjegénjét hordozó transzgénikus dohánynövények a vírussal szemben

rezisztensekké váltak. Az ilyen típusú ellenállóságot patogéntől származtatott rezisztenciának nevezik, mivel a

jelenséget kiváltó gén a kórokozóból származik. Az RNS-genommal rendelkező vírusok esetén (a legtöbb

növénypatogén vírus ilyen) ahhoz, hogy a kívánt gén a növénybe építhető legyen, a vírus cDNS klónjait készítik

el. A dohány mozaik vírussal kapcsolatos fenti kísérlet vezette be azokat a vizsgálatokat, melyek eredménye ma

már számos betegség-ellenálló növényfajtához vezetett.

2.2.1. A köpenyfehérjegénnel indukált vírusrezisztencia




A vírusoktól származtatott ellenállóság legelterjedtebb és legsikeresebben alkalmazott formája a vírus

köpenyfehérjéje által közvetített rezisztencia (coat protein mediated resistance) (Fauquet és Beachy, 1992;

Stiekema et al., 1993; Wassenegger, 1998). Ez olyan típusú rezisztencia, amelyet a növényi genomba épített

köpenyfehérjegén vált ki. Ezek a növények ellenállóak az adott vírussal és – bizonyos mértékig – a rokon

vírusokkal szemben is (Stark és Beachy, 1989; Ling et al., 1991). A Powell és munkatársai által 1986-ban közölt

kísérlet (loc. cit.) óta külföldi és hazai kutatók hasonló sikereket értek el a lucerna mozaik vírus (alfalfa mosaic

alfamovirus), az uborka mozaik vírus (cucumber mosaic cucumovirus), a burgonya X-vírus (potato X

potexvirus), a dohány csíkosság vírus (tobacco streak ilarvirus), a burgonya levélsodródás vírus (potato leafroll

polerovirus) és a különböző potyvirusok köpenyfehérjegénjével. Ma már több mint 20 vírussal szemben

állítottak elő köpenyfehérje-transzgénikus, rezisztens növényeket (Fauquet és Beachy, 1992; Stiekema et al.,

1993; Tepfer és Balázs, 1997; Miller és Hemenway, 1998). Ezek mindegyike valamilyen pozitív vagy negatív

RNS-genommal rendelkező vírus köpenyfehérjéjét termelte (34. táblázat).

34. táblázat - A köpenyfehérjegénnel indukált vírusrezisztencia a transzgénikus

növényekben (Miller és Hemenway, 1998)

Vírus-köpenyfehérjegén1 Transzgénikus növény

Arabis mozaik vírus (Arabis mosaic nepovirus) Nicotiana tabacum

Borsó enációs mozaik vírus (pea enation mosaic

enamovirus) Pisum sativum

Burgonya levélsodródás vírus (potato

\eafro\\polerovirus) Solanum tuberosum

Burgonya aukuba mozaik vírus (potato aucuba mosaic

potexvirus) Nicotiana tabacum

Burgonya M-vírus (potato M carlavirus) Solanum tuberosum

Burgonya S-vírus (potato S carlavirus) Solanum tuberosum

Burgonya X- vírus (potato X potexvirus) Solanum tuberosum,

Nicotiana tabacum

Burgonya Y- vírus (potato Y potyvirus) Solanum tuberosum,

Nicotiana tabacum

Cukkini sárga mozaik vírus (zucchini yellow mosaic

potyvirus) Nicotiana tabacum,

Cucurbita pepo

Cymbidium gyűrűsfoltosság vírus (Cymbidium ringspot

tombusvirus) Nicotiana tabacum

Dohány csíkosság vírus (tobacco streak ilarvirus) Nicotiana tabacum

Dohány karcolata s vírus (tobacco etch potyvirus) Nicotiana tabacum

Dohány mozaik vírus (tobacco mosaic tobamovirus) Nicotiana tabacum,

Lycopersicon esculentum




Dohány rattle vírus (tobacco rattle tobravirus) Nicotiana tabacum

Görögdinnye mozak vírus (watermelon mosaic


Cucurbita pepo

Kukorica csíkos mozaik vírus (maize dwarf mosaic

potyvirus) Zea mays

Lucerna mozaik vírus (alfalfa mosaic alfamovirus) Nicotiana tabacum,

Medicago sativa,


Papaya gyűrűsfoltosság vírus (papaya ringspot


Carica papaya

Paprika enyhe foltosság vírus (paprika mild mottle

tobamovirus) Nicotiana tabacum

Paradicsom bronzfoltosság vírus (tomato spotted wilt

tospovirus) Nicotiana tabacum

Paradicsom mozaik vírus (tomato mosaic tobamovirus) Lycopersicon esculentum

Répa nekrotikus sárgaerűség vírus (béét necrotic yellow

vein benyvirus) Beta vulgáris

Rizs csíkosság vírus (rice tripe tenuivirus) Oryza sativa

Saláta mozaik vírus (lettuce mosaic potyvirus)1 Lactuca sativa

Szilva himlő vírus (plum pox potyvirus) Nicotiana tabacum

Szójabab mozaik vírus (soybean mosaic potyvirus) Nicotiana tabacum

Szőlő króm mozaik vírus (grapevine chrome mosaic

nepovirus) Nicotiana tabacum

Uborka mozaik vírus (cucumber mosaic cucumovirus) Nicotiana tabacum,

Cucurbita pepo,

Capsicum annuum,


1 Lásd Dinant et al. (1997)

2.2.1.1.

2.2.1.1.1. A köpenyfehérje által közvetített rezisztencia megjelenési formája

A betegséggel szembeni rezisztenciát a vírusfertőzés után az infekciós helyek számának és/vagy a

betegségszimptómák kialakulásának összehasonlításával értékeljük a köpenyfehérjegént tartalmazó (CP+) és a




köpenyfehérjegént nem tartalmazó (CP–) növényekben. Az elsődlegesen transzformált növényeket és az F1

utódnemzedék rezisztenciáját is értékelik. A rezisztenciára történő tesztelés szempontjából előnyösebb a

növényi populációk vizsgálata, mert a populációkban az egyes egyedek korban, növekedési ütemben és

méretben is egységesek, ezért általában az F1 utódnemzedékben és a következő generációkban értékelik a

rezisztenciát.

A köpenyfehérje által közvetített rezisztencia vizuálisan is megnyilvánul. A rezisztencia első megnyilvánulási

formája az, hogy az inokulált leveleken kevesebb lesz a fertőzési helyek száma. A dohány mozaik vírus

fertőzése következtében a köpenyfehérjegént tartalmazó Nicotiana tabacum cv. Xanthi levelein a lokális

nekrotikus léziók száma 95–98%-kal csökkent a köpenyfehérjegént nem tartalmazó növényekhez képest

(Nelson et al., 1987).

A köpenyfehérjegént tartalmazó növényekben a rezisztencia másik megnyilvánulási formája a szisztemikus

szimptómák kialakulásának akadályozása. Az ilyen típusú növényekben jóval kisebb a valószínűsége annak,

hogy a lokális szimptómák kialakulása után a fertőzés szisztemizálódik.

A rezisztencia harmadik megnyilvánulási formája az, hogy a köpenyfehérjegént tartalmazó növényekben a vírus

jóval kisebb mennyiségben akkumulálódik a fertőzés után, mint a köpenyfehérjegént nem tartalmazó

növényekben. Azok a transzgénikus növények, amelyek a dohány mozaik vírus (tobacco mosaic tobamovirus),

az uborka mozaik vírus (cucumber mosaic cucumovirus), a burgonya X-vírus (potato X potexvirus) és a

burgonya Y-vírus (potato Y potyvirus) köpenyfehérjéjét termelték, a fertőzés után igen alacsony

koncentrációban, vagy pedig egyáltalán nem akkumulálták a vírusokat (Lawson et al., 1987; Nelson et al., 1987;

Cuozzo et al., 1988; Hemenway et al., 1988). A makroszimptómák megjelenésének hiánya és a

vírusakkumuláció elmaradása között szoros pozitív korreláció áll fenn.

Az inokulum koncentrációjának növelése megszüntetheti a rezisztenciát. A dohány mozaik vírus

inokulumkoncentrációjának a növelésével csökkent a transzgénikus növények közül a rezisztens egyedek száma

(Powell et al., 1986). Ezzel ellentétben azonban a burgonya X-vírus, a burgonya Y-vírus és a dohány karcolatos

vírus (tobacco etch potyvirus) köpenyfehérjegénjét tartalmazó növények a rendkívül magas (50 μ/ml)

inokulumkoncentrációval szemben is immunisnak bizonyultak (Hemenway et al., 1988; Stark és Beachy, 1989;

Lawson et al., 1990).

A burgonya X-vírus (potato X potexvirus) köpenyfehérjegénje által közvetített rezisztencia

A burgonya X-vírus a Potexvirus nemzetség típustagja. Hemenway et al. (1988) és Lawson et al. (1990)

létrehozták a burgonya X-vírus köpenyfehérjegén komplementer DNS-ét (cDNS). A létrehozott génkimérákat

agrobaktériumos transzformálással a Bintje és az Escort (Hoekema et al., 1989), valamint a Russet Burbank

(Lawson et al., 1990) burgonyafajtákba építették be. A regenerálódott burgonyanövényekben az összes növényi

protein 0,05–0,3%-a a burgonya X-vírus (potato X potexvirus) köpenyfehérje volt. A burgonya X-vírus

köpenyfehérjegénjét tartalmazó növények vírussal szembeni rezisztenciáját gyökeres dugványokon

tanulmányozták. A vírussal történő fertőzés után a transzgénikus Bintje és Escort fajták 20–50-szer kevesebb

vírust tartalmaztak, mint a nem transzgénikus növények, és a transzgénikus növényekben a betegség szimptómái

is később jelentek meg (Hoekema et al., 1989). Szoros pozitív korrelációt állapítottak meg az akkumulálódott

köpenyfehérje mennyisége és a rezisztencia erőssége között.

A burgonya vírusrezisztenciára történő nemesítése csak akkor eredményes, ha a fajta rezisztenciatulajdonságai

stabilan kifejeződnek, és a fajta egyéb hasznos tulajdonságai is megmaradnak a szabadföldi termesztés során.

Ezért a kérdést úgy kell feltenni, hogy a transzgénikus, burgonya X-vírussal szemben ellenálló burgonyák

hordozzák-e az eredeti fajták, a Bintje és az Escort fontos, egyéb értékmérő tulajdonságait. Ezen kérdés

megválaszolására a transzgénikus klónok szabadföldi viselkedését tanulmányozták 52 fontos, értékmérő

tulajdonság tekintetében. Azt találták, hogy a Bintje fajta transzgén klónjainak mindössze 17,9%-a, míg az

Escort fajta transzgén klónjainak 81,8%-a volt fajtaazonos.

A burgonya Y-vírus (potato Y potyvirus) köpenyfehérjegénje által közvetített rezisztencia

A burgonya Y-vírus a Potyvirus nemzetség típustagja. Lawson et al. (1990) elkészítették a burgonya Y-vírus

köpenyfehérjéjét kódoló gén cDNS-ét, majd azt Russet Burbank burgonyafajtába építették olyan formában,

hogy a gén a növényben kifejeződhessen. Azok a növényi vonalak, melyek a burgonya X-vírus (potato X

potexvirus) és a burgonya Y-vírus köpenyfehérjegénjét egyaránt tartalmazták, egyidejűleg mindkét vírus

fertőzésével szemben rezisztensek voltak. 20 μg/ml burgonya Y-vírus inokulumkoncentráció esetében a




transzgénikus növények rezisztenciát mutattak, míg ez az inokulumkoncentráció a nem transzgénikus növények

80%-át megfertőzte.

Stark és Beachy (1989) a szójabab mozaik vírus (soybean mosaic potyvirus) N törzsének köpenyfehérjét kódoló

génjét építették be a „Xanthi” dohányfajtába. Azok a dohányvonalak, melyek a szójabab mozaik vírus

köpenyfehérjegénjét tartalmazták, az összes kivonható protein 0,001–0,23%-ában akkumulálták a vírus-

köpenyfehérjét. Mivel a szójabab mozaik vírus nem patogén a dohányra, a vonalakat a dohány karcolatos

vírussal (tobacco etch potyvirus) és a burgonya Y-vírussal inokulálták; ezek a vírusok sem egymással, sem a

szójabab mozaik vírussal nem mutattak szerológiai rokonságot. Mégis számos vonal a burgonya Y- és a dohány

karcolatos vírusokkal szemben is bizonyos mértékű rezisztenciát mutatott, néhány vonal esetében azonban még

rendkívül magas (50 g/ml) inokulumkoncentráció esetén is erős rezisztenciát figyeltek meg.

A burgonya levélsodródás vírus (potato leafroll polerovirus) köpenyfehérjegénje által közvetített

rezisztencia

A burgonya levélsodródás vírus (potato leafroll polerovirus) a Polerovirus nemzetség gazdasági szempontból

igen veszélyes tagja. Kawchuk et al. (1991) e vírus köpenyfehérjegénjét építették Russet Burbank

burgonyafajtába. Bár több rezisztens vonalat is találtak a regeneránsok között, egyetlen transzgénikus klónban

sem tudták a köpenyfehérje jelenlétét kimutatni. Ugyanakkor a köpenyfehérjét kódoló messenger RNS (mRNS)

szintje igen magas volt. Ebből arra lehetett következtetni, hogy a rezisztenciát a mRNS, és nem a köpenyfehérje

közvetíti.

2.2.2. A replikáz génnel indukált rezisztencia

A replikázoktól származtatott vírusellenállóság Golemboski et al. (1990) nevéhez fűződik. Amikor a dohány

mozaik vírus (tobacco mosaic tobamovirus) 54 kD méretű replikáz fehérjéjét transzgénikus növényben

expresszálták, a növények ellenállóak lettek a vírusfertőzéssel szemben. Azóta számos esetben alakítottak ki

betegség-ellenállóságot vírusok replikáz génjeinek növényekbe építésével (Baulcombe, 1994; Palukaitis és

Zaitlin, 1997). A paprika enyhe foltosság vírus (pepper mild mottle tobamovirus) 54 kD-os protein génjének a

növényi genomba történő beépítésével ellenállóságot sikerült kialakítani. Az ellenállóság a paprika enyhe

foltosság vírus magas inokulumkoncentrációja esetén sem szűnt meg, más tobamovirusok (pl. dohány mozaik

vírus) azonban áttörték azt. Az 54 kD-os fehérje megcsonkított változata is ellenállóságot indukált a paprika

enyhe foltosság vírus fertőzéssel szemben, amiből azt a következtetést lehet levonni, hogy az ellenállóság

létrejöttéhez nem szükséges a teljes fehérje jelenléte.

A Cymbidium gyűrűsfoltosság vírus (Cymbidium ringspot tombusvirus) elleni, replikáz által közvetített

rezisztencia akkor volt erősebb, amikor a fehérje kisebb mennyiségben termelődött. Az ellenállóság a rokon

vírusok fertőzésével szemben nem nyilvánult meg. A burgonya X-vírus (potato X potexvirus) elleni, replikáz

által kiváltott ellenállóság tekintetében csupán az enzimet kódoló RNS megjelenése is elegendőnek bizonyult.

Az uborka mozaik vírus (cucumber mosaic cucumovirus) nem transzlálódó kettős RNS-szála magas szintű

rezisztenciát indukált. A fenti esetekben tehát az ellenállóságot minden bizonnyal nem a fehérje, hanem az RNS

közvetítette. A lucerna mozaik vírussal (alfalfa mosaic alfamovirus) szembeni rezisztencia esetében azonban az

a transzlációs termékhez volt köthető.

A replikáz génekkel kialakított rezisztenciák mechanizmusairól keveset tudunk. A legtöbb esetben nincs

közvetlen kapcsolat a protein kifejeződése és a rezisztencia mértéke között. Az uborka mozaik vírus (cucumber

mosaic cucumovirus) RNS-polimeráz gén-jét expresszáló dohánynövényekben a vírus sejtről sejtre történő

mozgása, valamint a floémbe lépése is gátolva volt. A legújabb megfigyelések szerint pedig az uborka mozaik

vírus helikáz génjét hordozó dohánynövény egyszerre volt képes gátolni a vírus szisztemikus terjedését,

valamint az inokulált levélben komplementálni a helikáz gént nem tartalmazó mutáns vírust. A replikáz gének

által közvetített rezisztenciákra általánosan elmondható, hogy szűk védettséget eredményeznek, azaz csupán a

legközelebbi rokon vírustörzsek ellen hatékonyak.

2.2.3. A mozgásfehérjegénnel indukált rezisztencia

A vírusok mozgásfehérjéje azok sejtről sejtre történő terjedését teszi lehetővé a fertőzött növényben. A

mozgásfehérje mutált változatainak beépítésével számos esetben vírussal szemben ellenálló növényvonalakat

állítottak elő. Az ilyen transzgéneket hordozó növények mutatták a legszélesebb, patogéntől származtatott

rezisztenciát; azok számos vírustörzzsel, sőt fajjal szemben ellenállónak bizonyultak.




A dohány mozaik vírus (tobacco mosaic tobamovirus) mozgásfehérjegénjének mutált szekvenciájával sikeresen

váltottak ki ellenállóságot transzformált dohánynövényekben.

A fehérhere mozaik vírus (white clover mosaic potexvirus) mutáns 13 kD méretű fehérjéjének beépítésével

olyan dohánynövényeket állítottak elő, melyek nem csupán az eredeti vírusra nézve voltak ellenállóak, hanem

két további, a Potexvirus nemzetségbe tartozó, valamint egy Carlavirus nemzetségbe tartozó vírussal szemben

is. Szintén több génusz képviselőire terjedt ki a védettség azokban az esetekben, amelyekben

burgonyanövényeket transzformáltak burgonya levélsodródás vírus (potato leafroll polerovirus), illetve

burgonya X-vírus (potato X potexvirus) módosított mozgásfehérjéivel. Az előbbi esetben a védettség burgonya

X-vírusra, valamint burgonya Y-vírusra, míg az utóbbiban egy Potexvirus és két Carlavirus nemzetségbe tartozó

vírusra is kiterjedt.

A mozgásfehérjét kódoló vírusgénnel transzformált növényekben ez a fehérje (vagy ennek mutációs változata)

elfoglalhatja a plazmodezmákon található kötődési helyeket, ezáltal kompetitív módon gátolhatja a vírus

eredetű, funkcióképes mozgásfehérje kötődését, amivel megakadályozza a kórokozó sejtről sejtre történő

terjedését. Hordozhat a növénybe épített mozgásfehérjét kódoló gén olyan mutációt is, ami azzal jár, hogy ez a

fehérje verseng a normális mozgásfehérjével, ami szintén gátolja a kórokozó terjedését.

2.2.4. A szatellit RNS (sat-RNS) által közvetített rezisztencia

A szatellit RNS-ek olyan kisméretű molekulák, melyek egyes vírustörzsekkel együtt fertőznek. Jellemző rájuk,

hogy csak a segítő (helper) vírus jelenlétében replikálódnak. Maga az RNS nem mutat homológiát a segítő vírus

genomjával (rövid szakaszoktól eltekintve), és fehérjét nem kódol. A szatellit RNS-ek néhány gazdanövényen

módosítják (erősítik vagy gyengítik) a segítő vírus tüneteit. Ebből ered a szatellit RNS-ek felhasználásának

lehetősége, de kockázata is.

A szatellit RNS jelenléte sok esetben enyhíti az uborka mozaik vírus (cucumber mosaic cucumovirus) fertőzés

tüneteit. A szatellit RNS-szekvenciákat kifejező transzgénikus dohánynövények rezisztensek az uborka mozaik

vírus, valamint a vele rokonságban álló paradicsom magtalanság vírus (tomato aspermy cucumovirus)

fertőzéssel szemben (Harrison et al., 1987). A dohány gyűrűsfoltosság vírus (tobacco ringspot nepovirus)

szatellit RNS-szekvenciáit kifejező dohányok ellenállónak bizonyultak a vírusfertőzéssel szemben (Gerlach et

al., 1987). Ennek a módszernek a kockázata részben abból ered, hogy előfordulhatnak a szatellit RNS és a segítő

vírus olyan kombinációi is, amelyek a tünetek súlyosságát fokozzák. Másrészt a gyenge, illetve a súlyos

tüneteket okozó kombinációk gyakran csak néhány nukleotidban különböznek egymástól. Mivel a szatellit RNS

gyakran szenved mutációt, fennáll a veszélye annak, hogy a transzgénikus növényben esetleg új, virulensebb

törzs keletkezik (Harrison, 1992).

2.2.5. A defektív interferáló (DI) RNS által közvetített rezisztencia

A defektív interferáló (DI) RNS-ek a vírusgenom deléciós származékai. A szatellit RNS-ekhez hasonlóan a DI-

RNS-ek is csak a segítő (helper) vírus jelenlétében replikálódnak, nukleotidsorrendjük azonban szinte teljes

egészében megegyezik a vírusgenom egyes szakaszaival. A DI-RNS-ek jelenléte gyakran gyengített

betegségtüneteket okoz az adott gazdanövényen.

Kollár et al. (1993) új típusú vírusellenállóságot értek el Nicotiana benthamiana növényekben a Cymbidium

gyűrűsfoltosság vírus (Cymbidium ringspot tombusvirus) DI RNS-ének beépítésével. A transzgénikus növények

genomjába integrálódott vírusszekvenciáról DI-RNS transzkriptumok íródtak át, ami azt eredményezte, hogy a

vírussal történt felülfertőzés után teljesen elmaradtak a betegségre egyébként jellemző súlyos tünetek, a csúcsi

nekrózis és az azt követő teljes növénypusztulás.

2.2.6. A köpenyfehérje által közvetített rezisztencia mechanizmusa

Ha a lucerna mozaik vírus (alfalfa mosaic alfamovirus) köpenyfehérjéből néhány aminosavat lehasítottak, akkor

az így „megcsonkított” fehérje alkalmatlan volt a rezisztencia indukálására a transzgénikus növényekben (van

Dun et al., 1988). A dohány mozaik vírus (tobacco mosaic tobamovirus) köpenyfehérjegén az AUG transzlációs

start kodon nélkül szintén nem közvetített vírusellenállóságot (Powell et al., 1990). Ezekből a megfigyelésekből

azt a következtetést vonták le, hogy nem a messenger RNS (mRNS), hanem annak transzlációs terméke, a

fehérje felelős a rezisztencia kialakításáért. A köpenyfehérjegén magasabb szintű kifejeződése a rezisztencia

magasabb szintű állapotához vezetett (Hemenway et al., 1988; Powell et al., 1990). Újabban azonban egyre több

bizo-nyíték utal arra is, hogy a köpenyfehérjegén által transzformált növényekben a rezisztenciát nem mindig a

fehérje közvetíti. A burgonya levélsodródás vírussal (potato leafroll polerovirus) szembeni rezisztencia a




transzgénikus burgonyavonalakban úgy nyilvánult meg, hogy a fehérjét a növényekben nem sikerült kimutatni.

Néhány esetben a köpenyfehérjegén antiszensz orientációban beültetve is védelmet nyújtott (Kawchuk et al.,

1991; van der Wilk et al., 1991). Ezek a tanulmányok azt igazolják, hogy a vírus köpenyfehérjegénjei különböző

típusú rezisztenciát indukálhatnak a transzgénikus növényekben.

Számos vizsgálat utal arra, hogy a köpenyfehérjegén megnyilvánulása gátolja a fertőzés korai eseményeit. A

rezisztencia a dohány mozaik, a lucerna mozaik és a dohány csíkosság (tobacco streak ilarvirus) vírusok

esetében megszűnt akkor, ha a fertőzéseket a vírus nukleinsavával és nem a komplett virionokkal végezték

(Loesch-Fries et al., 1987; Nelson et al., 1987; van Dun et al., 1988). Ezen megfigyelésekre alapozva azt a

következtetést lehetett levonni, hogy a köpenyfehérje által közvetített rezisztencia esetében a fertőzött sejtekben

a virionok szétválása (dekapszidáció) gátlódik. A csak nukleinsavat tartalmazó inokulum azért törte át a

rezisztenciát, mert ezekben az esetekben a fertőzéshez nem volt szükség a dekapszidációra (Register és Beachy,

1988). Ezzel ellentétben a burgonya X-vírus RNS-ével történő inokulálás nem szüntette meg a transzgénikus

növények rezisztenciáját (Hemenway et al., 1988). A fertőzés korai eseményeinek gátlása három módon

lehetséges: 1. a vírus nem tudja „levetni” a fehérjeburokját, ezért nem indulhat el a vírusgének transzlációja. Az

is elképzelhető, hogy a transzgén által kódolt köpenyfehérje blokkolja azokat a növényi sejtben meglévő

receptorokat, amelyekhez a vírus a fertőzés során kötődik; 2. a köpenyfehérjétől megszabadult nukleinsav a

transzgénikus növényben termelődött köpenyfehérjével újra beburkolódik (enkapszidálódik), ezáltal nem tud

fertőzni; 3. a köpenyfehérje a vírus RNS-replikációját befolyásolja (Baulcombe, 1996).

A legtöbb köpenyfehérjegén által közvetített rezisztencia esetén a fertőzés után a szisztemikus tünetek később

jelennek meg, vagy egyáltalán ki sem alakulnak. Ez a vírus sejtről sejtre történő terjedésének, a vírussal

inokulált levélből a szállítószövet-rendszerbe történő áramlásának, a nem inokulált levelekbe történő

behatolásának vagy ezekben a levelekben a fertőzés kezdetének a gátlásából adódhat (Beachy et al., 1990).

Wisniewski et al. (1990) a dohány mozaik vírus (tobacco mosaic tobamovirus) RNS-ével történő fertőzés után

összehasonlította a vírus terjedését a transzgénikus és a nem transzgénikus növényekben. A vírus terjedése a

fertőzési hely szűk környezetében (1–3 mm) mindkét típusú növény esetében hasonló volt, míg azoktól nagyobb

(5–10 mm) távolságokra, illetve más levelekbe a vírus csak a nem transzgénikus növények esetében jutott el. A

nem transzgénikus növényben a dohány mozaik vírus részecskék a szállítószövet-rendszerben és a csúcsi

szövetekben hét nappal korábban jelentek meg, mint a transzgénikus növényekben. Egyes megfigyelések szerint

a köpenyfehérjegénnel transzformált növényekben a víruspartikulumok nem léptek be a szállítószövet-

rendszerbe (Cassab és Varner, 1987).

2.2.7. Az RNS által közvetített rezisztencia mechanizmusa

A vírusszekvenciákkal transzformált növényekben fellépő ellenállóság lehet fehérjék vagy RNS által közvetített

rezisztencia; az előbbi általában széles spektrumú, több vírus ellen érvényesül, de gyengébb hatékonyságú, az

utóbbi a vírusok szűkebb körére terjed ki, ám nagy inokulumtömeg ellen is hatékony (Király és Hornok, 1996a,

b). Az RNS közvetítette ellenállóság annak köszönhető, hogy specifikus, a megcélzott vírus RNS-ét érintő

degradációs mechanizmus működik a transzgénikus növények sejtjeiben (Baulcombe 1996). Ezt a specificitást

áltatában a transzgén nukleinsavsorrendje biztosítja. Újabban azonban olyan eseteket is leírtak, melyekben

caulimo- és nepovirusok elleni rezisztencia homológ nukleáris gén (transzgén) hiányában alakult ki.

Feltételezik, hogy az említett citoplazmatikus RNS-degradáló folyamatot rövid, a célszekvenciával

komplementer RNS-ek de novo szintézise és anellálása (hibridizációja) váltja ki (Goodwin et al., 1996). Az

RNS által közvetített rezisztencia tanulmányozása nagymértékben hozzájárult a transzkripciót követő gén-

lecsendesítés (posttranscriptional gene silencing) felfedezéséhez. Ez az adaptív mechanizmus nem csupán az

inokulált levélben indukálódik, hanem az egész növényben elterjed, ami valamilyen jelátvivő rendszert

feltételez (Voinnet and Baulcombe, 1997). Bár a növényeknek ez az – úgy tűnik – általános, adaptív védekező

rendszere mind jobban jellemzett, az abban részt vevő biokémiai folyamatokról ma még keveset tudunk. Azt,

hogy a gén-lecsendesítésnek valóban fontos szerepe lehet a vírusok elleni védelemben, az is megerősíti, hogy

azok különböző mechanizmusokat fejlesztettek ki a növényi válaszreakció elkerülésé-re. A potyvirusok segítő

komponens fehérjéjéről (HCPro), valamint a cucumovirusok 2b fehérjéjéről kimutatták, hogy azok aktívan

visszaszorítják a gén-lecsendesítést (Kasschau and Carrington, 1998; Brigneti et al., 1998). E jelenségek

vizsgálata ma a növényi molekuláris biológia legintenzívebben kutatott területei közé tartozik.

