A resposta da checagem de danos no DNA telomérico em células senescentes Juliana Roriz Aarestrup.

A resposta da checagem de danos no

DNA telomérico em células senescentes

Juliana Roriz Aarestrup

INTRODUÇÃO

• HDFs Senescência em fibroblastos humanos diplóides primários

• O que é senescência?

• Checagem de danos no DNA

MATERIAL E MÉTODOS

• Cultura celular:Cultura celular: MCR5 e BJ em DMEM + soro bovino

fetal = senescência (após 3 semanas)

MCR5 e BJ irradiadas, fixadas, incubadas com anticorpos secundários

• Imunoblotting:Imunoblotting: Extração Tampão TEB150 + lisina ou

gel de poliacrilamida

• DNA microarray:DNA microarray: Clones DNA total Intervalos de 1Mb. Ps:

para cromossomo 22 = 447 clones Isolamento e amplificação dos

fragmentos DOP-PCR

• Marcação do DNA, hibridização e análise:Marcação do DNA, hibridização e análise: Escaneamento marcação (fluorescência)

hibridização (Dye-label-reverse)• Anticorpos:Anticorpos: Anti-Anti- -H2AX, CHK1, pS/TQ, CHK1, CHK1pS345,

CHK2, CHK2pT68, p53pS15, NBS1, SMC1pS966, SMC1, PML, RAD17, H2A, p21, TRF1, TRF2, Flag, MDC1, RAD1, RAD17pS645, MCM7, 53BP1

• Plasmídios:Plasmídios: pCHK2-KD Gerado por PCR de ORF

de CHK2 pH2B-YPF Histona H2B pATM-KD pATR-KD pCHK1-KD

• Microinjeção:Microinjeção: Células placas com poli-L-lisina incubação

em meio Nut Mix F-12 + soro de bovino recém-nascido

Plasmídio + pH2b-YFP Microinjeção em células senecentes

• SiRNA:SiRNA: Síntese e transferência por oligofectamine

RESULTADOS E

DISCUSSÃO

Figura 1 - Resposta a danos no DNA Figura 1 - Resposta a danos no DNA em células senescentes em células senescentes

Foci -H2AX e 53BP1

Quantificação de -H2AX e 53BP1

H2AX foi corada com anticorpos monoclonais de camundongo ou anticorpos policlonais de coelho.

Histogramas: % de céls. Com, no mínimo um focus detectável em recente proliferação celular, células quiescentes, senescentes e telomerizadas

e-i: Fibroblastos senescentes com Foci 53BP1, pS/TQ, MDC1, NBS1, SMCpS966, co-localizados com foci -H2AX

j-n: Extratos completos de céls. Irradiadas, não- irradiadas, quiescentes, senescentes e telomerizadas

Figura 2- Associação direta de Figura 2- Associação direta de terminações cromossômicas a terminações cromossômicas a -H2AX

Array de clonse de DNA p/ cromososmo 22q

Eixo Y:Diferença entre os raios de imunoprecipitação versus DNA input de céls. Senescentes e quiescentes.

Eixo X: Distância em Mb

Em vermelho: Clones de regiões enriquecidas em imunoprecipitados

Em preto: Clones que retratam o raio de diferença inferior a 99%

Figura 3- Resposta a danos no DNA Figura 3- Resposta a danos no DNA teloméricoteloméricoFibroblastos humanos imortalizados (T19) foram Fibroblastos humanos imortalizados (T19) foram induzidos a expressar TRF2induzidos a expressar TRF2BBM por até 8 diasM por até 8 dias

a- Expressão induzida de Flag- TRF2TRF2BBMM

b- Acúmulo progressivo de -H2AX

c- Fosforilação progressiva de SMC1 em S966

d- Fosforilação progressiva de RAD17 em S645

e- Fosforilação CHK1 em S345

f- Fosforilação CHK2 em T68

Asterisco: Banda específica

Análise por Ch1ps

Indução de TRF2BBM por associação M por associação de antígenos a DNA teloméricode antígenos a DNA telomérico

Figura 4- Checagem da inativação Figura 4- Checagem da inativação em células senescentes em células senescentes

Indução da progressão da fase S

Eixo Y: % de células Bj senescentes BrdU-positivas, microinjetadas com plasmídios expressando alelos dominante-negativos de quinases de checagem de danos no DNA ou vetores completos.

CONCLUSÃO• Céls. Somáticas: Número limitado de duplicações

in vitro;

• Senescência: Telômero funções anormais. A resposta a danos no DNA em céls. senescentes deve ocorrer em virtude de uma disfunção telomérica ou por geração de cromossomos dicêntricos;

• Marcadores moleculares ativos próximos a quebras de DNA: H2AX, 53BP1, MDC1, NBS1, CHK1, CHK2;

• Telômero Contribuição direta na resposta a danos de DNA em células senescentes;

• Inativação de quinases = indução do sistema checkpoint em céls. senescentes = Progresso da fase S;

“Este modelo explica porque a radiação ionizante e outros agentes levam a uma permanente estagnação do ciclo celular em HDFs. Assim, pode ser de relevância para mecanismos tumorais.”