1 A membránpotenciál Elektromos potenciál különbség a membrán két oldala közt, E m Réz Cink Galvani (1791) ideg izom mérőelektróda Erősítő (feszültségmérő műszer) Referencia Elektróda Ringer oldat Regisztrátum vagy elvezetés idő feszültség Nyugalmi potenciál A membránpotenciál mérése Mérési elv: feszültségmérő áramkör Erősítő (feszültségmérő műszer) elemei: Erősítő Analóg- digitális jelátalakító számítógép adattárolás Adat analízis megjelenítés Jel Mérőelektróda sejtbe hatolása idő
23
Embed
A membránpotenciál - tamaslab.orgtamaslab.org/osszehasonlitoelettan2_eloadas.pdf · 1 A membránpotenciál Elektromos potenciál különbség a membrán két oldala közt, E m Réz
This document is posted to help you gain knowledge. Please leave a comment to let me know what you think about it! Share it to your friends and learn new things together.
Transcript
1
A membránpotenciál
� Elektromos potenciál különbség a membrán két oldala közt, Em
Réz
Cink
Galvani (1791)
ideg
izom
mérőelektróda
Erősítő (feszültségmérő műszer)
ReferenciaElektróda
Ringeroldat
Regisztrátumvagy elvezetés
idő
fesz
ülts
ég
Nyugalmipotenciál
A membránpotenciál mérése� Mérési elv: feszültségmérő áramkör
Erősítő (feszültségmérő műszer) elemei:
Erősítő
Analóg-digitális
jelátalakító
számítógépadattárolás
Adatanalízis
megjelenítés
Jel
Mérőelektródasejtbe hatolása
idő
2
A membránpotenciál mérése� Példa egy műszerrendszerre
A membránpotenciál mérése� Az első sikeres kísérlet: tintahal óriásaxon
0,5 mm
Hodgkin and Huxley (1939)
Young (1936): Loligo óriásaxon
csillagdúc
csillagidegóriásaxonokkal
Erősítő (feszültségmérő műszer)
ReferenciaElektróda
mérőelektróda
óriásaxon
3
Ionokra ható erők: kémiai grádienselektromos mezőelektrokémiai grádiens
Egyensúlyi potenciál Donnan (1911)fluxus = 0elektromos potenciál különbség ellentételezi a kémiai grádienstionkoncentrációk aránya a membrán két oldalán meghatározott
ElektroneutralitásStatisztikailag páros K+ és Cl- vándorlásKCl diffúziós ráta mindkét irányban egyenlő
Onkotikus nyomás:víztöbblet I-ben
Donnan egyensúly
A nyugalmi potenciál� Sejtmembrán szelektív ionpermeabilitása: kálium
2.5–50.0001Ca2+
110-1254-9Cl-145-1505–15Na+
4-5140K+
Emlős sejtek
100.0001Ca2+
56040–150Cl-44050Na+
20400K+
Óriásaxon
ExtracellulárisIntracelluláris
Ionkoncentrációk (m M)
4
A Nernst-egyenlet� A nyugalomban lévő membrán leírására alkalmas
18 oC: 0,05838 oC: 0,061
Káliumra számítva az óriásaxonban: EK= -75,5 mV
Nernst-egyenlet:
Nátriumra számítva az óriásaxonban: ENa= +55,9 mV
Goldman-Hodgkin-Katz egyenlet� A nyugalmi potenciál több ion egyensúlyi potenciálja
A gliasejteknél elegendő a Nernst egyenlet:
A neuronoknál viszont nem elegendő:
Külső kálium koncentráció (mM)
Mem
nrán
pote
nciá
l (m
V)
Mért értékek
Nernst egyenlettelszámított függvény
5
Goldman-Hodgkin-Katz egyenlet� Az aktuális pillanatnyi membránpotenciál kiszámítására
Külső kálium koncentráció (mM)
Mem
nrán
pote
nciá
l (m
V)
Mért értékek
Nernst egyenlettelszámított függvény
GHK egyenlettelszámított függvény
Membránpotenciál és Na-K pumpa� Na-K pumpa nélkül nincs mebránpotenciál
1. Szivárgáskompenzáció
2. Pumpapotenciál: belső negativitás fokozása
6
A membrán passzív elektromos jellemz ői
� A sejtmembrán lipid kettősréteg természetének funkcionális következményei
� Mérési elv: áraminjektáló és feszültségmérő áramkör
A membrán passzív elektromos jellemz ői
Rellenállás > Regyéb komponensek - stimuláló áram állandóRerősítő (feszültségmérő műszer) nagy - nincs jelentős áramfolyás a mérőelektródon át
Ringer oldat
Referenciaelektróda
Erősítő (feszültségmérő műszer)
Mérő-elektródaÁraminjektáló elektróda
ellenállás
Áram-generátorÁram-
mérő
Fürdő-elektróda
Áraminjektáló áramkör Feszültségmérő áramkör
7
A membrán passzív elektromos jellemz ői� Az áraminjektáló és feszültségmérő áramkör