Ma már nyilvánvaló, hogy nem csak a vírus köpenyfehérjéje közvetítheti a rezisztenciát. 1990 óta növekszik

azon ellenálló vonalak száma, amelyek a vírusok nem strukturális génjeit (nem köpenyfehérje-gént) hordozzák

és expresszálják. Ilyen sikeresen alkalmazott gének a replikáz enzim és a mozgásfehérje (movement protein)

génjei. Ezen túlmenően a vírusgenom számos, fehérjét nem kódoló részével (DI-RNS-ek, szatellit RNS-ek,

mutáns, nem transzlálható genomi szekvenciák) sikerült betegség-ellenállóságot kiváltani. Ebből az az általános




következtetés vonható le, hogy elméletileg bármely vírus eredetű szekvencia alkalmas arra, hogy valamilyen

szintű ellenállóságot váltson ki a transzgénikus növényben (Lomonossoff, 1995).

2.3. Egyéb rezisztenciagének

A rezisztenciagének termékei valamilyen módon blokkolják a vírus szaporodását, növényen belüli mozgását,

vagy csökkentik patológiai hatásait. Korlátozott eredményekkel járó kísérleteket végeztek abból a célból, hogy

ezeket a hatásokat megtervezett módon, mesterségesen (nem természetes rezisztenciagénekkel, ill.

vírusgénekkel) váltsák ki (Wilson, 1993). Ezeket a kísérleteket a növényi genomba ültetett gének alapján a

következők szerint csoportosítjuk:

a. Ribozimokat kódoló gének. A ribozimok olyan RNS-molekulák, melyek endonukleáz enzimekhez hasonló

tulajdonságokkal rendelkeznek. Képesek egy másik RNS-molekulát specifikusan felismerni, és azt adott

helyen elhasítani. Több esetben olyan előre megtervezett ribozimokat ültettek a növényekbe, amelyek egy

adott vírus fertőzése esetén, annak RNS-genomját elhasították, gátolva így a vírus replikációját. A módszer

hátránya, hogy a ribozim és a vírus nukleinsavsorrendjének szinte tökéletesen egymást kiegészítőnek

(komplementernek) kell lennie, így ez a hatás csak a vírusok szűk körére vonatkozhat. A védettség

ugyanakkor csak kismértékű, mivel a sejtben gyorsan replikálódó vírus-RNS-ek invázióját a ribozimok csak

korláto-zott mértékben tudják közömbösíteni. A tünetek kialakulásának enyhe késését figyelték meg dohány

mozaik vírussal (tobacco mosaic tobamovirus) szemben terve-zett ribozimot kifejező dohánynövényeken,

amikor azokat híg koncentrációban fertőzték.

b. Antitesteket kódoló gének. Az antitestek az állati immunrendszer elemei, olyan proteinek, melyek egy másik

makromolekulát, annak jellemző részeit (epitópjait) specifikusan felismerik és megkötik. Ha egy

növénykórokozó vírus ellen előállított antitestet a növényi sejtbe juttatnak (a növényben expresszáltatják), az

nagy valószínűséggel ott is képes lesz az adott vírus megkötésére. Ez a kapcsolódás pedig gátolhatja a

kórokozó szaporodását vagy elterjedését. Tavladoraki et al. (1993) ezzel a megoldással alakított ki

rezisztenciát a Nicotiana benthamiana növényekben az articsóka tarka fodrosodás vírus (artichoke mottled

crinkle tombusvirus) ellen. Mindazonáltal az e területen folyó kutatások még kezdeti stádiumban vannak. A

módszer gyakorlati értékét egyelőre megkérdőjelezi az antitestek összeépülésének bizonytalansága és

alacsony koncentrációja a növényi citoplazmában.

c. Antiszensz vírusszekvenciák. Ebben az eljárásban, akárcsak az antitestek növényben történő felhasználása

esetében, úgy kívánják gátolni a kórfolyamatot, hogy a vírus makromolekuláit megkötik. Ha egy RNS-

genomú vírus cDNS klónjai rendelkezésre állnak, azokat promóter mögé építve, negatív orientációban is

integrálni lehet a növény genomjába. Az ilyen, úgynevezett „antiszenz” transzgénekről keletkező

transzkriptumok, szekvencia-komplementaritásuk következtében, hibridizálnak a citoplazmában a vírus

RNS-kel, ami – valószínűleg többirányú mechanizmusokon keresztül – blokkolja az RNS működését. Azok a

kísérletek, amelyeket az uborka mozaik vírus (cucumber mosaic cucumovirus), a burgonya X-vírus (potato X

potexvirus) és a dohány rattle vírus (tobacco rattle tobravirus) valamely genomrészletének antiszensz RNS-

ével végeztek, csekély eredménnyel jártak. Néhány esetben azonban gyenge védelmet sikerült elérni a

vírusfertőzéssel szemben.

d. „Öngyilkos gének”. Az ebben az eljárásban használt gének rendkívül erős fitotoxinokat kódolnak (például

ricin vagy diftéria toxin). Az „öngyilkos” elnevezés onnan ered, hogy e gének mindaddig

működésképtelenek, míg egy adott vírus meg nem jelenik a sejtben. Ezeket a toxin géneket ugyanis negatív

(antiszensz) orientációban építik be a növénybe, így a róluk átírt RNS-transzkriptum „értelmetlen”. E

transzkriptumok azonban tartalmazzák egy adott vírus RNS-polimeráz enzimje promóter régióját is.

Vírusfertőzés esetén ez az enzim átírja a toxin-RNS „értelmes” szálát, amelyről azonnal megindul a

fehérjeszintézis. A keletkező, erősen toxikus fehérjék pedig az egész sejtet – gyakran a környező szöveti

régiókkal együtt – elpusztítják, mielőtt a kórokozó továbbterjedne a növényben. Diftéria toxint és burgonya

X-vírus szubgenomi promóter régiót tartalmazó konstrukcióval transzformált növényekben a vírus

koncentrációja 1/20-a volt a negatív kontrollnövényekben lévőhöz képest.

2.3.1.

2.3.1.1.

2.3.1.1.1. Nem növénykórokozó mikroorganizmusok génjeivel indukált rezisztencia




Sok olyan mikroszkopikus gombafaj ismert, amelynek egyedeiben több-kevesebb gyakorisággal találhatunk

vírusszerű partikulumokat (virus-like particles, VLP), kettős szálú RNS- (double stranded, dsRNS) genommal.

A legtöbb gomba látszólag alkalmazkodott ehhez az állapothoz, mások viszont védekeztek a VLP-k ellen. A

Schizosaccharomyces pombe fajból klónozták a pac1 gént, amely dsRNS molekulákat bontani képes RNázt

kódol (Iino et al., 1991). Amikor ezt a gént átvitték dohányba, a transzformált növények fokozottan ellenállóvá

váltak a paradicsom mozaik vírussal (tomato mosaic tobamovirus) szemben, de az uborka mozaik vírussal és a

burgonya Y-vírussal fertőzött növényeken is késleltetve jelentek meg a tünetek (Watanabe et al., 1995). A

meglepő védettséget a szerzők azzal magyarázták, hogy az egyszálú növényvírusok szaporodása során kettős

szálú replikációs intermedierek is keletkeznek, és az említett gomba eredetű RNáz ezeket támadja meg.

2.3.1.1.2. Riboszóma-inaktiváló fehérjék által indukált rezisztencia

Vírusok ellen biztosítanak védelmet a riboszóma-inaktiváló fehérjék (ribosome inactivating proteins, RIP).

Közülük a Phytolacca americana fajból származó komponens, a PAP igen hatékony inhibítora számos növényi

vírusnak. Az egyes RIP-ek specifitása nagyon eltérő. Amikor a P. americana PAP génjét dohányba vitték, sok

növényegyed súlyosan károsodott, másokban viszont csekély mértékű volt a transzgén expressziója, így ezeken

nem jelentkeztek látható tünetek. Ez utóbbiak ugyanakkor ellenállóaknak bizonyultak a burgonya X-vírus, a

burgonya Y-vírus, valamint az uborka mozaik vírussal szemben (Lodge et al., 1993).

2.3.1.1.3. Magasabb rendű állatok génjeivel indukált rezisztencia

Egészen különleges lehetőséget kínálnak a magasabb rendű állatokból származó, növényvírusok ellen védelmet

nyújtó gének. Truve et al. (1993) a patkány 2–5A szintetázát kódoló génjével transzformálták a burgonyát, és

ezzel szabadföldi körülmények között is megnyilvánuló ellenállóságot értek el a burgonya X-vírussal (potato X

potexvirus) szemben. Ismert, hogy a 2–5A szintetáz az emlőssejtek interferon által indukált antivirális

védekezési reakciójában vesz részt oly módon, hogy aktiválja a vírus eredetű RNS-molekulák bontását végző

RNázt.

3. A rezisztenciagének beépítése a növényi genomba

A rezisztenciagének forrásától (például természetes rezisztenciagének, vírusgének, „öngyilkos” gének)

függetlenül szükség van azok bevitelére a növényi genomba. Ezt az eljárást növénytranszformációnak nevezzük,

mivel általa örökíthető módon új tulajdonságot lehet bevinni a növénybe. A transzformációs módszerek két

csoportba sorolhatók: 1. indirekt transzformáció és 2. direkt transzformáció. Amennyiben a génbevitel hordozó

(vektor) organizmus alkalmazásával történik, indirekt transzformációról beszélünk. Direkt transzformáció során

a DNS passzív módon (mechanikai, kémiai úton vagy elektroporációval) jut a sejtbe. E sejtekből azután egész

növényeket regenerálnak, melyekben tehát a sejtek mindegyike tartalmazza a bevitt DNS-szekvenciát. A

növénytranszformálás előfeltétele a jól működő regenerációs rendszer, amelynek segítségével növényegyedek

állíthatók elő.

3.1. Az agrobaktériumos transzformálás

A kétszikűeknél a legáltalánosabb, de újabban az egyszikű növényeknél is megjelent az Agrobacterium

tumefaciens (illetve az Agrobacterium rhizogenes) vektor felhasználásával történő génbevitel. Ezek a Gram-

negatív talajbaktériumok a kétszikű növényeket sebzési helyeken fertőzik és tumorokat okoznak rajtuk. A

baktériumok patogenitása öszszefügg a tumorindukáló (Ti) plazmid jelenlétével. A Ti plazmid egy része

(transzfer DNS = T-DNS) a kórfolyamat során átkerül a növényi sejtbe és a sejtmag DNS-állományába

integrálódik (Süle, 1985; Filippone és Penza, 1992). A T-DNS régióban helyezkednek el a tumorok

kialakulásáért felelős gének, míg a T-DNS átvitelét szabályozó gének mindvégig a baktériumsejtben

lokalizáltak. Ha a tumorindukálók helyére más géneket építenek be, azok éppúgy integrálódnak a növényi

genomba. E rendszer felhasználásával a növények gyakorlatilag bármely génnel transzformálhatók (109. ábra).

109. ábra - A növény idegen génnel történő transzformálásának főbb lépései [Salazar,

1996 után]




A T-DNS szakaszt hordozó plazmidot, amelybe a kívánt gén egyszerűen beépíthető, klónozó plazmidnak

nevezik. A növénytranszformálás gyakorlatában a T-DNS a következő régiókat tartalmazza (110. ábra):

a. Szelekciós marker gén (antibiotikum- vagy herbicid-rezisztenciagén) megfelelő promóter és terminációs

régiók között, melyek a gén működését, expresszióját (kifejeződését) teszik lehetővé.

b. A hasznos gén (például rezisztenciagén, vírus-cDNS-szekvencia) szintén promóter- és terminációs régió

között.

c. Határoló régiók. Ezek a T-DNS „jobb és bal oldali” végei, amelyek a szakasz integrálódásához

nélkülözhetetlenek.

110. ábra - A pGA 482 alapú plazmid. Az uborka mozaik vírus (cucumber mosaic

cucumovirus – CMV) Trk7-es törzse cDNS klónjáról származó, 1200 bázispár

hosszúságú régiót, mely a vírus köpenyfehérje génjét (CP) hordozza, az ábrán jelölt

XbaI helyre klónozták 35S promóter és NOS transzkripciós terminál régió közé. BR =

(right border) a T-DNS jobb oldali határszekvenciája; BL = (left border) a T-DNS bal

oldali határszekvenciája; NptII = neomicin-foszfotranszferáz II NOS promóter és

terminál régió között; Tet = tetraciklin-rezisztenciagén baktériumpromóter mögött

A marker gén (leggyakrabban a kanamicinrezisztenciát eredményező neomicin-foszfotranszferáz gén-nptII)

bevitele azért szükséges, hogy segítségével a regenerálás során a transzformáns növények szelektálhatók

legyenek. A növénytranszformálás folyamán alkalmazott lépések növényi rendszerenként eltérőek. Az általános

lépések azonban a következők:

A klónozó plazmidot (rajta a beépíteni kívánt génnel) tartalmazó Agrobacterium sejteket egy éjszakán keresztül

folyékony táptalajban fölszaporítják. A plazmidok hordoznak olyan antibiotikum-rezisztenciagéneket is,

amelyek baktériumpromóter mögött vannak. Így, ha a folyékony táptalajhoz megfelelő antibiotikumot is adnak,

akkor csak azok a sejtek szaporodnak föl, amelyek a kívánt plazmidot tartalmazzák. Ebbe a

baktériumszuszpenzióba mártják néhány másodpercre a megsebzett levél- vagy szárrészt. Ekkor megy végbe az

Agrobacterium fertőzés és a génátvitel. Ezt az explantumot aztán szilárd regeneráló táptalajra helyezik, ahol

megindul a kalluszképződés, majd a hajtásregenerálás. A gyökérregeneráláshoz a fiatal hajtásokat általában

gyökereztető táptalajra helyezik. Ez már kétféle antibiotikumot tartalmazó szelektív táptalaj. Az egyik




antibiotikum az augmentin, vagy cefotaxim, mely a növénykék felületén esetleg átvitt Agrobacterium sejteket

pusztítja el, a másik a T-DNS-en bevitt marker génnek megfelelő antibiotikum (általában kanamicin), melynek

hatására csak a transzformáns (a marker gént, tehát a T-DNS-t hordozó és expresszáló) hajtások gyökereznek

meg.

A fentiekben csupán nagy vonalakban ismertettük a rutinszerű dohánytranszformálás főbb lépéseit. Sok esetben

például nem differenciálódott levélszöveteket, hanem kalluszt transzformálnak, és a kalluszsejteket órákig

együtt tenyésztik az Agrobacterium sejtekkel. Többszöri átoltási lépések után organo- vagy embriogenezis útján

regenerálják az utódnövényeket. Az agrobaktériumos transzformálásban egységes protokoll nincs, a tenyésztési

lépések növényfajoktól és -fajtáktól, valamint laboratóriumoktól függően mások és mások.

A burgonyanövények (Solanum tuberosum) transzformálása (Dietze et al., 1995)

a. Transzformálásra alkalmas növények előállítása. Vírusmentes steril növények 15-15 mm-es hajtáscsúcsait 90

ml 2MS (0,7% Bitec agar, Difco) táptalajra oltjuk félliteres befőttesüvegekben. Négy héttel később 5–6 db,

sötétzöld levelet gyűjtünk be.

b. Az Agrobacterium tumefaciens-t 5 ml (a vektorplazmidnak megfelelő antibiotikumot tartalmazó) YEB

táptalajba oltjuk le 25 ml-es Erlenmeyer-lombikban, és egy éjszakán át 28 °C-on rázatjuk (130 rpm).

c. A leveleket üres Petri-csészébe helyezzük, levágjuk a levélalapi részt és egy éles zsilettpengével két, 1–2 mm

hosszúságú vágást végzünk egymástól 4–5 mm távolságra úgy, hogy a vágások keresztezzék a levél főerét.

d. Tíz ilyen levelet fonákával fölfelé 10 ml 2 MS (folyékony) táptalajt tartalmazó Petri-csészébe, a tápoldat

felszínére helyezünk, anélkül hogy a leveleket alámerítenénk. Ehhez 50 μl késői, logaritmikus fázisban lévő

Agrobacterium kultúrát adunk, és az elegyet óvatosan összekeverjük. A Petri-csészét két napra 22–24 °C-ra

helyezzük.

e. A leveleket fonákukkal lefelé kallusz-indukáló táptalajra (CIM) tesszük úgy, hogy a teljes levélfelület

érintkezzen a táptalajjal. A vágási helyeken először kisméretű kalluszok jelennek meg.

f. Hét nap elteltével a leveleket hajtás-indukáló táptalajra helyezzük (SIM), ahol megjelennek az első hajtások.

g. Amikor a hajtások elérték az 1–1,5 cm-es hosszúságot, azokat gyökereztető táptalajra (RIM) helyezzük át.

Ehhez a lépéshez célszerű 250 ml-es, 70 ml táptalaj tartalmú üveget használni. Három vagy négy héttel

később a gyökerekkel és levelekkel rendelkező növénykék tovább szaporíthatók, illetve üvegházba

ültethetők.

Dietze et al. (1995) a szövettenyésztés során a 16 órai megvilágítást követően 22 óráig tartó sötét periódust és

3000 lux fényintenzitást alkalmaztak. A transzformáns növényekre a kallusz-indukáló (CIM) és a hajtás-

indukáló (SIM) táptalajon a riporter génnek megfelelő antibiotikummal (kanamicin vagy higromicin stb.)

szelektáltak. Az itt ismertetett eljárás segítségével levelenként két-három transzformáns regenerálható.

Táptalajok

a. YEB: 0,1% élesztőextraktum; 0,5% marhahúsextraktum; 0,5% pepton; 0,5% szaharóz; 0,49 g/l MgSO4 ×

H2O. A megfelelő antibiotikumot sterilezés után a már szobahőmérsékletre lehűlt táptalajhoz adjuk.

b. MS táptalaj: Makroelemek: 1650 mg/l NH4NO3; 1900 mg/l KNO3; 440 mg/l CaCl2 × 2 H2O; 370 mg/l MgSO4

× 7 H2O; 170 mg/l KH2PO4. Mikroelemek: 6,2 mg/l H3BO3; 16,9 mg/l MnSO4 × H2O; 10,6 mg/l ZnSO4 × 7

H2O; 0,83 mg/l KI; 0,25 mg/l Na2MoO4 × 2 H2O; 0,025 mg/l CuSO4 × 5 H2O; 0,025 mg/l CoCl2 × 6 H2O; 37,3

mg/l Na2EDTA × 2 H2O; 27,5 mg/l FeSO4 × 7 H2O. Vitaminok: 0,5 mg/l nikotinsav; 0,5 mg/l piridoxin HCl;

0,1 mg/l tiamin HCl; 2,0 mg/l glicin; 100 mg/l mio-inozit. Szilárd táptalaj esetén szükséges még 0,7% agar

hozzáadása. A táptalaj pH-ját 5,7–5,8 értékre 1 M KOH-oldattal állítjuk be. A táptalaj sterilezése 121 °C-on

20 percig történik.

c. Kallusz-indukáló táptalaj (CIM): MG táptalaj (MS táptalaj 1,6% glükózzal); 5 mg/l naftolecetsav (NAA); 0,1

mg/l benzilaminopurin (BAP); 250 mg/l klaforán; 50 mg/l kanamicin vagy 1 mg/l higromicin.

d. Hajtás-indukáló táptalaj (SIM): MG táptalaj (MS táptalaj 1,6% glükózzal); 2 mg/l zeatin; 0,02 mg/l

naftilecetsav (NAA); 0,002 mg/l gibberellinsav (GA3); 250 mg/l klaforán; 50 mg/l kamicin vagy higromicin.




e. Gyökereztető táptalaj (RIM): MS táptalaj; 250 mg/l klaforán.

3.2. DNS-bevitel polietilén-glikollal (PEG) és elektromos impulzussal

Az Agrobacterium segítségével végzett növénytranszformálás az egyszikű növényeknél általában nem

alkalmazható. Alternatív eljárás a protoplasztok transzformálása polietilén-glikol- (PEG) oldatban. A PEG képes

megbontani a sejtmembrán folyamatosságát, és a keletkező pórusokon a DNS passzív módon bejuthat a sejtbe,

ahol a genomba integrálódhat. Makropórusok ugyanakkor elektromos impulzussal is létrehozhatók. Ez utóbbi

módszerrel nemcsak protoplasztokba, hanem intakt növényi sejtekbe is képesek DNS-t juttatni. Ma mindkét

eljárást széleskörűen alkalmazzák.

3.3. Génátvitel biolisztikus módszerrel

E módszer alkalmazható a legszélesebb körben intakt sejtek transzformációjára. A bejuttatni kívánt DNS-t 1–2

μm átmérőjű wolframrészecskékre rögzítik, majd ezeket nagy sebességre gyorsítják – általában nagynyomású

He-, illetve N2 gázzal. A részecskék eltalálják a célszövetet, és behatolnak a részlegesen sérült sejtekbe. A

részecskék felületén bevitt DNS azután integrálódhat a növény genomjába.

A „génpuskával” történő növénytranszformálás valójában óriási előrelépést jelentett a transzgénikus növények

előállításában, mivel számos gazdaságilag jelentős fajta transzformációját tette lehetővé.

3.3.1.

3.3.1.1.

3.3.1.1.1. A biotechnológia mint új és hatékony eszköz

Az elmúlt évtized biológiai, biokémiai és molekuláris biológiai felfedezései egyre közelebb vitték az

emberiséget ahhoz, hogy az egyes szervezetek működését ellenőrző géneket megismerjék és az adott keretek

között szinte korlátlan módon megváltoztassák. A génsebészet, ill. a génátültetés módszereinek felhasználásával

forradalmi változások következtek be a mezőgazdaságban és a növényvédelemben is (Balázs és Gáborjányi,

1984; Monti, 1992a, b). 1998-ban a transzgénikus növényfajták termesztési területe csaknem elérte a 40 millió

hektárt. Ewe (1998) szerint 1-2 évtized múlva a világ élelmezésében szerepet játszó 29 fő tápnövény 80%-a

transzgénikus növény lesz. A tendenciára jellemző, hogy az Amerikai Egyesült Államokban 2154, Japánban

2055, Németországban 629 géntechnológiai úton előállított növényre jelentettek be szabadalmat (Janositz,

1998).

Új, transzgénikus fajták termesztésbe vétele azonban bizonyos kockázatokkal is jár. Vírusellenálló növények

esetében ezek sokkal kevésbé egészségügyi, mint inkább ökológiai jellegű kockázatok (Bartsch et al., 1996a, b;

Parker és Bartsch, 1996; Bartsch és Pohl-Orf, 1996; Tepfer és Balázs, 1997). Rendkívül fontos ezért az ilyen

fajták kontrollált engedélyezése és termesztésbe vétele. E rendelkezéseket Magyarországon a géntechnológiai

tevékenységről szóló 1998. Évi XXVII. Törvény tartalmazza. Úgyszintén fontos feladat a nyilvánosság pontos

tájékoztatása a biotechnológia eredményeiről a megalapozatlan félelmek eloszlatása érdekében (Jones, 1994;

Deshayes, 1994; Balázs, 1997).


20. fejezet - Függelék

1. A vírusok, a vírusszerű organizmusok és a viroidok nemzetközi forgalmának (terjedésének) ellenőrzése és megakadályozása

A növényvírusok okozta igen jelentős gazdasági károk csökkentésére az elmúlt években szükség volt a

külföldről behozott, az országon keresztülhurcolt és az országból kivitt vírusokkal kapcsolatos intézkedésekre.

Ezeket a megnövekedett nemzetközi árucsere-forgalom, valamint az Európai Gazdasági Közösség Tanácsának

határozata is indokolta. A növényvédelmi intézkedések szigorú betartásában ezért alapvetően érdekeltek

vagyunk (Kalmár et al., 1994).

1.1. Vírusokra és vírusszerű kórokozókra vonatkozó növény-egészségügyi határozatok

Az Európai Gazdasági Közösség Tanácsának Növény-egészségügyi Határozatai részletesen megtalálhatók a

Budapest Fővárosi Növény-egészségügyi és Talajvédelmi Állomás által szerkesztett kiadványban (Szemessy és

Szőnyegi, 1993). A terjedelmes rendelkezések minden részletre kiterjedően intézkednek a növények vagy

növényi termékek károsítóinak az Európai Közösségbe történő behurcolásával, valamint a Közösségen belüli

elterjedésével kapcsolatban. A „Növényvírusok és virológiai vizsgálati módszerek” c. egyetemi tankönyvben

csak a vírusokra, ill. a vírusszerű kórokozókra vonatkozó ismereteket tárgyaljuk. A „Növény-egészségügyi

határozat” olyan kifejezéseket tartalmaz (pl. növények; növényi termékek; ültetés (telepítés), vetés; ültetésre

(telepítésre), vetésre szánt növények; károsítók; növényútlevél; hivatalos növényvédelmi szolgálat; bármely

állami hatóság; védett zóna; nyilatkozat vagy intézkedés), amelyek jelentésének egyértelmű meghatározása

feltétlen kívánatos.

1.1.1.

1.1.1.1.

1.1.1.1.1. Növények

Ide tartoznak az élő növények és azok élő részei, beleértve a vetőmagvakat is. Élő növényeknek és azok

részeinek tekinthetők a termések (a fagyasztással tartósított gyümölcsök kivételével); a zöldségfélék

(fagyasztottak kivételével); a gumó, hagyma, hagymagumó, rizóma; a vágott virágok; a leveles ágak; a leveleit

megtartó vágott fa és a növényi szövettenyészet.

1.1.1.1.2. Növényi termékek

Ide tartoznak a fel nem dolgozott vagy csak egyszerű előkészítésnek alávetett növényi eredetű termékek.

1.1.1.1.3. Ültetés (telepítés)/vetés

A növények talajba (termesztő közegbe) helyezése, amellyel biztosítani lehet fejlődésüket, szaporodásukat.

1.1.1.1.4. Ültetésre (telepítésre)/vetésre szánt növények

Azok a növények, amelyeket már kiültettek vagy elvetettek, vagy az eredeti közegben maradtak, vagy

hazahozataluk után újratelepítettek. Ide tartoznak azok a növények is, amelyeket behozatalukkor nem ültettek ki

és nem vetettek el, hanem azt később kívánják megtenni.

1.1.1.1.5. Károsítók

A növények vagy növényi termények károsítói azok, amelyek az állat- vagy növényvilághoz tartoznak, vagy

amelyek vírusok, fitoplazmák vagy egyéb kórokozók.

1.1.1.1.6. Növényútlevél

Függelék


Hivatalos címke, amely azt bizonyítja, hogy a jelen határozat növény-egészségügyi követelményekre és

különleges előírásokra vonatkozó rendelkezéseit betartották, és amelyet az Európai Közösségi szinten a

különböző növény- vagy növényi terméktípusokra egységesítettek, és amelyet bármely tagország hivatalos

testülete készített elő, állított ki a növényútlevél kiállítási eljárásának részleteit szabályozó végrehajtási

rendelkezések szerint.

1.1.1.1.7. Hivatalos, felelős testület

Növényvédelmi Szolgálat, vagy bármely más állami hatóság, amelyet országos vagy regionális szinten állítottak

fel az országos hatóság felügyelete alatt, az érintett tagország alkotmányos keretein belül.

1.1.1.1.8. Védett zóna

Védett zónának az a terület tekintendő, amelyben a határozatban említett egy vagy több károsító még nem

honos, vagy nem telepedett meg a kedvező körülmények ellenére sem, jóllehet az Európai Közösség egy vagy

több részén már megtelepedett. Továbbá védett zónának tekintendő az a terület is, amelyen fennáll a veszélye

annak, hogy bizonyos károsítók megtelepednek az adott növények számára kedvező ökológiai viszonyok

mellett, annak ellenére, hogy ezek a károsítók nem honosak vagy nem telepedtek még meg az Európai

Közösségben. Megjegyzés: egy károsító akkor tekinthető megtelepedettnek, ha az ott előfordul, és ha

hivatalosan nem intézkedtek megsemmisítéséről, vagy az intézkedések legalább két egymást követő éven át

hatástalannak bizonyultak.

