Doktori (Ph.D.) értekezés A búza (Triticum aestivum L.) táplálkozástani értékének javítása géntechnológiai módszerrel Készítette Tamásné Nyitrai Erzsébet Cecília Eötvös Loránd Tudományegyetem, Természettudományi Kar Biológia Doktori Iskola Dr.Erdei Anna Kísérletes növénybiológia PhD program Dr. Szigeti Zoltán Témavezetı Dr. Bedı Zoltán, akadémikus igazgató MTA Mezıgazdasági Kutatóintézete, Martonvásár MTA Mezıgazdasági Kutatóintézete, Martonvásár 2009
128
Embed
A búza ( Triticum aestivum L.) táplálkozástani értékének ...teo.elte.hu/minosites/ertekezes2009/tamasne_ny_e_c.pdf · 2.1 A búza jellemzése 2.1.1 A búza eredete és fontossága
This document is posted to help you gain knowledge. Please leave a comment to let me know what you think about it! Share it to your friends and learn new things together.
Transcript
Doktori (Ph.D.) értekezés
A búza (Triticum aestivum L.) táplálkozástani értékének javítása géntechnológiai módszerrel
Készítette Tamásné Nyitrai Erzsébet Cecília
Eötvös Loránd Tudományegyetem, Természettudományi Kar Biológia Doktori Iskola
Dr.Erdei Anna
Kísérletes növénybiológia PhD program Dr. Szigeti Zoltán
Témavezetı Dr. Bedı Zoltán, akadémikus
igazgató MTA Mezıgazdasági Kutatóintézete, Martonvásár
MTA Mezıgazdasági Kutatóintézete, Martonvásár 2009
TARTALOMJEGYZÉK 1. BEVEZETÉS........................................................................................................................1 2. IRODALMI ÁTTEKINTÉS ...............................................................................................2 2.1 A búza jellemzése ................................................................................................................2
2.1.1 A búza eredete és fontossága ......................................................................................2 2.1.2 Mag- és szemtermések fehérjéi, különös tekintettel a búza tartalékfehérjéire ...........2 2.1.3 A búza tartalékfehérje összetétel és a minıség kapcsolata.........................................9 2.1.4. Tészta- és lisztminısítésre alkalmas módszerek......................................................14
2.2 Az amarantusz jellemzése..................................................................................................15 2.2.1 Az amarantusz tartalékfehérjék csoportosítása és frakcionálásuk ............................15 2.2.2 Az amarantusz tartalékfehérjék aminosav összetétele..............................................20 2.2.3 Az AmA1 jelő fehérje jellemzése.............................................................................21
2.4 A búza genetikai módosítása .............................................................................................31 2.4.1 A növényregeneráció és az azt befolyásoló tényezık hatása a transzformációra.....32 2.4.2 A búza transzformációja ...........................................................................................35
3. CÉLKIT ŐZÉSEK ..............................................................................................................42 4 ANYAGOK ÉS MÓDSZEREK .........................................................................................43 4.1 Növényregenerációs kísérletek ..........................................................................................43
4.1.1 Növényi anyagok ......................................................................................................43 4.1.2 Éretlen embriók szövettenyésztése ...........................................................................43 4.1.3 Statisztikai elemzés...................................................................................................44
4.2 Búza-transzformációs kísérletek........................................................................................44 4.2.1 Növényi anyagok ......................................................................................................44 4.2.2 Növényi szövet elıkészítése bombázáshoz ..............................................................44 4.2.3 Transzgénikus növények elıállítása .........................................................................45
4.3 A transzgénikus jelölt növények nukleinsav szintő vizsgálatai.........................................47 4.3.1 Genomi DNS izolálása..............................................................................................47 4.3.2 PCR-reakció..............................................................................................................47 4.3.3 Southern-blot analízis ...............................................................................................48 4.3.4 RT-PCR reakció........................................................................................................49
4.4 A transzgénikus növények fehérje szintő vizsgálatai ........................................................50 4.4.1 A marker/riporter gének aktivitásának tesztelése .....................................................50 4.4.2 A transzgén (ama1) expresszió igazolása Western-blot analízissel .........................51 4.4.3 A szemtermés fizikai vizsgálatai ..............................................................................52 4.4.4 Liszt vizsgálatok .......................................................................................................52 4.4.5 A búzalisztbıl készült tészták dagasztási tulajdonságainak vizsgálata ....................54
5 EREDMÉNYEK ÉS ÉRTÉKELÉSÜK ............................................................................56 5.1 Növényregenerációs rendszer kidolgozása ıszi búza genotípusokhoz..............................56
5.1.1 A hajtásregeneráló táptalaj összetétel hatása a növényregenerációra.......................57 5.1.2 Az inkubációs hımérséklet csökkentésének hatása a növényregenerációra ............59 5.1.3 A fényintenzitás változtatásának hatása a növényregenerációra ..............................62 5.1.4 A hajtásregenerációban alkalmazott hımérséklet, fényintenzitás és táptalaj
összetétel együttes hatása a növényregenerációra ....................................................64 5.2 A növényregeneráció körülményeinek optimalizálása transzformációhoz .......................66 5.3 Búza-transzformációs kísérletek........................................................................................69
5.3.1 Transzgénikus búzanövények elıállítása és tesztelése .............................................69
5.3.2 Az AmA1 fehérje expresszió bizonyítása.................................................................75 5.3.3 Transzgénikus búza lisztminták elıállítása, fehérje- és aminosav összetétele .........77 5.3.4 A transzgénikus búza lisztminták HPLC analzíse ....................................................85 5.3.5 A transzgénikus búzavonalak lisztjének funkcionális vizsgálatai ............................88
kromatográfia és ultracentrifugás módszerek segítségével megállapították, hogy a kinyert
amarantin nagy tisztaságú. A globulin frakció a teljes fehérje 20,5%-át, míg az izolált
amarantin a 18,6%-át adta, így a globulinokat fıként az amarantin alkotja. Munkáikban
egyértelmő bizonyítást nyert az is, hogy az amarantin 389 kDa molekulatömegő és az erısen
konzervatív 11S-típusú globulin fehérjék szupercsaládjába tartozik, mely fehérjék
asszociációra és disszociációra hajlamos, cisztein aminosavakat tartalmazó alegységek
aggregátumai. Az aggregátumok létezését Segura-Nieto és mtsai. (1999) is megerısítették.
Chen és Paredes-López (1997) az A. hypochondriacus másik fajtájából (waxy fajta) két
különbözı ionerısségő extraháló szerrel az amarantin két heterogén formáját izolálták
(330 kDa és 400 kDa). SDS-PAGE analízissel kimutatták, hogy redukció elıtt a legfıbb sáv
az 50-52 kDa volt, míg redukció után két új sáv jelent meg (32-34 kDa és 22-24 kDa). Ez
tipikus jellemzıje a 11S globulinoknak, melyek egyetlen prekurzor molekulaként
szintetizálódnak, majd késıbb proteázok hasítják a 27-37 kDa savas alegységgé és a 20-24
kDa bázikus polipeptiddé, melyeket diszulfid híd (hidak) köt(nek) össze. A redukált
frakcióban is megjelenı 50-52 kDa molekulatömegő amarantin egy poszttranszlációs érési
folyamat alól ’megmenekült’ fehérje lehet (Barba de la Rosa és mtsai., 1996).
Egy 59,4 kDa rekombináns amarantin fehérjét Osuna-Castro és mtsai. (2000) E. coli
heterológ fehérjeszintetizáló rendszerben expresszáltattak. A munkájukhoz használt cDNS-t
Barba de la Rosa és mtsai. (1996) klónozták és jellemezték. A nagy mennyiségben
termeltetett fehérjét kromatográfiás módszerekkel tisztították, majd megállapították, hogy
elektromos-, felületi-, immunológiai-, biológiai- és funkcionális tulajdonságai hasonlóak a
natív fehérje tulajdonságaihoz. In vitro refolding vizsgálatokban igazolták a molekula helyes
19
konformációját is. További kísérletek szükségesek azonban ahhoz, hogy szisztematikusan
megváltoztatott szerkezető fehérjéket helyes másodlagos és harmadlagos szerkezettel képesek
legyenek heterológ rendszerben nagy mennyiségben elıállítani. Az így szerzett tudás
közelebb vihet a jó táplálkozástani értékő fehérjék transzgénikus növényekben való korrekt
termeltetéséhez. Az amarantin fehérje génjét rizs glutelin-1 promótere segítségével sikeresen
expresszáltatták transzgénikus kukoricában, ami fehérjetartalom növekedést (6-32%),
valamint esszenciális aminosav tartalom (lizin 18% és triptofán 22%) növekedést
eredményezett (Rascón-Cruz és mtsai., 2004) (lásd még 2.3.2.1/lizin fejezet).
Martínez és mtsai. (1997) az A. hypochondriacus kereskedelmi forgalomban lévı fajtájából
vízzel az albumin 1 frakciót, a maradékból foszfát-pufferrel pedig a globulin frakciót
extrahálták Konishi és mtsai. (1991) szerint. Az ırlemény maradékát tovább extrahálva
vízzel, majd abból a savas kicsapással nyert csapadékot vízben feloldva kapták az albumin 2
frakciót, míg híg vizes β-merkapto-etanolban oldva az albumin 2M frakciót. A frakciókat
elemezve megállapították, hogy az albumin 2 frakció egy erısen polimerizálódott polipeptid
komplex. Molekulatömege 300±10 kDa és diszulfid hidak stabilizálják. Fıként 52, 54 és 56
kDa alegységekbıl áll. Az 52 és 56 kDa alegységek két részre bonthatók (31-38 és 19-23
kDa), melyeket diszulfid hidak kötnek össze. Az 54 kDa alegység diszulfid hidakkal
összekapcsolt aggregátumot alkot a két kisebb résszel (31-38 és 19-23 kDa). A jellemzés
szerint úgy tőnik, hogy az albumin 2 szerkezetét tekintve olyan, mint a 11S globulinok vagy
más néven amarantin fehérje, csak tartalmaz egy extra 54 kDa polipeptidet, s hajlamosabb a
polimerizációra. Mivel ezt a polipeptidet csak a nagy molekulatömegő aggregátumban találták
meg, valószínősíthetı, hogy polimerizáció indukáló szerepe van az aggregátum képzésben. Ez
megerısíti Vasco-Méndez és Paredes-López (1995) eredményeit, miszerint nagyfokú
homológia van az amarantusz globulin és glutelin fehérjéi között és az amarantusz
tartalékfehérjék fıként globulin típusúak. A fehérjék a magon belül különbözı
aggregátumokban, különbözı konformációban vannak jelen, mely magyarázatot ad eltérı
oldhatóságukra és eltérı extrahálhatóságukra. Ezek alapján a szerzık a globulin fehérjéket
három csoportra osztották. Az elsı csoportba a 7S és a 11S globulinokat sorolják, míg további
két globulin csoportot alkotnak az erısen polimerizálódott globulin fehérjék (albumin 2) és az
amarant glutelin fehérjék. Mindez jó korrelációban van Fukuyima (1991) tartalékfehérje
csoportosítási módszerével, mely a fehérjéket kódoló gének szerkezetének hasonlóságán
alapul. További szekvencia elemzések és genetikai eredetvizsgálatok szükségesek azonban,
hogy egyértelmően jóváhagyható legyen az amarantusz tartalékfehérjék ilyen besorolása.
20
Az amarant tartalékfehérjéi asszociációra és disszociációra hajlamos, cisztein aminosavakat
tartalmazó alegységek aggregátumai, amiket nem csupán kémiai kötés (diszulfid hidak),
hanem gyenge, másodlagos kötıerık tartanak össze. Ezt az asszociációs/disszociációs
képességet különbözı savas és bázikus pH értékeken turbiditást mérı módszerekkel
vizsgálták (Segura-Nieto és mtsai., 1999). A pH változásának hatására megváltozott az egyes
fehérje alegységek felületi töltéseloszlása, izoelektromos pontja és hidrofóbicitása. Ez sokszor
az oligomerek disszociációját eredményezte monomerekre, azaz változás következett be a
harmadlagos szerkezetben is. Ennek következtében elképzelhetı, hogy a molekulák illetve
molekula aggregátumok/asszociátumok alakja nem mindig gömb, s ez meghamisítja a
gélfiltrációs molekulatömeg meghatározás eredményét. Valószínőleg ennek tulajdonítható,
hogy egymással nem korreláló molekulatömeg- és szedimentációs állandó értékeket kaptak az
egyes fehérjefrakciókra különbözı extraháló szerek használatakor például Martínez és mtsai.
(1997) is. A felületi töltésbeli különbségek miatti elektroforetikus mintázat megváltozását a
szója 7S globulinjainál is megfigyelték (Gorinstein és mtsai., 1999).
Az A. hypochondriacus 35 kDa molekulatömegő, albumin típusú fehérjével (AmA1)
kapcsolatos eddigi ismereteket a 2.2.3. fejezetben ismertetjük.
2.2.2 Az amarantusz tartalékfehérjék aminosav összetétele
Az amarantusz növények magvai nem csupán jóval magasabb fehérjetartalmúak de
gazdagabbak esszenciális aminosavakban is. Az albumin és globulin fehérjék könnyen
emészthetı, nagy táplálkozástani értéket képviselnek, ugyanúgy, mint a maximum 20%-ot
kitevı híg lúgos oldatban oldódó glutelin fehérjék (Paredes-López és mtsai 1988). A
mindössze néhány százaléknyi prolamin frakció fehérjei esszenciális aminosavakban
szegények. Noha a magfehérje frakciók aminosav összetétele nagymértékben függ a globulin
frakció extrahálási körülményeitıl, minden vizsgálati módszer eredménye jelentıs mértékő
eltérést mutat a búza tartalékfehérjéinek aminosav összetételétıl. Az A. hypochondriacus
magfehérjéi pl. több szerzı által bizonyítottan esszenciális aminosavakban gazdagok (Segura-
Nieto és mtsai., összefoglalója 1999). A zúzott magok lizin tartalma 3,7-7,6%, mely jóval
magasabb, mint ami gabonafélék szemtermésében található (pl. zab 2,8%, búza 2,8%) (Shoup
és mtsai., 1966). A kéntartalmú aminosavak mennyisége is nagyobb (3,1-7,1%), mint a
pillangósok magfehérjéié (1,3-2,8%) és a búzaszemé (1,2-2,3%). Arginin tartalmuk 9,2-
12,3%, mely általában a pillangósokra jellemzı (borsó 12,3%), míg a búzaliszté csak 2,9-
4,7% (Shoup és mtsai., 1966). A gabonákéhoz hasonló magas aszparaginsav/aszparagin és
glutaminsav/glutamin tartalom az amarant magfehérjék tartalékfehérje jellegét bizonyítja.
21
Argininben, lizinben és kén tartalmú aminosavakban gazdag fehérjéi miatt az amarantusz
növények magvai ígéretes forrásai nagy táplálkozástani értékő fehérje géneknek, melyek
felhasználhatók a géntechnológia úton történı nemesítésben.
2.2.3 Az AmA1 jelő fehérje jellemzése
Az A. hypochondriacus egyik albumin típusú tartalékfehérjéjének cDNS-ét Raina és Datta
(1992) klónozták. Az ama1 gén az AmA1 jelő, 35 kDa molekulatömegő fehérjét kódolja. A
polipeptid aminosav szekvenciáját (Függelék II. ábra) és az egyes aminosavak
molekulatömegét figyelembe véve, az AmA1 fehérje a WHO által is fontosnak tartott
esszenciális aminosavak közül 7,7% lizint, 7,0% tirozint és 5,4% treonint tartalmaz (2.2.1
táblázat), s ezért nagy táplálkozástani értéket képvisel. Mindemellett nagyon fontos
hangsúlyozni, hogy ez az albumin típusú fehérje, ellentétben a Brazil dió 2S albuminjával,
allergenitásra utaló aminosav szekvenciákat nem tartalmaz. A fehérje nem allergén voltát
egyértelmően bizonyítják a Chakraborty és mtsai. (2000) által végzett nagyérzékenységő
allergia teszt negatív eredményei, valamint az a tény, hogy az amarantuszok lisztjébıl
Mexikóban, Közép- és Dél-Amerikában évszázadok óta készítenek kovásztalan kenyeret, de
használják ıket élelmiszerek adalékaiként is minden negatív tünet nélkül.
2.2.1 táblázat Esszenciális aminosavak mennyisége az A. hypochondriacus mag teljes fehérje frakciójában, az AmA1 fehérjében és a WHO ajánlás (Raina és Datta, 1992).