kísérleti alkalmazása Az áraminjektáló áramkörrel negatíváramlépcsőt injektálunk a neuronba:
Eközben a feszültségmérő áramkörrel mérjük a neuron membránpotenciálját:
Az áraminjektáló áramkörrel pozitíváramlépcsőt injektálunk a neuronba:
Eközben a feszültségmérő áramkörrel mérjük a neuron membránpotenciálját:
X tengely: idő (ms)
A membrán passzív elektromos jellemz ői� Membrán kapacitancia
Membrán kondenzátor
Dielektromos állandó (~3 uF/cm2)
A sejtmembrán egyszerű elektromos modellje
Extracelluláris oldat
Konduktancia(ellenállás):ioncsatorna
Kapacitancia(kondenzátor):Lipid kettősréteg
Citoszol
Rezisztív áramKapacitív áram
Töltéseloszlás a membrán mentén
8
A membrán passzív elektromos jellemz ői� Elektrotónusos potenciál és membrán időállandó
A membrán passzív elektromos jellemz ői� Membrán ellenállás
Ohm törvénye:
Bemenő ellenállás a sejt teljes ellenállása a membránon átfolyó áramra vonatkoztatvaarányos a sejtfelülettel
Membrán konduktancia
Specifikus ellenállás
Bemenő konduktancia X ionra; emf = Vm
9
A membrán passzív elektromos jellemz ői� Membrán térállandó
λ, térállandóx, távolság
Rm, specifikus ellenállásRi, belső ellenállásRo, külső ellenállásRl, hosszanti (axiális) ellenállás
Áraminjekció
Mérő-elektródák
NyugalmipotenciálM
embr
ánpo
tenc
iál
Térállandó ( λ)
Távolság
Membrán modell
belülkívül
Áram-forrás
Mérési eredmény
1
2
3
Az akciós potenciál
10
A sejtmembrán magvezető modellje (Hodgkin)
A passzív és aktív membránt is modellező elektromos áramkör
V
I
bemenőrektifikáció
kimenőrektifikáció
lineárisbemenő I-V
lineáriskimenő I-V
anomális kimenőrektifikáció
anomális bemenőrektifikáció
Passzív membrán: lineáris I-V függvény (Ohmikus) Aktív mebrán:1. Rektifikáció: eltérés a lineáris áram-feszültség függvénytől 2. a membránon ellentétes irányban átfolyó áramok nem
egyenlőek3. aktív membránjellemző, feszültségfüggő ioncsatornák
működnek
bemenő rektifikáció
lineáris bemenő áram-feszültség (I-V) viszony
anomális bemenő rektifikáció
1
2
Inge
rlő á
ram
(nA
)
1
2
2
1
3
4
3
4
kimenő rektifikáció
anomális kimenő rektifikáció
Passzív és aktív membrán: áram-feszültség (I-V) függvény
11
Aktív membrán: akciós potenciál
Hiperpolarizáció: 1,2Depolarizáció: 3, 4Küszöb potenciálKüszöb alatti válasz (lehet passzív és aktív)Küszöb feletti válasz (mindig aktív)
Az áraminjektáló áramkörrel áramlépcső sorozatot (1-4) injektálunk a neuronba:
Eközben a feszültségmérő áramkörrel mérjük a neuron membránpotenciálját:
Az akciós potenciál lefutása sejttípusra jellemz ő
vázizom szívizom
Az akciós potenciál ionikus mechanizmusai� Nátrium mozgás felelős az akciós potenciál kialakulásáért
3. A túllövés amplitúdója a külső Na koncentráció függvénye Hodgkin and Katz (1949)Extracelluláris tengervíz NaCl tartalmának fokozatos (1-5) cseréje kolin-
kloridra, majd NaCl visszamosása a kolin-klorid helyett (6):
2. Túllövés alatt ENa közelében a Vm
1. Na influx depolarizálja a membránt (Hodgkin and Huxley, 1939)
Mem
brán
pote
nciá
l (m
V)
Idő (ms)
14
Az akciós potenciál ionikus mechanizmusai� Voltage-clamp (feszültségzár) módszer
Cole (1949)Hodgkin and Huxley (1952)- Parancs membránpotenciállal Vm beállítható és tartható,
I = V/R; I = V * gA membránon átmenő áram konduktanciaváltozást jelent
- Parancs membránpotenciált és mért membránpotenciált összehasonlító áramkör, az eltérést feedback áraminjekció kompenzálja
- az áramvisszacsatolás "zárja" a feszültséget- a visszacsatolt áramot mérjük- Előnyei
1. A membránon átfolyó áramot direkt mérjük2. Az ionáramok feszültség és időfüggők; Vm itt állandó, ezzel elválasztjuk a két változót, az ioncsatorna áramok feszültségfüggésedirekt úton mérhető:
Kontroll er ősítő
Feszültségmér ő
erősítő
Feszültségmér ő
elektróda
Membránon átfolyó áram
Áram elektródák
Kontrolláram