1.1.1.1.9. Nyilatkozat vagy intézkedés

A nyilatkozat vagy intézkedés akkor tekinthető hivatalosnak, ha azt a tagország hivatalos növényvédelmi

szervezetének a képviselője – vagy annak felelőssége mellett más köztisztviselő – hozza (teszi meg). Egyéb

esetekben a már említett képviselő vagy köztisztviselő vagy a meghatározott hivatalos felelős testület egyike

által alkalmazott „kvalifikált ügynök” (ha nincs személyes érdekeltsége az általa hozott intézkedések

kimenetelében, és megfelel a képesítés minimális követelményeinek) nyilatkozik (intézkedik). E tekintetben a

tagországoknak kell biztosítani, hogy köztisztviselőik és ügynökeik kvalifikáltak legyenek.

1.1.2. Az Európai Közösségben (EU) elő nem forduló, és az EU-ra nézve fontos vírusok, vírusszerű kórokozók és viroidok

Az e csoportba tartozó károsítókat a 35. táblázat tartalmazza. A károsítók (kórokozók) között vírusok (27),

fitoplazmák (5), viroid (1) és rickettsia (1) kórokozók vannak. A karantén vírusok 14 nemzetségbe tartoznak:

Begomovirus, Bigeminivirus, Bromovirus, Carlavirus, Caulimovirus, Comovirus, Crinivirus, Ilarvirus,

Luteovirus, Nepovirus, Potexvirus, Potyvirus, Rhabdovirus, Tymovirus. Két vírus [paradicsom Florida vírus

(tomato Florida virus), őszibarack mozaik vírus (amerikai), peach (American) mosaic virus] rendszertani helye

pontosan még nem ismert. A 35. táblázatban felsorolt burgonyapatogén vírusok (burgonya A-vírus, burgonya

M-vírus, burgonya S-vírus, burgonya V-vírus, burgonya X-vírus, burgonya Y-vírus, burgonya levélsodródás

vírus) és a burgonya orsósgumójúság viroid nem európai izolátumai tekintendők karantén kórokozóknak.

35. táblázat - Az Európai Közösségben elő nem forduló kórokozók1

A kórokozók magyar neve A kórokozók angol neve

Burgonyapatogén kórokozók

Burgonya andeszi látens vírus

Burgonya andeszi foltosság vírus

Arracacha B-vírus

Burgonya fekete gyűrűsfoltosság

vírus

Burgonya A-vírus*

Potato Andean latent tymovirus

Potato Andean mottle comovirus

Arracacha B ? nepovirus

Potato black ringspot nepovirus

Potato A. potyvirus

Potato M carlavirus

Függelék


Burgonya M-vírus*

Burgonya S-vírus*

Burgonya V-vírus*

Burgonya X-vírus*

Burgonya Y-vírus*

Burgonya levélsodródás vírus*

Burgonya orsósgumójúság

viroid*

Potato S carlavirus

Potato V potyvirus

Potato üpotexvirus

Potato Y potyvirus

Potato leafroll polerovirus

Potato spindle tuber viroid

Egyéb vírusok és fitoplazma

Szilfa floem nekrózis fitoplazma

Dohány gyűrűsfoltosság vírus

Paradicsom gyűrűsfoltosság

vírus

Bab aranysárga mozaik vírus**

Lóbab enyhe foltosság vírus**

Saláta fertőző sárgaság vírus**

Paprika enyhe „tigré” vírus**

Tök levélgöndörödés vírus**

Euphorbia mozaik vírus**

Paradicsom Florida vírus**

Elm phloem necrosis

phytoplasma

Tobacco ringspot nepovirus

Tomato ringspot nepovirus

Bean golden mosaic

begomovirus

Broad bean mild mottle

bromovirus

Lettuce infectious yellows

crinivirus

Pepper mild tigré ? bigeminivirus

Squash leaf curl bigeminivirus

Euphorbia mosaic bigeminivirus

Tomato Florida virus

Cydonia, Fragaria, Malus, Prunus, Pyrus, Ribes, Rubus, Vitis spp.

vírus, fitoplazma

és rickettsia kórokozói és minden nem Európában előforduló

kórokozói

Áfonya levélfoltosság vírus

Cseresznye érdeslevelűség vírus

(amerikai)

Őszibarack (amerikai) mozaik

vírus

Őszibarack ál-rickettsia

Őszibarack rozettás fitoplazma

Őszibarack X-betegség

fitoplazma

Blueberry leaf mottle nepovirus

Cherry rasp \eafnepovirus

Peach (American) mosaic virus

Peach phony rickettsia

Peach rosette phytoplasma

Peach X-disease phytoplasma

Peach yellows phytoplasma

Függelék


Őszibarack sárgaság fitoplazma

Szilva amerikai vonalas

mintázottság vírus

Málna levélgöndörödés vírus

(amerikai) Földieper látens C-

vírus

Földieper érszalagosodás vírus

Földieper boszorkányseprűsödés

fitoplazma

Plum American line pattern

ilarvirus

Raspbery leaf curl ? luteovirus

Strawberry latens C ?

rhabdovirus Strawberry vein

banding ? caulimovirus

Strawberry witches‟broom

phytoplasma

1 A *-gal megjelölt vírusok nem európai törzsei (izolátumai). A **-gal megjelölt vírusok Bemísia tabaci

vektorral terjednek.

1.1.3. Az Európai Közösségben (EU) előforduló és az EU-ra nézve fontos fitoplazma kórokozók

Az ide tartozó kórokozók a következők: alma sarjburjánzás fitoplazma (apple proliferation phytoplasma), kajszi

klorotikus levélsodródás fitoplazma (apricot chlorotic leafroll phytoplasma), körte pusztulás fitoplazma (pear

decline phytoplasma).

1.1.4. Kórokozók, amelyeknek a behurcolása és terjedése a meghatározott védett zónákban tilos

Két vírus behurcolása és terjedése tilos négy védett zónában (országban). Ezek a következők: a répa nekrotikus

sárgaerűség vírus (beet necrotic yellow vein benyvirus) behurcolása tilos Dániába, az Egyesült Királyságba

(Észak-Írország) és Portugáliába, valamint a paradicsom bronzfoltosság vírus (tomato spotted wilt tospovirus)

behurcolása tilos Dániába.

1.1.5. Kórokozók, amelyeknek a behurcolása és terjedése valamennyi tagországban tilos, ha azok egyes növényeken és növényi termékeken előfordulnak

Az ide tartozó vírus, fitoplazma és viroid kórokozókat a 36. táblázat tartalmazza.

36. táblázat - Az Európai Közösségben elő nem forduló, de az Európai Közösségre nézve

fontos vírus, vírusszerű és viroid kórokozók

A kórokozók magyar neve A kórokozók angol neve Növények

Répa levélcsúcs fodrosodás vírus

(nem európai izolátumok) Beet curly top

curtovirus Beta vulgaris

Fekete málna látens vírus Black raspberry latent

ilarvirus Rubus spp.

Kókuszdió cadang-cadang viroid Coconut cadang-cadang

viroid Pálmáé spp. (európai országokon

kívüli növények) telepítése esetén

(magvak kivételt képeznek)

Cseresznye levélsodródás vírus* Cherry leafroll

nepovirus Rubus spp.

Függelék


Citrus mozaik vírus Citrus mosaic

badnavirus Citrus, Fortunella Swingle és Poncirus

spp. és hibridjeik (termés és magvak

kivételt képeznek)

Citrus tristeza vírus Citrus tristeza

dosterovirus (nem

európai izolátumok)

Citrus, Fortunella Swingle és Poncirus



Citrus leprózis vírus Citrus leprosis ?

rhabdovirus Citrus, Fortunella Swingle és Poncirus



Cseresznye aprógyümölcsűség vírus

(nem európai izolátumok) Cherry little cherry virus Prunus cerasus, P. avium, P. insica,

P. sargentii, P. serrula, P. serrulata,

P. speciosa, P. subhirtella, P.

yedoensis hibridjei és fajtái (magvak

kivételével)

Citrus psorozis vírus (természetes

úton terjedő) Citrus psorosis virus Citrus, Fortunella Swingle,

Poncirus növényfajok és hibridek

(termés és magvak kivételével)

Pálma letális sárgaság fitoplazma Palm lethal yellowing

phytoplasma Pálma spp. (nem európai országból

származó) telepítése esetén (magvak

kivételt képeznek).

Barack nekrotikus gyűrűsfoltosság

vírus* Prunus necrotic ringspot

ilarvirus Rubus spp.

Satsuma törpülés vírus Satsuma dwarf ?

nepovirus Citrus, Fortunella Swingle,

Poncirus növények és hibridjeik

(termés, magvak kivételt képeznek)

Citrus rongyoslevelűség vírus Citrus tatter leaf

capillovirus Citrus, Fortunella Swingle,



Citrus boszorkányseprűsödés

fitoplazma Citrus witches‟broom

phytoplasma Citrus, Fortunella Swingle,



* A megnevezett vírusok az Európai Közösségben, Rubus-fajokon nem fordulnak elő.

1.1.6. Az Európai közösségben (EU) előforduló és az EU-ra nézve fontos vírus, vírusszerű, viroid és spiroplaza kórokozók

E csoportba 11 vírus, 1 viroid, 2 fitoplazma és 1 spiroplazma tartozik (37. táblázat).

37. táblázat - Az Európai Közösségben előforduló és az Európai Közösségre nézve

fontos károsítók

Függelék


A kórokozók magyar neve A kórokozók angol neve Növények


Répa levélgöndörödés

vírus

Arabis mosaic nepovirus

Beet leaf curl ?

rhabdovirus

Fragaria és Rubus spp.

Beta vulgáris

(vetőmag kivételével)

Krizantém törpülés viroid Chrysanthemum stunt

viroid Dendranthema spp.

(magvak kivételével)

Citrus tristeza vírus

(európai törzsek) Citrus tristeza

closterovirus Citrus, Fortunella Swingle, Poncirus

spp.


Citrus ér-enációs vírus Citrus vein enation virus Citrus, Fortunella Swingle, Poncirus

spp.


Szőlő aranyszínű sárgaság

fitoplazma Grapevine Flavescence

dorée phytoplasma Vitis spp.


Szilva himlő vírus Plum ponpotyvirus Prunus spp.


Burgonya sztolbur

fitoplazma Potato slolbw

phytoplasma Solanaceae családba tartozó növények

(vetőmagvak kivételével)

Málna gyűrűsfoltosság

vírus Raspberry ringspot

nepovirus Fragaria, Rubus spp. (magvak

kivételével)

Spiroplasma citri Spiroplasma citri Citrus, Fortunella Swingle, Poncirus

spp.


Földieper göndörödés

vírus Strawberry crinkle

cytorhabdovirus Fragaria spp.


Földieper látens

gyűrűsfoltosság vírus Strawberry latent ringspot

nepovirus Fragaria és Rubus spp.


Földieper enyhe sárga

levélszélűség vírus Strawberry mild yellow

edge-associated ?

potexvirus

Fragaria spp.



vírus Tomato black ring

nepovirus Fragaria és Rubus spp.


Függelék


Paradicsom

bronzfoltosság vírus Tomato spotted wilt

tospovirus Apium graveolens, Capsicum annuum,

Cucumis melo, Dentran-hema

növények.

Az Impatiens New Quinea hibridek

összes fajtája. Mindazok a Lactuca

sativa, Lycopersicon esculentum és

Nicotiana növények, amelyekről

bizonyított, hogy a növénytermesztés

számára értékesítik őket. Ültetésre

szánt Solanum melongena és S.

tuberosum

1.2. Egyéb határozatok

A „Növény-egészségügyi Határozat” (lásd Szemessy és Szőnyegi, 1993) I. és II. Függelékében a vírusokon és

vírusszerű kórokozókon kívül kitér azokra az ismeretekre is, amelyek a baktériumokkal, gombákkal, rovarokkal,

atkákkal, fonálférgekkel kapcsolatosak.

A „Növény-egészségügyi Határozat” III. Függeléke (A. rész) azokkal a növényekkel és növényi termékekkel,

valamint más anyagokkal foglalkozik, amelyek behozatala a tagországokba tilos. A B. rész azokkal a

növényekkel és növényi termékekkel, valamint más anyagokkal foglalkozik, amelyek behozatala a védett

zónákba tilos.

A IV. Függelék A. része a növények, növényi termékek és egyéb anyagok tagországokba történő behozatalakor

és a tagországokon belüli szállításakor valamennyi tagország által kötelezően alkalmazandó előírásokat foglalja

magában. Az I. Szekcióban vannak felsorolva az Európai Közösségen kívüli területekről származó növények,

növényi termékek és más anyagok is. A II. Szekcióban vannak felsorolva az Európai Közösség országaiból

származó növények és a velük kapcsolatos intézkedések. A IV. Függelék B. része azokat a különleges

eljárásokat tárgyalja, amelyeket valamennyi tagország köteles elrendelni a növények, növényei termékek és más

anyagok meghatározott védett zónákba történő bevitelével és a védett zónákon belüli szállításával kapcsolatban.

Az V. Függelék arról rendelkezik, hogy azokat a növényeket, növényi termékeket és más anyagokat, amelyeket

növény-egészségügyi ellenőrzésnek kell alávetni, az Európai Közösségből származók esetében a termőhelyen, a

Közösségen belüli szállítást megelőzően, az Európai Közösségen kívül eső országok esetében pedig a

származási országban vagy a feladó országban, az Európai Közösségbe hozatal engedélyezése előtt kell

ellenőrizni. A Függelék A. részének I. pontja azokkal az Európai Közösségből származó növényekkel, növényi

termékekkel és más anyagokkal foglalkozik, amelyek az egész Közösségre nézve fontos károsítók potenciális

hordozói, és amelyekhez növényútlevelet kell csatolni. Az A. rész II. pontja azokat a növényeket, növényi

termékeket és más anyagokat sorolja fel, amelyek bizonyos védett zónákra nézve fontos károsítók potenciális

hordozói, és amelyekhez az adott zónába történő behozatalkor vagy az adott zónán belüli szállításkor a

megfelelő zónákra érvényes útlevelet kell csatolni. A Függelék B. része az A. részben felsoroltaktól eltérő

területekről származó növényeket, növényi termékeket és más anyagokat sorolja fel.

2. Karantén és veszélyes vírusok, vírusszerű organizmusok és viroidok Európában

A „karantén károsító” a nemzetközileg elfogadott „Növényegészségügyi terminusok szótára” szerint olyan

károsító, amelynek potenciális gazdasági jelentősége van azon a területen, ahol eddig még nem fordult elő, vagy

ha elő is fordul, széles körben még nem terjedt el, és hivatalos ellenőrzés alatt van. A károsító magában foglalja

a faj, törzs, biotípus fogalmát is. Az Európai és Mediterrán Növényvédelmi Szervezet (EPPO, European and

Mediterranean Plant Protection Organization) a karantén károsítókat két csoportba sorolja: 1. azok a károsítók,

amelyek nem fordulnak elő az EPPO-régióban; ezek az A1 csoportba tartoznak, és 2. azok a károsítók, amelyek

az EPPO-régió néhány területén előfordulnak; ezek az A2 csoportba tartoznak. Az EPPO-régió tagállamai

kötelesek minden intézkedést megtenni az A1 csoportba tartozó károsítókkal szemben, míg az A2 csoportba

tartozó károsítókkal szembeni eljárásokat szabadon megválaszthatja. A követelmények igen szigorúak az ún.

„egzotikus”, A1 csoportba tartozó károsítókkal szemben. Ez a specifikus és „károsítócentrikus” szemlélet az

EPPO központi koncepciója.

Függelék


Az Európai Unió (EU) tizenöt tagállama mind aktív tagja az EPPO-nak. Az EU Növényegészségügyi Direktívái

(EU Plant Health Directive) (lásd Függelék előző fejezete) igen kis mértékben eltérnek az EPPO

követelményeitől, de alapvető kérdésekben megegyeznek. Az EPPO-tagállamok szoros kapcsolatban vannak az

EPPO titkárságával az A1 és A2 károsítók adatlapjainak összeállításában. Ezek az információk a szervezet

folyóiratában (Bulletin OEPP/EPPO Bulletin) jelennek meg, amelyek többnyire az alábbi adatokat tartalmazzák:

károsító neve, fő gazda, földrajzi elterjedés, biológia, gazdasági jelentőség, belépés módja, identifikálás,

egészségügyi vizsgálat, irodalom. A tudományos publikációkat többnyire színes ábrák egészítik ki.

Az EU, az EPPO, a CABI, a Nemzetközi Entomológiai Intézet, a Nemzetközi Mikológiai Intézet és a

Nemzetközi Parazitológiai Intézet nemrég összeállította és közzétette a „Quarantine Pests for Europe” (Európa

Karantén Károsítói) c. könyvet (Smith et al., 1997), amely a legújabb adatokat tartalmazza a karantén rovarokra,

atkákra, fonálférgekre, gombákra, baktériumokra, vírusokra, vírusszerű organizmusokra, viroidokra és parazita

növényekre vonatkozóan. A jelen fejezetben a vírusokra, vírusszerű organizmusokra és viroidokra – mint

karantén károsítókra – vonatkozóan közöljük az aktuális adatokat (38. táblázat).

38. táblázat - Európai karantén károsítók (vírusok, vírusszerű kórokozók és viroidok)

az EPPO-régióban (Smith et al., 1997 után)

A károsító neve Előfordulás

a a

régióban2 Magyar név Angol név1

Alma mozaik vírus Apple mosaic ilarvirus* A2

Arabis mozaik vírus Arabis mosaic nepovirus A2

Arracacha B-vírus Arracacha B ? nepovirus** A1

Árpa csíkos mozaik vírus Barley stripe mosaic hordeivirus A2

Bab aranysárga mozaik vírus Bean golden mosaic begomovirus A1

Répa levélcsúcs fodrosodás vírus Beet curly top curtovirus A2

Répa levélgöndörödés vírus Beet leaf curl ? rhabdovirus A2

Répa nekrotikus sárgaerűség vírus Beet necrotic yellow vein

benyvirus A2

Fekete málna látens vírus Black raspberry latent ilarvirus A2

Áfonya levélfoltosság vírus Blueberry leaf mottle nepovirus A2

Cseresznye levélsodródás vírus Cherry leafroll nepovirus* A2

Cseresznye aprógyümölcsűség vírus Cherry little cherry virus A1

Cseresznye nekrotikus rozsdaszínű

foltosság betegség Cherry necrotic rusty mottle

disease A2

Cseresznye érdeslevelűség vírus Cherry rasp leaf nepovirus A1

Krizantém törpülés viroid Chrysanthemum stunt viroid A2

Citrus sárgulás betegség Citrus blight disease A1

Függelék


Citrus leprózis vírus Citrus leprosis ? rhabdovirus A1

Citrus mozaik vírus Citrus mosaic badnavirus A1

Citrus gyűrűsfoltosság vírus Citrus ringspot virus A1

Citrus rongyoslevelűség vírus Citrus tatter leaf capillovirus A1

Citrus tristeza vírus Citrus tristeza closterovirus A2

Citrus ér-enációs vírus Citrus vein enation virus A2

Kókuszdió cadang-cadang viroid Coconut cadang-cadang viroid A1

Tehénborsó enyhe foltosság vírus Cowpea mild mottle carlavirus A1

Euphorbia mozaik vírus Euphorbia mosaic bigeminivirus A1

Saláta fertőző sárgaság vírus Lettuce infectious yellows

crinivirus A1

Őszibarack látens mozaik viroid Peach latent mosaic viroid*** A1

Őszibarack rozettás mozaik vírus Peach rosette mosaic nepovirus A1

Szilva (amerikai) vonalas mintázottság

vírus Plum (American) line pattern

ilarvirus A1

Szilva himlő vírus Plum pox potyvirus A2

Burgonya andeszi látens vírus Potato Andean latent tymovirus A1

Burgonya fekete gyűrűsfoltosság vírus Potato black ringspot nepovirus A1

Burgonya andeszi foltosság vírus Potato Andean mottle comovirus A1

Burgonya orsósgumójúság viroid Potato spindle tuber viroid A2

Burgonya T-vírus Potato T vitivirus A1

Burgonya sárga törpülés vírus Potato yellow dwarf

nucleorhabdovirus A1

Burgonya sárgaerűség betegség Potato yellow vein disease A1

Burgonya sárgaság vírus Potato yellowing alfamovirus A1

Málna levélgöndörödés vírus Raspberry leaf curl ? luteovirus A1

Málna gyűrűsfoltosság vírus Raspberry ringspot nepovirus A2

Satsuma törpülés vírus Satsuma dwarf ? nepovirus A1

Függelék


Tök levélgöndörödés vírus Squash leaf curl bigeminivirus A1

Földieper göndörödés vírus Strawberry crinkle

cytorhabdovirus A2

Földieper látens C-vírus Strawberry latent C ? rhabdovirus A1

Földieper látens gyűrűsfoltosság vírus Strawberry latent ringspot

nepovirus A2

Földieper enyhe sárga levélszélűség vírus Strawberry mild yellow edge

disease

associated ? potexvirus

A2

Földieper érszalagosodás vírus Strawberry vein banding ?

caulimovirus A2

Dohány gyűrűsfoltosság vírus Tobacco rinsgpot nepovirus A2

Paradicsom fekete gyűrűs vírus Tomato black ring nepovirus A2

Paradicsom foltosság vírus Tomato mottle bigeminivirus A1

Paradicsom gyűrűsfoltosság vírus Tomato ringspot nepovirus A2

Paradicsom bronzfoltosság vírus Tomato spotted wilt tospovirus A2

Paradicsom sárga levélgöndörödés vírus Tomato yellow leaf curl

bigeminivirus A2

1 * = Rubus növényen; ** = Oca-törzs; *** = Az EPPO (European and Mediterranean Plant Protection

Organization = Európai és Mediterrán Növényvédelmi Szervezet) karanténlistára vett egy új károsítót

[őszibarack látens mozaik viroid (peach latent mosaic viroid, PLMVd)], amely Olaszországban 20–50%-os

előfordulást és súlyos károkat okoz őszibarackon, nektarinon, szilván, sárgabarackon és cseresznyén (Barba és

Faccioli, 1998).

2 A1 = A károkozó (vírus) nem fordul elő az EPPO-régióban (European and Mediterranean Plant Protection

Organization = Európai és Mediterrán Növényvédelmi Szervezet); A2 = A károkozó előfordul az EPPO-régió

bizonyos területein.

3. Az ábrák eredete

Almási Asztéria (Budapest): 56.

Baker, C.J. és Orlandi, E.W.: 100., 101. Academic Press, London (1995) engedélyével.

Brandes, J. (Braunschweig, Németország): 6., 13B, C., 14A szívessége folytán.

Brown, T.A.: 83., 87., 88. Stanley Thornes (Publ.) Ltd., Cheltenham (1990) engedélyével.

Brunt, A. et al.: 20. CAB International, Wallingford (1990) engedélyével.

Chiykowski, L.N. (Ottawa, Kanada): 28A, B, C, D szívessége folytán.

De Bokx, J.A. (Wageningen, Hollandia): 23A szívessége folytán.

Függelék


Doke, N. és Ohashi,Y.: 104. The Amer. Soc. Plant Physiol., Plant Physiol., The Plant Cell, Rockville (1988)

engedélyével.

Esau, K.: 54., 57., 58. The University of Wisconsin Press, London (1968) engedélyével.

Érsek Tibor és Gáborjányi Richard: 67. ELTE Eötvös Kiadó, Budapest (1998) engedélyével.

Francki, R.I.B. és McLean, G.D.: 63. Van Nostrand Reinhold Co., New York (1968) engedélyével.

Francki, R.I.B. et al.: 55., 60A, B. CRC Press, Boca Raton (1985) engedélyével.

Fritzsche, R. (Aschersleben, Németország): 43 szívessége folytán.

Gáborjányi Richard (Budapest): 66.

German, T.L. et al.: 75. Ann. Rev. Inc., Palo Alto (1992) engedélyével.

Gibbs, A.J.(Harpenden, Herts, Nagy-Britannia): 15D, 18B, 53 szívessége folytán.

Hammond-Kosack, K.E. és Jones, J.D.G.: 99. The Amer. Soc. Plant Physiol., Plant Physiol., The Plant Cell,

Rockville (1996) engedélyével.

Hampton, R. et al.: 78., 79., 80., 81., 82. The American Phytopath. Soc., St. Paul, Minnesota (1990)

engedélyével.

Harrison, B.D. (Dundee, Skócia): 17A, B szívessége folytán.

Horváth József (Keszthely): 1A, B, C., 2A, B., 4A, B, C., 7A., 8A, B., 11A, B, C, D., 12A, B, C., 13A., 14B.,

16A, B., 17C., 22A, B., 23B., 24A, B., 26A, B., 33., 34A, B, C, D, E, F., 44., 45A, B., 46A, B., 47A, B, C, D.,

48A, D., 49A., 50A, B., 52A, B, C., 59A, B., 61A, B, C., 62A, B., 64A, B, C., 65A, B., 105A, B, C, D., 106A,

B.

Hull, R. és Covey, S.: 72. Elsevier Trends Journals, Cambridge (1983) engedélyével.

Kado, C.I. (Berkeley, Amerikai Egyesült Államok): 15A, B, C szívessége folytán.

Kunkel, H.: 35., 36. Academic Press, London (1977) engedélyével.

Lázár János (Kecskemét): 51 szívessége folytán.

Mamula, D. (Zagreb, Horvátország): 18A szívessége folytán.

Matthews, R.E.F.: 69., 70., 71. Academic Press, Orlando (1985), (1991) engedélyével.

McInnes, J.L. és Symons, R.H.: 90., 91. CRC Press, Boca Raton, Florida (1991) engedélyével.

Miller, A. (Ames, Amerikai Egyesült Államok): 27 szívessége folytán.

Molnár János (Szeged): 86, 89 szívessége folytán.

Mullineaux, P.M. et al.: 91. Oxford University Press, Oxford (1984) engedélyével.

Murant, A.F. (Dundee, Skócia): 10 szívessége folytán.

Murphy, F.A. et al.: 3. Springer Verlag, Wien und New York (1995) engedélyével.

Nakasuyi, F. (Okayama, Japán): 7B, C szívessége folytán.

Noordam, D.: 37., 38., 39., 40A, B, C; 41. PUDOC, Wageningen (1973) engedélyével.

Paliwal, Y.C. és Slykhuis, J. (Ottawa, Kanada): 29A szívessége folytán.

Peters, D. (Wageningen, Hollandia): 5., 9 szívessége folytán.

Függelék


Pfeifer, P. és Hohn, T.: 73. Cell Press, Cambridge (1983) engedélyével.

Pintér Csaba (Keszthely): 48B, C., 49B szívessége folytán.

Pogány Miklós (Budapest): 92., 93., 94A, B, C., 95., 96., 97.

Proeseler, G. (Aschersleben, Németország): 31 szívessége folytán.

Riechmann, J.L. et al.: 68. Kluwer Academic Publ., Dordrecht (1993) engedélyével.

Sain, B. és Erdei, S.: 84. Gondolat Könyvkiadó Kft., Budapest (1985) engedélyével.

Salazar, L.F. (Lima, Peru): 19., 109 szívessége folytán és az International Potato Center, Lima, Peru (1996)

engedélyével.

Sambrook, J. et al.: 85. Cold Spring Harbor Lab. Press, Cold Spring Harbor (1989) engedélyével.

Schlee, D.: 98. Gustav Fischer Verlag, Jena (1992) engedélyével.

Schmelzer, K. (Aschersleben, Németország): 21. Akademie Verlag, Berlin (1980) engedélyével.

Schopfer, P.: 103. The Amer. Soc. Plant Physiol., Plant Physiol., The Plant Cell, Rockville (1994) engedélyével.

Slykhuis, J.T. (Ottawa, Kanada): 29B szívessége folytán.

Smith, K.M. (Austin, Amerikai Egyesült Államok): 30 szívessége folytán.

Szalay-Marzsó László (Budapest): 32 szívessége folytán.

Szilassy Dénes (Gödöllő): 107., 108., 110.

Taylor, C.E. és Robertson, W.M.: 42. Plenum Publ. Company, London (1975) engedélyével.