1Az AmA1 fehérje aminosav összetételét a szerzık a szekvencia adatokból kalkulálták az adott aminosav molekulatömegének figyelembe vételével.
aminosav mennyiség, % aminosav
teljes fehérje 1AmA1 fehérje WHO ajánlás Trp
Met/Cys Thr Ile Val Lys
Phe/Tyr Leu
1,4 4,4 2,9 3,0 3,6 5,0 6,4 4,7
3,6 3,9 5,4 6,1 5,2 7,7
6,7/7,0 9,2
1,0 3,5 4,0 4,0 5,0 5,5 6,0 7,0
Az AmA1 fehérje négy izomer formában van jelen a magban. Az egyik izomerhez készített
antitest a másik hárommal is keresztreakciót adott. A legnagyobb (1,2kb) klón cDNS-e
egyetlen fı ORF-et tartalmaz, mely egy 304 aminosavból álló polipeptidet kódol. A klónt
hibridszelekciós transzlációval és immun-precipitációval azonosították. Az immun-precipitált
termék mérete megegyezett az érett fehérje méretével. A fejlıdı mag RNS és fehérje
22
vizsgálata azt mutatta, hogy az Ama1 fehérje szintézise a korai embriógenezisben kezdıdik és
mennyisége a félig érett magban éri el a maximumot. A gén expressziója mag specifikus, a
fehérje vagy annak RNS-e más növényi szövetben nem mutatható ki. Az érett mag még egy
év után is tartalmaz AmA1 mRNS-t, ugyan kissé csökkent mennyiségben. Csírázáskor az
AmA1 fehérje mennyisége nem azonnal csökken le nullára, de harmadik napra, amikor a mag
teljesen szétesik, a fehérje is eltőnik. A késleltetett lebomlás azt sugallja, hogy a fehérje a
citoszolban van és proteolitikus enzim szerepét is betöltheti. Higgins és mtsai. (1987)
borsóban találtak egy albumin típusú tartalékfehérjét, mely raktározási szerepe mellett
proteolitikus enzim funkciót is ellát, és mint ilyen a sejt szétesésének utolsó fázisáig nem
juthat ki a citoszolba. Ez a lokalizáció azonban nem zárja ki a magspecifitást, hiszen az csak a
gén mőködését szabályozó promóter és enhanszer elemek szekvenciájától függ.
Az A. hypochondriacus nagy táplálkozástani értékő AmA1 fehérjéjének génjét már elınyösen
használták géntechnológia úton történı nemesítésben (Chakraborty és mtsai., 2000).
(Részletes ismertetését lásd a 2.3.2.1 fejezetben.)
2.3 A táplálkozástani minıség javításának lehetıségei
A fejlett országok lakosságának tápláléka a gabonák mellett hüvelyesek magjaiból, húsból,
zöldségekbıl és gyümölcsökbıl is áll, s ez a változatos táplálkozás biztosítja a megfelelı
ásványi anyag- és fehérjeszükségletet. A fejlıdı országok lakossága számára azonban sokszor
egyetlen gabonaféle, a rizs vagy a kukorica, jelenti a fı fehérje- és energia bevitelt. Különösen
az ırölt gabona magvak nem csupán egyes aminosavakban (pl. lizinben), de A-vitaminban,
folsavban, vasban, cinkben és szelénben is szegények (Christou és Twyman, 2004). Így a
világ népességének kb. egyharmada szenved a fejlıdésüket meghatározó vitaminok,
nyomelemek és fehérjék hiányától. Ezért a gabona magvak fehérjetartalma és annak aminosav
összetétele különösen fontos számukra. Hasonlóan odafigyelést igényel a fehérjetartalom
(mennyiség és minıség) beállítása az állatok takarmányának elkészítésekor is, különösen a
gyors növekedéső szárnyasoknál és sertéseknél. (Shewry, 2007).
A táplálkozástani érték javításának nagyon sok módja ismert és alkalmazott a világban (Zhu
és mtsai., 2007).
A hagyományos nemesítés és különösen ennek együttes alkalmazása a molekuláris nemesítési
módszerekkel (pl. mutagenézis vagy molekuláris markerezés) fontos lehetıség a
táplálkozástani minıség javítására. A jó tulajdonságért felelıs fajták megkeresése és elınyös
23
tulajdonságaik beépítése elit fajtákba azonban hosszadalmas és csak a szülık
tulajdonságainak kombinálásával valósítható meg. A kívánatos tulajdonság illetve tulajdonság
csoport megjelenítésére a gabonafélék szemtermésében ma az egyik lehetséges megközelítés
a transzgénikus módszert is alkalmazó nemesítés (Shewry és Jones, 2005).
2.3.1 Táplálkozástani minıség javítása hagyományos nemesítéssel
2.3.1.1 Szelekció magas fehérjetartalomra
A gabona magvak fehérjetartalma a termesztés körülményeitıl és a használt tápanyagoktól
függıen igen tág határok között változik. Száraz tömegre vonatkoztatva a rizs fehérjetartalma
5,8-7,7% (Champagne és mtsai., 2004), az árpáé 8-15% (Shewry, 1993), a kukoricáé 9-11%
(Zuber és Darrach, 1987).
Az elsı minıségjavítási lépéseket fajon belüli magas fehérjetartalmú fajták megkeresése
jelentette. A legelsı, évekig tartó szelekciós kísérletben Dudley és mtsai. (1974) több
kukoricafajta 70 generációját vizsgálva 4,4-26,6% fehérjetartalmú törzseket találtak. A
késıbbiekben a legtöbb kísérletet árpára és búzára végezték. Az árpa magfehérjéinek
genetikai hátterérıl Ullrich adott kiváló összefoglalót (2002).
Az USDA világra kiterjedı búzakollekciójában lévı 12600 búzatörzs fehérjetartalmát Vogel
és mtsai. (1978) 7-22% közöttinek találták. Vizsgálataik szerint a magas fehérjetartalomért
kb. egyharmad részben a genetikai háttér a felelıs. A két legmagasabb fehérjetartalmú, Atlas
66 és Nap Hal fajtát (17 és 18% teljes ırleményben) késıbb keresztezték egymással, de külön
is használták hagyományos nemesítésben jobb táplálkozástani minıség és agronómiai
tulajdonságok elérésére (Shewry, 2007). A késıbbiekben több búzafajtából izoláltak magas
fehérjetartalomért felelıs géneket, és alkalmazták a hagyományos nemesítésben (Olmos és
mtsai., 2003; Distelfeld és mtsai., 2004, 2006). A kísérletekben QTL és RFLP markerezési
módszereket használtak azonosítási célra. Uauy és mtsai. (2006) kimutatták, hogy a Gpc-B1
gén, ami egy transzkripciós faktort kódol, felgyorsítja az öregedést, és ezáltal nitrogént és
ásványokat (cink, vas) szállít a levélbıl a fejlıdı búzaszembe. Ez a gén kb. a genetikai
variációk 70%-ért felelıs. Fenti sikerek ellenére nagyon nehéz magas fehérjetartalomra
szelektálni, mert a valószínőleg többgénes befolyásoltság mellett erıs a környezeti hatás is. A
fı probléma azonban az, hogy növekvı fehérjetartalom mellett általában csökken a búza
terméshozama (Simmonds összefoglalója, 1995). Emiatt ez a módszer nem valószínő, hogy
sikeres lesz kereskedelmi forgalomban lévı búzák esetén.
24
2.3.1.2 Szelekció emelt esszenciális aminosav tartalomra
A gabonafélék esszenciális aminosav tartalma
A fehérjék táplálkozástani értékét az esszenciális aminosav összetételük határozza meg. Az
esszenciális aminosavak az emberi és állati szervezetben de novo nem szintetizálódnak, így a
táplálékkal kell bevinni azokat. Ha egy ilyen aminosav limitáló mennyiségben van jelen, a
többi sem szívódik fel és kiürül a szervezetbıl. Tíz szigorúan esszenciális aminosavat
Forrás 1 1 2 3 4 4 4 5 5 1Az értékek Shoup és mtsai., által publikált adatok (1966) átlagai. A triptofán értékek Paul és Southgate (1978) méréseibıl származnak. 2Az értékek Newman és McGuire (1985) által publikált adatok átlagai. 3Az értékek Robbins és mtsai. (1971) által publikált adatok átlagai. 4Az értékek Paul és Southgate (1978) méréseibıl származnak. 5FAO/WHO/UNU (1985)
A limitáló aminosav minden gabonafélénél a lizin, mennyisége fajonként változik. Legtöbb a
zab- és a rizs darában található (4,2 és 3,7%), a legkevesebb a kukorica- és a búzalisztben (2,7
és 2,2%). A gabonafélék a többi aminosav tartalmukban is különböznek, de a kukorica
alacsony triptofán tartalma (0,6%) a legszembetőnıbb. A búza aminosav összetételét a teljes
szemre és az endospermiumból ırölt lisztre is megadják, hiszen ırléskor a magasabb
25
esszenciális aminosav tartalmú aleuron réteget és az embriót elveszítjük. A búzalisztben
különösen a lizin aminosav kevés (2,2%), míg a teljes szemre vonatkoztatva kis
mennyiségben jelenlévı aleuron réteg és az embrió lizin tartalma magas (4,8 és 8,3%) (Jensen
és Martens, 1983). A zab- és a rizsszemek endospermiumának legumin-típusú tartalékfehérje
frakciói több lizint tartalmaznak és így a teljes szemek is, mint a többi gabonaféle fıként
prolamin-típusú tartalékfehérjéi (Jensen és Martens, 1983). Mivel a gabonafélék prolamin
fehérjéire az alacsony esszenciális aminosav tartalom a jellemzı, a gabona magvak
táplálkozástani minısége a prolamin frakció arányának változtatásával módosítható (Shewry,
2007). Általánosan igaz, hogy a kisebb mérető gabonaszem (kisebb endospermium) magasabb
esszenciális aminosav tartalmú, de ez a liszt összetételét nem befolyásolja. Ha
nitrogéntartalmú mőtrágyázással növeljük a gabonaszem teljes N-tartalmát, az az
endospermium megnövekedett fehérjetartalmában, a prolamin típusú fehérjék mennyiségének
növekedésében fog megnyilvánulni. Emiatt a lizinben gazdag anatómiai részek aránya
csökken, s vele együtt a szem lizin tartalma és így táplálkozástani értéke is. Kirkman és mtsai.
(1982) árpánál, míg Mossé és Huet (1990) a legumin-típusú tartalékfehérjékkel rendelkezı
zabnál is igazolták ezt a feltevést. Így a gabonatermesztésben alkalmazott mőtrágyázás
mértéke egy kompromisszum eredménye a nagy terméshozam és a magas táplálkozástani
érték között (Shewry, 2007).
Szelekció emelt lizin tartalomra
A legelsı lizinben gazdag (69%-kal több lizin, mint átlagos szemben) természetes mutáns
gabonát, („opaque-2” kukorica) magas lisztkihozatalú törzsek elemzésekor találták meg
(Mertz és mtsai., 1964). Munck és mtsai. (1970) az árpaszemek festékmegkötı képességét
vizsgálták szelekciós munkájukban. Az emelt lizin tartalmú természetes mutáns kukoricát,
kölest és árpát, melyeket több ezer fajta közül válogattak ki, kémiai (etilin-imin, nátrium-azid,
etilmetán-szulfonát) és fizikai (gamma-sugárzás, gyors neutronok, forró neutronok)
mutagenézisnek vetették alá. Vizsgálataik szerint (Gibbon és Larkins, 2005) a mutációért
felelıs gének azonos módon fejtették ki hatásukat, azaz a magas lizin tartalom a lizinben
szegény prolamin frakció szintézisének visszaszorulásából, a lizinben gazdag fehérje frakciók
túltermelésébıl és a szabad lizin mennyiségének növekedésébıl adódott. Ez azonban negatív
hatással is járt. Mindhárom gabona mutáns utódai csökkent terméshozamúak voltak, sıt a
kukorica és kölesszemek puhábbak is lettek. A magas lizin tartalomért felelıs géneket
(opaque-2, hl, lys3a) még nem sikerült kereskedelmi forgalomban lévı kölesbe és árpába
hagyományos nemesítéssel bejuttatni (Oria és mtsai., 2000). Prasanna és mtsai. (2001) a
magas lizin tartalmú kukorica törzsek közül a normális endospermiummal rendelkezıket
26
választották ki. Megállapították, hogy ezek a törzsek a magas lizin tartalomért felelıs gén
(opaque-2) mellett a keményítı szintézisét szupresszáló, módosító (mo) gént is tartalmaznak,
s a normális endospermium textúrát ennek tulajdonították. Biokémiai vizsgálataik szerint
ebben a kukorica fajtában (Quality Protein Maize, Kiváló Fehérjeminıségő Kukorica) a 22
kDa molekulatömegő α-zein mennyisége lecsökkent, de megemelkedett a 27 kDa-os γ-zein
mennyisége. Ez a fehérje valószínőleg térhálót képez a keményítı granulátumok körül, s így
módosítja a keményítıben gazdag endospermium struktúráját (Dannenhoffer és mtsai., 1995).
A Kiváló Fehérjeminıségő Kukoricafajtát ma Latin Amerika, Afrika és Ázsia több
országában, valamint Ausztráliában emberi táplálékként és állati takarmányként is termesztik
(Prasanna és mtsai., 2001). Crow és Kermicle (2002) az USA-ban hasonló jó táplálkozástani
értékő opaque-2 kukorica fajtákat állítottak elı magas terméshozammal, de ezek kicsi
szemkeménységük miatt csak állati takarmánynak alkalmasak.
Szelekció emelt metionin tartalomra
A metionin bioszintézise aszparaginsavból indul ki, mint a lizin és treonin aminosavaké.
Utóbbiak a szintézis enzimeit negatív visszacsatolással szabályozzák (Galili, 1995), így a
kukoricaszemek lizin és treonin tartalmú táptalajon nem képesek csírázni. Phillips és mtsai.
(1981) a kor ismereteit meghaladva, 200 kukoricaszemet lizin és treonin tartalmú táptalajon
gyökereztettek. Az egyetlen túlélı növény magvai magas metionin tartalmúak, 30-70% δ-
zeint tartalmaztak. A fehérjében több mint, 20 mol% lizin volt, s felületéhez nagy mennyiségő
metionin aminosav kapcsolódott (Phillips és McClure, 1985). Hagyományos nemesítéssel
azonban e jó tulajdonságot nem tudták átvinni újabb fajtákba.
prototípusán végeztük (Tömösközi és mtsai., 2000; Haraszi és mtsai., 2004). A mérésekhez
használt liszt mennyisége 4 g volt. A vízfelvétel meghatározása egy bevezetı mérés
formájában történt (a helyes vízabszorpció a felvett görbe maximális ellenállásából (PR)
számítható, 4.2 ábra). A maximális keverési ellenállás és a vízfelvevı képesség közötti
negatív, lineáris összefüggés van (Gras és mtsai. 2000).
A mikro z-arm mixer által szolgáltatott jelek regisztrálása a Scom, a dagasztási jellemzık
meghatározása az IZARM program (CSIRO, Ausztrália) segítségével történt. A mérést
valamennyi minta esetében állandó fordulatszámon (88-89 rpm), két-három ismétlésben
végeztük. A regisztrált görbék alapján a dagasztási paramétereket az említett szoftverek
segítségével határoztuk meg. A mikro-Valorigráf és egy, a készülékkel regisztrált tipikus
alapgörbe a leolvasható reológiai paraméterek értelmezésével a 4.2 ábrán látható.
55
4.2 ábra A mikro z-arm mixerrel felvett alapgörbe DDT: a maximális tésztaellenállásig eltelt idı (Dough Development Time, sec). PR: maximális
tésztaellenállás (Peak Resistance, VU). ST: stabilitás, az a hossz, mely a PR elıtti és utáni görbeelhajlásig tart (Stability, sec). BD: tésztaellágyulás, a PR utáni 10 perces görbeszakasz és a
maximumhoz húzott egyenes közötti területérték (Break Down in Resistance) (VU x sec).
A mikro-Valorigráf (mikro z-arm mixer) állandó fordulatszámon, a tengelyen ébredı erıvel
arányos és a motor teljesítményében bekövetkezı áramerısség-változást méri. A vízadagolás
pillanatától kezdıdıen, egy kaotikus szakasz után, a görbe növekvı tendenciája jelzi a
tésztaképzıdés megindulását. A vízadagolástól a maximális konzisztencia eléréséig eltelt idı
a minta dagasztási szükséglete (DDT, dough development time) míg a regisztrált maximális
ellenállásérték (PR, peak resistance) az úgynevezett maximális konzisztencia. Ha a dagasztást
folytatjuk a maximális ellenállás értéke csökken. Ez a hosszabb-rövidebb ideig tartó plató a
tészta stabilitását (ST) jellemzi (D’Appolonia és Kunerth, 1984). Az ellágyulás (BD, break
down) mértéke, vagyis a konzisztencia-csökkenés meredeksége az úgynevezett tolerancia
indexet adja meg.