Parancs V m Mért Vm
Óriásaxon
Hiperpolarizáció Depolarizáció
Par
ancs
Vm
(mV
)M
embr
ánon
átfo
lyó
áram
(nA
)
Az akciós potenciál ionikus mechanizmusai� Az akciós potenciál
voltage-clamp analíziseParancs V m
-59 mV
+20 mV
Membránon átfolyóösszes áram
Membránon átfolyónátrium áram
Membránon átfolyókálium áram
Akciós potenciálmembránpotenciál
görbéje
Nátrium konduktancia
Kálium konduktancia
-59 mV
15
Ionáramok és ioncsatornák
Ionáramok mérése: patch clampNeher and Sakmann (1976), Nobel-díj 1992
Sejtbe injektált áram
Egycsatorna-áramok
Egycsatorna-áramok összege
16
Patch clamp mérési konfigurációkNeher and Sakmann (1976), Nobel-díj 1992
Patch clamp mérési konfigurációk� Példa egy whole cell patch clamp kísérletre
17
A gyors nátrium csatorna működése
1. Feszültségfüggő csatorna: depolarizáció (-75 � -25 mV) konformációváltozást okoz2. Óriási feszültségváltozás a csatornafehérjére vonatkoztatava: 100000 V/cm3. Kapu áram (gating current) töltéssel rendelkező csoportok elmozdulhatnak4. Zárt, nyitott és inaktivált működési állapota lehetséges.Refrakter periódus: Na inaktiváció és K konduktancia együttes hatásaIntracelluláris Na koncentráció alig változik (0,001-1 % /AP, ∆Vmembrán: 0,3 mV) 10-12 M Na+; 100 mV; 160-500 Na+/ µm2/AP;Extracelluláris K koncentráció: rendkívül limitált tér (~30-40 nm a sejtek között) gliális K felvétel
Aktivációskapu
InaktiválódoménParancs V m
Mért áram
A gyors nátrium csatorna szerkezete
tetrodotoxin
Helyi érzéstelenít ők: Lidocain
Alfa és béta skorpiótoxin
S4: pórusformáló alfa hélix
Inkativálóhurok
Alfa alegység:
Alegységekelrendeződése:
Blokkolószerek:
18
A feszültségfüggő K+-csatorna szerkezete
Eukariota kálium csatorna alfa alegység monomerek
bakteriális kálium csatorna monomerek
Eukariotaalegységekelrendeződése:
Blokkolószerek:tetraetilammónium4-aminopiridin
A feszültségfüggő K+-csatorna működése
Rod Mackinnon (Nobel-díj 2003)
Zárt állapotNyitott állapot
A béta alegységek érzékelik a feszültséget éscsavarják az alfa alegységeket
19
A feszültségfüggő K+-csatorna működése
1. Az intracelluláris oldalon aK+ elveszti hidrátburkát
2. Alfa alegység oxigénatomjaiátveszik a hidrátburok szerepét
3. K+ mozgás a 4 lehetségesoxigénzseb között
4. K+ rehidrálódik az extracelluláris oldalon
Két S4 alegység modellje
Ionszelektivitás:a nátrium túl kicsi az alfa alegység oxigénjei között
Az akciós potenciál terjedése
20
A Na-csatornák s űrűsége az idegsejtekenA Na-csatornák az axon iniciális szegmentumon sűrűsödnek,itt a legkisebb a küszöbpotenciál, ezért indul innen az akciós potenciál
Antigén (pl. Na-csatorna)
Nemspecifikus protein
Elsődleges antitest
Másodlagos antitest-enzim komplex
Az enzim szubsztrátja
Mikroszkópban láthatószínes reakciótermék
Immuncitokémia kísérleti elve: A kísérlet eredménye:
A Na-csatornák s űrűsége az idegsejtekenA Na-csatornák a Ranvier-féle befűződéseken is sűrűsödnek
Oligodendrocyta / Schwann-sejt
Myelin hüvely
Axon membránja
Ranvier-féle befűződés
21
Az akciós potenciál pontról pontra terjedése
Az akciós potenciál terjedési tulajdonságai:1. változatlan amplitúdóval és2. egy irányban terjed
Terjedési irány:1. ortodromikus2. antidromikus
Idő (ms)
Helyi Na-csatorna aktiváció
Szomszédos membránfolt depolarizációja
Szomszédos membránfolteléri a küszöbpotenciált
A repolarizált membránfoltabszolút refrakter stádiumba kerül
relatív refrakter periódusbanlévő membránfolt
Terjedési irány
Az akciós potenciál pontról pontra terjedéseAz akciós potenciál visszaterjed a szómába és a dendritekbeSzimultán háromelektródás whole cell patchclamp elvezetés egyetlen piramissejten:
1
2
3
1
2
3
A visszaterjedés sejttípustól függ
piramissejt
Purkinje sejt
22
Az akciós potenciál pontról pontra terjedéseAz akciós potenciál visszaterjed a szómába és a dendritekbe