Teakle, D.S. (Brisbane, Ausztrália): 25A, B, C szívessége folytán.

Washio, O. et al.: 37. [módosítva Kunkel, H.: Academic Press, London (1977) engedélyével].

Wu, G. et al.: 102. The Amer. Soc. Plant Physiol., Plant Physiol., The Plant Cell, Rockville (1995)

engedélyével.


Irodalom

Principles of molecular organization, expression, and evolution of closteroviruses: over the barriers.

Agranovsky, A.A. Adv. Virus Res. 47 1996 119–157

Methods of virus classification. Andrewes, C.H. Academie Press In: Maramorosch, K. and Koprowski, H.

(eds.), Methods in Virology. Vol. IV., , ppNew York and London 1968 593–613

Orvosi virológia. Bakács, T. és Farkas E. Medicina KönyvkiadóBudapest 1965 444 pp

A növényi RNS-vírusok bioszintézise. Balázs, E. Medicina Könyvkiadó In: Csaba Gy. (szerk.), A biológia

aktuális problémái 23Budapest 1981 77–93

Potyvirus Taxonomy. Barnett, O.W. Springer Verlag Arch. Virol. Suppl. 5Wien and New York 1992

Plant Viruses and Virus Diseases. Bawden, F.C. Waltham Mass 3rd Edit. Chronica Botanica Co 1950

Állatorvosi mikrobiológia, bakteriológia, virológia, immunológia. Belák S., Tuboly S. és Varga J.

Mezőgazdasági KiadóBudapest 1983 449 pp

Introduction to Plant Virology. Bos, L. PUDOCWageningen 1983 160 pp

Virus Identification Data Exchange. Boswell, K.F. and Gibbs, A.J. Viruses of Legumes. Austr. Nat. Univ.,

Canberra 1983 139 pp

The VIDE (Virus Identification Date Exchange) Boswell, K.F., Dallwitz, M.J., Gibbs, A.J. and Watson, L.

Project: A Date Bank for Plant Viruses. Rev. Plant Pathol. 65 1986 221–231

Some properties of a phloem-limited non–mechanically transmissible grapevine virus. Boulila, M., Boscia, D.,

Di Terlizzi,B., Castellano, M.A., Minafra, A., Savino, V. and Martelli, G.P. J. Phytopathol. 129 1990

151–158

Gross morphology and serology as a basis for classification of elongated plant viruses. Brandes, J. and Bercks,

R. Adv. Virus Res. 11 1965 1–24

Klassifizierung und Nomenklatur pflanzenpathogener Viren. Brandes, J. Akademie Verlag In: Klinkowski, M.

(Ed.), Pflanzliche Virologie. Band 1. Einführung in die allgemeinen ProblemeBerlin 1967 237–243

Viruses of Tropical Plants. Brunt, A A., Crabtree, K. and Gibbs, A. CAB International Descriptions and Lists

from the VIDE DatabaseWallingford 1990 707 pp

Viruses of Plants. Brunt, A.A., Crabtree, K., Dallwitz, M.J., Gibbs, A.J. and Watson, L. CAB International

Description and Lists from the VIDE DatabaseWallingford 1996a 1484 pp

Plant Virus Online: Descriptions and Lists from the VIDE Database. Brunt, A.A., Crabtree, K., Dallwitz, M.J.,

Gibbs, A.J., Watson, L. and Zurcher, E.J. Index to Viral Genera, Index to Virus Species and Index to

Virus Acronyms. Version 20th August 1996b

Sinaloa tomato leaf curl virus, a newly described geminivirus of tomato and pepper in West Coastal Mexico.

Brown, J.K., Idris, A.M. and Fletcher, D.C. Plant Dis. 77 1993 1262

Phylogenetic relationships reveal recombination among isolates of cauliflower mosaic virus. Chenault, K.D.

and Melcher, U. J. Mol. Evol. 39 1994 496–505

Fully biologically active in vitro transcripts of the Eriophid mite–transmitted wheat streak mosaic tritimovirus.

Choi, Il-R., French, R., Hein, G.L. and Stenger, D.C. Phyto. pathol. 89 1999 1182–1185

A new Bemisia tabaci (Gennadius) biotype in southwestern United States and its role in silverleaf of squash and

transmission of lettuce infectious yellows virus. Cohen, S., Duffus, J.E. and Liu, H.-Y. Phytopathology

82 1992 86–90

Irodalom


Proposals for changes in luteovirus taxonomy and nomenclature. D‟Arcy, C.J. and Mayo, M. Arch. Virol. 142/6

1997 1285–1287

Cassava vein mosaic virus (CsVMV), type species for a new genus of plant double stranded RNA viruses. de

Kochko, Verdaguer, B., Taylor, N., Carcamo, R., Beachy, R.N. and Fauquet, C. Arch. Virol. 143 1988

945–962

Maize white line mosaic virus. de Zoeten, G.A. and Reddick, B.B. CMI/AAB Descriptions of Plant Viruses 283

1984 1–4

Molecular biology and evolution of closteroviruses: Sophisticated build-up of large RNA genomes. Dolja, V.V.,

Karasev, A.V. and Koonin, E.V. Ann. Rev. Phytopathol. 32 1994 261–285

Variation of rice tungro viruses: further evidence of two rice tungro bacilliform virus strains and possibly

several rice tungro spherical virus variants. Druka, A. and Hull, R. J. Phytopathol. 146 1998 175–178

A novel subrival agent associated with a geminivirus. Dry, I. B., Krake, L. R., rigden, J. E. and Rezaian, M. A.

The first report of a DNA satellite. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94 1997 7088–7093

Lettuce infectious yellows virus – A new type of whitefly-transmitted virus. Duffus, J.E., Larsen, R.C. and Liu,

H.Y. Phytopathology 76 1986 97–100

Handbook of Viruses Infecting Legumes. Edwardson, J.R. and Christie, R.G. CRC PressBoca Raton, Florida

1991a 504 pp

The Potyvirus Group. Edwardson, J.R. and Christie, R.G. Vol. I-IV. Florida Exp. Stat. Monograph. 16 1991b

Inclusion in diagnosing plant virus diseases. Edwardson, J.R., Christie, R.G., Purcifull, D.E. and Petersen, M.A.

CRC Press In: Matthews, R.E.F. (ed.), Diagnosis of Plant Virus DiseasesBoca Raton, Florida 1993

101–127

Növénykórokozó mikroorganizmusok. Érsek, T. és Gáborjányi R. ELTE Eötvös KiadóBudapest 1998 288 pp

The nomenclature and classification of viruses the international committee on nomenclature of viruses. Fenner,

F. Virology 46 1971 979–980

Classification and nomenclature of viruses. Fenner, F. Intervirol. 7 1976 1–115

Plant virus satellites. Francki, R.I.B. Ann. Rev. Microbiol. 39 1985a 151–174

The Plant Viruses. Vol. 1. Francki, R.I.B. Plenum Press Polyhedral Virions with Tripartite GenomesNew York

and London 1985b 309 pp

Classification and nomenclature of viruses. Francki, R.I.B., Fauquet, C.M., Knudson, D.L. and Brown, F.

Springer VerlagWien and New York 1991 450 pp

Atlas of Plant Viruses. Vol. II. Francki, R.I.B., Milne, R.C. and Hatta, T. CRC PressBoca Raton, Florida 1985

284 pp

Tierische Vektoren pflanzenpathogener Viren. Fritzsche, R., Karl, E., Lehmann, W. und Proeseler, G. VEB

Gustav Fischer VerlagJena 1972 521 pp

A gabonafélék vírusbetegségei, gabonavírusok. Gáborjányi, R. Akad. Dokt. Ért 1990 Budapest

Bevezetés a növényvirológiába. Gáborjányi, R. JATE PressSzeged 1991 101 pp

A vírusfertőzés inhibitorai és vírusbioszintézist gátló anyagok. Gáborjányi, R. és Tóbiás I. Növénytermelés 35

1986a 139–146

A növényi vírusok elleni kémiai védekezés lehetőségei. Indukált antivirális anyagok és kemoterápiás szerek.

Gáborjányi, R. és Tóbiás I. Növénytermelés 35 1986b 341–350

What’s in a virus name? Gibbs, A.J., Harrison, B.D., Watson,D.H. and Wildy, P. Nature 209 1966 450–454

Irodalom


Plant Virology. Gibbs, A. and Harrison, B. The Principles. Edward Arnold, London 1976 1976 292 pp

Plant virus classification. Gibbs, A.J. Adv. Virus Res. 14 1969 263–328

Molecular evolution of plant RNA viruses. Goldbach, R.W. Ann. Rev. Phytopathol. 24 1986 289–310

A History of Experimental Virology. Grafe, A. Spinger VerlagBerlin 1991 343 pp

Plant Virus Disease Control. Hadidi, A., Khetarpal, R.K. and Koganezawa, H. APS PressSt. Paul, Minnesota

1998 704 pp

Guidelines for the identification and characterization of plant viruses. Hamilton, R.I., Edwardson, J.R., Francki,

R.I.B., Hsu, H.T., Hull, R., Koenig, R. and Milne, R.G. J. Gen. Virol. 54 1981 223–241

Chemotherapy of Plant Virus Infections. Hansen, A.J. Plenum Publ. Corp In: Kurstak, E., Marusyk, R.G. and

Murphy, F.A. (Eds), Applied Virology Research. Vol. 1. New Vaccines and ChemotherapyNew York

1988 285–299

Antiviral Chemicals for Plant Disease Control. Hansen, A.J. CRC Critical Rev.Pl. Sci. Vol. 8., Issue 1., Boca

Raton 1989 45–86

Advances in Disease Vector Research. Vol. 9 and 10. Harris, K.F. Springer VerlagNew York 1992–1994 367

and 442 pp

Vectors of Plant Pathogens. Harris, K.F. and Maramorosch, K. Academic PressNew York 1980 467 pp

Usefulness and limitations of the species concept for plant viruses. Harrison, B.D. Intervirol. 24 1985 71–78

Separation and properties of tobacco rattle virus with different lenghts. Harrison, B.D. and Nixon, H.L. J. Gen.

Microbiol. 21 1959 569–581

Sixteen groups of plant viruses. Harrison, B.D., Finch, J.T., Hollings, M., Shepherd, R.J., Valenta, V. and

Wetter, C. Virology 45 1971 356–363

Virus structure: high resolution perspectives. Harrison, S.C. Adv. Virus Res. 28 1983 175–240

Methods in Plant Virology. Hill, S.A. Blackwell Sci. PublOxford 1984 1984 67 pp

Handbook of Phytopathogenic Viruses. Holmes, F.O. BurgessMinneapolis 1939

Növényvírusok, vektorok, vírusátvitel. Horváth, J. Akadémiai KiadóBudapest 1972 515 pp

A szántóföldi növények betegségei. Horváth, J. (szerk.) Mezőgazda KiadóBudapest 1995 328 pp

New artificial hosts and non-hosts of plant viruses and their role in the identification and separation of viruses.

I. Horváth, J. Historical review. Acta Phytopath. Acad. Sci. Hung. 12 1977 177–214

Hosts and Non-Hosts of Plant Viruses. Horváth, J. Internat. Biosci. Monograph. No. 12. Today and Tomorrow‟s

Printers and Publishers, New Delhi 1982 77 pp


Horváth, J. XVIII. Concluding remarks. Acta Phytopath. Acad. Sci. Hung. 18 1983 121–161

Host Plants in Diagnosis. Horváth, J. CRC Press In: Matthews, R.E.F. (eds.), Diagnosis of Plant Virus

DiseasesBoca Raton, Florida 1993a 15–47

A list of proposed letter codes for hosts and non-hosts of plant viruses. Horváth, J. Acta Phytopath. et Entomol.

Hung. 28 1993b 21–58

Hosts and non-hosts in the diagnostic strategy of plant viruses. Horváth, J. Acta Phytopath. et Entomol. Hung.

28 1993c 257–354

Növényvírusok. Horváth, J. Egyetemi jegyzet, PATE, Keszthely 1999 237 pp

Irodalom


Molecular characterization of peanut stunt virus (PSV) strain BV-15, a natural reassortant between subgroups I

and II of PSV strains. Hu, C.C. and Ghabriel, S.A. Phytopathology 86, 17 (Abstr.) 1996

A list of proposed standard acronyms for plant viruses and viroids. Hull, R., Milne, R.G. and Van Regenmortel,

M.H.V. Archs. Virol. 120 1991 151–164

Sinaloa tomato leaf curl geminivirus: biological and molecular evidence for a new subgroup III virus. Idris,

A.M. and Brown, J.K. Phytopathology 88 1998 648–657

Pflanzliche Virologie. Klinkowski, M. Akademie Verlag Band 2–4Berlin 1977a 434 pp., 389 pp., 528 pp

Pflanzliche Virologie. Klinkowski, M. Akademie Verlag Registerband. Verzeichnisse und Übersichten zu den

Virosen in EuropaBerlin 1977b 337 pp

Pflanzliche Virologie. Klinkowski, M. Akademie Verlag Band 1. Einführung in die allgemeinen

ProblemenBerlin 1980 658 pp

Studies on the use of antiphytoviral compounds in potato stem cutting cultures considering the quantitative virus

resistance of cultivars. Kluge, S., Möschke, M. and Schulze, S. Arch. Phytopath. Pflanzenschutz. 26

1990 353–358

The Plant Viruses. Vol. 3. Koenig, R. Plenum Press Polyhedral Virions with Monopartite RNA GenomesNew

York and London 1988 294 pp

Arthropodenviren. Krieg, A. Georg Thieme VerlagStuttgart 1972 328 pp

Handbook of Plant Virus Infections. Kurstak, E. Elsevier/North-Holland Biomedical Press Comparative

DiagnosisAmsterdam 1981 943 pp

Applied Virus Research. Vol. 1 Kurstak, E., Marusyk, R.G. and Murphy, F.A. Plenum Publ. Corp New Vaccines

and ChemotherapyNew York 1988

Nematode Vectors of Plant Viruses. Lamberti, F., Taylor, C.E. and Seinhorst, J.W. Plenum PressLondon and

New York 1974 460 pp

Cytopathological effects induced by maize chlorotic mottle virus in infected maize. Lesemann, D.-E. VIIIth

Conf. Virus Diseases of Graminaceae in Europe., Goslar 1998

Vírusok, fertőző gének. Lomniczi, B. Gondolat KiadóBudapest 1978 326 pp

Characterization, nucleotide sequence and genome organization of leek white stripe virus, a putative new

species of the genus Necrovirus. Lot, H., Rubino, L., Delecolle, B., Jacquemond, M., Turturo, C. and

Russo, M. Arch. Virol. 141 1996 2375–2386

The classification of viruses. Lwoff, A. and Tournier, P. Ann. Rev. Microbiol. 20 1966 45–74

A system of viruses. Lwoff, A., Horne, R. and Tournier, P. Cold Spring Harb. Symp. Quant. Biol. 27 1962 51–

55

Plant Viruses. Vol I. Mandahar, C.L. CRC Press Structure and ReplicationBoca Raton 1989 366 pp

Leafhopper Vectors and Plant Disease Agents. Maramorosch, K. and Harris, K.F. Academic PressNew York

1979 654 pp

Methods in Virology. Vol. I–VIII. Maramorosch, K. and Koprowski, H. Academic PressNew York and London

1967–1984

Trichovirus, a new genus of plant viruses. Martelli, G.P., Candresse, T. and Namba, S. Arch. Virol. 134 1994

451–455

Oleavirus, a new genus in the family Bromoviridae. Martelli, G.P. and Grieco, F. Arch. Virology 142 1997

1933–1936

Irodalom


Foveavirus, a new plant virus genus. Martelli, G.P. and Jelkmann, W. Arch. Virology 143 1998 1245–1249

Vitivirus, a new genus of plant viruses. Martelli, G.P., Minafra, A. and Saldarelli, P. Arch. Virology 142 1997

1929

Aureuvirus, a novel genus in the family Tombusviridae. Martelli, G.P., Russo, M., Rubino, L. and Sabanadzovic,

S. Arch. Virology 143 1998 1847–1851

Plant Virology. 3rd ed. Matthews, R.E.F. Academic PressNew York 1991 835 pp

Fundamentals of Plant Virology. Matthews, R.E.F. Academic PressSan Diego 1992 403 pp

Diagnosis of Plant Virus Diseases. Matthews, R.E.F. CRC PressBoca Raton 1993 374 pp

Angewandte Pflanzenvirologie. Mayer-Kahsnitz, S. B. Thalacker VerlagBraunschweig 1993 218 pp

Recent revision of the rules of virus classification and nomenclature. Mayo, M.A. Arch. Virol. 141 1996 2479–

2484

Molecular biology of luteoviruses. Mayo, M.A. and Ziegler-Graf, V. Adv. Virus Res. 46 1996 413–460

Virus taxonomy – 1997. Mayo, M.A. and Pringle, C.R. J. Gen. Virology 79 1998 649–657

Family Luteoviridae: A reclassification of luteovirus. . Mayo, M.A. and D‟Arcy, C. J. CAB International In:

Smith, H. G. and Barker, H. (Eds.): The Luteoviridae CABI PublWallingford 1999 15–22

Taxonomy of viruses, 1975. Melnick, J.L. Progr. med. Virol., 20 1975 208–211

Alternatives to the species concept for virus taxonomy. Milne, R.G. Intervirol. 24 1985 94–98

The Plant Viruses. Vol. 4. Milne, R.G. Plenum Press The Filamentous Plant VirusesNew York and London 1988

423 pp

Ophioviruses, an emerging cluster of plant viruses. Milne, R.G., Accotto, G.P., Lisa, V. and Vaira, A.M. Xth

International Congr. Virology. Jerusalem 1996 84

CMI/AAB (now AAB) Descriptions of Plant Viruses. Murant, A.F. and Harrison, B.D. Sets 1–22. Assoc. Appl.

Biol., Wellesbourne 1970-1989

Virus Taxonomy. Classification and Nomenclature of Viruses. Murphy, F.A., Fauquet, C.M., Bishop, D.H.L.,

Ghabrial, S.A., Jarvis, A.W., Martelli, G.P., Mayo, M.A. and Summers, M.D. Springer VerlagWien

and New York 1995 586 pp

A vírusok biológiája. Nász, I. Medicina Kiadó In: Csaba, Gy. (szerk.): A biológia aktuális problémáiBudapest

1975 9–67

Vírusrendszertan. Nász, I. Biológia 27 1979 3–43

Álatalános virológia. Nász, I. Medicina Könyvkiadó In: Nász, I., Klinikai mikrobiológiaBudapest 1988 49–95

Az adenovírusok és kórokozó szerepük. Nász I., Béládi I. és Lengyel A. Akadémiai KiadóBudapest 1967

Vírus, Mycoplasma and Rickettsia Diseases of Fruit Trees. Németh, M. Akadémiai KiadóBudapest 1986 841 pp

Viren, Mykoplasmosen und Rickettsien. Nienhaus, F. UlmerStuttgart 1985 264 pp

Identification of Plant Viruses. Noordam, D. Methods and Experiments. PUDOC.: Wageningen 1973 207 pp

Taxonomy of several tobamoviruses from China as determined by molecular hybridization analysis with

complementary DNA. Palukaitis, P., Randles, J.W., Tian Ying-tuan, Kang, Liang-yi and Tien, Po

Intervirology 16 1981 136–141

Irodalom


Yield losses in virus-infected crops. Pennazio, S., Roggero, P. and Conti, M. Arch. Phytopath. Pflanz. 30 1996

283–296

Virus nomenclature. Pereira, H.G. Nature 210 1966 149–150

Recent Progress in Tospovirus and Thrips Research. Peters, D. and Goldbach, R. 4th Internat. Symp.

Tospoviruses and Thrips in Floral and Vegetable Crops. Wageningen 1998 110 pp

Strawberry vein banding virus – definitive member of the genus caulimovirus. Petrzik, K., Benes, V., Mráz, I.,

Honetlegrová-Fránová, J., Ansorge, W. and ¹pak, J. Virus Genes 16 303–305

The universal system of virus taxonomy of the International Committee on Virus Taxonomy (ICTV), including

new proposals ratified since publication of the Sixth ICTV Report in 1995. Pringle, C.R. Arch. Virol.

142/1 1998 203–208

The emergence of whitefly-transmitted geminiviruses in tomato in the Western Hemisphere. Polston, J.A. and

Anderson, P.A. Plant Dis. 81 1997 1358–1359

Nucleotide sequence and taxonomy of maize chlorotic dwarf virus within the familie Sesquiviridae. Reddick,

B.B., and Habera, L.F. J. Gen. Virol. 78 1997 1165–1174

Mechanisms of plant virus evolution . Roossinck, M.J. Ann. Rev. Phytopathol. 35 1997 191–209

A phylogenetic and evolutionary justification for three genera of Geminiviridae. Rybicki, E.P. Arch. Virol. 139

1994 49–77

Virologisches Praktikum. Schmelzer, K., Schmidt, H.E. und Wolf, P. Akademie Verlag In: Klinkowski, M.

(Ed.), Pflanzliche Virologie. Band 1, Einführung in die allgemeinen ProblemeBerlin 1980 531–610

Synthetic Antiphytoviral Substances. Schuster, G. Plenum Publ. Corp In: Kurstak, E., Marusyk, R.G. and

Murphy, F.A. (Eds), Applied Virology Research. Vol. 1. New Vaccines and ChemotherapyNew York

1988 265–283

Isolation and characterization of a rodshaped, whitefly transmissible, DNA-containing plant virus. Sela, I.,

Assouline, I., Tanne, E., Cohen, S. and Marco, S. Phytopathology 70 1980 226–228

The Potyviridae. Shukla, D.D., Ward, C.W. and Brunt, A.A. CAB InternationalWallingford 1993 516 pp

The Luteoviridae. Smith, H.G. and Baker, H. CABI Publ. CAB InternationalWallingford 1999 297

Insect Virology. Smith, K.M. Academic PressNew York and London 1997 256. pp

Phylogenetic relationships within the family Potyviridae: Wheat streak mosaic virus and brome streak mosaic

virus are not members of the genus Rymovirus. Stenger, D.C., Hall, J.S., Choi, Il-R. and French, R.

Phytopathology 88 1998 782–787

Az L333, az azadihidrouracil (DHT) és a cianoguanidin (CG) gátló hatása az árpa csíkos mozaik vírus (BSMV)

ellen. Tallóczy, Zs. és Gáborjányi R. Növénytermelés 39 1990 245–253

Proposed re-classification of furoviruses. Torrance, L. and Mayo, M.A. Arch. Virol. 142/2 1997 435–439

Gyümölcsfák vírusos, mikoplazmás és rickettsiás betegségei. V., Németh M. Mezőgazdasági KiadóBudapest

1979 629 pp

Applying the species concept to plant viruses. Van Regenmortel, M.H.V. Arch. Virol. 104 1989 1–17

Virus species, a much overlooked but essential concept in virus classification. Van Regenmortel, M.H.V.

Intervirol. 31 1990 241–254

Viral species. Van Regenmortel, M.H.V. Chapman and Hall Ltd In: Claridge, M.F., Dawah, H.A. and Wilson,

M.R. (Eds), Species: The Units of BiodiversityLondon 1997 17–24

Irodalom


The Plant Viruses. Van Regenmortel, M.H.V. and Fraenkel-Conrat, H. Plenum PressNew York and London

1986 424 pp

The concept of virus species. Van Regenmortel, M.H.V., Maniloff, J. and Calisher, C. Arch. Virol. 120 1991

313–314

Applied Plant Virology. Walkey, D.G.A. Heinemann LtdLondon 1986 329 pp

Interspecific reassortment in the evolution of a cucumovirus. White, P.S., Morales, F.J. and Roossinck, M.J.

Virology 207 1995 334–337

Classifying viruses at higher levels: symmetry and structure of virus particles as criteria. Wildy, P. Symp. Soc.

Gen. Microbiol. 12 1962 145–163

Classification and Nomenclature of Viruses. Wildy, P. In: Melnick, J.L. (ed.), Monographs in Virology. Vol. 5.

S. Karger, Basel, München, Paris, London, New York, Sydney 1971 450 pp

Ecology and epidemiology of whitefly-transmitted closteroviruses. Wisler, G.C., Duffus, J.E., Liu, H.-Y. and Li,

R.H. Plant Disease 82 1998a 270–280

Tomato chlorosis virus: a new whitefly-transmitted, phloem-limited, bipartite closterovirus of tomato. Wisler,

G.C., Li, R.H., Liu, H.-Y., Lowry, D.S. and Duffus, J.E. Phytopathol. 88 1998b 402–409

Antiphytoviral activity of 1-morpholinomethyl-tetrahydro-2(1H)-pyrimidinone (DD13). Yordanova, A.,

Karparov, A., Stoimenova, E. and Starcheva, M. Plant Pathology 45 1996 547–551

Plant Pathology. Agrios, G. N. Academic PressNew York 1988

Kertészeti növények fonálféreg-kártevői. Andrássy, I. és Farkas K. Mezőgazdasági KiadóBudapest 1988 419 pp

Plant regeneration from seedling derived callus of dodder (Cuscuta trifolii Bab. et Gibbs). Bakos, Á., Fári, M.,

Toldi, O. and Lados, M. Plant Science 109 1995 95–101

Basky, Zs. (1993) Acta Phytopath. et Entomol. Hung. 28 71–121 Identification key for alate aphids caught in

yellow pan traps.

A szilvahimlő vírust terjesztő levéltetvek rajzása és a természetes fertőzés összefüggései. Basky, Zs. és

Gáborjányi R. Növényvédelem 30 1994 201–206

Adsorption of tobacco mosaic virus (TMV) in five soils of Cuba. Blanco-Sanches, N., Crespo, J. and Gonzales,

G. Ciencias de la Agr. 29 1986 9–14

Nematode transmission of plant viruses – a 30 year perspective. Brown, D.J.F. and Trudgill, D.L. Scottish Crop

Research Institute. Ann. Rep. 1997/1998. Invergowrie 1998. pp 1988 121–125

Practical Plant Virology. Dijkstra, J. and De Jager, C.P. Springer Verlag Protocols and ExcercisesBerlin–

Heidelberg 1998 458 pp

Methoden der Übertragung pflanzenpathogener Viren durch Nematoden. Fritzsche, R. Biol. Zbl. 86 1967 753–

759

Tierische Vektoren pflanzenpathogener Viren. Fritzsche, R., Karl, E., Lehmann, W. und Proeseler, G. VEB

Gustav Fischer VerlagJena 1972 521 pp

Bevezetés a növényvirológiába. Gáborjányi, R. JATE PressSzeged 1991

Adatok a sztolbur vírus magyarországi elterjedéséhez. Gáborjányi, R. és Lönhard M. Növényvédelem 3 1967

176–180

A paradicsom bronzfoltosság vírus (TSWV) járványtani kérdései. Gáborjányi R., Jenser G. és Nagy Gy.

Növényvédelem 29 1993 543–547

Irodalom


Characterization and natural spread of tomato spotted wilt virus isolated in Hungarian tobacco plantations.

Gáborjányi, R., Jenser, G. and Vasdinyei, R. Horticultural Science 26 1994 91–94

A paradicsomot, a paprikát és a dohányt fertőző paradicsom bronzfoltosság vírus hazai izolátumainak tünettani

és szerológiai jellemzése. Gáborjányi R., Vasdinyei R., Almási A., Csilléry G. és Ekés M.


Plant Virology. Gibbs, A. and Harrison, B. The Principles. Edward Arnold, London 1976

Evidence that a component other than the virus particle is needed for aphid transmission of potato virus Y.

Govier, D. A. and Kassanis, B. Virology 57 1974 285–286

Partial purification and characterization of the potato virus Y helper component. Govier, D. A., Kassanis, B.

and Pirone, T. P. Virology 78 1977 306–314

Vectors of Plant Pathogens. Harris, K. F. and Maramorosch, K. Academic PressNew York 1980 467 pp

Transmission of tobacco ratte virus isolate PpK20 by its nematode vector requires one of the two nonstructural

genes in the viral RNA2. Hernández, C., Visser, P. B., Brown, D.J.F. and Bol, J.F. J. Gen. Virology 78

1997 465–467

Methods in Virology. Hill, S. A. Blackwell Sci. PublOxford 1984 167 pp

The water-culture method for growing plants without soil. Hoagland, D.R. and Arnon, D.J. Coll. Agr. Univ.