DDT
56
5 EREDMÉNYEK ÉS ÉRTÉKELÉSÜK
5.1 Növényregenerációs rendszer kidolgozása ıszi búza genotípusokhoz
Minden sikeres növényi transzformációs módszer elsıdleges követelménye, hogy jól
regenerálódó szövettenyészetbıl induljon ki, hogy rendelkezésre álljon jól mőködı in vitro
növény-sejt-növény rendszer. A kontrollált körülmények között tartott sejt- és
szövettenyészetek a növényi biotechnológia és a géntechnológia alappillérei. A búza genetikai
állományának módosítása, azaz transzformálása leggyakrabban az éretlen embriókból nyert
kalluszok belövésével vagy fertızésével kezdıdik. Ezekbıl a kalluszokból kell aztán növényt
regenerálni és felnevelni úgy, hogy azok tartalmazzák a transzgént. Függetlenül attól, hogy a
transzgént tartalmazó sejteket a nem transzformált sejtek közül milyen módszerrel válogatjuk
ki (szelekció), a legfontosabb az, hogy képesek legyünk belövés nélkül is nagyszámú növényt
regenerálni. Ezért kísérleteinkben elıször azt teszteltük, hogy a kiválasztott magyar ıszi
búzafajták (Mv Emese, Mv Magvas, Mv Martina, Mv Pálma, két Mv Emma genotípus és a
Bánkúti 1201 búzafajta három törzse: B2, B8, B70) éretlen embriói hogyan kalluszosíthatók,
valamint a képzıdött kalluszokból milyen körülmények között lehet a legtöbb növényt
regenerálni. A búzafajták regenerációs képességét a korábban Hartog tavaszi búzára
kidolgozott és búza transzformációban sikeresen mőködı (Tamás és mtsai., 1999)
regenerációs rendszerünket használva teszteltük. Ez a növényregenerációs rendszer a Larkin
(1982) által publikált módszeren alapul. A teszt kísérletben a szövettenyésztés egymást
követı három fázisában (kalluszindukció, hajtásregeneráció és gyökérregeneráció) egyaránt
26±1 oC hımérsékletet alkalmaztunk, mert a szövettenyésztés hımérsékleti tartománya az
irodalom szerint általában 20-30 oC közötti, s mindhárom szakaszban azonos érték. A
hımérsékleti optimum fajonként változik (Chalupa, 1987). A donor növények kalászait 8-10
nappal virágzás után győjtöttük be, és a steril körülmények között preparált éretlen embriókat
BEG 2 táptalajon (Függelék I. táblázat), sötétben kalluszosítottuk. Az egy hét sötétben történı
inkubálás során hajtást adó embriókat eldobtuk, melyek aránya az eredeti embriók számához
képest mind a kilenc vizsgált búza genotípus esetén 8-10% volt. A sötétben, 5 hét alatt
képzıdött kalluszokat MS9 táptalajt tartalmazó Petri csészékben, alacsony intenzitású fénnyel
(20 µmol m-2 s-1, 16/8 óra fotóperiódus) világítottuk meg 4 héten keresztül hajtásregeneráció
céljából. A képzıdött hajtásokat hormonmentes MS táptalajon, a hajtásregenerációval azonos
körülmények között 4 hétig gyökereztettük. Kísérleteinkben ilyen körülmények között a
legnagyobb regenerációs hatékonyságot (61%) a Bánkúti 1201/B8 törzs mutatta, míg a többi
57
búzafajta regenerálhatósága nagymértékben eltért egymástól (0-15%). A teszt kísérlet
eredményeit az 5.1 összefoglaló táblázat elsı oszlopában mutatjuk be.
5.1 táblázat A hajtásregenerációban alkalmazott táptalaj összetétel és az inkubációs hımérséklet hatása a növényregenerációra.
mellett az Mv Emma búzafajta egyik genotípusának (2+12 HMW-GS összetételő)
regenerációs képessége szignifikánsan magasabbnak bizonyult IAA használata mellett (MS92
táptalaj, 18%), mint NAA használatakor (MS92N táptalaj, 11%). Ugyanakkor a Bánkúti
1201/B70 törzs a NAA használata mellett (MS92N táptalaj) mutatott szignifikánsan
magasabb regenerációs képességet (10 helyett 21%). A többi genotípusra általában csak az
mondható el, hogy minden Martonvásári búzafajta az MS92 hajtásregeneráló táptalaj
használatakor, ha nem is javult szignifikánsan, de magasabb regenerációs hatékonyságot (18-
35% szemben a 11-29%-kal) mutatott. Ugyanakkor a Bánkúti 1201 régi magyar búzafajta
mindhárom törzsének regenerációs hatékonysága az MS92N táptalajon volt a legjobb (21-
28% szemben a 10-30%-kal).
Annak ellenére, hogy az átlagos regenerációs hatékonyság a makroelem koncentráció
csökkentésével 3-10%-ról 20-22%-ra javult, az in vitro szövettenyésztés során több minıségi
problémát is tapasztaltunk. A sötétben indukált kalluszok mindössze egy-két százaléka volt
embriogén, azaz a kompakt kalluszok felszínén csak néhány esetben figyeltünk meg apró
fehér kinövéseket (embrioidok). A legtöbb kallusz (a kalluszok több mint fele), vagy már a
kalluszindukció alatt, vagy pedig a fényszakaszban szinte teljesen elvizesedett és/vagy
megbarnult.
5.1.2 Az inkubációs hımérséklet csökkentésének hatása a növényregenerációra
A fentiekben ismertetett minıségi problémák kiküszöbölése érdekében a következı
kísérletben a szövettenyésztés mindhárom egymást követı fázisában alacsonyabb inkubációs
hımérsékletet alkalmaztunk. Az embriókat, a kalluszokat és a zöld képzıdményeket 26±1 oC
helyett ennek a kísérletnek minden szövettenyésztési fázisában 23±1 oC hımérsékleten
60
tartottuk. Kalluszindukció céljából az embriókat BEG2 táptalajon inkubáltuk, és a
hajtásregenerációban ugyanazt a négyféle táptalajt használtuk (MS9, MS9N, MS92, MS92N),
mint az elızı, magasabb hımérsékleten végrehajtott kísérletekben. A megvilágítás intenzitása
és fotóperiódusa is ugyanaz volt (20 µmol m-2 s-1, 16/8 óra fotóperiódus). Kísérleteink során
megfigyeltük, hogy az alacsonyabb hımérséklet alkalmazása egyértelmően jó hatással volt a
kalluszok indukciójára. A sötét szakaszban a kalluszok lassabban fejlıdtek ugyan, de külsı
megjelenésük ígéretesebb volt (keményebb szövet, ’grízes’ felszín). Az embriogén kalluszok
száma minden genotípus esetében meghaladta a 15%-ot, és átlagosan 18-22% volt. A
szövettenyésztés mind sötét, mind fényszakaszában a kalluszok sokkal kisebb hányada
(maximum 5-6%) vizesedett el, és csökkent a barna, nekrotikus elhalást mutató kalluszok
száma is. Mindezen minıségi változások mellett, és valószínőleg hatására, az átlagos
növényregenerációs hatékonyság is javult. Míg a 26±1 oC hımérsékleten elvégzett összes
(mindenegyes genotípus és minden táptalaj alkalmazása melletti) kísérlet eredményeit
átlagolva az átlagos regenerációs képesség 13% volt, addig a 23±1 oC hımérsékleten
elvégzett összes kísérlet eredményeit átlagolva jóval magasabb értékeket kaptunk (57%) (5.1
táblázat). Mindemellett nagyon fontos hangsúlyozni, hogy a növényregeneráció hatékonysága
(20-96%) ebben a kísérleti beállításban is nagymértékben függött a genotípustól. A
legalacsonyabb regenerációs képességet (20%, MS9N táptalajon) az Mv Emma búzafajta
(5+10 genotípusa) mutatta, míg a legjobban az Mv Emese búzafajta regenerálódott (96%,
MS92 táptalajon). A genotípus mellett ezen az alacsonyabb hımérsékleten is erıteljesen
befolyásolta a kísérletbe vont búzafajták regenerációs hatékonyságát az alkalmazott táptalajok
összetétele. Az auxin típusának megváltoztatása (IAA helyett NAA) az eredeti koncentrációjú
MS táptalajok esetén (MS9 helyett MS9N) a búzafajták átlagos regenerációs képességét nem
javította (35% ill. 37%). Az egyes genotípusokra kapott regenerációs értékek közötti
különbségek azonban az mutatják, hogy míg a Martonvásári búzafajták növényregenerációja
kis mértékben romlott (28-45%-ról 27-37%-ra), kivétel ezalól az Mv Emma két genotípusa,
addig a Bánkúti 1201 búzafajta három törzsének regenerációs képessége valamelyest javult az
MS9N táptalajon (33-39%-ról 39-58%-ra). A pozitív változás csak egy búzafajta esetében
(Bánkúti 1201/B8 törzs) volt szignifikáns, a növényregeneráció mértéke 39%-ról 58%-ra
emelkedett. Szignifikáns pozitív változást ezen az alacsonyabb inkubációs hımérsékleten
(23±1 oC) a makroelemek koncentrációjának felére csökkentése hozott, mely érvényes
minden genotípusra. A koncentráció csökkentése az átlagos regenerálhatóságot 35-37%-ról
78%-ra növelte. Ilyen körülmények között a legalacsonyabb regenerációs hatékonyságot
(48% MS92 táptalajon, 54% MS92N táptalajon) most is a Bánkúti 1201/B70 törzs mutatta.
61
Legeredményesebben ismét az Mv Emese búzafajta éretlen embrióiból nyert kalluszok
regenerálódtak (96%, MS92 táptalajon). Az IAA helyettesítése NAA-val, a makroelemeket
fele mennyiségben tartalmazó táptalajokban (MS92 helyett MS92N), hasonló változást
eredményezett a vizsgált búzafajták regenerációs hatékonyságában, mint az eredeti MS
koncentrációjú táptalajokban. Azt tapasztaltuk, hogy a Martonvásári búzafajták éretlen
embriói az IAA tartalmú hajtásregeneráló táptalaj (MS92) alkalmazása mellett regenerálódtak
jobban. Regenerációs hatékonyságukat 62-96% közötti értéknek találtuk, szemben az NAA-t
tartalmazó táptalajok (MS92N) használata során kapott 56-90% növényregenerációval. A
Bánkúti 1201 búzafajta három törzsének éretlen embriói az NAA tartalmú táptalajon
(MS92N) regenerálódtak jobban (54-93% szemben a 48-86%-kal). Szignifikáns javulást
azonban csak a B2 törzs esetén tapasztaltunk (80% helyett 88%). A többi genotípus éretlen
embrióiból nyert kalluszok növényregenerációs képességét az alkalmazott auxin típusa nem
befolyásolta szignifikánsan, 5% szignifikancia szinten. Annak ellenére, hogy a Martonvásári
búzafajták és a Bánkúti 1201 búzafajta három törzse eltérı regenerációs képességet mutatott a
két különbözı auxint tartalmazó hajtásregeneráló táptalajon, ha minden egyes vizsgált
genotípus kísérleti eredményeit figyelembe vesszük a növényregeneráció átlagos
hatékonysága közel azonos volt a két különbözı auxint tartalmazó hajtásregeneráló táptalajon
(79% MS92 táptalajon és 78% MS92N táptalajon).
Ebben az alacsonyabb inkubációs hımérsékletet alkalmazó kísérleti beállításban nagyon
fontos eredményre jutottunk. Összességében azt mondhatjuk, hogy a szövettenyésztés
mindhárom fázisában 23±1 oC-ra csökkentett hımérséklet hatása szignifikáns pozitív
változást eredményezett a növényregeneráció mértékében: az átlagérték 13%-ról (26±1 oC)
57%-ra nıtt. (Az átlagértékek számításánál mindenegyes genotípusra és a
hajtásregenerációban alkalmazott minden táptalajra kapott regenerációs eredményeket
figyelembe vettük.) Ez az átlagérték azonban még mindig 60% alatt van. Ezért egy további
kísérleti beállításban az embriogén kalluszok számának növelése céljából a kalluszindukció
során még alacsonyabb (20±1 oC) hımérsékletet alkalmaztunk, míg a szövettenyésztés
késıbbi fázisaiban ugyanúgy, mint elızıekben, 23±1 oC hımérsékletet biztosítottunk. A
kalluszindukcióban BEG2 táptalajt, a hajtásregenerációban MS92 táptalajt használtunk és a
fényviszonyokon nem változtattunk. A sötétfázisban alkalmazott még alacsonyabb
hımérséklet hatására az embriogén kalluszok száma tovább nıtt (25-30%), de a regeneráció
hatékonysága nem javult, hanem 10-14%-kal volt alacsonyabb, mint azokban a kísérletekben,
amikor a kalluszindukciót 23±1 oC hımérsékleten végeztük (az eredményeket nem közöljük).
A negatív mennyiségi változások mellett megfigyeltük azt is, hogy a regenerált növények
62
nagy része nem a sötét szakaszban indukált kalluszok felületén képzıdött embrioidokból
fejlıdött tovább. Az embriószerő képzıdmények elhaltak, s a hajtáskezdemények a kalluszok
más területein jelentek meg elıször zöld foltok, majd zöld kinövések formájában. Ezeket a
megfigyeléseket figyelembe véve arra következtethetünk, hogy az alkalmazott
szövettenyésztési viszonyok között az általunk tesztelt búzafajták növényregenerációja
valószínőleg túlnyomórészt organogenézisen és nem embriógenézisen keresztül játszódik le.
A növényregeneráció hatékonyságára kapott alacsonyabb értékek és fenti megfigyeléseink
miatt a hımérséklet 23±1 oC alá csökkentését a késıbbiekben nem alkalmaztuk, mert ha a
növényeket organogenézisen keresztül regeneráljuk a kalluszokból, az mozaikossághoz
vezethet. A mozaikosságot a növényi transzformációban kerülni kell, hogy az idegen DNS-
molekulát a géntechnológiával módosított növény minden sejtje hordozhassa. Ez csak akkor
valósulhat meg, ha a szövettenyésztés optimális körülményeinek kidolgozásakor alapvetıen
embriógenézist indukálunk, hogy szomatikus embriógenézissel fejlıdhessen tovább a
transzformált sejt (Shewry és Jones, 2005).
5.1.3 A fényintenzitás változtatásának hatása a növényregenerációra
A szövettenyésztés hajtásregeneráló fázisában alkalmazott megvilágítás spektrális összetétele,
intenzitása és fotóperiódusa egyaránt befolyásolja a kallusz sejtek differenciálódását. Noha a
kutatók nagy része ma már nem vizsgálja az optimális fejlıdéshez és differenciálódáshoz
szükséges fény minıségét és mennyiségét, ennek fontosságáról számos korai riport számolt
be (Thorpe, 1980; Hughes, 1981). Munkánk külön kísérleti beállításaiban mind a kilenc búza
genotípus kalluszainak regenerációs képességét alacsony (20 µmol m-2 s-1) 16/8 óra
fotóperiódussal, vagy magas (50 µmol m-2 s-1) intenzitású fényt állandó megvilágítással
használva vizsgáltuk. A fenti kísérletek hajtásregeneráló fázisában mindig alacsony
intenzitású megvilágítást alkalmaztunk 16/8 óra fotóperiódussal. Ekkor az inkubációs
hımérséklet csökkentése (26±1 °C-ról 23±1 °C-ra) és a felére csökkentett mennyiségő
makroelemet tartalmazó táptalajok alkalmazása (MS92, MS92N) hatására minden vizsgált
ıszi búza genotípus éretlen embrió eredető kalluszaiból nagy számú növényt regeneráltunk.
Az átlagos regenerációs képesség 20%-ról 78%-ra nıtt, a legalacsonyabb érték 48% (Bánkúti
1201/B70 törzs, MS92 táptalajon), míg a legmagasabb 96% volt (Mv Emese, MS92
táptalajon) (5.1 táblázat). A pozitív mennyiségi változások mellett azonban kísérleteinkben a
kalluszokból lassan (6-8 hét) fejlıdtek ki hajtások, az embriók preparálásának idıpontjától
számítva 11-13 hét alatt (5 hét kalluszindukció), amit 4 hét gyökérregeneráció követett. A
63
hosszú szövettenyésztési idı az irodalmi adatok szerint genetikai instabilitáshoz és nagyfokú
szomaklonális variabilitáshoz vezethet (Harvey és mtsai., 1999). Ezért a következı kísérlet
hajtásregeneráló fázisában a megvilágítás intenzitását és idıtartamát megnöveltük (50 µmol
m-2 s-1, állandó fény). Ez gyorsíthatja a kalluszok redifferenciálódását, de az alkalmazott
fényviszonyokat empirikus úton szükséges meghatározni (Thorpe, 1994). A szövettenyésztés
hımérsékletét (23±1 oC) és a hajtásregeneráló táptalajok összetételét (MS9, MS9N, MS92,
MS92N) nem változtattuk. A fényviszonyok módosítása nem vezetett egyértelmő
eredményekre. Jó hatással volt ugyan a kalluszok redifferenciálódására (már egy hét után
nagy számú zöld folt és hajtáskezdemény jelent meg), de a többnyire fodros hajtások nem
fejlıdtek növénnyé, és a kalluszok nagymértékben gyökeresedtek. A regeneráció mértéke
ezért nem volt számszerősíthetı. A negatív változásokat az NAA tartalmú táptalajon
tenyésztett kalluszokon figyeltük meg (MS9N, MS92N). Ezek aktív citokinin/auxin hormon
aránya kisebb, mint az IAA tartalmúaké (MS9, MS92), mivel az NAA azonos mól arány
esetén nagyobb bioaktivitású auxin típusú hormon, mint az IAA (Thorpe, 1994). A szerzı
szerint a főfélék in vitro hajtás regenerációja általában alacsony citokinin koncentrációt
igényel, de a citokinin/auxin hormon arány erısen függ a genotípustól is. A következı
kísérletben a citokinin/auxin hormon arányt a két NAA tartalmú táptalajban a citokinin (BAP)
abszolút mennyiségének duplájára emelésével (4,4 µM helyett 8,8 µM BAP) növeltük meg.
Hatására a kalluszok gyökeresedése csökkent, de a hajtások fodrosak maradtak, melyekbıl
növények továbbra sem fejlıdtek. Így a gyökérképzıdés visszaszorulása nem javította a
növényregeneráció mértékét. Elképzeléseink szerint ennek két oka lehetséges. Az egyik, hogy
a kísérleteink sötét fázisa után alkalmazott állandó, magasabb (50 µmol m-2 s-1) intenzitású
megvilágítás a kalluszok számára fény stresszt jelentett. A másik az lehet, hogy búzánál, mint
a legtöbb növénynél a hajtásregeneráció mértékét a külsı (táptalajban használt)
citokinin/auxin hormonarány mellett a genotípus és az alkalmazott szövettenyésztési
körülmények (táptalaj összetétel, hımérséklet- és fényviszonyok) együttes hatása befolyásolja
(Thorpe, 1994; Fischer-Iglesias és mtsai., 2001). Az okok keresése, az optimális körülmények
kidolgozása céljából az egyes paraméterek változtatásának hatását elıbb külön-külön (mint
fent), majd együttesen is vizsgáltuk (következı, 5.1.4 fejezet).
64
5.1.4 A hajtásregenerációban alkalmazott hımérséklet, fényintenzitás és táptalaj
összetétel együttes hatása a növényregenerációra
Az elızıekben ismertetett minıségi problémák (túl hosszú szövettenyésztés, a kalluszok
erıteljes gyökeresedése és fodros hajtások képzıdése), kiküszöbölése érdekében a következı
kísérleti beállításban a szövettenyésztés egymást követı három fázisában a megvilágító fény
intenzitását valamint a hımérsékleti értékeket fokozatosan és együttesen változtattuk. A
kísérletbe vont mind a kilenc búza genotípus éretlen embrióit most is sötétben, a korábban is
alkalmazott körülmények között (BEG2 táptalaj, 23±1 oC) kalluszosítottuk. A hajtások
regenerálását csak két különbözı, az eredetihez képest fele makroelemet tartalmazó táptalajon
(MS92, MS92N) végeztük. A fény stressz elkerülése érdekében azonban a kalluszokat elıször
2 hétig alacsony intenzitású fénnyel világítottuk meg (20 µmol m-2 s-1, 16/8 óra fotóperiódus)
23±1 oC hımérsékleten, majd a zöldülı kalluszokat azonos összetételő táptalajon, de állandó,
magas fényintenzitás mellett (50 µmol m-2 s-1) és magasabb hımérsékleten (26±1 oC)
tenyésztettük, míg növények nem fejlıdtek rajtuk. Ez általában még 2 hetet vett igénybe. A
hımérséklet és fényintenzitás fokozatos, együttes növelésének hatására a két különbözı
összetételő táptalajon megfigyeltük, hogy a kalluszok sokkal kevésbé gyökeresedtek, rajtuk
fodros levelek nem képzıdtek, így minden hajtáskezdemény növénnyé fejlıdhetett. Ezek a
minıségi változások a növényregeneráció hatékonyságára is pozitív hatással voltak. Az
átlagos növényregenerációs képesség az elızı kísérletben elért 78%-ról MS92N táptalajon
82%-ra, míg MS92 táptalajon 83%-ra emelkedett (5.2 táblázat). Eredményeink jól egyeznek a
Thorpe (1994) által megállapítottakkal, miszerint szinte minden in vitro tenyésztés
hatékonyságát több faktor együttes hatása befolyásolja, s ezeket empirikus úton szükséges
meghatározni.
5.2 táblázat A hajtásregeneráló táptalaj összetétel, valamint a hajtásregenerációban alkalmazott hımérséklet és fényintenzitás fokozatos, együttes változtatásának hatása a növényregenerációra.
táptalajon). A három közül két búza törzs (B70, B8) növényregenerációs képessége
szignifikánsan magasabb volt MS92N hajtásregeneráló táptalajon, mint az MS92 táptalaj
alkalmazása mellett. Ez az eredmény nagyon hasonló Pellegrineschi és mtsai. (2002) által
publikált, a Bobwhite búzafajta egyes törzseinek növényregenerációs képességét
tanulmányozó kísérletekben tapasztaltakkal. Eredményeink az irodalmi adatokkal
megegyezıen azt jelzik, hogy lehetséges még egy tájfajtán belül is a jó regenerációs
képességre szelektálni. A Martonvásári búzafajták mindegyike, ebben a kísérleti beállításban
is, az MS92 táptalajon mutatott jobb regenerációs képességet. Közülük három búzafajta (Mv
Emese, Mv Emma két genotípusa) regenerációs hatékonysága szignifikánsan magasabb volt,
mint az MS92N táptalajon elért értékek. Ebben a kísérleti beállításban is, mint az elızı
kilencben is, a regenerációs képesség nagymértékben függött a búza genotípusától, de a
különbözı kísérletekben az egyes genotípusok hasonló módon viselkedtek. Mind a tíz
különbözı kísérleti beállításban kapott eredményeinket elemezve, a genotípus és a különbözı
szövettenyésztési körülmények között szoros, pozitív korrelációt állapítottunk meg (0,83** -
0,99***).
Összefoglalva elmondható, hogy az általunk kidolgozott szövettenyésztési módszer mind a
kilenc vizsgált, köztük hat kereskedelmileg is fontos magyar búzafajtára alkalmas, nagy
hatékonyságú módszer. A genotípusok közötti regenerációs képességbeli különbségek nem
tőntek el, ami azt jelezheti, hogy az általunk vizsgált paraméterek nagy valószínőséggel olyan
változásokat eredményeztek a kísérleteinkbe bevont ıszi búza genotípusok regenerációs
képességében, melyek általános érvényőek. Ennek eredményeként a módszer különösen
hasznos lehet, mivel jó kiindulási alapot szolgáltat további búzafajták regenerációs
képességének teszteléséhez, optimalizálásához.
66
5.2 A növényregeneráció körülményeinek optimalizálása transzformációhoz
A fentiekben tárgyalt, belövés nélküli regenerációs kísérleteinkben a növényregeneráció
hatékonyságát a hajtásregeneráló táptalajok összetételének és a hajtásregeneráció
körülményeinek (fény, hımérséklet viszonyok) változtatása mellett vizsgáltuk. A két
eredmény kombinációjaként a regenerálódás mértéke belövetlen kalluszokkal több ıszi búza
genotípusnál (Mv Emese, Mv Martina, Bánkúti 1201/B2 és B8 törzs) meghaladta a 90%-ot,
mely jó kiindulási alapot nyújtott a búza genetikai módosítására biolisztikus módszerrel. Ezt a
kidolgozott szövettenyésztési módszert búza transzformációs kísérleteinkben a fenti négy
legjobb regenerációs képességő ıszi búza genotípusra alkalmaztuk. A szelekciós markergént
és a transzgént ugyanúgy, mint korábbi munkánkban (Tamás és mtsai., 1999) az éretlen
embriókból nyert egyhetes kalluszokba juttattuk be biolisztikus módszerrel. A célszövet
túlzott sérülésének elkerülése és a megfelelı hatékonyságú növényregeneráció fenntartása
érdekében a belövés fizikai paramétereit az irodalmi adatok szerinti optimális (Rasco-Gaunt
és mtsai., 1999a; Harwood és mtsai., 2000) értéknek választottuk. A transzformált sejtek
kiválogatásához, valamint belılük növények regenerálásához azt az nptII/kanamycin
szelekciós rendszert használtuk, mely a korábbi munkánkban (Tamás és mtsai., 1999) sikeres
transzformációra vezetett. Az antibiotikum szelekciót a lövés utáni szövettenyésztés korai
szakaszában elkezdtük. A kalluszokat két hétig sötétben BEG2 táptalajon szelekciós ágens
nélkül tenyésztettük, majd a friss kalluszindukáló táptalajba 50 mg/l kanamycint adagoltunk
és további két hétig inkubáltuk sötétben. A hajtások és a gyökér regenerációja is szelekciós
nyomás alatt történt, mint azt más kutató laboratóriumokban is végezték (pl. Rooke és mtsai.,
1999). A belövés utáni növényregenerációs hatékonyság a kanamycin tartalmú táptalajokon a
kísérletbe vont ıszi búza genotípusoknál 8-15% volt, mely eredmény jól egyezik más kutató
csoportok eredményeivel (Lee Rooke személyes közleménye). Az irodalmi adatok szerint a
kanamycint ennél nagyobb koncentrációban (100 mg/l) csak transzgénikus rizs növények
szelekciójához használják (Chamberlain mtsai., 1994). Kísérleteinkben minden genotípus
esetén nagy számban (30-40) kaptunk regenerált búzanövényt, melyeknek csak egy részében
tudtuk kimutatni a transzgén jelenlétét (4-5 növény/genotípus). A DNS szintő vizsgálatokat a
fiatal növények leveleibıl kinyert genomi DNS-en PCR módszerrel végeztük. A PCR pozitív
T0 növények T1 szemtermésébıl többet elvetettünk, de a T1 növényekbıl izolált DNS-ben
nem tudtuk kimutatni a szelekciós markergén jelenlétét. Ha figyelembe vesszük az
alkalmazott szelekció hatékonyságára vonatkozó irodalmi és személyes közleményeket (mint
fent), a gén „elvesztése” nagy valószínőséggel nem a szelekció hiányossága, hanem inkább
67
annak lehetett az eredménye, hogy a transzgén mozaikosan épült be a búza genetikai
állományába. A mozaikosságot a növényi transzformációban úgy tudjuk elkerülni, ha
megtaláljuk a szövettenyésztés körülményeinek kidolgozása során az alapvetıen
embriógenézist indukáló táptalajokat és körülményeket (Shewry és Jones, 2005).
A továbbiakban a növényregeneráció hatékonyságát javítani szándékozó szövettenyésztési
kísérleteinket olyan módosításokkal egészítettük ki, melyek a szomatikus embriógenézist
segíthetik elı. Míg korábbi növényregenerációs kísérleteinkben (Tamás és mtsai., 2004) csak
a hajtásregenerációban alkalmazott körülményeket (táptalajok összetétele, hımérséklet- és
fényviszonyok) változtattuk, addig a továbbiakban a kalluszindukció körülményeit és a
hajtásregeneráció korai szakaszának (elsı három hét) táptalaját módosítottuk. Korábbi
növényregenerációs kísérleteinkben valószínőleg a preparált éretlen embriók
dedifferenciálódása sem volt megfelelı. Mindezek miatt az embriópreparálás módját és a
kalluszindukcióban alkalmazott táptalajok összetételét módosítottuk.
Kísérleteinkben a legjobb regenerációs hatékonyságot mutató magyar ıszi búzafajta (Mv
Emese) mellett két tavaszi, úgynevezett modell búzafajtát is vizsgáltunk (Bobwhite és
Cadenza). A modell búzafajták alkalmazása lehetıvé tette a használt szövettenyésztési
körülmények és táptalajok, valamint a kiindulási növényi anyag tesztelését.
A csírázás megakadályozása, valamint az embriók eredeti genetikai programjának leállítása
érdekében az éretlen embriók embriócsúcsát mikroszkóp alatt eltávolítottuk. Az így preparált
szkutellum ma az egyik leggyakrabban használt kiindulási szövet a búza biolisztikus
módszerrel történı transzformációjában (Jones és mtsai, 2005). A preparált szkutellumokat
olyan kalluszindukáló táptalajra helyeztük, melyek nem tartalmaztak glicint, de tartalmaztak
10 mg/l AgNO3-ot, nagyobb mennyiségő szacharózt (30 g/l helyett 90 g/l) és változó
mennyiségben 2,4-D auxin típusú hormont (2,0 mg/l, 1,0 mg/l és 0,5 mg/l). Kísérleti
eredményeink azt mutatták, hogy a növényregeneráció hatékonysága leginkább a preparált
embriók méretétıl (azaz hormon tartalmától) függött, mint azt Pastori és mtsai. (2001) is
publikálták. A regenerációs képességet nagymértékben befolyásolta a kísérletbe vont
búzafajta genotípusa is. A legtöbb növényt a Bobwhite és Cadenza búzafajtáknál a kicsi (0,5-
1,0 mm) és közepes mérető (0,8-1,2 mm) embriókból kiindulva neveltünk (75-80%), míg az
Mv Emese búzafajta regenerációs képessége a nagymérető (1,0-1,6 mm) embriókból
kiindulva (5.1 ábra) volt a legmagasabb (80%). Az Mv Emese búzafajta kicsi embrióiból
preparált szkutellumok kalluszaiból egyáltalán nem lehetett növényt regenerálni. Az
embriócsúcs eltávolítása mindenegyes búzafajta esetén és bármely mérető embrióból
kiindulva megakadályozta a csírázást.
68
6 5 4 3 2 1
5.1 ábra Éretlen embriók csoportosítása méret szerint: 1 és 2 kicsi (0,5-1,0 mm), 3 közepes (0,8-1,2 mm), 4 és 5 nagy (1,0-1,6 mm), 6 túl nagy. A Bobwhite búzafajta transzformálásához a hármas számú, áttetszı szkutellumot és kissé opálos embriócsúcsot tartalmazó közepes mérető embriók a megfelelıek (Pellegrineschi személyes közleménye).
A növényregeneráció mértékét a genotípus és az embrió mérete mellett a kalluszindukáló
táptalaj 2,4-D tartalma (2,0 mg/l, 1,0 mg/l és 0,5 mg/l) is nagymértékben befolyásolta.
Mindhárom genotípus esetén a 0,5 mg/l 2,4-D tartalmú kalluszindukciós táptalaj (MD0,5;
Függelék II. táblázat) használatakor kaptuk a legtöbb növényt, mely jó korrelációt mutatott a
sötétben indukált embriogén kalluszok számával (az adatokat nem közöljük). Ez a
megfigyelés nagyon fontos, hiszen az embriogén kalluszokból az új növény a kallusz egyetlen
totipotens sejtjébıl fejlıdik ki embriószerő képzıdményen keresztül, s ezáltal a
géntechnológiai úton módosított növény feltételezhetıen minden sejtje hordozni fogja az
idegen DNS-molekulát. Az embrioidok hajtássá fejlıdését az elsı hajtásregeneráló fázisban
használt táptalajban (RZ+1/2Cu; Függelék II. táblázat) oldott 0,05 mM CuSO4-tal segítettük
az irodalomban publikáltak szerint (Sparks és Jones, 2004). Ugyanezen célból, valamint a
szomaklonális variabilitás elıfordulási esélyének csökkentése érdekében minden
szövettenyésztési fázist három hétre rövidítettünk le. A változtatások, azaz a szkutellumok
5.2 ábra Transzgénikus növények genomi DNS-én végzett PCR vizsgálat AmaF1-NosR3 primer párral. Az amplifikált termék mérete 480 bp. 52, 58, 59, 65, 71, 76, 80, 83: PCR pozitív T0 növények számjelzése, Ca és Em: negatív növényi kontrollok (Cadenza és Mv Emese donor növények), Pl+: plazmid pozitív kontroll.
A bar gén jelenlétét hat Bobwhite, húsz Cadenza és három Mv Emese búzafajta szelekciót
túlélt, regenerált növényében mutattuk ki, mely 0,24-1,00 % transzformációs hatékonyságot
jelent (5.3 táblázat). A szelekciós markergént tartalmazó 29 búzanövény közül 18, a növények
62 %-a tartalmazta az ama1 transzgént is. Ezek a transzformációs- és kotranszformációs
gyakoriságra vonatkozó eredményeink jó egyezést mutatnak a korábban modell genotípusok
éretlen embrióival végzett legtöbb kísérlet eredményeivel (lásd. Rasco-Gaunt és mtsai., 2001
összefoglalója,). Kísérleteinkben a kotranszformáció hatékonysága genotípusonként változott
(5.3 táblázat, negyedik oszlop). A legmagasabb kotranszformációs hatékonyságot (83%) a
Bobwhite fajta, a legalacsonyabbat pedig (33%) az Mv Emese ıszi búzafajta esetén
tapasztaltuk. A Cadenza búzafajta kotranszformációja (60%) az átlaggal megegyezı volt. A
transzformációban elıállított, PCR pozitív T0 növényeket üvegházi kontrollált körülmények
között, elkülönítve neveltük fel. A búzanövények mindegyike fertilis, normális magkötésőnek
bizonyult.