CalifBerkeley 1950

A levélsodródás vírus (Corium solani Holmes) kimutatására alkalmazott Igel-Lange teszt megbízhatósága.

Horváth, J. Növénytermelés 3 1962 257–266

A burgonya levélsodródás vírus (Corium solani Holmes) átvitele indikátornövényekre. Horváth, J.

Növénytermelés 1 1963 57–64

Green petal – a new disease of rape in Hungary. Horváth, J. Acta Phytopath. Acad. Sci. Hung. 4: 1969 363–367

A sárgaság típusú növénybetegségeket okozó mikoplazmák tulajdonságai és a növényi mikoplazmózisok.

Horváth, J. Növénytermelés 19 1970 327–337

Növényvírusok, vektorok, vírusátvitel. Horváth, J. Akadémiai KiadóBudapest 1972 515 p

Újabb adatok a mikoplazmák és mikoplazmózisok tulajdonságairól és előfordulásáról. Horváth, J. A

Növényvéd. Korszerűsítése 8 1974 103–148

Host Plants in Diagnosis. Horváth, J. CRC Press In: R.E.F. Matthews (Eds), Diagnosis of Plant Virus

DiseasesBoca Raton, Florida 1993a 15–47

Hosts and non-hosts in the diagnostic strategy of plant viruses. Horváth, J. Acta Phytopath. et Entomol. Hung.

28 1993b 257–354

Isolation of cucumber mosaic virus from a water plant living in the Lake Balaton. Horváth, J. Malhotra Publ.

House In: Rishi, N., Ahuja, K. L. and Singh, B. P. (Eds), Virology in the TropicsNew Delhi 1994 211–

216

Növényvirológia. Horváth, J. Egyetemi jegyzet. Pannon Agrártudományi Egyetem, Keszthely 1999 237 pp

Solanum demissum-Hybride A6 als neue Testpflanze für den Nachweis des Gurkenmosaik-Virus (cucumber

mosaic virus). Horváth, J. and Pocsai, E. Z. Pfl-Krankheiten 78 1971 695–699

Tobacco mosaic virus in Danube water in Hungary. Horváth, J., Juretiæ, N., Krajaæiæ M. and Mamula, D. Acta

Phytopath. et Entomol. Hung. 21 1986 337–340

Transmission of plant viruses by dodder. Hosford, R. M. Bot. Rev. 33 1967 387–406

Irodalom


Molecular biology of plant virus-vector interaction. Hull, R. Springer-Verlag In: Harris, K.F. (Ed), Advances in

Disease Vector ResearchNew York 1994 361–383

Kis nematologia. Jávor, I. Mezőgazdasági KiadóBudapest 1974 142 pp

A tripszek szerepe a paradicsom bronzfoltosság vírus terjedésében. Jenser, G. Növényvédelem 31 1995 541–

545

Seed transmission of viruses: current perspectives. Johansen, E., Edwards, M.C. and Hampton, R.O. Ann. Rev.

Phytopathol. 32 1994 363–386

Experimental transmission of viruses in diagnosis. Jones, A.T. CRC Press In: Matthews, R.E.F. (Ed), Diagnosis

of Plant Virus DiseasesBoca Raton 1993a 49–72

Virus transmission through soil and by soil-inhabiting organisms in diagnosis. Jones, A.T. CRC Press In:

Matthews, R.E.F. (Ed), Diagnosis of Plant Virus DiseasesBoca Raton 1993b 73–99

Some data on adsorption of two plant viruses to soil. Juretiæ, N. and Horváth, J. Acta Phytopath. et Entomol.

Hung. 26 1991 423–426

Occuring of ribgrass mosaic virus in water of Hungarian river Zala. Juretiæ, N., Horváth, J. and Krajaèiæ, M.

Acta Phytopath. et Entomol. Hung. 21 1986 291–295

Pflanzliche Virologie. Band I. Klinkowski, M. Akademie Verlag Einführung in die allgemeinen ProblemeBerlin

1958

Plant viruses in rivers and lakes. Koenig, R. Adv. Virus Res. 31 1986 321–333

Plant viruses in German rivers and lakes. I. Koenig, R. and Lesemann, D. E. Tombusviruses, a potexvirus and

carnation mottle virus. Phytopath. Z. 112 1985 105–116

Isolation of carnation ringspot virus from a canal near a sewage plant: cDNA hybridization analysis, serology

and cytopathology. Koenig, R., Lesemann, D. E. and Burgermeister, W. J. Phytopathology 121 1988

346–356

Membran feeding systems aphids research. Kunkel, H. Academic Press In: Harris, K. F. and Maramorosch, K.

(Eds), Aphids as Virus VectorLondon 1977 311–339

Molecular biology of the tobravirus genome. MacFarlane, S., Brown, D.J.F., Vassilakos, N., Mooney, A.,

Schmitt, C., Mueller, A-M., Prior, D. and Oparka, K. Scottish Crop Research Institute. Ann. Rep.

1997/1998. Invergowrie, pp 1998 129–131

Angewandte Pflanzenvirologie. Meyer-Kahsnitz, S. Bernhard Thalacker VerlagBraunschweig 1993 218. pp

Pollen- and seed-transmitted viruses and viroids. Mink, G.I. Ann. Rev. Phytopath. 31 1993 375–402

Aseptic cultivation of four virus transmitting species of leafhoppers (Cicadellidae). Mitsuhashi, J. and

Maramorosch, K. Contrib. Boyce Thompson Inst. 22 1963 165–173

Notes on aphid transmission of potato leafroll virus. Miyamoto, S. and Miyamoto, Y. Scient. Rep. Hyogo Univ.

Agric., Ser. Plant Protection 7 1966 51–66

The Vpg of tobacco etch virus RNA is the 49-Kda proteinase or the N-terminal 2,4-Kda part of the proteinase.

Murphy, J.F., Rhoads, R.E., Hunt, A.G. and Shaw, J.G. Virology 178 1990 285–288

Übertragung der Gelbsuchtviren durch die Zwergzikade Euscelis plebejus (Fallén). Musil, M. Biol. Práce 1

1965 1–86

Identification of Plant Viruses. Methods and Experiments. Noordam, D. Centre for Agricultural Publishing and

Documentation (Pudoc), Wageningen 1973

First report on the multiplication of tomato spotted wilt tospovirus in tobacco thrips, Frankliniella fusca. Pappu,

H.R., Todd, J.W., Culbreath, A.K., Bandla, M. and Sherwood, J.L. Plant Disease 82 1998 1282

Irodalom


A Manual of Entomological Techniques. Peterson, A. 7th Ed. Edwards, Ann. Arbor, Michigen 1953

Efficiency and selectivity of the helper-component-mediated aphid transmission of purified potyvirus. Pirone,

T.P. Phytopathology 71 1981 922–924

Viral genes and gene products that determine insect transmissibility. Pirone, T.P. Virology 2 1991 81–87

Nematode transmission. Raski, D. J. and Hewitt, W. B. Academic Press In: Maramorosch, K. and Koprowski,

H. (Eds): Methods in Virology. Vol. INew York 1967 309–345

Loss of aphid-transmissibility of turnip mosaic virus. Sako, N. Phytopathology 70 1980 647–649

A helper factor essential for aphid transmissibility of turnip mosaic virus. Sako, N. and Ogata, K. Ann.

Phytopath. Soc. Japan 47 1981 68–70

Beiträge zur Kenntnis der Übertragbarkeit von Viren durch Cuscuta-Arten. Schmelzer, K. Phytopath. Z. 28

1956 1–56

Übertragungsmöglichkeiten. Schmelzer, K. Akademie Verlag Übertragung unter Ausschluss tierischer

Vektoren. In: Klinkowski, M. (Ed), Pflanzliche Virologie. Band. 1. Einführung in die allgemeinen

ProblemeBerlin 1980 111–133

Virologisches Praktikum. Allgemeines, Übertragung, Nachweis. Schmelzer, K., Schmidt, H.E. und Wolf, P.

Akademie Verlag In: Klinkowski, M. (Ed), Pflanzliche Virologie. Band 1., Einführung in die

allgemeinen ProblemeBerlin 1980 531–610

Samenübertragbare Viren bei Gemüsekulturen. Schmidt, H.E. Vortr. Pflanzenzüchtung 29 1994 109–136

Immunological detection and mutational analysis of the RNA2-encoded nematode transmission proteins of pea

early browing virus. Schmitt, C., Mueller, A-M., Mooney, A., Brown, D. and MacFarlane, S. Virology

79 1998 1281–1288

The quantitative extraction of nematodes from soil. Seinhorst, J. W. Nematologica 1 1956 249–267

Aphid transmission of cucumber mosaic virus affected by temperature and age of infection in diseased plants.

Stimmann, M. W. and Swenson, K. G. Phytopathology 57 1967 1074–1076

Virus transmission by aphids. Sylvester, E. S. Interscience Publishers A viewpoint. In: Maramorosch, K. (Ed),

Viruses, Vectors and VegetationNew York 1969 159–173

Aquisition, retention and transmission of viruses by nematodes. Taylor, C. E. and Robertson, W. M. Plenum

Press In: Lamberti, F., Taylor, C. E., and Seinhorst, J. W. (Eds), Nematode Vectors of Plant

VirusesLondon 1975 253–276

Fungus transmission of plant viruses. Teakle, D. S. Academic Press In: Maramorosch, K. and Koprowski, H.

(Eds), Methods in Virology. Vol. INew York 1967 369–391

Purification and characterization of potyvirus helper component. Thornbury, D. W., Hellmann, G. M., Rhoads,

R. E. and Pirone, T. P. Virology 144 1985 260–267

Criteria for host plant acceptance by aphids. Tjallingii, W. F. and Mayoral, A. Kluwer Academic Press In:

Menken, S. B. J., Visser, J. H. and Harrewijn, P. (Eds). Proc. 8th Internat. Symp. Insect Plant

RelationshipsDordrecht 1992 280–282

Virus diseases of cucumbers. Van Dorst, H. J. M. Ann. Rep. Glasshouse Grops Res. and Exp. Stat., Naaldwijk

1961 75

Exclusivity and complementarity in the association between nepo- and tobraviruses and their respective vector

nematodes. Vassilakos, N., MacFarlane, S. A., Weischer, B. and Brown, D. J. F. 1997. Med. Fac.

Landbouww. Univ. Gent, 62/3a 1997 713–720

Irodalom


Loss of potyvirus transmissibility and helper component activity correlates with non-retention of virions in

aphid stylet. Wang, R. Y., Ammar, E. D., Thornbury, D. W., Lopez-Moya, J. J. and Pirone, T. P. J.

Gen. Virology 77 1996 861–867

Role of helper component in vector-specific transmission of potyviruses. Wang, R. Y., Powel, G., Hardie, J. and

Pirone, T. P. J. Gen. Virology 79 1998 1519–1524

Testing methods for, genetics of and breeding for resistance to rice stripe disease. Washio, O., Ezuka, A.,

Toriyama, K. and Sakurai Y. Bull. Chugoku Agr. Exp. Stn. 16 1968 39–197

A szaporítóanyag certifikációs rendszere és követelményei. Bach, I. és Szőnyegi S. OMMI, BFNTÁBudapest

1996

Grapevine disease in Hungary caused by alfalfa mosaic virus infection. Beczner, L. and Lehoczky, J. Acta

Phytopath. Acad. Sci. Hung. 16 1981 119–128

Symptoms of Virus Diseases in Plants. Bos, L. Centre Agr. Publ. DocWageningen 1970 1970 206 pp

Practical Plant Virology. Dijkstra, J. and De Jager, C.P. Springer Verlag Protocols and ExcersiesBerlin–


The Potyvirus Group. Vol. 1–4. Edwardson, J.R. and Christie, R.G. Univ. of Florida, Gainesville 1991

Anatomy of plant virus infections. Esau, K. Ann. Rev. Phytopath. 5 1967 45–76

Effects of light and temperature on symptom development and virus content of tobacco leaves inoculated with

potato mop-top virus. Harrison, B. D. and Jones, R.A.C. Ann. Appl. Biol. 67 1971 377–387

Methods in Plant Virology. Hill, S.A. Blackwell Sci. PublOxford 1984 167 pp

Inoculating methods in tobacco mosaic studies. Holmes, F. O. Bot Gaz. 87 1929 56–63

A comparison of the experimental host ranges of tobacco-etch and tobacco-mosaic viruses. Holmes, F. O.


Studies on strains of potato virus Y. 1. Horváth, J. Strain C. Acta Phytopath. Acad. Sci. Hung. 1 1966a 125–138

A burgonyát fertőző vírusok differenciálásának módszerei és a burgonya Y-vírustörzsek (Marmor upsilon

Holmes) tulajdonságai. Horváth, J. Kandidátusi Ért. Rostock-Budapest 1966b 231 pp

Separation and determination of viruses pathogenic to potatoes with special regard to potato virus Y. Horváth,

J. Acta Phytopath. Acad. Sci. Hung. 2 1967 319–360

Die Anfälligkeit von Chenopodium amaranticolor Coste et Reyn. gegenüber dem Kartoffel-Y-Virus im Hinblick

auf die Blattsequenz. Horváth, J. Acta Bot. Acad. Sci. Hung. 15 1969a 71–77

Die Anfälligkeit und Symptomausprägung der Blätter von Nicotiana tabacum L. cv. Hicks Fixed A2-426 nach

Infection mit dem tobacco mosaic virus in Abhängigkeit von ihrer Sequenz am Spross. Horváth, J. Acta

Phytopath. Acad. Sci. Hung. 4 1969b 131–137

Trennung und Nachweis des Kartoffel-X- und Kartoffel-Y-Virus mittels Chenopodium murale Horváth, J. L. Z.

PflKrankh. PflSchutz 76 1969c 9–11


A hőmérséklet és a fotoperiódus hatása a Nicotiana tabacum L. cv. Xanthi-nc dohány-levélkorongok lokális

érzékenységére a dohány mozaik vírussal szemben. Horváth, J. és Pocsai E. A Növényvéd.

Korszerűsítése 6 1972 65–82

Vírus-gazdanövénykörök és vírusdifferenciálás. Horváth, J. Akadémiai Doktori Ért., Budapest-Keszthely 1976

607 pp

Irodalom


Preservation of some plant viruses by dehydration over anhydrous calcium chloride (CaCl2). Horváth, J. and

Besada, W.H. Z. PflKrankheiten 87 1980 463–472


XVIII. Concluding remarks. Acta Phytopath. Horváth, J. Acad. Sci. Hung. 18 1983 121–161

Újabb adatok a növények vírusfogékonyságáról. 5. Horváth, J. Chenopodiaceae (Chenopodium fajok). Bot.

Közlem. 73 1986 229–242

Potato gene centres, wild Solanum species, viruses and aphid vectors. Horváth, J. Acta Phytopath. et Entomol.

23 1988 423–448

A burgonyavírus-kutatás helyzete Magyarországon: Múlt, jelen, jövő. Horváth, J. Burgonyatermesztés 2 1990

36–66

Hosts and non-hosts in the diagnostic strategy of plant viruses. Horváth, J. Acta Phytopath. et Entomo 28 1993a

257–354

A list of proposed letter codes for hosts and non-hosts of plant viruses. Horváth, J. Acta Phytopath. et Entomol.

28 1993b 21–58

Host plants in diagnosis. Horváth, J. CRC Press In: Matthews, R.E.F. (ed), Diagnosis of Plant Virus

DiseasesBoca Raton 1993c 15–48

The role of Nicotiana species in plant virology with special regard to Nicotiana benthamiana Domin: A review.

Horváth, J. Acta Phytopath. et Entomol. 28 1993d 355–377

A szántóföldi növények betegségei. Horváth, J. Mezőgazda KiadóBudapest 1995 428 pp

Potato virus research in Hungary. Horváth, J. and Kazinczi, G. Global Conf. Potato, New Delhi, p 1999 267

Transmission of viruses from apperently healthy potatoes. Johnson, J. Wisc. Agr. Exp. Stat., Res. Bull. No. 63

1925

Szaporítóanyagok EU-minősítési rendszere és meghonosítása Magyarországon. Kiss, P. Agroinform Kiadó és

Nyomda Kft FM EU-Integrációs Sorozat. 17Budapest 1998 1–34

Untersuchungen über die Viruskrankheiten der Kartoffel. 1. Köhler, E. Versuche mit Viren aus der

Mosaikgruppe. Phytopath. Z. 5 1933 567–591

Szőlővírusokkal kapcsolatos újabb hazai kutatások eredményei. Lázár, J. Egyetemi Doktori Értekezés. Budapest

1996

A hazai szőlő-vírusmentesítési program történeti előzményei, jelene és megoldásra váró problémái. Lázár, J.


A szőlő virológiai szűrésének mai gyakorlata és a vírusmentes egészségi állapot megőrzésének kilátásai a termő

üzemi szőlőültetvényekben. Lehoczky, J. Kertgazdaság 13 1981 59–77

Szőlőtőkék korai elhalásának etiológiája. Lehoczky, J. Doktori Ért., Budapest 1992

Szőlőbetegség a lucerna mozaik vírus fertőzésétől. Lehoczky, J. és Beczner L. Vírusátvitel fás szárú

indikátorokra (indexelés). Kertgazdaság 12 1980 59–66

A paradicsom fekete gyűrűs vírus előfordulása szőlőben Magyarországon. Lehoczky, J. és Burgyán J.

Kertgazdaság 18 1986 47–57

A szőlő krómmozaik vírusbetegségének elterjedése hazánkban és vírusának kimutatása ELISA technikával a

szabadföldi tőkék leveléből. Lehoczky J., Kölber M., Beczner L. és Pácsa S. Kertgazdaság 16 1984 41–

52

Isolation of Arabis mosaic virus from Hungarian grapevines. Martelli, G.P. and Lehoczky, J Phytopath. Medit.

7 1968 129–133

Irodalom


Über die Mosaikkrankheit des Tabaks. Mayer, A. Landwirtsch. Versuchsstat. 32 1886 451–467

CMI/AAB Descriptions of Plant Viruses. Murant, A. F. and Harrison, B. D. Assoc. Appl. Biol., Wellesbourne,

Warvick 1970-1988

Gyümölcsfák vírusos, mikoplazmás és rickettsiás betegségei. Németh, M. Mezőgazdasági KiadóBudapest 1979

629 pp

Vírus, mycoplasma and rickettsia diseases of fruit trees. Németh, M. Akadémiai KiadóBudapest 1986 1986 841

pp

A vírusmentes gyümölcs szaporítóanyag-előállítás rendszerének hazai kialakulása, jelenlegi problémái és

kutatási feladatai. Németh, M. és Kölber M. Növényvédelem 35 1998 409–414

Identification on Plant Viruses. Noordam, D. Methods and Experiments. Centre for Agr. Publ. Doc.,

Wageningen 1973

Yield losses in virus-infected crops. Pennazio, S., Roggero, P. and Conti, M. Arch. Phytopath. Pflanz. 30 1996

283–296

Recovery of plants from viral diseases: historical and new perspectives. Pennazio, S., Roggero, P. and Conti, M.

Z. Pflanzenkrankh. Pflschutz 106 1999 128–139

A szántóföldi növények vírusmentesítési rendszere. Pocsai, E. Növényvédelem 35 1998 419–428

Comparative host ranges of six plant viruses. Price, W. C. Amer. J. Botany 17 1940 694–702

Äussere Symptome. Schmelzer, K. Akademie Verlag In: Klinkowski, M., Pflanzliche Virologie. Band 1.

Einführung in die allgemeinen ProblemeBerlin 1980 21–83

Virologisches Praktikum. a, Allgemeines, Übertragung, Nachweis. Schmelzer, K., Schmidt, H. E. und Wolf, P.

Akademie Verlag In: Klinkowski, M., Pflanzliche Virologie. Band 1., Einführung in die allgemeinen

ProblemeBerlin 1980 531–610

Pathologische Zytologie und Anatomie. Schmidt, H.B. Akademie Verlag In: Klinkowski, M., Pflanzliche

Virologie. Band 1. Einführung in die allgemeinen ProblemeBerlin 1980 84–110

On the composite nature of certain potato virus diseases of the mosaic group as revealed by the use of plant

indicators and selective methods of transmission. Smith, K.M. Proc. Roy. Soc. B109 No. 251 1931

Arabis mosaic virus. Thomas, B. J. In: Hammond, J. and Lawson, R. H. (Eds), Diagnostic Methods for Viruses

of Ornamental Crops. Florist and Nursery Crops Laboratory, USDA, BARC-West, Beltsville, USA

1983 3–4

A vírusmentes gyümölcsszaporító-anyag előállítás bázisültetvényeinek kialakítása, fenntartása az Érdi GyDKF

Kft-nél. Voigt, E. és Kállay T. Növényvédelem 34 1998 688–692

Procedures to increase virus yield from infected plants. Yarwood, C.E. Academic Press, New York In:

Maramorosch, K. and Koprowski, H. (Eds), Methods in Virology. Vol. V 1971 451–479

Leaf-dip serology. In: Maramorosch, K. and Koprowski, H. (Eds), Methods in Virology. Vol. V. Ball, E.M.

Academic Press, New York 1971 445–450

Elektronmikroskopische Untersuchungen am Kartoffel-X- und Tabakmosaik-Virus. Bode, O. und Köhler, E. Z.

Naturf. 7b 1952 598–600

Identifizierung von gestreckten pflanzenpathogenen Viren auf morphologischer Grundlage. Brandes, J. Mitt.

biol. BundAnst. Ld-u. Forstw. 110 1964 1–130

Classification of elongated plant viruses on the basis of particle morphology. Brandes, J. and Wetter, C.

Virology 8 1959 99–115

Atlas of Plant Viruses . Vol. I-II. Francki, R.I.B., Milne, R.G. and Hatta, T. CRC PressBoca Raton 1985

Irodalom


Practical Plant Virology. Dijkstra, J. and De Jager, C.P. Springer Verlag Protocols and ExcersiesBerlin-


The relationship between barley stripe mosaic and lychnis ringspot viruses. Gibbs, A.J., Kassanis, B., Nixon,

H.L. and Wood, R.D. Virology 20 1963 194–198

The use of negative staining in the electron microscopic examination of plant viruses in crude extracts.

Hitchborn, J.H. and Hills, G.J. Virology 27 1965 528–540

Techniques for Electron Microscopy. Kay, D. Blackwell Scientific Publications Oxford 1961 1961

Use of thin sectioning for visualization and identification of plant viruses. Martelli, G.P. and Russo, M.

Academic Press In: Maramorosch, K. and Koprowski, H. (Eds), Methods in Virology. Vol.

VIIIOrlando 1984 143–224

Immunosorbent electron microscopy in plant virus studies. Milne, R.G. and Lesemann, D.-E. In Academic

Press: New YorkMaramorosch, K. and Koprowski, H. (Eds), Methods in Virology. Vol. VIII 1984 85–

101

Electron microscopy for the identification of plant viruses in in vitro preparations. Milne, R.G. Academic Press

In: Maramorosch, K. and Koprowski, H. (Eds), Methods in Virology. Vol. VIINew York 1984 87–112

Electron microscopy of in vitro preparations. Milne, R.G. CRC Press In: Matthews, R.E.F. (Ed), Diagnosis of

Plant Virus DiseasesBoca Raton 1993 215–251

Elektronenmikroskopie. Schmidt, H.B. Akademie Verlag In: Klinkowski, M. (Ed), Pflanzliche Virologie. Band

1. Einführung in die allgemeinen ProblemeBerlin 1980a 329–353

Die Darstellung des Virus im Elektronmikroskop. In: Klinkowski, M. (Ed), Pflanzliche Virologie. Band 1.

Schmidt, H.B. Akademie Verlag Einführung in die allgemeinen ProblemeBerlin 1980b 599–610

Localization of the 34 kDa polyhedron envelope protein in Spodoptera frugiperda cells infected with

Autographa californica nuclear polyhedrosis virus. Van Lent, J.W.M., Groenen, J.T.M., Klinge-Roede,

E.C., Rohrmann, G.F., Zuidema, D. and Vlak, J.M. Arch. Virol. III 1990 103–114

Comparison of ultrastructural changes of Nicotiana benthamiana infected with three different viruses. Almási,

A., Ekés, M. and Gáborjányi, R. Acta Phytopath. et Entomol. 31 1996 181–190

Association of virions and coat protein of tobacco vein mottling potyvirus with cylindrical inclusions in tobacco

cells. Ammar, E.D., Rodríguez-Cerezo, E., Shaw, J.G. and Pirone, T.P. Phytopathology 84 1994 520–

524

Chlorophyll, chloroplast ribosomal RNA, DNA are reduced by barley stripe mosaic virus systemic infection.

Brakke, M.K., White, J.L., Samson, R.G. and Joshi, J. Phytopathology 78 1988 570–574

Light and Electron Microscopy of Plant Virus Inclusion. Christie, R.G. and Edwardson, J.R. Florida

Agricultural Experiment Stations. Monograph Ser. Nr. 9., Institute of Food and Agricultural Sciences,

University of Florida, Gainesville 1977

Light microscopic techniques for detection of plant virus inclusion. Christie, R.G. and Edwardson, J.R. Plant

Dis. 70 1986 271

Cell to cell movement of tobacco ringspot virus. Davison, E.M. Virology 37 1969 694

Practical Plant Virology. Protocols and Excercises. Dijkstra, J. and De Jager, C.P. Springer VerlagBerlin-


Assembly of Enveloped RNA Viruses. Dubois-Dalcq, M., Holmes, K.V. and Rentier, B. Springer-VerlagWien

1984

Handbook of Viruses Infecting Legumes. Edwardson, J.R. and Christie, R.G. CRC PressBoca Raton 1991

Irodalom


Inclusions in diagnosing plant virus diseases. Edwardson, J.R., Christie, R.G., Purcifull, D.E. and Petersen,

M.A. CRC Press In: Matthews, R.E.F. (Ed), Diagnosis of Plant Virus DiseasesBoca Raton 1993 101–

128

Viruses in Plant Hosts. Esau, K. The University of Wisconsin PressMadison 1968

Cauliflower mosaic virus gene II product forms distinct inclusion bodies in infected plant cells. Espinoza, A.M.,

Medina, V., Hull, R. and Markham, P.G. Virology 185 1991 337–344

Barley yellow mosaic virus: purification, electron microscopy, serology, and other properties of two types of the

virus. Huth, W., Lesemann, D.-E. and Paul H.-L. Phytopath. Z. 111 1984 37–54

Electron microscopy of developmental stages of tomato spotted wilt virus in plant cells. Ie, T.S. Virology 2 1971

468–479

Plant virions in plasmodesmata. Kitajima, E.W. and Lauritis, J.A. Virology 37 1969 681

Comparative cytological and immunogold labelling studies on different isolates of tomato spotted wilt virus.

Kitajima, E.W., Ávila, de A.C., Resende, R. de O., Goldbach, R.W. and Peters, D. J. Submicrosc.

Cytol. Pathol. 24 1992 1–14

Peripheral vesicles of barley stripe mosaic virus-infected wheat cells contain double-stranded RNA. Lin, N.-S.

and Langenberg, W.G. Virology 142 1985 291–298

Coat protein-related polypeptides from in vitro tobacco mosaic virus coat protein mutants do not accumulate in

the chloroplasts of directly inoculated leaves. Lindbeck, A.G.C., Dawson, W.O. and Thomson, W.W.

Molecular Plant-Microbe Interactions 4 1991 89–94

Plant virus inclusion bodies. Martelli, G.P. and Russo, M. ( Adv. Virus Res. 21 1977 175

Host plant responses to virus infection. In: Fraenkel-Konrat, H. and Wagner, R.R. (Eds), Comprehensive

Virology. Vol. 16. Matthews, R.E.F. Plenum Press Virus-Host InteractionsNew York 1980 297–359

Plant Virology. Matthews, R.E.F. Academic PressNew York 1981

Ultrastructure of cell-wall thickenings and paramural bodies induced by barley stripe mosaic virus. Mc Mullen,

C.R., Garden, W.S. and Myers, G.A. Phytopathology 67 1977 462–467

Aberrant plastids in barley leaf tissue infected with barley stripe mosaic virus. Mc Mullen, C.R., Garden, W.S.

and Myers, G.A. Phytopathology 68 1978 317–325

Some effects of systemic infection by tomato spotted wilt virus on chloroplasts of Nicotiana tabacum leaves.