A transzgénikus búzanövények további vizsgálataihoz (T1 és T2 generáció) a T0 növények
közül hét független transzgénikus vonalat választottunk. Ezek a Bobwhite búzafajta #15, a
Cadenza búzafajta #28, #58, #59, #80, #83, és az Mv Emese búzafajta #71 számú
transzgénikus vonalai voltak. Minden kiválasztott T0 növény 16 db T1 magjából T1
növényeket neveltünk, és a három-négy leveles növények leveleibıl kinyert genomi DNS-en
71
a bar és az ama1 gén jelenlétét PCR módszerrel vizsgáltuk. Ezt követıen az öt-hat leveles
állapotú növényekben a bar gén aktivitását herbicid resziztencia teszttel is ellenıriztük úgy,
hogy egy hét eltéréssel a növényeket 1 g/l PPT tartalmú kereskedelmi forgalomban lévı
totális gyomirtó szerrel (FINALE, glufozinát-ammónium) kétszer lepermeteztük. A herbicid
resziztencia tesztet túlélt növények száma a különbözı transzgénikus vonalaknál 9-13 közötti
volt, ami a lepermetezett növények 56,3-78,6%-a (5.4 táblázat). A herbicid rezisztancia
tesztnek ellenálló legtöbb búzanövényt (13) a Cadenza búzafajta #59 vonala adta, a
legkevésbé ellenálló pedig az Mv Emese (#71) és a Cadenza búzafajta #58 és #83 számú
vonalai voltak (9 túlélı/16 tesztelt növény). A teszt eredménye nem csak a búza fajtájától
függıen változott, de a Cadenza búzafajtánál az egyes transzgénikus búzavonalakra is eltérı
Függetlenül azonban a búza fajtájától és azon belül a transzgénikus vonaltól, minden vizsgált
transzgénikus búzanövény esetében azt tapasztaltuk, hogy a bar gént hordozó PCR pozitív
növények mindegyike a bar gén által kódolt foszfinotricin-acetiltranszferáz (PAT) enzimet
expresszálta, mely inaktiválta a totális gyomírtószert, s ezzel biztosította a lepermetezett
növény számára a túlélést. A genomi DNS-en transzgénre (ama1) elvégzett PCR vizsgálatok
eredményei azt mutatták, hogy minden vizsgált transzgénikus vonal T1 utódja, mely
tartalmazta a markergént és expresszálta a PAT enzimet, hordozta az ama1 transzgént is.
Ebbıl azt a következtetést vonhatjuk le, hogy nagy valószínőséggel a bar gént tartalmazó
pAHC25 nevő plazmid és az ama1 gént hordozó AmA1-pTLZ jelő transzformációs kazetta
egymáshoz közeli helyre (lokuszra) épült be a búza genetikai állományába. Eredményeink
összhangban vannak számos kutatócsoport eredményeivel, miszerint a búza biolisztikus
72
transzformációja során a kotranszformált gének többnyire ugyanazon lokuszra épülnek be
(Pawlowski és Somers, 1998; Stoger és mtsai.,1998; Rooke és mtsai., 2003). A szerzık arról
is beszámoltak, hogy a szelekciós markergén és a transzgén az esetek többségében együtt
öröklıdtek át a következı nemzedékre. Kísérleteinkben a mindkét génre PCR pozitív
növények száma az elemzett T1 generációban a növények 56-78%-át tette ki, ami a Mendeli
öröklıdés szabályainak majdnem teljes mértékben megfelel. Ez jó egyezést mutat az elmúlt
néhány évben elvégzett búza transzformációs kísérletekben tapasztaltakkal, hogy a
géntechnológiai módszerrel bejuttatott gének a transzgénikus növények korai generációiban
Mendeli öröklıdés szerint jutnak tovább a következı nemzedékre (Vasil összefoglalója,
2007).
A T2 generáció nagy számú növényében (24 db növény/transzgénikus vonal) a marker-,
riporter- és transzgén jelenlétét a genomi DNS-en végzett PCR reakcióval, míg az uidA
génrıl expresszálódó glükuronidáz enzim (GUS) jelenlétét a szemtermésekben hisztokémiai
GUS teszttel igazoltuk. Ehhez a T1 növények érett T2 magjaiból (kivéve az Mv Emese #71
vonalát, mely apró szemeket termett) vékony szeletet vágtunk le a csíra oldallal szemben és
GUS festıoldatban inkubáltuk. Az GUS fehérjét expresszáló növények szemtermésének
vékony metszete kékre szinezıdött (5.3 ábra).
negatív kontroll 1 2 3 4 5
5.3 ábra A transzgénikus növények T2 szemtermésének hisztokémiai tesztje.
(GUS enzim aktivitás kimutatás) 1-5: a vizsgált búza növény utódvonalainak száma.
A csírát tartalmazó részbıl növényt neveltünk. A levélszövetbıl kinyert genomi DNS-en
végzett PCR reakciók valamint a GUS teszt eredményei azt mutatták, hogy a kotranszformált
marker/riporter- és a transzgén (bar/uidA és ama1 gének) a T2 generációban is megfeleltek a
Mendeli öröklıdés szabályainak (5.4 táblázat). A vizsgált növények 48-83%-a hordozta mind
a három gént. Találtunk a transzgénikus Cadenza #28, #59 és #80 vonalak utódjai között
olyan vonalakat is, melyeknek mind a 12 vizsgált T2 növénye hordozta mind a három gént
(úgynevezett ‘tiszta’ vonalak). A kotranszformált gének ebben a generációban is szinte
minden vizsgált transzgénikus vonal utódjaiban együtt, nem szegregálódva jutottak át a T2
73
generációba. Ez alól egyetlen kivétel volt, a transzgénikus Bobwhite #15 vonala, melynek két
T2 növénye csak az ama1 transzgént tartalmazta. Ehhez hasonló adatokat találunk az
irodalomban is, miszerint a kotranszformált gének általában együtt öröklıdnek, de az esetek
kis százalékában (<10%) a markergén és a transzgén szegregálódik a magasabb
generációkban (Rooke és mtsai., 2003). A Bobwhite búzafajta #15 vonala két transzgénikus
utódvonalainak további vizsgálata lehetıséget nyújt arra, hogy csak ama1 gént tartalmazó
transzgénikus búzavonalakat állítsunk elı. A szelekciós markergén hiánya elméleti
lehetıséget adhat arra, hogy a transzgénikus növény további szigorú feltételek teljesülése
mellett, alapos és körültekintı vizsgálatok után, akár kereskedelmi forgalomba is kerülhessen.
Ehhez természetesen szükséges a szabályozó szervezetek engedélye és a fogyasztók elfogadó
magatartása is, mely hosszú távon nem elképzelhetetlen.
5.3.1.2 Southern-blot analízis
Az ama1 gén jelenlétét a búza genomjában nem csak PCR reakcióval, hanem Southern-
hibridizációval is ellenıriztük. A sikeres beépülést, valamint az integrálódás mintázatát két
független transzgénikus Cadenza vonal (#28 és #58) több PCR pozitív T1 utódjában
vizsgáltuk. Negatív kontrollként a transzgénikus #28 vonal egyik PCR negatív utódvonalát
(transzgénikus null minta) használtuk. A növények levélszövetébıl CTAB módszerrel kinyert
genomi DNS EcoRI restrikciós enzimmel emésztett elegyét agaróz gélen elválasztottuk,
Nylon membránra transzferáltuk, majd a membránon lévı DNS-t DIG jelölt próbával
hibridizáltuk. Kemiluminszcens detektálás után megállapítottuk, hogy a #28 vonal utódjaiban
egy, míg az #58 vonal utódjaiban három (plusz egy hosszabb és egy rövidebb) hibridizálódó
DNS szakasz mutatható ki. A belsı kontrollként használt PCR negatív utódvonalban
(transzgénikus null #28 vonal) az elvárásoknak megfelelıen hibridizálódó sávot nem
detektáltunk (5.4 ábra).
74
5.4 ábra Transzgénikus Cadenza T1 növények Southern-blot analízise az ama1 génre. 1: a molekulatömeg standard (Promega, 1kb ladder) 1000bp mérető sávja, 2: negatív kontroll (a transzgénikus #28 vonal PCR negatív utódvonala), 3-6: a transzgénikus #28 vonal négy PCR pozitív utódvonala, 7: plazmid kontroll (a linearizált plazmid mérete ~6,4 kb), 8 és 9: a transzgénikus #58 vonal két PCR pozitív utódvonala. A nyilak a búza genomjába integrálódott, a próbával hibridizálódó DNS fragmenteket jelzik.
A vizsgálattal nem csak azt bizonyítottuk, hogy az ama1 gén stabilan integrálódott a búza
genetikai állományába, hanem a Southern-blot eltérı mintázata azt is jelzi, hogy a két
transzgénikus búzavonal biztosan két egymástól független transzformációs eseménybıl
származik. A hibridizálódott sávok száma jelzésértékő az integrálódó fragmentek számát
illetıen. A Cadenza búzafajta transzgénikus #28 vonalának Southern-blot elemzésekor
detektált egy sáv mérete megfelel a transzformációs kazetta restrikciós enzimmel történı
emésztése után kapott DNS molekula relatív mobilitásának. Ez azt jelzi, hogy az integrálódás
során a plazmid nem rövidült meg. Ezzel szemben az #58 vonalban a transzformáció során a
DNS kazetta nem csak teljes mérető integrálódása történt meg, hanem vagy beépülés közben
megrövidült a kazetta, vagy a beépülés után átrendezıdés történt, melyet a Southern-blot két
extra hibridizációt mutató sávja valószínősít. A legrövidebb (~1000bp) fragment mérete (5.4
ábra) megfelel az ama1 gén hosszának, azaz a transzformációs kazetta valószínőleg
elveszítette a promóter és a vektor részét. Ilyen jelenségrıl már korábban is beszámoltak búza
és rizs biolisztikus, valamint agrobaktérium közvetítette transzformációja során egyaránt (Fu
és mtsai., 2000; Wu és mtsai., 2006; Zhao és mtsai., 2007).
A transzgénikus növényeket és a biolisztikus transzformáción átesett, de nem transzgénikus
növényeket a donor növényektıl elkülönítve, kontrollált körülmények között neveltük fel.
75
5.3.2 Az AmA1 fehérje expresszió bizonyítása
A transzgén transzkripció ját a transzgénikus búzanövények éretlen T1 szemtermései
endospermiumából tisztított mRNS-en végzett RT-PCR reakcióval vizsgáltuk. A hosszában
félbevágott 20 napos éretlen szemek elemzésével minden, ama1 génre PCR pozitív növény
fejlıdı endospermiumában kimutatható volt az mRNS jelenléte is. Transzgénikus
vonalanként változó szintő transzkripciót detektáltunk (5.5 ábra), bár ez a szemi-kvantitatív
módszer nem a legmegfelelıbb a transzkripció mennyiségi viszonyainak jellemzésére,
összehasonlítására.
5.5 ábra Az ama1 transzgén transzkripciójának igazolása RT-PCR reakcióval. dw: desztilláltvíz, M: molekulatömeg standard, pl: plazmid pozitív, #28, #31, #58, #59, #80, #83: a T0 transzgénikus vonalak számjelzései, #49: a biolisztikus transzformáción átesett, de nem transzgénikus (PCR negatív) növény számjelzése.
A munkánkban használt búza endosperm specifikus promóter (1Bx17 HMW-GS)
szövetspecifitását transzkripciós szinten is igazoltuk. A levélbıl és gyökérbıl tisztított
mRNS-rıl átírt cDNS mintákon a PCR reakció negatív volt, míg a tubulin fehérje génjének
(pozitív kontroll) transzkripcióját mindkettıben ki tudtuk mutatni. Az endospermium
specifikus promóter az ama1 gén transzkripcióját csak az endospermiumban teszi lehetıvé.
Eredményeink összhangban vannak a korábban mások által (Jones és mtsai., 2005) és saját
munkánk során is tapasztaltakkal (Oszvald és mtsai., 2007), miszerint búza endosperm
specifikus promóterrel szabályozott idegen eredető gének is csak a búza endospermiumban
expresszálódnak.
Az ama1 gén transzkripciója idıbeli változását a Cadenza #28 transzgénikus vonal három T2
növényének éretlen szemtermésében követtük nyomon. Az éretlen endospermiumokból
virágzás után 10, 17, 24 és 31 nappal teljes RNS-t izoláltunk és a mintákban qRT-PCR
módszerrel tanulmányoztuk az mRNS mennyiségét. A reakcióelegyben lévı SybrGreen
76
floureszcenciájának mérésével kimutattuk, hogy az ama1 génrıl átíródott mRNS már a 10
napos mintákban is jelentıs mennyiségben jelen van. A telítési jellegő görbe elemzésével
megállapítottuk, hogy mennyisége kb. a huszadik napig tovább nıtt, majd nagyon lassú
csökkenés indult el (5.6 ábra).
0,0000
0,0001
0,0010
0,0100
0,1000
1,0000
10,0000
0 5 10 15 20 25 30 35
Virágzást követ ı napok száma
ama1
mR
NS
rel
atív
men
nyis
ége
T3 mag 28-3-13
T3 mag 28-3-22
T3 mag 28-3-2
5.6 ábra Az ama1 transzgén transzkripciójának mennyiségi elemzése qRT-PCR reakcióval. Az ama1 mRNS mennyiségét a tubulin fehérje mRNS-ének mennyiségéhez viszonyítottuk. A vizsgálatot három T2 növény (T228-3-2, T228-3-13, T228-3-22) éretlen szemtermésével végeztük.
Minden mintát és a kontrollt is öt ismétlésben elemeztünk. A PCR reakció után felvett
olvadási görbék minden esetben egy csúcsot tartalmaztak, ami a reakciókörülmények (reakció
vannak a korábban publikált adatokkal (Grimwade és mtsai. (1996), ami szerint a búza
endospermiumban a tartalékfehérje gének transzkripciója már 10 nappal a virágzás után
megindul, és az mRNS termelıdése, ami a 21-ik nap körül éri el a maximumát, majd lassú
csökkenést mutat a szemtermés fejlıdésének késıi szakaszáig.
Az AmA1 fehérje búza szemtermésben történı expresszióját a félbevágott éretlen (20
DPA) T1 szemek másik felébıl kinyert fehérje Western-blot analízisével bizonyítottuk. A
Western-blot analízist arra is felhasználtuk, hogy ellenırizzük az ama1 gén transzlációjának
idıbeli korrekt lejátszódását. Ehhez a legjobban expresszáló Bobwhite #15 és Cadenza #28
vonalak egy-egy T1 növényének éretlen T2 szemtermésébıl nyertünk ki fehérjét a virágzás
után 17, 24 és 31 nappal. Az elválasztást követıen már az SDS-PAGE gélen egy új fehérje
sávot figyeltünk meg a kontrollként használt búzafehérje extraktum mintázatához képest. Az
új sáv mérete alapján a detektált fehérje molekulatömege 35 kDa (5.7.a. ábra), és a sáv
intenzitása a virágzás után eltelt idıvel egyre erısödött. A Western-blot analízis (5.7.b. ábra)
bizonyította, hogy ez az extra sáv az AmA1 fehérjének felel meg.
77
5.7 ábra Transzgénikus Cadenza növény (#28-4 vonal) SDS-PAGE és Western-blot elemzése. (a) A virágzás után 17, 24 és 31 nappal begyőjtött éretlen szemtermésbıl kinyert albumin fehérjefrakció SDS-PAGE vizsgálata. (b) Ugyanabból az éretlen szemtermésbıl extrahált fehérje Western-blot elemzése. A nem specifikus kötıdéső sáv a búza albumin fehérjének felel meg, mely az érés során változatlan mennyiségben expresszálódik. AmA1: az amarantusz magból extrahált vízoldható albumin fehérje, C: a donor (nem transzformált) növénybıl nyert búza endospermium fehérje. A nyilak mindkét ábrán a 35 kDa mérető AmA1 fehérjét (rekombináns fehérje) mutatják.
Az 5.7 ábrán jól látható, hogy a transzgénikus növények szemtermésében termelıdött extra
fehérje (rekombináns fehérje) az endospermium szövetekben növekvı mennyiségben
akkumulálódott a szemtermés fejlıdésének elırehaladtával. Eredményeink jól egyeznek
korábban publikált megfigyelésekkel, miszerint a búza tartalékfehérjék expressziója már 14
nappal virágzás után kimutatható az endospermiumban és szintézisük fokozódó intenzitással
folyik a szemtermés fejlıdésének késıi szakaszáig (Gupta és mtsai., 1996).
5.3.3 Transzgénikus lisztminták elıállítása, fehérje- és aminosav összetétele
5.3.3.1 A szemtermések fizikai vizsgálata
A T2 szemtermés fizikai vizsgálataihoz a herbicid rezisztencia tesztet (PPT permetezés) túlélt
T1 növények szemtermését használtuk (lásd 5.4 táblázat). Az Mv Emese fajta #71 vonalának
utódjait nem vizsgáltuk, mert a búzaszemek nagyon aprók voltak (ezerszem tömeg 20 g, míg
a donor- és T0 növényé 42-45 g), s véleményünk szerint ez irreális eredményeket adott volna
a továbbiakban. A többi transzgénikus vonal (Bobwhite #15, Cadenza #28, #58, #59, #80 és
#83) esetében, mivel a markergén és az ama1 transzgén a T1 generációban együtt öröklıdtek,
az egyes vonalak T1 növényeinek szemtermését (90%-át) egyesítettük, hogy egy-egy vonalból
a vizsgálatokhoz elegendı mennyiség álljon rendelkezésre. Annak ellenére, hogy nem
78
jellemeztük teljesen a szemeket, a szemtermést egységes mintaként kezeltük, ahogyan ezt
korábban mások is tették transzgénikus búzavonalak T2 szemtermésének vizsgálatakor (Rooke
és mtsai., 1999). A transzgénikus vonalanként termett 260-300 búzaszembıl Perten SKCS
4100 készülékkel mért szemátmérı, ezerszem tömeg és szemkeménység értékeket az 5.5
táblázat tartalmazza. A szemtermés korlátozott mennyisége miatt a lisztmintákat a
szemkeménység mérés után kapott töret ırlésével mikro-szitán megszitálva állítottuk elı. A
vonalankénti 2,5-3,5 g lisztet (lisztkihozatal értékek az 5.5 táblázatban) a késıbbiekben
fehérje és funkcionális oldalról is vizsgáltuk.
A T3 szemtermést minden transzgénikus búzavonal (Bobwhite #15, Cadenza #28, #58, #59,
#80, #83) 3-4 független utódvonala 12 magjából kicsírázott T2 növények felnevelésével
nyertük (28-50 g szem) (lásd 5.4 táblázat). Találtunk négy Cadenza T1 vonalat (T128-6, T128-
12, T159-16, T180-16), melyek 12 magját elvetve a felnevelt növények mindegyike hordozta a
transzgént (tiszta T2 vonalak). A T4 szemtermést a T2-28-1-1 növény 12 magjából felnevelt
növények (tiszta T3 vonalak) termése adta. A fizikai paramétereket a Perten SKCS 4100
készülékkel 400-800 búzaszemen vizsgáltuk. A lisztet a töretbıl és teljes szemekbıl ıröltük,
majd szitáltuk. A mérési eredményeket két kontrollhoz viszonyítottuk, a nem transzformált,
úgynevezett donor növény, és a PCR negatív T2 növények, úgynevezett null transzgénikus
(null segregant) növények, szemtermésének adataihoz. A mért értékeket az 5.6 táblázatban
foglaljuk össze.
5.5 táblázat Transzgénikus búzák T2 szemtermésének fizikai jellemzıi és lisztkihozatala.
A különbözı transzgénikus búzavonalak lisztmintáinak esszenciális aminosav összetételét
Adebowale és mtsai. (2007) módszerével határoztuk meg. A T2 szemtermésbıl ırölt összes
lisztmintára vonatkozó eredményeket a Függelék III. számú táblázatában adjuk meg. A
táblázatban látható, hogy az egyes aminosavak tartalmában 0-6,4% növekedés mutatható ki a
kontroll lisztminta értékeihez képest. A legmagasabb AmA1 fehérjetartalmú (2,41%)
transzgénikus búza (Cadenza #28 vonal) lisztjének mért értékeit az 5.9 táblázatban is
bemutatjuk. Ebben a lisztmintában a legnagyobb változást (6,4% növekedés) a lizin aminosav
mennyiségében találtuk a donor növény (negatív kontroll) lisztminták lizin tartalmához
képest. A tirozin aminosav mennyisége 3,8%-kal, a treonin aminosavé 3,1%-kal nıtt, a
kontroll minták megfelelı aminosavainak értékeihez képest. A metionin aminosav
mennyiségében nem mérhetı változás ezzel a módszerrel.
83
5.9 táblázat A legmagasabb AmA1 fehérjetartalmú (2,41 %) transzgénikus Cadenza #28 vonal T2 szemtermésébıl nyert lisztminta esszenciális aminosav összetétele.
aminosav tartalom (%) aminosav
Cadenza (donor) Cadenza (null) transzgénikus #28 vonal His 2,26 2,20 2,28 (0,9) Ile 3,38 3,33 3,46 (2,4) Leu 6,53 6,45 6,58 (0,8) Lys 2,19 2,18 2,33 (6,4) Met 1,32 1,32 1,32 (0,0) Phe 5,03 4,98 5,08 (1,0) Thr 2,53 2,51 2,61 (3,1) Tyr 2,61 2,57 2,71 (3,8) Val 4,28 4,26 4,34 (1,4)
Az értékek három párhuzamos mérés átlagai. A standard error ±0,01. Zárójelben a nem transzformált búzanövény lisztjében mért aminosav tartalomhoz viszonyított növekedést adtuk meg %-ban.
A legmagasabb AmA1 fehérjetartalommal rendelkezı ’tiszta’ búzavonalak (Cadenza #28,
#59, #80 utódai) T3 és T4 termésébıl ırölt lisztminták esszenciális aminosav tartalma az 5.10
táblázatban látható.
5.10 táblázat Transzgénikus búzák T3 és T4 szemtermésébıl nyert lisztminták esszenciális aminosav összetétele.
Az értékek három párhuzamos mérés átlagai. A standard error ±0,01. Zárójelben a nem transzformált búzanövény lisztjében mért aminosav tartalomhoz viszonyított növekedést adtuk meg %-ban.
Az egyes aminosavak tartalmában figyelemreméltó növekedést mutattunk ki a kontrollhoz
lisztmintákhoz képest. A legnagyobb változást (7,3% növekedés) a lizin aminosav
mennyiségében mértük a transzgénikus búza (Cadenza #28 vonal) ‘tiszta’ T3 növényei
szemtermésébıl ırölt T4 lisztben, mindkét negatív kontroll lisztminta lizin aminosav
tartalmához képest. A másik két transzgénikus búzavonal (#59 és #80) T3 lisztjében is a lizin
84
aminosav mennyisége változott a legnagyobb mértékben (6,4% és 6,0%), míg a tirozin
mennyiségében 3,8-4,2%, a treonin mennyiségében 2,8-3,1% növekedést mértünk.
Eredményeink alapján megállapíthatjuk, hogy az AmA1 fehérjét legnagyobb mennyiségben
(2,57%, 2,45% és 2,27%) termelı transzgénikus Cadenza búza #28, #59 és #80 ’tiszta’
vonalainak lisztjében a rekombináns fehérjetartalom növekedése szoros összefüggést mutat a
lisztminta esszenciális aminosav tartalom növekedésével. Az adatok alapján feltételezzük,
hogy ez az aminosav tartalom változás a transzgénikus búza szemtermésének
endospermiumában expresszálódó AmA1 fehérjének köszönhetı. Irodalmi adatok szerint
(Chakraborty és mtsai., 2000) ennek a fehérjének burgonya gumóban történı expresszáltatása
magas fehérjetartalom növekedés (35-45%) mellett azzal arányos, jelentıs mértékő esszen-
ciális aminosav tartalom növekedést is eredményezett (a lizin mennyisége ötszörösére, a
cisztein, metionin és tirozin aminosavak mennyisége hétszeresére nıtt a nem transzformált
növényben mért adatokhoz képest).
Rascón-Cruz és mtsai. (2004) transzgénikus kukoricában az Amaranthus hypochondriacus
11S globulin fehérjéjét (amarantin) expresszáltatták rizs glutelin-1 promótere segítségével. A
magas fehérjetartalom növekedéssel (6-32%) az esszenciális aminosav tartalom arányosan
nıtt (lizin 18%-kal, triptofán 22%-kal) a vadtipusú kukoricáéhoz képest (0,34% és 0,09%
teljes ırleményben).
Eredményeink azért biztatóak, mert a búza különösen e három (Lys, Thr, Tyr) esszenciális
aminosavban szegény. Az általunk mért, az irodalomban publikált adatokhoz képest
(Chakraborty és mtsai., 2000; Rascón-Cruz és mtsai., 2004) kisebb mértékő aminosav
tartalom növekedés, ahogyan a kisebb mértékő idegen fehérje koncentráció is, a transzgén
alacsonyabb kópia számával, valamint a búza endospermium jóval magasabb fehérje- és
esszenciális aminosav tartalmával magyarázható. Ha azonban figyelembe vesszük, hogy
Barro és mtsai. (1997) képesek voltak olyan transzgénikus búzát elıállítani, mely a
géntechnológiai úton bejuttatott 1Dx5 HMW-GS tartalékfehérje gént több kópiában (10-15),
több generáción át stabilan öröklıdve hordozza és magas szinten (4-6-szoros a vadtípushoz
képest) termeli, úgy tőnik technikailag lehetséges olyan magas Ama1 fehérjetartalmú búzát is
elıállítani, mely jelentısen megemelkedett szintő táplálkozástani értéket képvisel (akár 30-
35%-os esszenciális aminosav tartalom növekedés).
85
5.3.4 A transzgénikus búza lisztminták HPLC analízise
A transzgénikus búzanövények T2, T3 és T4 szemtermésébıl nyert búzalisztben nem csak a
fehérjetartalmat (teljes- és AmA1 fehérje), valamint aminosav tartalmat határoztuk meg,
hanem HPLC kromatográfiás módszerekkel vizsgáltuk és jellemeztük a transzgénikus búzák
tartalékfehérje összetételét is. Az SE- és RP-HPLC módszerek alkalmasak arra, hogy
tanulmányozzuk a lisztben megjelenı AmA1 rekombináns fehérje hatását a liszt funkcionális
tulajdonságaira, valamint hogy elıre jelezzük a tészta minıségében esetleg bekövetkezı
változásokat.
5.3.4.1 SE-HPLC vizsgálatok
A lisztmintákban a polimer (glutenin) és monomer (gliadin) fehérjék arányát (számított
Glu/Gli arány) az SE-HPLC kromatogramm adataiból, Batey és mtsai. (1991) módosított
módszerét követve határoztuk meg. A vizsgálatokhoz a transzgénikus vonalakból, valamint a
kontroll búzák lisztjébıl teljes-, oldható- és oldhatatlan fehérje frakciókat extraháltunk, majd
elemeztük azokat három ismétlésben. A herbicid rezisztencia tesztet túlélt transzgénikus
növények T2 szemtermésébıl nyert lisztmintákban a glutenin és gliadin fehérjék egymáshoz
viszonyított mennyisége 0,958 és 1,224 között változott (számított Glu/Gli arány, 5.11
táblázat).
5.11 táblázat Transzgénikus búzák T2 szemtermésébıl nyert lisztminták HPLC analízise.
UPP%: oldhatatlan polimer fehérje frakció relatív mennyisége, HMW/LMW arány: nagy molekulatömegő- és kis molekulatömegő glutenin alegységfehérjék egymáshoz viszonyított mennyisége a polimer frakcióban. Egy oszlopon belül a csillaggal jelzett középértékek szignifikánsan különböznek egymástól 5% szignifikancia szinten.
Négy transzgénikus Cadenza vonal (#28, #59, #80 és #83) Glu/Gli aránya szignifikánsan nıtt
mindkét kontroll értékéhez képest (1,110 és 1,112). A donor növény lisztjének elemzési
adataiból számolt Glu/Gli arányt száz egységnek véve, az eltérések 5,5-10,1% között voltak.
86
A glutenin és gliadin fehérjék egymáshoz viszonyított mennyisége a Bobwhite #15 vonal
lisztjében szignifikánsan nem különbözött a kontrollhoz képest.
Az oldhatatlan polimer fehérje frakció relatív mennyiségének (UPP%) meghatározásához egy
széles körben elterjedt módszert alkalmaztunk (Gupta és MacRitchie, 1994). A polimer
fehérjék méreteloszlásának jellemzésére használt UPP% értéket a Cadenza donor növény
értékéhez viszonyítva adjuk meg. Azt 100 egységnek véve, a transzgénikus vonalak
lisztmintáinak UPP% értéke 4,4-9,9%-kal nıtt, ami a transzgénikus vonalak lisztmintáiban
(egy kivétellel) szignifikáns eltérést mutatott a kontroll minták értékeihez képest (5.11
táblázat). Szignifikáns pozitív változást három Cadenza vonal esetében kaptunk (#28, #80,
#83). A transzgénikus Bobwhite vonal (T2-15 minta) UPP% értéke jelentısen magasabb volt
(+9,9%), mint a kontrollé.
A T3 és T4 transzgénikus szemtermésbıl ırölt lisztminták Glu/Gli aránya 0,582 és 0,756
között változott (5.12 táblázat). Három transzgénikus búzavonal (Cadenza T4-28-1-1-tiszta,
T3-59-tiszta, T3-80-tiszta) Glu/Gli értéke szignifikáns pozitív változást mutatott mindkét
kontroll búzaliszthez képest, míg a #58 vonal lisztmintájában (Cadenza T3-58) szignifikánsan
alacsonyabb értéket kaptunk. A transzgénikus pozitív és negatív Bobwhite búzafajta
lisztjének Glu/Gli értékei nem tértek el egymástól.
5.12 táblázat Transzgénikus búzák T3 és T4 szemtermésébıl nyert lisztminták HPLC analízise.
UPP%: oldhatatlan polimer fehérje frakció relatív mennyisége. Egy oszlopon belül a csillaggal jelzett középértékek szignifikánsan különböznek egymástól 5% szignifikancia szinten.
A transzgénikus búzavonalak T3 szemtermésébıl nyert lisztminták UPP% értéke 1,3-14,8 %-
kal nıtt a kontrollhoz képest (5.12 táblázat), míg a T3-58 mintában csökkenést tapasztaltunk
(mínusz 6,3%), ami szignifikáns eltérést jelent. Szignifikáns pozitív változást a T3
87
szemtermések lisztjében csak egy esetben (T3-59-tiszta, 14,8%) mértünk, de a T4-28-1-1-tiszta
lisztmintában is nıtt (13,6%) az oldhatatlan polimer fehérjék aránya. A transzgénikus
Bobwhite búzafajta ezen paramétere sem mutatott változást az AmA1 fehérje expressziójának
hatására.
Vizsgálatainkban a Cadenza búzafajta egyik transzgénikus vonala (#58) rendre eltérı módon
viselkedett a többi transzgénikus vonal lisztmintáitól a funkcionális tulajdonságokat vizsgáló
SE-HPLC analízisek során. A T2-58 és T3-58 transzgénikus lisztmintákban lévı
tartalékfehérjék Glu/Gli arányát és UPP% értékét egyaránt szignifikánsan alacsonyabbnak
találtuk a kontrollhoz képest. A szignifikánsan negatív eltérések a kontrolltól valószínőleg a
transzformáció során bekövetkezı nem kívánatos változások következményei, mely eredhet
magából a transzformáció eljárásából, de okozhatja a transzgén hibás integrációja vagy
kromoszóma átrendezıdés is (Rooke és mtsai., 2003; Shewry és Jones, 2005). Mindezek
kiszámíthatatlan agronómiai tulajdonságbeli (Svitashev és mtsai., 2002; Barro és mtsai.,
2003) vagy funkcionális tulajdonságbeli változásokhoz vezethetnek (Blechl és mtsai., 1998;
és Békés Ferenc személyes közleménye).
Ugyanakkor a transzgénikus Cadenza búza #28-as vonal utódainak szemtermésébıl készült
lisztminták Glu/Gli arányát és UPP% értékeit mind a három generációban szignifikánsan
magasabbnak találtuk a kontrollok értékeihez képest. Ezek a megemelkedett értékek, irodalmi
adatok szerint, hozzájárulnak a búzalisztbıl készült tészták dagasztási reológiai és
tulajdonságainak javulásához (Uthayakumaran és mtsai., 1999; 2001). Munkájuk során
összehasonlítottak különbözı Glu/Gli értékekkel rendelkezı búzaliszteket és kimutatták, hogy
a lisztben mérhetı polimer/monomer fehérje arány pozitívan korrelált a tészta reológiai,
dagasztási és kenyérsütési paramétereivel. A búzaliszt másik fontos, a végtermék minıségét
(end-use quality) befolyásoló paramétere a lisztben lévı polimer fehérjék méreteloszlása,
melyet az UPP% értékkel jellemezhetünk. Irodalmi adatok szerint szoros összefüggés van a
polimerek méreteloszlása és a különbözı búzafajták kenyérsütési (pl. cipó magasság és cipó
térfogat) tulajdonságai között (Gupta és mtsai., 1995).
Nem csak különbözı vad típusú búzafajták lisztjeiben vizsgálták a Glu/Gli, továbbá az UPP%
értékek és a liszt funkcionális tulajdonságainak kapcsolatát, hanem búza HMW glutenin
alegységfehérje génekkel transzformált transzgénikus búzavonalakban is. A transzgénikus
liszt funkcionális tulajdonságainak változása erıs korrelációt mutat a két érték
megnövekedésével (Rooke és mtsai., 1999; Uthayakumaran és mtsai., 2003; Rakszegi és
mtsai., 2005; León, és mtsai., 2009). Az 1Dx5 HMW alegységfehérje expressziója a
transzgénikus búzában olyan mértékben megváltoztatta a Glu/Gli és az UPP% értékét a
88
lisztben, hogy a kenyértészta túlzottan erıssé vált, a bevált módon mikro-készülékben nem
volt dagasztható (Barro és mtsai., 1997). Az LMW glutenin alegységfehérjék expressziója
transzgénikus búzában szintén megváltoztatta a polimer monomer fehérjék arányát és az
UPP% értékét, mivel képesek beépülni a sikér fehérje mátrixába, de kevésbé drasztikusan
növelték a polimer fehérjék méreteloszlását. Emiatt hatásuk kevésbé erıteljes a liszt
funkcionális tulajdonságaira, a tészta egyes dagasztási paramétereire (Masci és mtsai., 2003;
Tosi és mtsai., 2005).