Mohamed, N.A. Physiological Plant Pathology 3 1973 509–516

Association of TMV coat protein with chloroplast membranes in virus-infected leaves. Reinero A. and Beachy,

R. Plant Molecular Biology 6 1986 291–301

Reduced photosystem II activity and accumulation of viral coat protein in chloroplasts of leaves infected with

tobacco mosaic virus. Reinero A. and Beachy, R. Plant Physiol. 89 1989 111–116

The Potyviridae. Shukla, D.D., Ward, C.W. and Brunt A.A. CAB InternationalCambridge 1994

Light and Electron Microscopy of Plant Virus Inclusions. Christie, R.G. and Edwardson, J.R. Florida

Agricultural Experiment Stations. Monograph Series. Nr. 9. Institute of Food and Agricultural

Sciences, University of Florida, Gainesville 1977

Light microscopic techniques for detection of plant virus inclusions. Christie, R.G. and Edwardson, J.R. Plant

Dis. 70 1986 273

Cytology of virus infection and virus transport. de Zoeten, G.A. Springer-Verlag In: Heitefuss, R. and Williams,

P.H. (Eds), Physiological Plant PathologyBerlin 1976 129–149

Irodalom


Practical Plant Virology. Dijkstra, J. and De Jager, C.P. Springer Verlag Protocols and ExcersiesBerlin-


Viruses in Plant Hosts. Esau, K. The University of Wisconsin PressMadison 1968

Plant Virology. Matthews, R.E.F. Academic PressNew York 1981

Pathologische Zytologie und Anatomie. Schmidt, H.B. Akademie Verlag In: Klinkowski, M. (Ed), Pflanzliche

Virologie. Band 1., Einführung in die allgemeinen ProblemeBerlin 1980 84–110

Néhány fontosabb növényi vírus tisztítási módszere. Balázs, E. és Vassányi, R. Növényvédelmi Kutató

IntézetBudapest 1984 34 pp

Virus degradation and nucleic acid isolation. Bruening, G.E. In: Kado, C.I. and Agrawal, H.O. (Eds), Principles

and Techniques in Plant Virology. Van Nostrand Reinhold, Princeton 1972. pp 1972 444–465

Practical Plant Virology. Dijkstra, J. and De Jager, C.P. Springer Verlag Protocols and ExcercisesBerlin–


The potential for using double stranded RNAs as diagnostic probes for plant viruses. Dodds, J.A. In: R.A.C.

Jones and L. Torrance. (Eds), Developments in Applied Biology 1. Developments and Applications in

Virus Testing. Association of Applied Biologists, Wellesbourne, UK 1986 71–86

Serological comparison of tospoviruses with polyclonal antibodies against the main structural proteins of

TSWV. Feldhoff, A., Kikkert, M., Kormelink, R., Krczal, G., Goldbach, R. and Peters, D. X. Intern.

Congr. Virology, Jerusalem, p 1996 119

Plant Virology Protocols. Foster, G.D. and Taylor, S.C. Humana Press From Virus Isolation to Transgenic

ResistanceTotowa, New Jersey 1998 571 pp

Degradation of tobacco mosaic virus with acetic acid. Fraenkel-Conrat, H. Virology 4 1957 1–4

Purification of potato virus X and preparation of infectious ribonucleic acid by degradation with lithium

chloride. Francki, R.I.B. and McLean, G.D. Australian J. Biol. Sci. 21 1968 1311–1318

A simple technique for purification of tobacco mosaic virus in large quantities. Gooding, G.W., Jr. and Hebert,

T.T. Phytopathol. 57 1967 1285

Methods in Enzymology. Vol. 12A and 12 B. Grossman, L. and Moldave, L. Nucleic Acids. Academic PressNew

York 1967-1968

Propagation of DNA viruses. Methods in Enzymology. Vol. 118. Guilfoyle, T.J. Academic PressNew York 1986

696–704


Application of double-stranded RNA analysis of plants to detect viruses, virus-like agents, virus satellites and

subgenomic viral RNAs. Jones, A.T. In: J.M. Duncan and Torrance, L. (Eds), Techniques for the Rapid

Detection of Plant Pathogens. Blackwell Scientific Publications, Oxford 1992 115–128

Propagation and Purification of RNA Viruses. Lane, L. Academic Press Methods in Enzymology. Vol. 118New

York 1986 687–696

Estudio de la transmisión por áfidos del virus de la sharka, „plum pox virus” (PPV). López-Moya, J.J. Thesis

Doctoral, Univ. Politécnica de Madrid 1993 32–34

The use of hot phenol in preparing DNA. Massie, H.R. and Zimm, B.H. Proc. Natl. Acad. Sci. US. 54 1965

1641–1643

Isolation and analysis of double-stranded RNA from virus-infected plant and fungal tissue. Morris, T.J. and

Dodds, J.A. Phytopathology 69 1979 854–858

Irodalom


Viral specific dsRNA: diagnostic value for plant virus disease identification. Morris, T.J., Dodds, J.A., Hillman,

B., Jordan, R.L., Lommel, S.A. and Tamaki, S.J. Plant Molecular Biology Rep. 1 1983 27–30

CMI/AAB Descriptions of Plant Viruses. Murant, A.F. and Harrison, B.D. Assoc. Appl. Biol., Wellesbourne,

Warwick 1970-1988

Transmission of several plant viruses by phenol-water extracts of diseased tissues. Schlegel, D. Phytopathology

50 1960 156–158

DNA in cauliflower mosaic virus. Shepherd, R.J., Wakeman, R.J. and Romanko, R.R. Virology 36 1968 150–

152

Double stranded DNA from cauliflower mosaic virus. Shepherd, R.J., Bruening, G.E. and Wakeman, R.J.

Virology 41 1970 339–347

Purification and serological analysis of tomato spotted wilt virus. Tas, P.W. L., Boerjan, M.L. and Peters, D.

Neth. J. Pl. Path. 83 1977 61–72

Isolation and properties of virus proteins. Tsugita, A. and Hirashima, A. In: Kado, C. I. and Agrawal, H. (Eds),

Principles and Techniques in Plant Virology. Van Nostrand Reinhold Co. New York 1972 413–443

Double-stranded RNA analysis of strawberry plants affected by June yellows. Watkins, C.A., Jones, A.T. Mayo,

M.A. and Mitchell M.J. Ann. Appl. Biol. 117 1990 73–83

Isolation and characterization of a protein subunit of broadbean mottle virus. Yamazuki, H. and Kaesberg, P. J.

Mol. Biol. 6 1963 465–673

Molecular biology and molecular genetics of plant bromoviruses. Ahlquist, P. Plenum Press In: von Wettstein.

D. and Chua, N.H (Eds), Plant Molecular BiologyNew York 1987 419–431

Nucleotide sequence of brome mosaic virus genome and its implications for virus replication. Ahlquist, P.,

Dasgupta, R. and Kaesberg, P. J. Mol. Biol. 172 1984 369–383

Complete nucleotide sequence of brome mosaic virus RNA3. Ahlquist, P., Luckow, V. and Kaesberg, P. J. Mol.

Biol. 153 1981 23–38

Nucleotide sequence of DNA from an altered-virulence isolate D/H of the cauliflower mosaic virus. Balázs, E.,

Gulley, H., Jonard, G. and Richards, K. Gene 19 1982 239–249

A defective interfering RNA molecule in Cymbidium ringspot virus. Burgyán, J., Grieco, F. and Russo, M. J.

Gen. Virol. 70 1989 235–239

Non-geminated single stranded DNA plant viruses. Chu, P. Boevink, P., Surin, B., Larkin, P., Keese, P. and

Waterhouse, P. Pergamon Press In: Singh, R., Singh, U. and Kohmoto, K. (Eds), Pathogenesis and

Host Specificity in Plant Diseases. Vol. 3. Viruses and ViroidsOxford 1995 311–341

Genom expression of plant positive-strand RNA viruses. Davies, J.W. and Hull, R. J.Gen. Virol. 61 1982 1–14

Translation of mRNA: Protein synthesis directed by several virus RNAs in a cell-free extract from wheat germ.

Davies, J.W. and Kaesberg, P. J. Gen. Virol. 25 1974 11–20

Tospoviruses. de Haan, P. Academic Press In: Webster, R.W. and Granoff, A. (Eds), Encyclopedia of

VirologyLondon, Vol. 3 1994 1459–1464

Geminiviruses. Dhar, A.K. and Singh, R.P. Pergamon Press In: Singh, R., Singh, U. and Kohmoto, K. (Eds),

Pathogenesis and Host Specificity in Plant Diseases. Vol. 3. Viruses and ViroidsOxford 1995 289–309

The cowpea mosaic virus RNA replication complex and the host-encoded RNA-dependent RNA polymerase-

template complex are functionally different. Dorssers, L., van der Meer, J., van Kammen, A. and Zabel,

P. Virology 125 1984 155–174

Irodalom


Translation of potyvirus RNA in a rabbit reticulocyte lysate: Reaction conditions and identification of capsid

protein as one of the products in vitro translation of tobacco etch and pepper mottle viral RNAs.

Dougherty, W.G. and Hiebert, E. Virology 101 1980 466–474

A novel subviral agent associated with a geminivirus. Dry, I.B., Krake, L.R., Rigden, J.E. and Rezaian, M.A.

The first report of a DNA satellite. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94 1997 7088–7093

Translation of TMV-RNA in a cell-free wheat embryo system. Efron, D. and Marcus, A. Virology 53 1973 343–

348

Növénykórokozó mikroorganizmusok. Érsek, T. és Gáborjányi, R. ELTE Eötvös KiadóBudapest 1998 288 pp

Plant Virology Protocols. Foster, G.D. and Taylor, S.C. Humana Press From Virus Isolation to Transgenic

ResistanceTotowa, New Jersey 1998 571 pp

Nucleotide sequence of cauliflower mosaic virus DNA. Franck, A., Gullley, H., Jonard, I.G., Richards, K. and

Hirth. L. Cell 21 1980 285–294

Plant virus satellites. Francki, R.I.B. Ann. Rev. Microbiol. 39 1985 151–174

The complete nucleotide sequence of an infectious clone of cauliflower mosaic virus by M13mp7 shotgun

sequencing. Gardner, R.C., Howarth, A., Hahn, P., Brown-Leudi, M., Shepherd, R.J. and Messing, J.

Nucleic Acid Res. 9 1981 2871–2888

Tospoviruses. Diagnosis, molecular biology, phylogeny and vector relationship. German, T.L., Ullman, D.E.

and Mayer, J.W. Annu. Rev. Phytopathol. 30 1992 315–348

Goelet, P., Lomonosoff, G.P., Butler, P.J.G., Akam, M.E., Gait, M.J. and Karn, J. (1982) Proc. Natl. Acad. Sci.

USA. 79 5818–5822 Nucleotide sequence of tobacco mosaic virus RNA.

Molecular evolution of plant RNA viruses. Goldbach, R.W. Ann. Rev. Phytopathol. 24: 1986 289–310

Structure, replication, and expression of the bipartite genome of cowpea mosaic virus. Goldbach, R. and van

Kammen, A. CRC Press In: Davies, J.W. (Ed.). Molecular Plant Virology. Vol. 2Boca Raton, Florida

1985 83–120

Cucumber mosaic virus replication in cowpea protoplasts: Time course of virus, coat protein and RNA

synthesis. Gonda, T.J. and Symons, R.H. J. Gen. Virol. 45 1979 723–736

Observations concerning the discontinuous DNAs of cauliflower mosaic virus. Gulilley, H., Richards, K.E. and

Jonard, G. EMBO J. 2 1983 277–282

Advances in geminivirus research. Harrison, B.D. Ann. Rev. Phytopathol. 23 1985 55–82

Virus resistance in transgenic plants that express cucumber mosaic virus satellite RNA. Harrison, B.D., Mayo,

M.A. and Baulcombe, D.C. Nature 328 1987 799–802

A defective interfering RNA that contains mosaic of a plant virus genome. Hillman, B.I., Carrington, J.C. and

Morris, T.J. Cell 51 1987 427–433

Replication of cauliflower mosaic virus and transcription of its genome in turnip leaf protoplasts. Howell, S.H.

and Hull, R. Virology 86 1978 468–481

Does the cauliflower mosaic replicate by reverse transcription? Hull, R. and Covey, S.N. Trends Biochem. Sci.

8 1983 119–121

Structure and replication of caulimovirus genomes. Hull, R., Covey, S.N. and Maule, A.J. J. Cell Sci., Suppl. 7

1987 213–229

Infection of protoplasts from soybean cell culture with southern bean mosaic and cowpea mosaic viruses. Jarvis,

N.P. and Murakishi, H.H. J. Gen. Virol. 48 1980 365–376

Irodalom


Cucumber mosaic virus-associated RNA5. Kaper, J.M. and Waterworth H.E. Causal agent for tomato necrosis.

Science 196 1977 429–431

Cucumoviruses. Kaper, J.M. and Waterworth, H.E. Elsevier-North Holland Biomedical Press In: Kurstak, E.

(Ed), Handbook of Plant Infections and Comparative DiagnosisAmsterdam 1981 257–332

The nucleic acid sequence of cowpea mosaic virus B RNA. Lomonossoff, G.P. and Shanks, M. EMBO J. 2 1983

2253–2258

Viral taxonomy for the nonvirologist. Matthews, R.E.F. Ann. Rev. Microbiol. 39 1985 451–474

Plant Virology. Matthews, R.E.F. Academic PressSan Diego, London 1991 835 pp

Fundamentals of Plant Virology. Matthews, R.E.F. Academic PressSan Diego 1992 403 pp

The nucleotide sequence of maize streak virus DNA. Mullineaux, P. M., Donson, J., Morris-Krsinich, B.A.M.,

Boulton, M.I. and Davies, J.W. EMBO J. 3 1984 3063–3069

Satellites of plant viruses Murant, A.F. and Mayo, M.A. Ann. Rev. Phytopathol. 20 1982 49–70

Efficient system of homologous RNA recombination in brome mosaic virus: sequence and structure requirement

and accuracy of crossovers. Nagy, P.D. and Bujarski, J.J. J.Virol. 69 1995 131–140

Time course of alfalfa mosaic virus RNA and coat protein synthesis in cowpea protoplasts. Nassuth, A.,

Bruggencate, G. and Bol, J.F. Virology 125 1983 75–84

A szilvahimlő vírus molekuláris klónozása, új diagnosztikai módszer kifejlesztése és transzgénikus

vírusrezisztens növények előállítása. Palkovics, L. Ph.D. értekezés, Gödöllő 1996 1–113

Comparative sequence analysis of four complete primary structures of plum pox virus strains. Palkovics, L.,

Burgyán, J. and Balázs, E. Virus Genes 7 1993 339–247

Involvement of reverse transcription in the replication of cauliflower mosaic virus: A detailed model and test of

some aspects. Pfeifer, P. and Hohn, T. Cell (Cambridge, Mass.) 33 1983 781–789

Expression of cowpea mosaic virus M RNA in cowpea protoplasts. Rezelman, G., Goldbach, R. and van

Kammen, A. J. Virol. 36 1980 366–373

Expression of cowpea mosaic virus M RNA in cowpea protoplasts. Rezelman, G., van Kammen, A., and

Wellink, J. J. Gen. Virol. 70 1989 3043–3050

Highlights and prospects of potyvirus molecular biology. Riechmann, J.L., Lain, S. and Garcia, J.A. J. Gen.

Virol. 73 1992 1–16

Mechanisms of plant virus evolution. Roossinck, M. J. Annu. Rev. Phytopathol. 35 1997 191–209

Effects of defective interfering viruses on virus replication and pathogenesis in vitro and in vivo. Roux, L.,

Simon. A.E. and Holland J.J. Adv. Virus Res. 40 1991 181–211

The molecular biology of geminiviruses. Stanley, J, Adv. Virus Res. 30 1985 139–177

Structure and function of the DNA geminiviruses. Stanley, J. and Davies, J.W. CRC Press In: Davies, J.W. (Ed),

Molecular Plant Virology. Vol. 2Boca Raton, Florida 1989 191–218

The use of protoplasts in plant virology. Takebe, I. Annu. Rev. Phytopathol. 13 1975 105–125

Monoclonal antibodies against tomato spotted wilt virus: Characterization and application. Adam, G.,

Lesemann, D. E. and Vetten H. J. Ann. Appl. Biol. 118 1991 87–104

Immunochemical studies of tobacco mosaic virus. VI. Altschuh, D., Al Moudallal, Z., Briand, J. P. and Van

Regenmortel, M. H. V. Attempts to localize viral epitopes with monoclonal antibodies. Mol. Immunol.

22 1985 329–337

Irodalom


Three-dimensional structure of an antigen-antibody complex at 2.8 A resolution. Amitt, A. G., Marinzza, R. A.,

Phillips, S. E. V. and Poljak, R. J. Science 233 1986 747–753

Coupling of enzymes to proteins with glutaraldehyde. Avrameas, S. Use of the conjugates for the detection of

antigens and antibodies. Immunochemistry 6 1969 43–52

Plant Dis. 69, 202–205. Banttari, E. E. and Goodwin, P. H. (1985) Detection of potato viruses S, X, and Y by

enzyme-linked immunosorbent assay on nitrocellulose membranes (Dot-ELISA).

A simple indirect ELISA using F(ab’)2 fragments of immunoglobulin. Barbara, D. J. and Clark, M. F. J. Gen.

Virol. 58 1982 315–322

Application of new test procedures to surveys: merging the new with the old. Barnett, O. W. In: Jones, R. A. C.

and Torrance, L. (Eds), Developments and Applications in Virus Testing. Association of Applied

Biologists, Wellesbourne, pp 1986 247–268

Textbook of Immunology. Barrett, J. T. C. V. Mosby CoSt. Louis, MO 1988 455 pp

Preparation of antigens, viruses. Brakke, M. K. APS Press In: Hampton, R., Ball, E. and De Boer, S. H. (Eds),

Serological Methods for Detection and Identification of Viral and Bacterial Plant PathogensSt. Paul,

Minnesota 1990 15–26

Serological differentiation of tobamoviruses by means of monoclonal antibodies. Briand, J. P., Al Moudallal, Z.

and Van Regenmortel, M. H. V. J. Virol. Meth. 5 1982 293–300

Cross-protection and multiplication of mild and severe strains of TMV in tomato plants. Burgyán, J. and

Gáborjányi, R. Phytopath. Z. 110 1984 156–167

Monoclonal Antibody Technology: The Production and Characterization of Rodent and Human Hybridomas.

Campbell, A. M. ElsevierNew York 1984 265 pp

Characteristics of the microplate method of enzyme-linked immunosorbent assay for the detection of plant

viruses. Clark, M. F. and Adams, A. N. J. Gen. Virol. 34 1977 475–483

Enzyme immunosorbent assays in plant virology. Clark, M. F. and Bar-Joseph, M. Academic Press In:

Maramorosh, K. and Koprowski, H. (Eds), Methods in Virology. Vol. VIIOrlando 1984 51–85

Three-dimensional structure of a complex of antibody with influenza virus neuraminidase. Colman, P. M.,

Laver, W. G., Varghese, J. N., Baker, A. T., Tulloch, P. A., Air, G. M. and Webster, R. G. Nature 326

1987 358–365

Practical Plant Virology. Dijksra, J. and De Jager, C.P. Springer Verlag Protocols and ExcersiesBerlin-


Plant virus detection using a new form of indirect ELISA. Edwards, M. L. and Cooper, J. I. J. Virol. Methods 11

1985 309–319

T cell receptors: Structure and genetics. Ezquerra, A. and Coligan, J. E. Current Opinion in Immunol. 1 1988

77–83

Interaction of major histocompatibility complex molecules with immunogenic peptides. Fox, B. S. Current

Opinion in Immunol. 1 1988 103–106

Monoclonal antibodies: Principles and Practice. Goding, J. W. Academic Press Production and Application of

Monoclonal Antibodies in Cell Biology, Biochemistry and ImmunologyNew York 1983 276 pp

Serological identification of potato Y virus and tobacco etch virus using immunodiffusion plates containing

sodium dodecyl sulfate. Gooding, G. V. and Bing, W. W. Phytopathology 60 1970 1293

Rocket immunelectrophoresis assay for cauliflower mosaic virus. Hagen, T. J., Taylor, D. B. and Meagher, R.

B. Phytopathology 72 1982 239–242

Irodalom


Monoclonal antibodies in plant-disease research. Halk, E. L. and De Boer, S. H. Ann. Rev. Phytopathol. 23

1985 321–350

APS Press: St. Paul, Minnesota Hampton, R., Ball, E. and De Boer, S. (Eds) (1990) 387 pp Serological Methods

for Detection and Identification of Viral and Bacterial Plant Pathogens.

Antibodies. A laboratory manual. Harlow, E. and Lane, D. Cold Spring Harbor Laboratory. Cold Spring Harbor,

NY 1988 726 pp

A quantitative theory of the precipitin reaction. II. Heidelberger, M. and Kendall, F. E. A study of an azoprotein

– antibody system. J. Exp. Med 1935 62, 467

Herstellung und Charakterisierung von poly- und monoklonalen Antikörpern gegen fünf Stämme des

Wasserrübenmosaikvirus (Turnip mosaic virus, TuMV). Herscheid, R. Inaugural Dissertation zur

Erlangung des Grades Dr. agr. Bonn 1992 122 pp

A dot immunobinding assay for the detection of tobacco mosaic virus in infected tissues. Hibi, T. and Saito, Y. J.

Gen. Virol. 66 1985 1191–1194

Host plants in diagnosis. Horváth, J. CRC Press In: Matthews, R. E: F. (Ed), Diagnosis of Plant Virus

DiseasesBoca Raton 1993 15–48

Towards a network theory of the immune system. Jerne, N. K. Ann. Immunol. (Inst. Pasteur). 125C 1974 373–

389

Serological properties of viruses and their fragments. Kleckowski, A. In: Beemster, A. B. R. and Dykstra, J.

(Eds), Viruses of Plants. North-Holland, Amsterdam 1966 196 pp

Applications of immuno-blotting in plant virus diagnosis. Koenig, R. and Burgermeister, W. In: Jones, R. A. C.

and Torrance, L. (Eds), Developments and Applications in Virus Testing. Developments in Applied

Biology. Association of Applied Biologists. Wellesbourne, pp 1986 121–138

Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specifity. Kohler, G. és Milstein, C. Nature

256 1975 495–497

Electroimmunoassay. Laurell, C. B. and McKay, E J., Academic Press In: Langone, J. J. and van Vunakis, H.

(Eds), Methods in Enzymology. Part B. Immunochemical Techniques. Vol. 73New York 1981 339–

369

Immunological detection of plant viruses and a mycoplasmalike organism by direct tissue blotting on

nitrocellulose membranes. Lin, N. S., Hsu, Y. H. and Hsu, H. T. Phytopathology 80 1990 824–828

Evaluation of indirect enzyme-linked immunosorbent assay for the detection of plant viruses. Lommel, S. A.,

McCain, A. H. and Morris, T. J. Phytopathology 72 1982 1018–1022

Antigen recognition overwiev. Long, E. O. and Kindt, T. J. Current Opinion in Immunol. 1 1988 71–72

Plant Virus Serology. Matthews, R. E. F. University PressCambridge 1957 128 pp

Serological characterization of Hungarian plum pox virus isolates. Moya, J. L., Abella, D. L., Rúiz, J. R.,

Garcia, B. M. and Gáborjányi, R. Z. Naturforsch. 52 1997 1–5

Identification of Plant Viruses: Methods and Experiments. Noordam, D. Center Agric. Publ. Document,

Wageningen 1973 207 pp

Handbook of Immunodiffusion and Immunoelectrophoresis. Ouchterlony, O. Ann. Arbor Science Publishers,

Inc. Ann Arbor 1968 215 pp

Specific precipitation in gels and its application to immunochemical analysis. Oudin, J. Year Book Publishers

Inc In: Corcoran, A. (Ed), Methods in Medical Research. Vol. 5Chicago 1952 335–378

Immunodiffusion tests with sodium dodecyl sulfate (SDS)-treated plant viruses and plant viral inclusions.

Purcifull, D. E. and Batchelor, D. L. Fla. Agric. Exp. Stn. Tech. Bull. 788 1977). 1–39

Irodalom


Improvements in the passive hemagglutination technique for serological detection of plant viruses. Rajeshwari,

R., Reddy, D. V. R. and Izuka, N. Phytopathology, 71 1981 306–308

Development of a dot-immunobinding assay for detection of citrus tristeza virus. Rocha-Pena, M. A., Lee, R. F.

and Niblett, C. L. J. Virol. Meth. 34 1991 297–309

Potato Viruses and Their Control. Salazar, L. F. IPC PessLima 1996 214 pp

Gel-Diffusion Methods for the Serological Detection of Potato Viruses X, S and M. Shepard, J. F. Montana State

Univ. Bull. 662 1972 1–71

Immunochemical cross-reactivity between the dissociated capsid proteins of PVY group plant viruses. Shepard,

J. F., Secor, G. A. and Purcifull, D. E. Virology 58 1974 464–475

Three dimensional structure of an antobody-antigen complex. Sheriff, S., Silverton, E. V., Padlam, E. A.,

Cohen, G. H., Smith-Gill, S. J., Finzel, B. C. and Davies, D. R. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84 1987

8075–8079

Detection of viral antigens by direct one-incubation time-resolved fluoroimmunoassay. Siitari, H., Lovgren, T.

and Halonen, P. In: Jones, R. A. C. and Torrance, L. (Eds), Developments and Applications in Virus

Testing. Association of Applied Biologists, Wellesbourne, pp 1986 155–164

Hybridoma Technology in Agricultural and Veterinary Research. Stern, N. and Gamble, H. R. Rowman and

AllenheldNew Yersey 1984 318 pp

The use of rocket immunoelectrophoresis to detect tobacco mosaic virus in infected pepper tissues. Tóbiás, I.,

Hornok, L. and Balázs, E. Acta Phytopath. Acad. Sci. Hung 14 1979 231-237

Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: Procedure and some

applications. Tobwin, H., Staehelin, T. and Gordon, J. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76 1979 4350–4354

Use of protein A to improve sensitisation of latex particles with antibodies to plant viruses. Torrance, L. Ann.

Appl. Biol. 96 1980 45–50

Single radial immunodiffusion. Vaerman, J. P. Methods Enzymol. 73 1981 291–305

Detection of a wide spectrum of tobacco mosaic virus strains by indirect enzyme immunoassay (ELISA). van

Regenmortel, M. H. V. and Burckard, J. Virology 106 1980 327–334

Serology and Immunochemistry of Plant Viruses. van Regenmortel, M. H. V. Academic PressNew York 1982

302 pp

Molecular dissection of protein antigens and the prediction of epitopes. van Regenmortel, M. H. V. Elsevier

Science Publ. Co. Inc In: Burdon, R.H. and van Kippenberg, P. H. (Eds), Laboratory Techniques in

Biochemistry and Molecular BiologyNew York 1988 1–40

Serological procedures. van Regenmortel, M. H. V. and Dubs, M. C. CRC Press In: Matthews, R. E. F. (Ed),

Diagnosis of Plant Virus DiseasesBoca Raton 1993 159–214

Serology in virus disease diagnosis. Wetter, C. Ann. Rev. Phytopathol. 3 1965 19–42

Gene Cloning. Brown, T.A. An introduction. Chapman and Hall 1990

Practical Plant Virology. Dijkstra, J. and De Jager, C.P. Springer Verlag Protocols and ExcercisesBerlin-


Nucleic Acid Hybridisation. Hames, B.D. and Higgins, S.J. IRL Press A Practical ApproachOxford 1985

Nucleic acid hybridization procedures. Hull, R. CRC Press In: Matthews, R.E.F. (Ed), Diagnosis of Plant

VirusesBoca Raton 1993 254–271

Plant Virology. Third Edition. Matthews, R.E.F. Academic PressNew York 1991

Irodalom


Fundamentals of Plant Virology. Matthews, R.E.F. Academic PressSan Diego 1992 1992. 403 pp

A new methode of sequencing DNA. Maxam, A. and Gilbert, W. Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 74 1977 560–564

Comparative stucture of viroids and their rapid detection using radioactive and nonradioactive nucleic acid

probes. McInnes, J.L. and Symons, R.H. CRC Press In: Maramorosch, K. (Eds), Viroids and Satellites:

Molecular Parasites at the Frontier of LifeBoca Raton 1991

Orvosi biológia. I. Genom, gének, sejtfunkciók. Molnár, J. Egyetemi jegyzet, SZOTE, Szeged 1991

Enzymatic amplification of α-globulin genomic sequences and restriction site analysis for diagnosis of sickle

cell anemia. Saiki, R.K., Scharf, S., Faloona, F., Mullis, K.B., Horn, G.T., Erlich, H.A. and Arnheim,

N. Science 230 1985 1350–1354

Génsebészet. Sain, B. és Erdei S. Gondolat KiadóBudapest 1985

A rapid method for determining sequences in DNA by primer synthesis with a DNA polimerase. Sänger, F. and

Coulson, A.R. J. Molecular Biol. 94 1975 441

Molecular Cloning. Sambrook, J., Fritsch, E.F. and Maniatis, T. A laboratory Manual. Cold Spring Harbor

Laboratory Press 1989

The immunoassay of gibberellins II. Quantitation of GA3, GA4 and GA7 by ultra-sensitive solid-phase enzyme

immunoassay. Atzorn, R. and Weiler, E. W. Planta 159 1983 7–11

Mass spectrometric identification of indole compounds produced by Rhizobium strains. Biomed. Badenoch-

Jones, J., Summons, R. E., Entsch, B., Rolfe, B. G., Parker, C. W. and Letham, D. S. Mass Spectrom. 9

1982 429–437

Phytohormones, Rhizobium mutants, and nodulation in legumes. Badenoch-Jones, J., Summons, R., Rolfe, B. G.

and Letham, D. S. Auxin metabolites in pea root nodules. J. Plant Growth Regul. 3 1984 23–39

Gibberellins and the early disease syndrome of aspermy virus in tomato (Lycopersicon esculentum [Mill.]).