Az általunk vizsgált transzgénikus búzavonalak lisztjében a szignifikánsan magasabb Glu/Gli
és UPP% értékek az amarantusz albumin fehérje pozitív hatását jelzik a búzaliszt funkcionális
tulajdonságaira.
5.3.4.2 RP-HPLC vizsgálatok
A liszt minıségét még a HMW/LMW arány változása is befolyásolhatja (Gupta és mtsai.,
1989, 1995), ezért ezt az arányt is megmértük a transzgénikus lisztmintákban. A polimer
frakción belül a HMW- és LMW glutenin alegységfehérjék egymáshoz viszonyított
mennyiségét RP-HPLC módszerrel határoztuk meg. A vizsgálatokhoz Marchylo és mtsai.
(1989) módosított eljárását használtuk. A transzgénikus és kontroll búzanövények T2
szemtermésébıl nyert lisztminták kromatogrammjainak görbe alatti területeibıl HMW/LMW
arányt számoltunk. Az adatok az 5.11 táblázatban láthatók (5.3.4.1 fejezet). A transzgénikus
Cadenza búzafajták lisztjének HMW/LMW aránya 0,436 és 0,518 között változott. A számolt
értékek egyike sem mutatott szignifikáns eltérést a kontroll növények adataihoz képest. A
transzgénikus Bobwhite búzafajta HMW/LMW aránya sem mutatott szignifikáns eltérést a
kontroll növényben mért értékhez képest. Eredményeink azt jelzik, hogy a pszeudo cereália
albumin fehérjéjének expressziója a búza endospermiumában nem befolyásolja a búzaliszt
ezen paraméterét, azaz nem változtatja meg sem a nagy-, sem a kismolekulatömegő glutenin
fehérjealegységek expressziós szintjét. Mivel a T2 szemtermésbıl nyert lisztminták
HMW/LMW arányában nem tapasztaltunk változást a transzgénikus lisztmintákban, ezt a
paramétert a T3 és T4 transzgénikus szemtermésbıl ırölt lisztmintákban nem vizsgáltuk.
5.3.5 A transzgénikus búzavonalak lisztjének funkcionális vizsgálatai
A búzafajták kenyérminıségét meghatározó módszerek alapvetıen két típusba sorolhatók. Az
úgynevezett közvetett módszerek valamilyen, a tészta minıségével szoros összefüggésben
álló fizikai tulajdonságot határoznak meg, mint pl. az ülepedési képesség – szedimentációs
érték. Az úgynevezett közvetlen módszerek a tészta reológiai tulajdonságairól (erısség,
89
stabilitás, nyújthatóság) adnak információt. A fajta nemesítés kezdeti szakaszában, a genetikai
módosítás lehetıségeinek tanulmányozásakor és a változások molekuláris szinten történı
magyarázatához szükséges vizsgálatokban a rendelkezésre álló minta mennyisége korlátozott.
A hagyományos mőszerek analógiájára készült, ún. mikro-készülékekkel és mikro-
módszerekkel már néhány grammnyi liszt minıségi paramétereit, illetve a paraméterek
néhány mg tisztított fehérje adagolása hatására bekövetkezı változásait vizsgálhatjuk (Békés
és mtsai., 2003).
5.3.5.1 Lisztminták Zeleny szedimentációs tesztje
Munkánkban a Zeleny szedimentációs teszt (AACC Method 56-61A) kis mintamennyiségek
vizsgálatára alkalmas változatát használtuk (mikro Zeleny teszt) és a Tömösközi és mtsai.
(2005) által leírt módszert követtük. A transzgénikus búzavonalak szemtermésébıl ırölt
lisztminták vizsgálati eredményeit az 5.13 táblázatban mutatjuk be.
5.13 táblázat Transzgénikus búzák T2 , T3 és T4 szemtermésébıl nyert lisztminták szedimentációs vizsgálata.
A reológiai sajátságok mérése a lisztbıl víz hozzáadásával készült tészta dagasztási
paramétereinek meghatározásával történik. Annak tanulmányozására, hogy a transzgénikus
búzában expresszáltatott albumin típusú fehérje milyen hatással van a lisztbıl készített tészta
dagasztási paramétereire, nagyobb mennyiségő búzaliszttel kell rendelkezni. Így a dagasztási
kísérletekhez azokat a T3 és T4 szemtermésbıl ırölt lisztmintákat használtuk, melyek legalább
15-18 g mennyiségben álltak rendelkezésünkre (Bobwhite T3-15 és 7 db transzgénikus
Cadenza búzavonal lisztmintái). A mérést mikro-Valorigráf (mikro z-arm mixer) prototípusán
91
végeztük úgy, ahogyan azt a szerzık leírták (Tömösközi és mtsai., 2000; Haraszi és mtsai.,
2004). Egy a készülékkel felvett tipikus alapgörbét és a belıle leolvasható paramétereket az
5.8 ábrán mutatjuk be.
5.8 ábra A mikro z-arm mixerrel felvett alapgörbe. DDT: a maximális tésztaellenállásig eltelt idı (Dough Development Time, s). PR: maximális tésztaellenállás (Peak Resistance, VU). ST: stabilitás, az a hossz, mely a PR elıtti és utáni görbeelhajlásig tart (Stability, s). BD: tésztaellágyulás, a PR utáni 10 perces görbeszakasz és a maximumhoz húzott egyenes közötti területérték (Break Down in Resistance, VU x s).
A transzgénikus búzavonalak lisztmintáival elvégzett dagasztási kísérletek eredményeit az
5.14 táblázatban foglaltuk össze.
A Bobwhite transzgénikus búzavonal T3-15 szemtermése lisztmintájából készített tészta
dagasztási idıszükséglete (DDT), dagasztással szembeni maximális ellenállása (PR) és tészta
ellágyulási értéke (BD) nem különbözött szignifikánsan a Bobwhite null transzgénikus
kontroll értékétıl. Ugyanakkor a tészta stabilitása szignifikánsan magasabb volt (1,4 perc),
mint a kontrollé (1,1 perc).
DDT
92
5.14 táblázat Transzgénikus búzák T3 és T4 szemtermésébıl nyert lisztminták dagasztási paraméterei.
Az értékek 2 párhuzamos mérés átlagai. Egy oszlopon belül a csillaggal jelzett középértékek szignifikánsan különböznek egymástól 10% szignifikancia szinten.
A Cadenza transzgénikus búzák lisztmintáin mért dagasztási idık 3,24 és 4,22 perc között
változtak. A vizsgált hét Cadenza lisztminta közül két minta (T3-28-12-tiszta, T4-28-1-1-
tiszta) dagasztási idı szükséglete szignifikánsan magasabb (10% szignifikancia szinten), a T3-
59-tiszta mintáé szignifikánsan alacsonyabb volt, mint a kontrollok értékei (3,52 és 3,58
perc). Ez utóbbi azért érdekes, mert tésztájának maximális ellenállása a második legmagasabb
érték volt (531 VU) és stabilitása is szignifikánsan nagyobb volt (1,1 perc), mint a
kontrolloké. A dagasztással szembeni maximális ellenállás értékei (PR) 433 és 583 VU között
változtak. A tésztaminták dagasztással szembeni ellenállása szignifikánsan nıtt, azaz a tészta
erısebb volt, a Cadenza #28 transzgénikus vonal, három úgynevezett ’tiszta’ utódvonalainak
szemtermésébıl nyert lisztmintákból készült tészták esetén. Közülük is a legmagasabb PR
értéket a T4 szemtermés lisztjébıl készült tészta mutatta (583 VU). A vizsgált lisztminták
mindegyike egy kivétellel (T3-58) jelentısen stabilabb tésztát adott (ST 1,1-1,4 perc), mint a
kontrollok.
A transzgénikus Cadenza T3-58 szemtermés lisztjébıl készült tészta egyetlen egy dagasztási
paramétere sem különbözött a kontrollétól. A dagasztási kísérletekben ugyanúgy eltérı
viselkedést mutatott, mint azt az SE-HPLC és a Zeleny szedimentációs vizsgálatokban
tapasztaltuk. Feltételezzük, hogy a többi transzgénikus vonaltól eltérı viselkedés oka a
transzformáció során lejátszódott folyamatokban keresendı. Fontos megjegyezni, hogy az 58-
as vonal Southern blot analízisének képe eltért a 28-as vonal képétıl.
93
A legjobb paraméterekkel jellemezhetı tésztát a T4-28-1-1-tiszta lisztmintából dagasztottuk,
melynek három mért paramétere szignifikánsan eltért a kontrollokéitól. A T4-28-1-1-tiszta
lisztmintából és a kontrollból mikro-Valorigráffal dagasztott tészta dagasztási görbéit az 5.9
ábrán mutatjuk be. Az ábrán látható görbék lefutása hasonló, de a transzgénikus mintán mért
jelentısen nagyobb maximális ellenállás és a stabilitás értékek erısebb (rugalmasabb és
stabilabb) tészta kialakulását igazolják. A T4-28-1-1 mintából kapott lisztnek a dagasztás
során mért, az erısségre vonatkozó paraméterei, az összes vizsgált minta közül a
legmagasabbak (PR, 583 VU; DDT, 4,22 perc). Ugyanakkor jelentısen javult a tészta
stabilitása, melyet az ST érték növekedése (1,4 perc) és a tészta ellágyulási értéke (BD)
csökkenése (89 VU x s) jelez. Irodalmi adatok szerint a tészta erısség javulását a dagasztási
idıszükséglet (DDT) és az úgynevezett maximális dagasztási ellenállás (PR) növekedése jelzi
(Békés és mtsai., 1994b). Hasonlóan jó dagasztási paramétereket mértünk a T3-28-6-tiszta
lisztmintából készült tésztán is, melynek stabilitás értéke a legmagasabb (1,6 perc),
ellágyulási értéke a legkisebb (62 VU x s) és PR értéke is szignifikánsan magasabb (433 VU)
volt a kontrollénál. A dagasztási idıszükséglet (3,59 perc) nem különbözött a kontrollétól.
5.9 ábra A transzgénikus T4-28-1-1-tiszta lisztmintából és a Cadenza kontrollból mikro-Valorigráffal dagasztott tészta alapgörbéi.
Irodalmi adatokból jól ismert, hogy az amarantuszok tartalékfehérjéi pozitív hatással vannak a
búzalisztbıl készült tészta funkcionális tulajdonságaira mind egyszerő addíció után (Ayo,
2001; Silva-Sanchez és mtsai., 2004) mind inkorporálva azokat a búzaliszt fehérje mátrixába
(Oszvald és mtsai., 2009). A búzalisztben lévı fehérjék szabad SH csoportjaikon keresztül
képesek diszulfid hidakat (S-S kötés) létrehozni, melynek eredményeképpen javul a
búzatészta erıssége, rugalmassága (Tamas és mtsai., 2002). Az S-S kötések létrejöttének
hatását a búzaliszt tulajdonságaira egyrészt a polimer/monomer (Glu/Gli) fehérjék arányának
mérésével (SE-HPLC technika, 5.3.4 fejezet), dagasztási kísérletekkel (mint fent), valamint a
94
lisztminták dagasztása során kapott tészták fehérje összetételének elemzésével (SE-HPLC,
mint alább) követhetjük nyomon.
A tésztamintákat, melyek dagasztását a maximális ellenállás elérésekor abbahagytuk,
fagyasztva szárítottuk, majd a korábban leírt módon kinyert három fehérje frakció összetételét
SE-HPLC módszerrel elemeztük. A görbe alatti területekbıl számolt Glu/Gli arány értékeket
és a normalizált (a Cadenza donor növény lisztjének tésztájára vonatkoztatott) UPP%
értékeket az 5.15 táblázatban mutatjuk be. Eredményeink szerint a transzgénikus Bobwhite
búzafajta T3-15 lisztjébıl készült tészta fehérje összetétele valószínőleg megváltozott
(szignifikánsan nagyobb Glu/Gli arány és UPP% a Bobwhite null transzgénikus kontroll
értékeihez képest), ami az AmA1 fehérjének a sikér fehérje mátrixába való beépülését jelzi.
Hasonlóan pozitív változás figyelhetı meg a Cadenza lisztminták dagasztása során is három
kivétellel (T3-28-12-tiszta, T3-59-tiszta, T3-83), mely mintáknak csak az egyik mért
paramétere mutatott jelentıs eltérést a kontrollétól. A másik három minta (T3-28-6-tiszta, T4-
28-1-1-tiszta és T3-80-tiszta) mindkét szignifikánsan magasabb mért értéke azt jelzi, hogy a
rekombináns AmA1 fehérje expressziója a búza endospermiumban pozitív hatással van a
búzaliszt funkcionális tulajdonságaira, a tészta minıségére.
5.15 táblázat Transzgénikus búzák T3 és T4 lisztjébıl dagasztott tésztaminták HPLC analízise.
Amoah, B.K., Wu, H., Sparks, C., Jones, H.D., 2001. Factors influencing Agrobacterium-mediated transient expression of uidA in wheat inflorescence tissue. Journal of Experimental Botany 52, 1135–1142.
Anderson, O.D., Greene, F.C., Yip, R.E., Halford, N.G., Shewry, P.R., Malpica-Romero, J.M., 1989. Nucleotid sequences of the two high-molecular-weight glutenin genes from the D-genome of a hexaploid bread wheat, Triticum aestivum L., cv Cheyenne. Nucleic Acids Research 17(1), 461-462.
Ayo, J.A., 2001. The effect of amaranth grain flour on the quality of bread. International Journal of Food Properties 4, 341-351.
Baga, M., Chibbar, R.N., Kartha, K.K., 1999a. Expression and regulation of transgenes for selection of transformants and modification of traits in cereals. Molecular Improvement of Cereal Crops. In Vasil IK (eds), Advances in Cellular and Molecular Biology of Plants 5, pp 83-131. Kluwer Academic Publishers, The Netherlands.
Barba de la Rosa, A.P., Gueguen, J., Paredes-López, O., Viroben,G., 1992. Fractionation procedures, electrophoretic characterization, and aminoacid composition of amaranth seed protein. Journal of Agricultural and Food Chemistry 40, 931-936.
103
Barba de la Rosa, A.P., Herrera, A., Utsumi, S., Parades-López, O., 1996. Molecular characterization, cloning and structural analysis of a cDNA encoding an amaranth globulin. J. Plant Physiol. 149, 527-532.
Barcelo, P. and Lazzeri, P. A., 1995. Transformation of cereals by microprojectile bombardment of immature inflorescence and scutellum tissues. In: Methods in Molecular Biology: Plant Gene Transfer and Expression Protocols, (Ed. H. Jones), Humana Press, Totowa. Vol. 49, pp 113-123.
Barcelo, P. and Lazzeri, P.A., 1998. Direct gene transfer: Chemical, electrical and physical methods. In Lindsey, K. (eds), Transgenic Plant Research pp. 35-55. Harwood Academic Publishers, The Netherlands.
Barro, F., Cannell, M.E., Lazzeri, P., Barcelo, P., 1998. Influence of auxins on transformation of wheat and tritordeum and analysis of transgene integration patterns in transformants. Theoretical Applied Genetics 97, 684-695.
Barro, F., Martin, A., Lazzeri, P.A., Barcelo, P., 1999. Medium optimisation for efficient somatic embryogenesis and plant regeneration from immature inflorescences and immature scutella of elite cultivars of wheat, barley and tritordeum. Euphytica, 108, 161-167.
Barro, F., Barcelo, P., Lazzeri, P.A., Shewry, P.R., Ballesteros, J., Martin, A., 2003. Functional properties of flours from filed grown transgenic wheat lines expressing the HMW glutenin subunit 1Ax1 and 1Dx5. Molecular Breeding 12, 223-229.
Baruah-Wolff, J., Harwood, W.A., Lonsdale, D.A., Harvey, A., Hull, R., Snape, J.W., 1999 Luciferase as a reporter gene for transformation studies in rice (Oryza sativa L.). Plant Cell Reports 18, 715-720.
Batey, IL., Gupta, RB., MacRitchie, F., 1991. Use of SE-HPLC in the study of wheat flour proteins: An improved chromatographic procedure. Cereal Chem 68, 207-209.
Beccari, J.B., 1745. De Frumento. De Bononiensi Scientarium et Artium. Instituto atque Academia Commentarii: Bologna 2, 122-127.