Bailiss, K. W. Ann. Bot. 32 1968 543–551

Gibberellins, Abscisic Acid and Virusinduced Stunting. Bailiss, K. W. Akadémiai Kiadó In: Király, Z. (Ed.),

Current Topics in Plant PathologyBudapest 1977 361–373

Ethylene production in Xanthi tobacco after systemic and local virus infections. Balázs, E., Gáborjányi, R.,

Tóth, A. and Király, Z. Acta Phytopath. Hung. 4 1969 355–358

Leaf senescence and increased virus susceptibility in tobacco. Balázs, E., Gáborjányi, R. and Király, Z. The

abscisic acid. Physiol. Plant. Path. 3 1973 341–346

The role of cytokinins in the systemic acquired resistance of tobacco hypersensitive to tobacco mosaic virus.

Balázs, E., Sziráki, I. and Király, Z. Physiol. Plant Path. 11 1977 29–37

The problem of halting enzyme action when extracting plant tissues. Bieleski, W. J. Anal. Biochem. 9 1964

431–442

Modern methods for plant growth substance analysis. Brenner, M. L. Ann. Rev. Plant Physiol. 32 1981 511–

538

Membrane localised gibberellins A9 and A4 in wheat chloroplasts. Browning, G. and Saunders, P. F. Nature

265 1977 375–377

A rapid and simple procedure for purification of indole-3-acetic acid prior to GC-SIM-MS analysis. Chen, K-

H., Miller, A. N., Patterrson, G. W. and Cohen, J. D. Plant Physiol. 86 1988 822–825

Convenient apparatus for the generation of small amounts of diazomethane. Cohen, J. D. J. Chromatogr. 303

1984 193–196

Irodalom


Modern methods of analysis of gibberellins. Crozier, A. and Durley, R. C. Praeger In: Crozier, A. (Ed.), The

Biochemistry and Physiology of the Gibberellins. Vol. INew York 1983 485–560

NaCl reduces indole-3-acetic acid levels in the roots of tomato plants independent of stress-induced abscisic

acid. Dunlap, J. R. and Binzel, M. L. Plant Physiol. 112 1996 378–384

Reversion of dwarfing induced by virus infection; effect of polyacrylic gibberellic acids. Fernandez, T. F. and

Gáborjányi, R. Acta Phytopath. Hung. 11 1976 271–275

Indole-3-acetic acid. Mass spectra and chromatographic properties of amino acid conjugates. Feung, C. S.,

Hamilton, R. H. and Mumma, R. O. J. Agric. Food Chem. 23 1975 1120–1124

Ethylene production, tissue senescence and local virus infections. Gáborjányi, R., Balázs, E. and Király, Z. Acta

Phytopath. Hung. 6 1971 51–56

Growth inhibition of virus-infected plants: Alterations of peroxidase enzymes in compatible and incompatible

host-parasite relations. Gáborjányi, R., Sági, F. and Balázs, E. Acta Phytopath. Hung. 8 1973 81–90

Gibberellins. Hedden, P. Academic Press In: Rivier, L. and Crozier, A. (Eds.), Principles and Practice of Plant

Hormone Analysis. Vol. ILondon 1987 9–110

Modern methods for the quantitative analysis of plant hormones. Hedden, P. Annu. Rev. Plant Physiol. Plant

Mol. Biol. 44 1993 107–129

Modern methods for plant hormone analysis. Horgan, R. Pergamon In: Rheinhold, L., Harborne, J. B. and

Swain, T. (Eds.), Progress in Phytochemistry. Vol. VIIOxford 1981 137–170

Cytokinins. In: Rivier, L. and Crozier, A. (Eds.), Principles and Practice of Plant Hormone Analysis. Vol. II.

Horgan, R. and Scott, I. M. Academic PressLondon 1987 303–365

Analysis of gibberellins and gibberellin conjugates by ion-supression reversed-phase high-performance liquid

chromatography. Jensen, E., Crozier, A. and Monteiro, A. M. J. Chromatogr. 367 1986 377–384

The five „classical” plant hormones. Kende, H. and Zeevart, J. A. D. Plant Cell 9 1997 1197–1210

New method of detecting traces of illuminating gas. Knight, L. I., Rose, R. C. and Crocker, W. Science 31 1910

635

Cytokinin levels and kinetin-virus interactions in tobacco ringspot virus-infected cowpea. Kuriger, W. E. and

Agrios, G. N. Phytopathology 67 1977 604–609

Thin layer chromatography of gibberellins. MacMillen, J. and Suter, P. J. Nature 197 1963 790

A mathematical treatment for rate data obtained in biological flow systems under nonsteady state conditions.

Marynick, D. S. and Marynick, M. C. Plant Physiol. 56 1975 680–683

Derivatives of indole-3-acetic acid for SIM GC-MS studies. McDougall, J. and Hillman, J. R. Z.

Pflanzenphysiol. 98 1980 89–93

Effect of deseeding on the indole-3-acetic acid contents of shoots and roots of Zea mays seedlings. Momonoki,

Y. S., Schulze, A. and Bandurski, R. S. Plant Physiol. 72 1983 526–529

Ethylene production by detached leaves infected with tobacco mosaic virus. Nakagaki, Y., Hirai, T. and

Stahmann, M. A. Virology 40 1970 1–9

Abscisic acid and related compounds. Neill, S. J. and Horgan, R. Academic Press In: Rivier, L. and Crozier, A.

(Eds.), Principles and Practice of Plant Hormone Analysis. Vol. ILondon 1987 111–167

Oxidation of indole-3-acetic acid and oxindole-3-acetic acid to 2,3-dyhidro-7-hydroxy-2-oxo 1 H indole-3-

acetic acid-7’-O-b-D-glucopyranoside in Zea mays seedlings. Nonhebel, H. M. and Bandurski, R. S.

Plant Physiol. 76 1984 979–983

Irodalom


Effect of tobacco mosaic virus infection on the endogenous levels of indoleacetic, phenylacetic and abscisic

acids of tobacco leaves in various stages of development. Rajagopal, R. Z. Pflanzenphysiol. 83 1977

403–409

Chemical ionization mass spectrometry of IAA and ABA: evaluation of negative ion detection and quantification

of ABA in growing maize roots. Rivier, L. and Saugy, M. J. Plant Growth Regul. 5 1986 1–16

Validation of a radioimmunoassay for (+)-abscisic acid in extracts of apple and sweet-pepper tissue using high-

pressure liquid chromatography and combined gas chromatography-mass spectrometry. Rosher, P. H.,

Jones, H. G. and Hedden, P. Planta 165 1985 91–99

Growth regulators and the effect of barley yellow dwarf virus on barley (Hordeum vulgare L.). Russel, S. L. and

Kimmins, W. C. Ann. Bot. 35 1971 1037–1043

Ethylene. Saltveit, M. E., Jr. and Yang, S. F. Academic Press In: Rivier, L. and Crozier, A. (Eds.), Principles

and Practice of Plant Hormone Analysis. Vol. IILondon 1987 367–401

Indole-3-acetic acid and related compounds. Sandberg, G., Crozier, A. and Ernstsen, A. Academic Press In:

Rivier, L. and Crozier, A. (Eds.), Principles and Practice of Plant Hormone Analysis. Vol. IILondon

1987 169–301

Esterification of fatty acids with diazomethane on a small scale. Schlenk, H. and Gellerman, J. Anal. Chem. 32

1960 1412–1414

Alterations in the auxin levels of resistant and susceptible hosts induced by the curly-top virus. Smith, S. H.,

McCall, S. R. and Harris, J. H. Phytopathology 58 1968 575–577

The effect of infection by TMV on cytokinin level of tobacco plants, and cytokinin in TMV-RNA. Sziráki, I. and

Balázs, E. Akadémiai Kiadó In: Király, Z. (Ed.), Current Topics in Plant PathologyBudapest 1977

345–352

The influence of kinetin on tobacco ringspot virus infectivity and the effect of virus infection on the cytokinin

activity in intact leaves of Nicotiana glutinosa L. Tavantzis, S. M., Smith, S. H. and Witham, F. H.

Physiol. Plant Path. 14 1979 227–233

Effects of auxin on the localization of tobacco mosaic virus in hypersensitively reacting tobacco. Van Loon, L.

C. Physiol. Plant Path. 14 1979 213–226

Etude spectroscopique (IR, NMR1H, masse) comparée des acides indolyl-1 acétique (AIA-1), indolyl-2 acétique

(AIA-2), et indolyl-3 acétique (AIA-3) et de leurs esters méthyliques (masse). Vebrel, J., Laude, B.,

Seguin, A. and Dubouchet, J. Spectrochim. Acta 39 1983 887–894

The role of cytokinins in relation to flower-bud blasting in Iris cv. Ideal: Cytokinin determination by an

improved enzyme-linked immunosorbent assay. Vonk, C. R., Davelaar, E. and Ribot, S. A. Plant

Growth Regul. 4 1986 65–74

Effect of systemic and local-lesion-forming strains of tobacco mosaic virus on abscisic acid concentration in

tobacco leaves: Consequences for the control of leaf growth. Whenham, R. J. and Fraser, R. S. S.

Physiol. Plant Pathol. 18 1981 267–278

High-performance liquid chromatography of plant hormones. II. Wurst, M., Pikryl, Z, and Vokoun, J.

Determination of plant hormones of the indole type. J. Chromatograph. 286 1984 237–245

Rapid stimulation of an oxidative burst during elicitation of cultured plant cells. Apostol, I., Heinstein, P.F. and

Low, P.S. Plant Physiol. 90 1989 109–116

Chloroplast: formation of active oxygen and its scavenging. Asada, K. Acad. Press In: Colowick, S.P. and

Kaplan, N.O. (Eds), Methods in Enzymology. Vol. 105New York 1984 422–429

Early responses during plant-bacteria interactions in tobacco cell suspensions. Baker, C.J., O‟Neill, N.R.,

Keppler, L.D. and Orlandi, E.W. Phytopathology 81 1991 1504–1507

Active oxigen in plant pathogenesis. Baker, C.J. and Orlandi, E.W. Annu. Rev. Phytopathol. 33 1995 299–321

Irodalom


Localization of hydrogen-peroxide accumulation during the hypersensitive reaction of lettuce cells to

Pseudomonas syringae pv. phaseolicola. Bestwick, C.S., Brown, I.R., Benett, M.H.R. and Mansfield,

J.W. Plant Cell 9 1995 209–221

Tissue printing on nitrocellulose paper: a new method for immunolocalization of proteins, localization of

enzyme activities and anatomical analysis. Cassab, G.I. and Varner, J.E Cell Biol. Int. Rep. 13 1989

147–152

Active oxygen species in the induction of plant systemic acquired resistance by salicylic acid. Chen, Z., Silva, H.

and Klessig, D.F. Science 262 1993 1883–1886

Death don’t have no mercy: cell death programs in plant-microbe interactions. Dangl, J.L., Dietrich, R.A. and

Richberg, M.H. Plant Cell 8 1996 1793–1807

Nitric oxide functions as a signal in plant disease resistance. Delledonne, M., Xia, Y., Dixon, R.A. and Lamb,

C.J. Nature 394 1998 585–588

Leaf senescence: Correlated with increased levels of membrane permeability and lipid peroxidation, and

decreased level of superoxide dismutase and catalase. Dhindsa, R.S., Plumb-Dindsa, P.and Thrope,

T.A. J. Exp. Bot. 32 1981 93–101

Early events in the activation of plant defense responses. Dixon, R.A., Harrison, M.J. and Lamb, C.J. Annu.

Rev. Phytopathol. 32 1994 479–501

Involvement of superoxide anion generation in the hypersensitive response of potato tuber tissue to infection

with an incompatibile race of Phytophthora infestans and to the hyphal wall components. Doke, N.

Physiol. Plant Pathol. 23 1983 345–357

Involvement of an O2 generating system in the induction of necrotic lesions on tobacco leaves infected with

tobacco mosaic virus. Doke, N. and Ohashi Y. Physiol. Mol. Plant Pathol. 32 1988 163–175

Defense gene induction in tobacco by nitric oxide, cyclic GMP, and cyclic ADP-ribose. Durner, J.,

Wendehenne, D. and Klessig, D.F. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95 1998 10328–10333

Mechanisms of oxygen activation during plant stress. Elstner, E.F. and Osswald, W. In: Crawford, R.M.M.,

Hendry, G.A.F. and Goodman, B.A. (Eds) Oxygen and enviromental stress in plants. Royal Society of

Edinburgh, Edinburgh, pp 1994 131–154

Local and systemic responses of antioxidants to tobacco mosaic virus infection and to salicylic acid in tobacco.

Fodor, J., Gullner, G., Ádám, A.L., Barna, B., Kőmíves, T. and Király, Z. Role in systemic acquired

resistance. Plant Physiol. 114 1997 1443–1451

An improved method for monitoring active oxygen in bacteria-treated suspension cells using luminol-dependent

chemiluminescence. Glazener, J.A., Orlandi, E.W. Harmon, G.L. and Baker, C.J. Physiol. Mol. Plant

Pathol. 39 1991 123–133

The active oxygen response of cell suspensions to incompatible bacteria is not sufficient to cause hypersensitive

cell death. Glazener, J.A., Orlandi, E.W. and Baker, C.J. Plant Physiol. 110 1996 759–763

Antioxidants in nutrition, health, and disease. Gutteridge, J.M.C. and Halliwell, B. Oxford University PressNew

York, pp 1994 10–13

Properties and physiological function of a glutathione reductase purified from spinach leaves by affinity

chromatography. Halliwell, B. and Foyer, C.H. Planta 139 1978 9–7

Resistance gene-dependent plant defense responses. Hammond-Kosack, K.E. and Jones, J.D.G. Plant Cell 8

1996 1773–1791

Photoperoxidation in isolated chloroplasts. 1. Heath, R.L. and Packer, L. Kinetics and stochiometry of fatty

acid peroxidation. Arch. Biochem. Biophys. 125 1968 189–198

Irodalom


Plasma membrane alteration during bacteria-induced hypersensitive reaction in tobacco suspension cells as

monitored by intracellular accumulation of fluorescein. Keppler, L.D., Atkinson, M.M. and Baker, C.J.

Physiol. Mol. Plant Pathol. 32 1988 209–219

Role of extracellular polysaccharide (EPS) slime of plant pathogenic bacteria in protecting cells to reactive

oxygen species. Király, Z., El-Zahaby, H.M. and. Klement, Z. J. Phytopathology 145 1997 59–68

Scavenging of hydrogen peroxide in the endosperm of Ricinus communis by ascorbate peroxidase. Klapheck, S.,

Zimmer, I. and Cosse, H. Plant Cell Physiol. 31 1990 1005–1013

Hypersensitivity. Klement, Z. Academic Press In: Mount, M.S. and Lacy, G.H. (Eds), Phytopathogenic

ProcaryotesNew York 1982 149–177

The salicylic acid signal in plants. Klessig, D.F. and J. Malamy Plant Mol. Biol. 26 1994 1439–1458

Hypersensitive cell death, autofluorescence, and insoluble silicon accumulation in barley leaf epidermal cells

under attack by Erysiphe graminis f. sp. hordei. Koga, H., Zeyen, R.J., Bushnell, W.R. and Ahlstrand,

G.G. Physiol. Mol. Plant Pathol. 32 1988 395–409

Hydrogen peroxide stimulates salicylic acid biosynthesis in tobacco. Léon, J., Lawton, M.A. and Raskin, I.

Plant Physiol. 108 1995 1673–1678

H2O2 from the oxidative burst orchestrates the plant hypersensitive disease resistance response. Levine, A.,

Tenhaken, R., Dixon, R. and Lamb, C. Cell 79 1994 583–593

Alternative solutions to radical problems. Millar, A.H. and Day, D.A. Trends in Plant Science 2 1997 289–290

Inhibition of programmed cell death in tobacco plants during a pathogen-induced hypersensitive response at

low oxygen pressure. Mittler, R., Shulaev, V., Seskar M. and Lam, E. Plant Cell 8 1996 1991–2001

Hydrogen peroxide is scavenged by ascorbate-specific peroxidase in spinach chloroplasts. Nakano, Y and

Asada, K. Plant Cell Physiol. 22 1981 867–880

Abrupt increase in the level of hydrogen peroxide in leaves of winter wheat is caused by cold treatment. Okuda,

T., Matsuda, Y., Yamanaka, A. and Sagisaka, S. Plant Physiol. 97 1991 1265–1267

Hydrogen peroxide and lignification. Olson, P.D. and Varner, J.E. Plant J. 4 1993 887–892

Estimation of hydrogen peroxide in plant extracts using Titanium(IV). Patterson, B.D., MacRae, E.A. and

Ferguson, I.B. Anal. Biochem. 139 1994 487–492

Bonckés alatt a kutatás. Selye, J. Kriterion könyvkiadóBukarest 1975

Ökologische Biochemie (2 Auflage). Schlee, D. Gustav Fischer VerlagJena 1992

Histochemical demonstration and localization of H2O2 in organs of higher plants by tissue printing on

nitrocellulose paper. Schopfer, P. Plant Physiol. 104 1994 1269–1275

A comparison of methods for determination of the oxidative burst in whole plants. Schroeder, A.T., Martin, G.

and Low, P.S. In: Stacey, G., Mullin, B. and Gresshoff, P.M. (Eds), Biology of Plant-Microbe

Interactions, Proc. 8th International Symposium on Molecular Plant-Microbe Interactions. International

Society for Molecular Plant-Microbe Interactions St. Paul, pp 1996 15–20

The generation of oxygen radicals during host plant responses to infection. Sutherland, M.W. Physiol. Mol.

Plant Pathol. 39 1991 79–93

Subcellular localization of H2O2 in plants. H2O2 accumulation in papillae and hypersensitve response during

the barley-powdery mildew interaction. Thordal-Christensen, H., Zhang, Z., Wei, Y. and Collinge, D.

B. Plant J. 11 1997 1187–1194

Quantification of hydrogen peroxide in plant extracts by the chemiluminescence reaction with luminol. Warm,

E. and Laties, G.G. Phytochemistry 21 1982 827–831

Irodalom


Disease resistance conferred by expression of a gene encoding H2O2-generating glucose oxidase in transgenic

potato plants. Wu, G., Shortt, B.J., Lawrence, E.B., Levine, E.B. and Fitzsimmons, K.C. Plant Cell 7

1995 1357–1368

Copper, zinc superoxide dismutase catalyzes hydroxyl radical production from hydrogen peroxide. Yim, M.B.,

Chock, P.B. and Stadtman, E.R. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87 1990 5006–5010

Guidelines for the conduct of tests for distinctness uniformity and stability. Anonymous, Sweet pepper. UPOV

Internat. Union for the Protection of New Varieties of Plants. TG6/7. Geneve 1994 22 pp

Inheritance of resistance to potato viruses Y and A in progeny obtained from potato cultivars containing gene

Ry: evidence for a new gene for extreme resistance to PVA. Barker, H. Theor. Appl. Genet. 93 1996

710–716

Studies on the etiology of tuber necrotic ringspot disease in potato. Beczner, L., Horváth, J., Romhányi, I. and

Förster, H. Potato Res. 27 1984 339–352

Resistance to TMV in Capsicum chacoense Hunz is governed by on allele of the L-locus. Boukema, I.W.

Capsicum Newsl. 3 1984 47–48

Reaction of unknown Solanum stoloniferum Schlechtd. et Bche and Solanum demissum Lindl. accessions to the

tuber necrosis strain of potato Y Potyvirus (PVYNTN). Bősze, Z., Kazinczi, G. and Horváth, J. Acta

Phytopath. et Entomol. 31 1996 169–174

Potato Genetics Bradshaw, J.E. and MacKay, G.R. CAB InternationalWellesbourne 1994 552 pp

The Potato. (3rd ed.) Burton, W.G. Longman GroupUK 1989

A new pepper strain of tomato mosaic virus. Csilléry, G., Tóbiás, I. and Ruskó, J. Acta Phytopat. Acad. Sci.

Hung. 18 1983 195–200

Szóbeli közlés. Csilléry, G. – 1995

Genetic analysis of broad spectrum resistance to potyviruses using doubled haploid lines of pepper (Capsicum

annuum L.). Dogimont, C., Palloix, A., Daubze, A.M., Marchoux, G., Selassie, K.G. and Pochard, E.

Euphytica 88 1996 231–239

Characterization of somatic hybrids between tetraploid potato Solanum tuberosum L. cultivars and S. brevidens

Phil. Fehér, A., Preiszner, J., Horváth, J., Gáborjányi, R., Dudits, D. and Király, Z. 7th International

Congr. Plant Tissue and Cell Culture. Amsterdam, p 1990 209

Coat protein sequence of a resistance-breaking strain of potato virus X isolated in Argentina. Feigelstock, D.A.,

Tozzini, A.C. and Hopp, H.E. Virus Genes 10 1995 289–292

Breeding for resistance: conventional methods. Foxe, M.J. Neth. J. Pl. Path. 98 (Suppl. 2.) 1992 13–20

Genes for resistance to plant viruses. Fraser, R.S.S. CRV/Critical Rev. Plant Sci. 3 1986 257–294

Resistance to tobacco mosaic virus in tomato: Effects of the Tm-1 gene on virus multiplication. Fraser, R.S.S.

and Loughlin, S.A.R. J. Gen. Virol. 48 1980 87–96

Effects of temperature on the Tm-1 gene for resistance to tobacco mosaic virus in tomato. Fraser, R.S.S. and

Loughlin, S.A.R. Physiol. Plant Pathol. 20 1982 109–117

A növények vírus-ellenállóságának és fogékonyságának kórélettani kérdései. Gáborjányi, R. és Tóbiás, I.

Kertgazdaság 4 1984 61–79

Breeding for cucumber mosaic virus resistance in pepper: Phenotypic and molecular marker-assisted

approaches. Grube, R.C., Zhang, Y., Lackney, V., Prince, J., Murphy, J., Huang, B., Paran, I. and

Kyle, M. Nat. Pepper Conf., Naples, FL 1996 1996

Irodalom


Molecular mapping, tagging and inheritance of virus resistance loci in Capsicum. Grube, R.C., Zhang,Y.,

Radwanski, E.R., Paran, I., Livingstone, D.,Blauth, J. and Kyle Jahn, M.M. 10th EUCARPIA Meeding

on Genetics and Breeding of Capsicum and eggplant. Avignon, pp 1998 137–140

Current use of potato collections. Hermsen, J.G.Th. Cambridge Univ. Press In: Brown, A.H.D., Frankel, O.H.,

Marshall, D.R. and Williams, J.T. (Eds), The use of plant genetic resourcesCambridge 1989 68–75

Local lesions in tobacco mosaic. Holmes, F.O. Botan. Gaz. 87 1929 39–55

Studies on strains of potato virus Y. 1. Strain C. Horváth, J. Acta Phytopath. Acad. Sci. Hung. 1 1966a 125–138

Studies on strains of potato virus Y. 2. Normal strain. Horváth, J. Acta Phytopath. Acad. Sci. Hung. 1 1966b

333–352

Studies on strains of potato virus Y. 3. Strain causing browning of midribs in tobacco. Horváth, J. Acta

Phytopath. Acad. Sci. Hung. 2 1967a 95–108

Studies on strains of potato virus Y. 4. Anomalous strain. Horváth, J. Acta Phytopath. Acad. Sci. Hung. 2 1967b

195–210

A vírusrezisztenciára nemesítés eredményei és a dohánymozaik vírus rezisztenciára nemesítés lehetőségei

burgonyánál. Horváth, J. Növénytermelés 17: 1968 225–238

The role of resistant plants in virology and plant breeding. Horváth, J. Tag.-Ber. Akad. Landwirtsch.-Wiss.

DDR, Berlin, 216 1983 201–216

Burgonyagéncentrumok: A rezisztenciagének és víruspatogének forrásai. Horváth, J. Medicina Könyvkiadó In:

Csaba Gy.(szerk.). A biológia aktuális problémáiBudapest 1984 153–185

Compatible and incompatible relations between Capsicum species and viruses. I. Review. Horváth, J. Acta

Phytopath. et Entomol. Hung. 21 1986a 35–49

Compatible and incompatible relations between Capsicum species and viruses. II. Horváth, J. New compatible

host-virus relations (susceptible plants). Acta Phytopath. et Entomol. Hung. 21 1986b 51–58

Compatible and incompatible relations between Capsicum species and viruses. III. Horváth, J. New

incompatible host-virus relations (resistant and immune plants). Acta Phytopath. et Entomol. Hung. 21

1986c 59–62

Horváth, J. (1988) Acta Phytopath. et Entomol. Hung. 23 423–448 Potato gene centres, wild Solanum species,

viruses and aphid vectors.

Reaction of some new Bolivian tuber-bearing Solanum species to different potato pathogenic viruses. Horváth,

J. and Hoekstra, R. Acta Phytopath. et Entomol. Hung. 24 1989 351–362

Reaction of Solanum stoloniferum accessions to potato virus Y and henbane mosaic virus. Indian Horváth, J.

and Wolf, I. J. Virology 7 1991 176–178

Detection of a tymovirus from Solanum hannemannii. Horváth, J., Lesemann, D.E., Koenig, R., Weidemann, H.

L. and Hoekstra, R. Newsl. Eur. Community Potato Quarantine Stats. 1 1993a 2–3

Resistance of somatic hybrids between Solanum tuberosum and S. brevidens to potato leaf roll Luteovirus.

Horváth, J., Wolf, I., Fehér, A., Preiszner, J., Dudits, D. and Horváth, S. 12th Triennial Conf. EAPR,

Paris, France, pp 1993b 455–456

Serological investigations on the symptomless accessions of Solanum brevidens infected by the NTN strain of

potato Y Potyvirus (PVYNTN). Horváth, J., Francsics, I., Bősze, Z., Wolf, I. and Pocsai, E. 13th

Triennial Conf. EAPR, Veldhoven, The Netherlands 1996. pp 1996 166–167

The risks from exotic potato viruses. Howell, P.J. EPPO Bull. 11 1981 243–249

Conservation of potato genetic resources at CIP. Huaman, Z. Circular 14 1986 1–10

Irodalom


Molecular breeding for virus resistant potato plants. Neth. Huisman, M.J., Jongedijk, E., Posthumus-Lutke

Willink, D., Van der Wilk, F. and Cornelissen, B.J.C. J. Pl. Path. 98 (Suppl. 2) 1992 29–36

Further studies on resistance-breaking strains of potato virus X. Jones, R.A.C. Plant Pathol. 34 1985 184–189

Handbuch der Pflanzensüchtung. 2. Aufl., III. Band. Kappert, H. und Rudorf, W. Verlag Paul PareyBerlin und

Hamburg 1958

Resistenz von Kulturpflanzen gegen pflanzenpathogene Viren. Kegler, H. und Friedt, W. Gustav Fischer

VerlagJena 1993 408 pp

Types of and genes for resistance to plant pathogenic viruses. Kegler, H. and Spaar, D. Arch. Phytopath. Pflanz.

28 1993 95–107

Resistance to Viral Diseases of Vegetables. Kyle, M.M. Timber PressPortland, Oregon 1993 278 pp

Gene list of pepper. Lippert, L.F., Bergh, B.O. and Smith, P.G. J. Heredity 56 1965 30–34

Inhibitor of virus replication released from tobacco mosaic virus-infected protoplasts of a local lesion-

responding tobacco cultivar. Loebenstein, G. and Gera, A. Virology 114 1981 132–139

Two strains of tobacco mosaic virus, one of which is seed borne in an etch immune pungent pepper. McKinney,

H.H. Plant Dis. Rep. 36 1952 184–187

Advances in population breeding and its potential impact on the efficiency of breeding potatoes for developing

countries. Mendoza, H.A. Cambridge Univ. Press In: Jellis, G.J. and Richardson, D.E. (Eds), The

Production of New Potato Varieties. Technological AdvancesCambridge 1986

Results of pepper breeding in Hungary. Moór, A. and Zatykó, L. Acta Horticulturae 412 1995 88–91

The Potatoes of South America. Ochoa, C.M. Cambridge Univ. PressCambridge 1990 512 pp

Systemic infection of tomato bushy stunt virus in Gomphrena globosa induced by high temperature and long

photoperiod. Redolfi, P., Pennazio, S., Appiano, A. and Martin, C. Phytopath. Z. 90 1977 43–50

Continous high temperature can break the hypersensitivity of Capsicum chinense ’PI 152225’ to tomato spotted

wilt tospovirus (TSWV). Roggero, P., Lisa, V., Nervo, G. and Pennazio, S. Phytopath. Medit. 35 1996

117–120

Potato Breeding. Ross, H. Verlag Paul Parey Problems and PerspectivesBerlin and Hamburg 1986 132 pp

Breeding white sweet pepper hybrids armed with the tobamovirus resistance allele L4. Sági, Zs. and Salamon,

P. Xth EUCARPIA Meeting on Genetics and Breeding of Capsicum and Eggplant. Avignon, p 1998

173

Some natural relationships among strains of tobacco mosaic virus. Siegel, A. and Wildman, S.G.


Bekämpfung von Viruskrankheiten der Kulturpflanzen. Spaar, D. und Kleinhempel, H. VEB Deutscher

LandwirtschaftsverlagBerlin 1985 440 pp

Typen genetisch kontrollierter Virusrezistenz der Pflanzen. Spaar, D., Kegler, H. and Schenk, G. Zbl. Mikrobiol.

147 1992 157–171

Inheritance of resistance to viruses. Swiezynski, K.M. CAB International In: Bradshaw, J.E. and MacKay, G.R.

(Eds), Potato GeneticsWallingford 1994 338–363

Resistance in Solanum brevidens to both potato virus Y and potato virus X may be associated with slow-to-cell

spread. Valkonen, J.P.T., Pehu, E., Jones, M.G.K. and Gibson, R.W. J.Gen. Virol. 72 1991 231–236

Interactions of the Solanum spp. of the Etuberosa group and nine potato-infecting viruses and viroid. Valkonen,

J.P.T., Brigneti, G., Salazar, L.F., Pehu, E. and Gibson, R.W. Ann. Appl. Biol. 120 1992 301–313

Irodalom


Use of the virus strain group concept to characterize the resistance to PVX and PVYO in the potato cv.

Valkonen, J.P.T., Slack, S.A. and Plaisted, R.L. Allegany. Amer. Potato J. 71 1994 507–516

Comparison of resistance to potyviruses within Solanaceae: infection of potatoes with tobacco etch potyvirus

and peppers with potato A and Y potyviruses. Valkonen, J.P.T., Kyle, M.M. and Slack, S.A. Ann. Appl.

Biol. 129 1996 025–038

Characteristics of a resistance-breaking isolate of potato virus Y causing potato tuber necrotic ringspot disease.

Eur. Van den Heuvel, J.F.J.M., Van der Vlugt, R.A.A., Verbeek, M., De Haan, P.T. and Huttinga, H. J.

Plant Pathol. 100 1994 347–356

Development and Breeding of Resistance to Pepper and Tomato Viruses. Watterson, J.C. Timber Press In: Kyle,

M.M. (Ed.), Resistance to Viral Diseases of VegetablesPortland, Oregon 1993 80–101

Pepper mild mottle virus, a tobamovirus infecting pepper cultivars in Sicily. Wetter, C., Conti, M., Altschuh, D.,

Tabillon, R. and Van Regenmortel, M.H.V. Phytopathology 74 1984 405–410

Breeding for resistance. Wiersema, H.T. In: de Bokx, J.A. (Ed.), Viruses of Potatoes and Seed-Potato

Production. Puduc, Wageningen, pp 1972 174–187

New results of pepper breeding in Hungary. Zatykó, L. and Moór, A. IXth EUCARPIA Meeting on Genetics

and Breeding on Capsicum and Eggplant. Budapest, pp 1995 1–4

Tranfer of resistance to potato leaf roll virus from Solanum brevidens into Solanum tuberosum by somatic

fusion. Austin, S., Baer, M. A. and Helgeson, J. P. Plant Sci. 39 1985 75–82

A növényvédelem új feladata a géntechnológiai úton módosított szervezetekről alkotott törvény végrehajtása.

Balázs, E. Növényvédelem 33 1997 582–584

A génátültetés alkalmazása: A korszerű növényvédelem új lehetősége. Balázs, E. és Gáborjányi, R.


Ecological aspects of transgenic sugarbeet: transfer and expression of herbicide resistance in hybrids with wild

beets. Bartsch, D. and Pohl-Orf, M. Euphytica 91 1996 55–58

Competitiveness of transgenic sugarbeet resistant to beet necrotic yellow vein virus and potential impact on

wild beet populations. Bartsch, D., Schmidt, M., Pohl-Orf, M., Haag, C. and Schuphan, I. Molecular

Ecol. 5 1996a 199–205

How will transgenic sugarbeets behave in natural plant communities? Bartsch, D., Edmonds, A., Gluth, H.,

Haag, C., Morak, C., Pohl-Orf, M. and Schmidt, M. Springer-Verlag In: Schmidt, E. R. and Hankeln,

T. (Eds), Transgenic Organisms and BiosafetyBerlin and Heidelberg 1996b 319–329

Replicase-mediated resistance: a novel type of virus resistance in transgenic plants. Baulcombe, D. C. Trends

Microbiol. 2 1994 60–63

Mechanisms of pathogen-derived resistance to viruses in transgenic plants. Baulcombe, D. C. The Plant Cell 8

1996 1833–1844

Coat protein mediated resistance against virus infection. Beachy, R. N., Loesch-Fries, S. and Tumer, N. E. Ann.

Rev. Phytopathol. 28 1990 451–474

Reaction of unknown Solanum stoloniferum Schlechtd. et Bche and Solanum demissum Lindl. accessions to the

tuber necrosis strain of potato Y potyvirus (PVYNTN). Bősze, Z., Kazinczi, G. and Horváth, J. Acta

Phytopath. et Entomol. 31 1996 169–174

Viral pathogenecity determinants are suppressors of transgene silencing in Nicotiana benthamiana. Brigneti,

G., Voinnet, O., Li, W., Ji, L., Ding, S., and Baulcombe, D. The EMBO J. 17 1998 6739–6746

Immunocytolocalization of extensin in developing soybean seed coats by immunogold-silver staining and by

tissue printing on nitrocellulose paper. Cassab, G. and Varner, J. E. J. Cell Biol. 105 1987 2581–2588

Irodalom


Bio/Technology 6, 549–557. Couzzo, M., O‟Conell, K. M., Kaniewski, W., Fang, R. X., Chua, N. H. and

Tumer, N. E. (1988) Viral protection in transgenic tobacco plants expressing the cucumber mosaic

virus coat protein or its antisense RNA.

Identification of an Arabidopsis locus required for resistance to turnip crinkle virus. Dempsey, D A., Pathirana,

M. S., Wobbe, K. K. and Klessig, D. F. The Plant J. 11 1997 301–311

Deshayes, A. F. (1994) Environmental, and social impacts of GMO‟s In 5–19Jones, D. D. (Ed), The Biosafety

Results of Field Tests of Genetically Modified Plants and Microorganisms. Univ. California, Oakland,

pp What have we learned from the past few years?

Agrobacterium-mediated transformation of potato (Solanum tuberosum). Dietze, J., Blau, A. and Willmitzer, L.

Springer Verlag, Berlin In: Spangenberg, G. (Ed.), Gene Transfer to Plants 1995 24–29

Coat protein gene-mediated protection in Lactuca sativa against lettuce mosaic potyvirus strains. Dinant, S.,

Maisonneuve, B., Albony, J., Chupeau, Y, M.C., Bellec, Y., Gaudefroy, F., Kusiak, C., Souche, S.,

Robaglia, C. and Lot, H. Molecular Breeding 3 1997 75–86

Transposon tagging of tobacco mosaic virus resistance gene N: Its possible role in the TMV-N- mediated signal

transduction pathway. Dinesh-Kumar, S. P., Whitham, S., Choi, D., Hehl, R., Corr, C. and Baker, B.

Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92 1995 4175–4180

Növénybiotechnológia. Dudits, D. és Heszky L. Mezőgazdasági KiadóBudapest 1990 309 pp

Transgenes Saatgut und Biomedizin. Ewe, T. Deutschland 1 1998 28–30

Virus-engineered resistance: Concepts, efficacy, and stability. Fauquet, C. and Beachy, R. N. In: Thottappilly,

G., Monti, L. M., Mohan Raj, D. R. and Moore, A. W. (Eds), Biotechnology: Enhancing Research on

Tropical Crops in Africa. CTA/IITA Co-Publ., IITA Ibadan, pp 1992 273–286

Characterization of somatic hybrids between tetraploid potato Solanum tuberosum L. cultivars and S. brevidens

Phil. Fehér, A., Preiszner, J., Horváth, J., Gáborjányi, R., Dudits, D. and Király, Z. 7th Internat. Congr.

Plant Tissue and Cell Culture. Amsterdam, p 1990 209

Agrobacterium tumefaciens-mediated gene transfer. Filippone, E. and Penza, R. In: Thottappilly, G., Monti, L.

M., Mohan Raj, D. R. and Moore, A. W. (Eds), Biotechnology: Enhancing Research on Tropical Crops

in Africa. CTA/IITA Co-Publ., Ibadan, pp 1992 197–202

Isolation of protoplasts and genetic manipulation. Filippone, E., D‟Ambrosio, F. and Cardi, T. In: Thottappilly,

G., Monti, L. M., Mohan Raj, D. R. and Moore, A. W. (Eds), Biotechnology: Enhancing Research on

Tropical Crops in Africa. CTA/IITA Co-Publ., Ibadan, pp 1992 127–134

Plant Virology Protocols. From Virus Isolation to Transgenic Resistance. Foster, G.D. and Taylor, S.C.

Humana Press, Totowa, New Jersey 1998 571 pp

Introduction to classical crossprotection. Fraser, R.S.S. Humana Press In: Foster, G.D. and Taylor, S.C. (Eds),

Plant Virology Protocols. From Virus Isolation to Transgenic ResistanceTotowa, New Jersey 1998 13–

24

Construction of a plant disease resistance gene from the satellite RNA of tobacco ringspot virus. Gerlach, W. L.,

Lewellyn, D. and Haseloff, J. Nature 328 1987 802

Resistance to potato leaf roll virus and potato virus Y in somatic hybrids between dihaploid Solanum tuberosum

and S. brevidens. Theor. Gibson, R. W., Jones, M. G. K. and Fisch, N. Appl. Genet. 76 1988 113–117

Gibson, R. W., Pehu, E., Woods, R. D. and Jones, M. G. K. (1990) Ann. Appl. Biol. 116 151–156 Resistance to

potato virus Y and potato virus X in Solanum brevidens.

Plants transformed with a tobacco mosaic virus nonstructural gene sequence are resistant to the virus.

Golemboski, D. B., Lomonossoff, G. P. and Zaitlin, M. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87 1990 6311–

6315

Irodalom


Genetic and biochemical dissection of transgenic RNA-mediated virus resistance. Goodwin, J., Chapman, K.,

Swaney, S., Parks, T.D., Wernsman, E.A., and Dougherty, W.G. Plant Cell 8 1996 95–105

Advances and prospects in potato virology with special reference to virus resistance. Harrison, B. D. Neth. J. Pl.

Path. 98 1992 1–12

Virus resistance in transgenic plants that express cucumber mosaic virus satellite RNA. Harrison, B. D., Mayo,

M. A. and Baulcombe, D. C. Nature 328 1987 799–802

New genes for disease resistances through somatic hybridization. Helgeson, J. P. Neth. J. Pl. Path. 98 1992

223–229

Hemenway, C., Fang, R. X., Kaniewski, W. K., Chua, N. H. and Turner, N. E. (1988) EMBO J. 7 1273–1280

Analysis of the mechanism of protection in transgenic plants expressing the potato virus X coat protein

or its antisense RNA.

A kultúrflóra biodiverzitása Magyarországon. Heszky L., Bódis L. és Kiss E. Növénytermelés 48 1999 435–443

The genetic engineering of two commercial potato cultivars for resistance to potato virus X. Hoekema, A.,

Huisman, M. J., Molendijk, L., van den Elzen, P. J. M. and Cornelissen, B. J. C. Bio/Technology 7

1989 273–278

Cross protection test with four strains of potato virus Y in Nicotiana tabacum L. cv. Samsun. Horváth, J. Zbl.

Bakt. II. Abt. 123 1969 249–252

Extreme and complex resistance to infection by NTN strain of potato Y potyvirus and other viruses in genotypes

of tuber bearing Solanum stoloniferum. Horváth, J. and Wolf, I. 9th EAPR Virology Section Meeting.

Bled, pp 1995 29–30

Serological investigations on the symptomless accessions of Solanum brevidens infected by the NTN strain of

potato Y potyvirus (PVYNTN). Horváth, J., Francsics, I., Bősze, Z., Wolf, I. and Pocsai, E. 13th

Triennial Conf. EAPR., Veldhoven, pp 1996 166–167

Resistance to potato leafroll luteovirus in four accessions of Solanum brevidens Phil. Horváth, J., Király, Z.,

Föglein, F. and Balogh, J. 10th Triennial Conf. EAPR, Aalborg, pp 1987 321–322

Resistance of somatic hybrids between Solanum tuberosum and S. brevidens to potato leaf roll luteovirus.

Horváth, J., Wolf, I., Fehér, A., Preiszner, J., Dudits, D. and Horváth, S. 12th Triennial Conf. EAPR,

Paris, pp 1993 455–456

Molecular breeding for virus resistant potato plants. Huisman, M. J., Jongedijk, E., Willink, D. P., van Der

Wilk, F. and Cornelissen, B. Neth. J. Pl. Path. 98 1992 29–36

S. pmbe pacl+, whose overexpression inhibits sexual development, encodes a ribonuclease III-like RNase. Iino,

Y., Sugimoto, A. and Yamamoto, M. EMBO J. 10 1991 221–226

Die Bioregionen-Zellen des Wachtums. Janositz, P. Deutschland 1 1998 26–28

The Biosafety Results of Field Tests of Genetically Modified Plants and Microorganisms. Jones, D.D. The

Univ.Calif., Division of Agr. and Natural Resources, Oakland 1994 558 pp

Resistance to potato leaf roll virus in Solanum brevidens. Jones, R. A. C. Potato Res. 22 1979 149–152

A counterdefensive strategy of plant viruses: suppression of posttranscriptional gene silencing. Kasschau, K.D.,

and Carrington, C.J. Cell 95 1998 461–470

Sense and antisense RNA-mediated resistance to potato leafroll virus in Russet Burbank potato plants.

Kawchuk, L. M., Martin, R. R., and McPherson, J. Molecular Plant-Microbe Interact. 4 1991 254–261

A gazda-patogén kapcsolatok molekuláris hátterének tanulmányozása új távlatokat nyit a

rezisztencianemesítésben. I. Király, Z. és Hornok, L. Mikroorganizmusokból klónozott gének.

Növénytermelés 45 1996a 195–206

Irodalom


A gazda-patogén kapcsolatok molekuláris hátterének tanulmányozása új távlatokat nyit a

rezisztencianemesítésben. II. Király, Z. és Hornok, L. Rezisztenciagének, transzgénikus növények.

Növénytermelés 45 1996b 307–316

Defective interfering RNA-mediated resistance against cymbidium ringspot tombusvirus in transgenic plants.

Kollár, Á., Dalmay, T. and Burgyán, J. Virology 193 1993 313–318

Biosearch: Gentechnik-Datenbank der BBA Landsmann, J. und Shah, A. 3. Mitteilung. Nachrittenbl. Deut.

Pflanzenschutzd. 47 1995 135

Engineering potato virus Y in transgenic Russet Burbank. Lawson, C., Kaniewski, W., Haley, L., Rozman, R.,

Newell, C., Sanders, P. and Tumer, N. E. Bio/Technology 8 1990 127–134

Expression of a soybean b-conglycinin gene under the control of the cauliflower mosaic virus 35S and 19S

promoters in transformed petunia tissues. Lawson, M. A., Tierney, M. A., Nakamura, I., Anderson, E.

and Komeda, Y. Plant Mol. Biol. 9 1987 315–324

Protection against detrimental effects of potyvirus infection in transgenic tobacco plants expressing the papaya

ringspot virus coat protein gene. Ling, K., Namba, S., Gonsalves, C., Slightom, J. L. and Gonsalves, D.

Bio/Technology 9 1991 752–758

Broad-spectrum virus resistance in transgenic plant expressing pokeweed antiviral protein. Lodge, J. K.,

Kaniewski, W. K. and Tumer, N. E. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 1993 7089–7093

Expression of alfalfa mosaic virus RNA 4 in transgenic plants confers virus resistance. Loesch-Fries, L. S.,

Merlo, D., Zinnen, T., Burhop, L. and Hall, K. EMBO J. 6 1987 1845–1851

Pathogen-derived resistance to plant viruses. Lomonossoff, G. P. Ann. Rev. Phytopathol. 33 1995 323–343

Identification and characterization of a locus (RTM1) that restricts long-distance movement of tobacco etch

virus in Arabidopsis thaliana. Mahajan, S. K., Chisholm, S. T., Whitham, S. A. and Carrington, J. C.

The Plant J. 14 1998 177–186

Protoplast fusion. Marchant, R., Davey, M. R. and Power, J. B. Academic Press In: Dey, P. M. and Harborne, J.

B. (Eds), Methods in Plant Biochemistry. Vol. 10. Molecular BiologyLondon 1993 187–205

Fundamentals of Plant Virology. Matthews, R. E. F. Academic PressSan Diego 1992 403 pp

Mosaic diseases in the Canary Islands McKinney, H. H. West Africa and Gibraltar. J. Agr. Res. 39 1929 557–

558

History of coat protein-mediated protection. Miller, E.D. and Hemenway, C. Humana Press In: Foster, G.D. and

Taylor, S.C. (Eds), Plant Virology Protocols. From Virus Isolation to Transgenic ResistanceTotowa,

New Jersey 1998 25–38

The use of wild species in crop improvement. Monti, L. M. In: Thottappilly, G., Monti, L. M., Mohan Raj, D. R.

and Moore, A. W. (Eds), Biotechnology: Enhancing Research on Tropical Crops in Africa. CTA/IITA

Co-Publ., IITA Ibadan, pp 1992a 55–62

The role of biotechnology in agricultural research. Monti, L. M. In: Thottappilly, G., Monti, L. M., Mohan Raj,

D. R. and Moore, A. W. (Eds), Biotechnology: Enhancing Research on Tropical Crops in Africa.

CTA/IITA Co-Publ., IITA Ibadan, pp 1992b 1–10

Isolation and culture of tobacco mesophyll protoplast. Nagy, I. Int. Symp. and Training Course in Plant

Biotechnology. Gödöllő, pp 1992 15–29

Lesions and virus accumulation in inoculated transgenic tobacco plants expressing the coat protein gene of

tobacco mosaic virus. Nelson, R. S., Powell, P. and Beachy, R. N. Virology 158 1987 126–132

Movers and shakers: Maize transposons as tools for analyzing other plant genomes. Osborne, B. I. and Baker,

B. Curr. Opin. Cell Biol. 7 1995 406–413

Irodalom


Replicase-mediated resistance to plant virus disease. Palukaitis, P. and Zaitlin, M. Adv. Virus Res. 48 1997

349–377

Recent advances in ecological biosafety research on the risks of transgenic plants: A trans-continental

perspectives. Parker, I. M. and Bartsch, D. Birkhuser Verlag In: Tomink, J., Wöhrmann, K. and

Sentker, A. (Eds), Transgenic Organisms-Biological and Social ImplicationsBasel 1996 147–161

Genome Mapping in Plants. Paterson, A. H. R.G. Landes Company Austin, Texas, USA, 1996 1996

Studies on the genetic basis of resistance to potato leaf roll virus, potato virus Y and potato virus X in Solanum

brevidens using somatic hybrids of Solanum brevidens and Solanum tuberosum. Pehu, E., Gibson, R.

W., Jones, M. G. K. and Karp, A. Plant Sci. 69 1990 95–101

Delay of disease development in transgenic plants that express the tobacco mosaic virus coat protein gene.

Powell, P. A., Nelson, R. S., Hoffman, N. and Rogers, S. G. Science 232 1986 738–743

Protection against tobacco mosaic virus infection in transgenic plants requires accumulation of coat protein

rather than coat protein RNA sequences. Powell, P. A., Sanders, P. R., Tumer, N., Fraley, R. T. and

Beachy, R. N. Virology 175 1990 124–130

Progress in Plant Protoplast Research. Puite, K. J., Dons, J. J. M., Huizing, H. J., Kool, A. J., Koornnef, M. and

Kreus, S. A. Kluwer Acad. PublBoston 1988

Resistance to TMV in transgenic plants results from interference with an early event in infection. Register, J. C.

and Beachy, R. N. Virology 166 1988 524–532

Resistance gene evolution. Ronald, P.C. Curr. Opin. Plant Biol. 1 1998 294–298

Freilandversuche mit gentechnisch vernderten Pflanzen im Jahr 1994. Schiemann, J. und Casper, R.

Nachrichtenbl. Deut. Pflanzenschutzd. 47 1995 100–101

Transposable elements and gene-tagging. Shepherd, N.S. IRL Press In: Shaw, C.H. (Ed), Plant Molecular

Biology. A Practical ApproachOxford 1988

Protection against potyvirus infection in transgenic plants: evidence for broad spectrum resistance. Stark, D.

M. and Beachy, R. N. Bio/Technology 7 1989 1257–1262

Is durable resistance against viruses and bacteria attainable via biotechnology? Stiekema, W. J., Visser, B. and

Florack, D. E. A. Kluwer Acad. Publ In: Jacobs, Th. and Parlevliet, J. E. (Eds), Durability of Disease

ResistanceDordrecht 1993 71–81

A növénykórokozó baktériumok plazmidjai, különös tekintettel az Agrobacterium tumefaciensre. Süle, S.

Akadémiai Kiadó In: Érsek, T. és Hornok, L. (Szerk.), Kórokozók és a fertőzött növényBudapest 1985

34–46

Chromosome landing: a paradigm for map-based gene cloning in plants with large genomes. Tanksley, S. D.,

Ganal, M. V. and Martin, G. B. Trends in Genetics 11 1995 63–68

Transgenic plants expressing a functional single-chain Fv antibody are specifically protected from virus attack.

Tavladoraki, P., Benvenuto, E., Trinca, S., Martinis, D., Cattaneo, D. and Galeffi, P. Nature 366 1993

4649–472

Virusresistant Transgenic Plants: Potential Ecological Impact. Tepfer, M. and Balázs, E. Springer VerlagBerlin

1997 126 pp

Transgenic potato plants expressing mammalian 2’ - 5’ oligoadenylate synthase are protected from potato virus

X infection under field conditions. Truve, E., Aaspollu, A., Honkanen, J., Puska, R., Mehto, M., Hassi,

A., Teeri, T. H., Kelve, M., Seppnen, P. and Saarma, M. Bio/Technology 11 1993 1048–1052

Interactions of the Solanum spp. of the Etuberosa group and nine potato-infecting viruses and a viroid.

Valkonen, J. P. T., Brigneti, G., Salazar, L. F., Pehu, E. and Gibson, R. W. Ann. Appl. Biol. 120 1992

301–313

Irodalom


Resistance to viruses in F1 hybrids produced by direct crossing between diploid Solanum series Tuberosa and

diploid S. brevidens (series Etuberosa) using S. phureja for rescue pollination. Valkonen, J. P. T.,

Orillo, M., Slack, S. A., Plaisted, R. L. and Watanabe, K. N. Plant Breeding 114 1995 421–426

Resistance in Solanum brevidens to both potato virus Y and potato virus X may be associated with slow cell-to-

cell spread. Valkonen, J. P. T., Pehu, E., Jones, M. G. K. and Gibson, R. W. J. Gen. Virology 72 1991

231–236

Expression of the potato leafroll luteovirus coat protein gene in transgenic potato plants inhibits viral infection.

van der Wilk, F., Willink, D., Huisman, M. J., Huttinga, H. and Goldbach, R. Plant Molecular Biol. 17

1991 431–439

Transgenic tobacco expressing tobacco streak virus or mutated alfalfa mosaic virus coat protein does not cross-

protect against alfalfa mosaic virus infection. van Dun, C. M., Overduin, B., van Vloten-Doting, L. and

Bol, J. F. Virology 164 1988 383–389

Systemic signalling in gene silencing. Voinnet, O., and Baulcombe, D.C. Nature 389 1997 553–555

Application of PCR to transgenic plants. Wassenegger, M. Humana Press In: Meltzer, S.J. (Ed), PCR in

BioanalysisTotowa, New Jersey 1998 153–164

Resistance against multiple part viruses in plants mediated by a double stranded-RNA specific ribonuclease.

Watanabe, Y., Ogawa, T., Takahashi, H., Ishida, I., Takeuchi, Y., Yamamoto, M. and Okada, Y. FEBS

Letters 372 1995 165–168

Strategies in unconventional breeding for disease resistance. Wenzel, G. Ann. Rev. Phytopathol. 23 1985 149–

172

Strategies to protect crop plants against viruses: pathogen derived resistance blossoms. Wilson, A.M.T. Proc

Natl. Acad. Sci. USA 90 1993 3134–3141

Local and systemic movement of tobacco mosaic virus (TMV) in tobacco plants that express the TMV coat

protein gene. Wisniewski, L. A., Powell, P. A., Nelson, R. S. and Beachy, R. N. Plant Cell 2 1990 559–

567

Karantén és veszélyes növényi károsítók diagnosztikai kézikönyve. I. kötet. Kalmár K., Szőnyegi S. és Németh

M. Budapest Fővárosi Növény-egészségügyi és Talajvédelmi Állomás, Budapest 1994 1–180

Az Európai Gazdasági Közösség Tanácsának Növény-egészségügyi határozatai. Szemessy, Á. és Szőnyegi S.

Budapest Fővárosi Növény-egészségügyi és Talajvédelmi Állomás, Budapest 1993 96

Karantén és veszélyes növényi károsítók diagnosztikai kézikönyve. I. kötet. Kalmár K., Szőnyegi S. és Németh

M. Budapest Fővárosi Növény-egészségügyi és Talajvédelmi Állomás, Budapest 1994 1–180

Az Európai Gazdasági Közösség Tanácsának Növény-egészségügyi határozatai. Szemessy, Á. és Szőnyegi S.

Budapest Fővárosi Növény-egészségügyi és Talajvédelmi Állomás, Budapest 1993 96

Latent mosaic, an emerging disease of peach. Barba, M. and Faccioli, F. Inf. Agr. 54 1998 71–72

Quarantine Pests for Europe. Smith, I.M., McNamara, D.G., Scott, P.R. and Holderness, M. CAB

InternatWallingford 1997 1997 1425 pp

A vírusok osztályozása - tankonyvtar.hu · Created by XMLmind XSL-FO Converter. Növényvírusok és virológiai vizsgálati módszerek dr. Horváth, József Ez a könyv a Földművelésügyi

Documents