Bechtel, D.B., Wilson, J.D., Shewry, P.R., 1991. Immunocytochemical localization of the wheat storage protein triticin in developing endoperm tissue. Cereal Chem. 68, 573-577.
Bedı, Z., Kárpáti, M., Vida, Gy., Kramarik-Kissimon, J., Láng, L., 1995. Good breadmaking quality wheat (Triticum aestivum L.) genotypes with 2+12 subunit composition at the Glu-D1 locus. Cer. Res. Comm. 23, 283-289.
Békés, F., Gras, P.W., Gupta, R.B., Hickman, D.R., Tatham, A.S. 1993. Effects of a high Mr glutenin subunit (1Bx20) ont he dough mixing properties of wheat flour. Journal of Cereal Science. 19, 3-7.
Békés, F. and Gras, P.W., 1994. Effects of individual HMW glutenin subunits on mixing properties. In ’Gluten Proteins 1993’. Association of Cereal Research, Detmold, Germany, 170-179.
Békés, F., Anderson, O., Gras, P.W., Gupta, R.B., Tam, A., Wrigley, C.W., Apples, R., 1994a. The contribution to mixing properties of 1D glutenin subunits expressed in a bacterial system. Proc.'Improvement of Cereal Quality by Genetic Engineering', (Eds. Henry, R., and Ronalds, J.) pp 97-104.
Békés, F., Gras, P.W., Gupta, R.B., 1994b. Mixing properties as a measure of reversible reduction and oxidation of doughs. Cereal Chemistry. 71, 44-50.
104
Békés, F., Gras, P.W., Gupta, R.B., 1995. The effects of purified cereal polypeptides on mixing properties of dough, 92-98. in: Proc. 45th Australian Cereal Chemistry Conf. Y.A. Williams and C.W. Wrigley, eds. RACI: Noth Melbourne, Australia.
Békés, F., Southan, M.S., Tömösközi, S., Nanasi, J., Gras, P.W., Varga, J., McCorquodale, J., Osborne, B.G. 2000. Comparative studies on a new micro scale laboratory mill. Proc. 49. RACI Conference, Eds.: Panozzo, J.F., Ratcliffe, M., Wootton, M., Wrigley, C.W., 483-487., RACI, Melbourne.
Békés, F., Lukow, O., Uthayakumaran, S., Mann, G., 2003. Small-scale dough testing methods. In: Shewry, P.R., Lookhart, G. (Eds.), Wheat Gluten Protein Analysis. AACC, St. Paul, USA, pp 173–198.
Ben Amer, I.M., Korzun, V., Worland, A.J., Börner, A., 1997. Genetic mapping of QTL controlling tissue-culture response on chromosome 2B of wheat (Triticum aestivum L.) in relation to major genes and RFLP markers. Theoretical Applied Genetics 94, 1047-1052.
Bhattacharyya-Pakrasi, H., Peng, J., Elmer, J.S., Laco, G., Shen, P., Kaniewska, M.B., Kononowicz, H., Wen, F., Hodges, T.K., Beachy, R.N., 1993. Specificity of a promoter from the rice tungro bacilliform virus for expression in phloem tissues. Plant Journal 4, 71-79.
Blechl, A.E., Anderson, O.D., 1996. Expression of a novel high molecular weight glutenin subunit gene in transgenic wheat. Nat Biotechnol 14, 875–879.
Blechl, A.E., Le, H.Q., Anderson, O.D., 1998. Engineering changes in wheat flour by genetic transformation. Journal of Plant Physiology 152, 703-707.
Blechl, A.E., Lin, J., Nguyen, S., Chan, R., Anderson, O.D., Dupont, F.M., 2007. Transgenic wheats with elevated levels of Dx5 and/or Dy10 high-molecular-weight glutenin subunits yield doughs with increased mixing strength and tolerance. Journal Of Cereal Science. 45, 172-183.
Boutrot, F., Guirao, A., Alary, R., Joudrier, P., Gautier, M.F., 2005. Wheat non-specific lipid transfer protein genes display a complex pattern of expression in developing seeds. Biochim. Biophys. Acta 1730, 114-125.
Bregitzer, P., Halbert, S.E., Lemaux, P.G., 1998. Somaclonal variation in the progeny of transgenic barley. Theoretical Applied Genetics 96, 421-425.
Bressani, R. and Garcia-Vela, L.A., 1990. Protein fractions in amaranth grain and their chemical characterization. Journal of Agricultural and Food Chemistry 38, 1205-1209.
Brinch-Pedersen, H., Olesen, A., Rasmussen, S.K., Holm, P.B., 2000. Generation of transgenic wheat (Triticum aestivum L.) for constitutive accumulation of an Aspergillus phytase. Molecular Breeding 6, 196.
Brinch-Pedersen, H., Sorensen, L.D., Holm, P.B., 2002. Engineering crop plants: getting a handle on phosphate. Trends in Plant Science 7, 118–125.
Brinch-Pedersen, H., Hatzack, F., Sorensen, L.D., Holm, P.B., 2003. Concerted action of endogenous and heterologous phytase on phytic acid degradation in seeds of transgenic wheat (Triticum aestivum L.). Transgenic Research 12, 649–659.
Brinch-Pedersen, H., Hatzack, F., Stoger, E., Arcalis, E., Pontopidan, K., Holm, P.B., 2006. Heat-stable phytases in transgenic wheat (Triticum aestivum L.): deposition pattern, thermostability, and phytate hydrolysis. J Agric Food Chem 54, 4624–4632.
Burgess, S.R., and Shewry, P.R., 1986. Identification of homologous globulins from embryos of wheat, barley, rye and oats. J. Exp. Bot. 37, 1863-1871.
Burton, R.A., Wilson, S.M., Hrmova, M., Harvey, A.J., Shirley, N.J., Medhurst, A., Stone, BA., Newbigin, N.J., Bacic, A., Fincher, GB., 2006. Cellulose synthase-like CslF genes mediate the synthesis of cell wall (1,3;1,4)-b-D-glucans. Science 311, 1940–1942.
105
Bushuk, W., 1998. Wheat breeding for end-product use. Euphytica. 100, 137-145. Bushuk, W. Interactions: The Keys To Cereal Quality, 1st ed. Hamer, R.J. and Honesey, R.C. Eds. American Association of Cereal Chemistry: St. Paul. Mn. 1998. Chapter 2.
Bushuk, W. and Tkachuk, R. Eds. 1991. Gluten proteins 1990. Am. Assoc. Cereal Chemistry: St. Paul, Mn.
Butow, B.J., Tatham, A.S., Savage, A.W.J., Gilbert, S.M., Shewry, P.R., Solomon, R.G., Békés, F., 2003a. Creating a balance – the incorporation of a HMW glutenin subunit into transgenic wheat lines. Journal of Cereal Science. 38, 181-187.
Butow, B.J., Ma, W., Gale, K.R., Rampling, L., Larroque, O., Morell, M.K., Békés, F., 2003b. Molecular discrimination of Bx7 alleles demonstrates that highly expressed high-molecular weight glutenin allele has major impact on wheat flour dough strength. Theoretical and Applied Genetics 107, 1524-1532.
Cannell, M.E., Barcelo, P., Lazzeri, P.A., 1998. Stability and heritability of marker genes in transgenic wheat and Tritordeum. In Slinkard AE (eds), Proceedings of the 9th International Wheat Genetic Symposium 3, 92-94. University Extension Press, University of Saskatoon, Canada.
Capell, T. and Christou, P., 2004. Progress in plant metabolic engineering. Curr. Opin. Biotechnol. 15, 148-154.
Chakraborty, S., Chakraborty, N., Datta, A., 2000. Increased nutritive value of transgenic potato by expressing a nonallergenic seed albumin gene from Amaranthus hypochondriacus. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 97, 3724–3729.
Chalupa, V., 1987. Temperature. In: Bonga JM, Durzan DJ (eds) Cell and Tissue Culture in Forestry, Vol. 1. Martinus Nijhoff Publishers, Dordrecht, pp 142-151.
Chamberlain, D.A., Brettel, R.I.S., Last, D.I., Witrzens, B., McElroy, D., Dolferus, R., Dennis, E.S., 1994. The use of the Emu promoter with antibiotic and herbicide resistance genes for the selection of transgenic wheat callus and rice plants. Australian Journal of Plant Physiology 21, 95-112.
Champagne, E.T., Wood, D.F., Juliano, B.O., Bechtel, D.B., 2004. The rice grain and its gross composition. In: Champagne, E.T. (Ed.), Rice: Chemistry and Technology, third ed. AACC, St. Paul, MN, pp 77–107.
Chaturvedi, A., Sarojini, G., Nirmala, G., Nirmalamma, N., Satyanarayana, D., 1997. Glycemic index of grain amaranth, wheat and rice in NIDDM subjects. Plant Foods for Human Nutrition 50, 171-178.
Chaure, P., Gurr, S.J., Spanu, P., 2000. Stable transformation of Erysiphe graminis, an obligate biotrophic pathogen of barley. Nature Biotechnology 18, 205-207.
Chawla, H.S., Cass, L.A., Simmonds, J.A., 1999. Developmental and environmental regulation of anthocyanin pigmentation in wheat tissues transformed with anthocyanin regulatory genes. In Vitro Cellular and Developmental Biology-Plant 35, 403-408.
Chen, S.F., Paredes-Lopez, O., 1997. Isolation and characterization of the 11S globulin from amaranth seedsSource. Journal of Food Biochemistry 21, 53-65.
Chen, Z., Young, T.E., Ling, J., Chang, S.C., Gallie, D.R., 2003. Increasing vitamin C content of Plant through enhanced ascorbate recycling. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 100, 3525–3530.
Cheng, M., Fry, J.E., Pang, S., Zhou, H., Hironaka, C.M., Duncan, D.R., Conner, T.W., Wan, Y., 1997. Genetic transformation of wheat mediated by Agrobacterium tumefaciens. Plant Physiology 115, 971-980.
Christensen, A.H. and Quail, P.H., 1996. Ubiquitin promoter-based vectors for high-level expression of selectable and/or screenable marker genes in monocotyledonous plants. Transgenic Res 5, 213-218.
106
Christou, P. and Twyman, R.M., 2004. The potential of genetically enhanced Plant to address food insecurity. Nutr. Res. Rev. 17, 23–42.
Constabel, F., Shyluk, J.P., 1994. Initiation, nutrition, and maintenance of plant cell and tissue culture. In: Vasil IK, Thorpe TA (eds) Plant Cell and Tissue Culture. Kluwer Academic Publishers, Dordrecht, pp 3-15.
Cornish, G., Békés, F., Larroque, O., Appels, R., 1998. The relationships between allelic composition of glutenin subunits and functional properties. In ‘Cereals 98—Proceedings of the 48th RACI Cereal Chemistry Conference’. (Eds AW Tarr, AS Ross, CW Wrigley) pp 536–539. (RACI: North Melbourne)
Crow, J.F., Kermicle, J., 2002. Oliver Nelson and quality protein maize. Genetics 160, 819–821.
D’Appollonia, B.L. and Kunerth, W.H. Eds. 1984. The Farinograph handbook, AACC, St. Paul, MN, ISBN-0-913250-37-6.
Dai, S., Carcamo, R., Zhang, Z., Chen, S., Beachy, R.N., 2001. The bacterial cytosine deaminase gene used as a conditional negative selection marker in transgenic rice plants. Plant Cell Reports 20, 738–743.
Dannenhoffer, J.M., Bostwick, D.E., Or, E., Larkins, B.A., 1995. Opaque-15, a maize mutation with properties of a defective opaque-2 modifier. Proceedings of the National Academy of the Sciences USA 92, 1931–1935.
De Block, M., Debrouwer, D., Moens, T., 1997. The development of a nuclear male sterility system in wheat. Expression of the barnase gene under the control of tapetum specific promoters. Theoretical Applied Genetics 95, 125-131.
Diaz de la Garza, R.I., Quinlivan, E.P., Klaus, S.M.J., Basset, G.J.C., Gregory III, J.F., Hanson, A.D., 2004. Folate biofortification in tomato by engineering the pteridine branch of folate synthesis. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 13720-13725.
Diaz de la Garza, R.I., Gregory, J.F., Hanson, A.D., 2007. Folate biofortification of tomato fruit. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 4218–4222.
Distelfeld, A., Uauy, C., Olmos, S., Schlatter, A.R., Dubcovsky, J.,Fahima, T., 2004. Microlinearity between a 2-cM region encompassing the grain protein content locus Gpc-6B1 on wheat chromosome 6B and a 350-kb region on rice chromosome 2. Functional and Integrative Genomics 4, 59–66.
Distelfeld, A., Uauy, C., Fahima, T., Dubcovsky, J., 2006. Physical map of the wheat high-grain protein content gene Gpc-B1 and development of a high-throughput molecular marker. New Phytologist 169, 753–763.
Dubetz, S., Gardiner, E.E., Flynn, D., de la Roche, A.I., 1979. Effect of nitrogen fertilizer on nitrogen fractions and amino acid composition of spring wheat. Canadian J Plant Sci 59, 299-305.
Ducreux, L.J.M., Morris, W.L., Hedley, P.E., Shepherd, T., Davies, H.V., Millam, S., Taylor, M.A., 2005. Metabolic engineering of high carotenoid potato tubers containing enhanced levels of beta-carotene and lutein. J. Exp. Bot. 56, 81–89.
Dudits, D. és Heszky, L., 2003. Növényi biotechnológia és géntechnológia. Agroinform Kiadó, Budapest (második, bıvített kiadás).
Dudley, J.W., Lambert, R.J., Alexander, D.E., 1974. Seventy generations of selection for oil and protein concentration in the maize kernel. In: Dudley, J.W. (Ed.), Seventy Generations of Selection for Oil and Protein in Maize. Crop Science Society of America, Madison, WI, pp 181–212.
Dunwell, J.M., Purvis, A. and Khuri, S., 2004. Cupins: the most functionally diverse protein superfamily. Phytochem. 65, 7-17.
Dwivedi, S., Perotti, E., Ortiz, R., 2008. Toward molecular breeding of reproductive traits in cereal crops. Plant Biotechnology Journal 6(6), 529-559.
107
Ebinuma, H., Sugita, K., Matsunaga, E., Yamakado, M., 1997. Selection of marker-free transgenic plants using the isopentenyl transferase gene as a selectable marker. Proceedings of the National Academy of Science 94, 2117–2121.
Ebinuma, H., Komamine, A., 2001. MAT (Multi-Auto-Transformation) vector system. The oncogenes of Agrobacterium as positive markers for regeneration and selection of marker-free transgenic plants. Cell. Dev. Biol.–Plant 37, 103-113.
Edlin, D.A.N., Kille, P., Wilkinson, M.W., Jones, H.D., Harwood, J.L., 2000. Morphological and metabolic changes in transgenic wheat with altered glycerol-3-phosphate acyltransferase or acyl-acyl carrier protein (ACP) thioesterase activities. In: 14th International Symposium on Plant Lipids, Biochemical Society Transactions 28(6), 682-683.
Falco, S.C., Guida, T., Locke, M., Mauvais, J., Sandres, C., Ward, R.T., Webber, P., 1995. Transgenic canola and soybean seeds with increased lysine. Bio/Technology 13, 577.
FAO/WHO/UNU, 1985. Necessidades de Energia y Proteinas. World Health Organisation, Geneva.
Feldman, M., Lupton, F.G.H., Miller, T.E., 1995. Wheats Triticum spp. In Evolution of Crop Plants 2nd edition (eds. Smartt,J. and Simmonds,N.W.) Longmann Scientific and Technical, pp184-192.
Fennell, S., Bohorova, N., van Ginkel, M., Crossa, J., Hoisington, D., 1996. Plant regeneration from immature embryos of 48 elite CIMMYT bread wheats. Theoretical Applied Genetics 92, 163-169.
Fido, R.J., Békés, F., Gras, P.W., Tatham, A., 1997. The effects of added gliadin classes on the mixing properties and extension of dough. Journal of Cereal Science 26, 271-277.
Fischer-Iglesias, C., Sundberg, B., Neuhaus, G., Jones, A.M., 2001. Auxin distribution and transport during embryonic pattern formation in wheat. Plant J 26, 115-129.
Frame, B.R., Drayton, P.R., Bagnall, S.V., Lewnau, C.J., Bullock, W.P., Wilson, H.M., Dunwell, J.M., Thompson, J.A., Wang, K., 1994. Production of fertile transgenic maize plants by silicon carbide fiber-mediated transformation. The Plant Journal 6, 941-948.
Frederico, M.L., Kaeppler, H.F., Skadsen, R.W., 2005. The complex developmental expression of a novel stress-responsive barley Ltp gene is determined by a shortened promoter sequence. Planr Molecular Biology 57(1), 35-51.
Fu, X.D., Duc, L.T., Fontana, S., Bong, B.B., Tinjuangjun, P., Sudhakar, D., Twyman, R.M., Christou, P., Kohli, A., 2000. Linear transgene constructs lacking vector backbone sequences generate low-copy-number transgenic plants with simple integration patterns. Transgenic Res 9, 11-19.
Fukuyima, D., 1991. Structures of plant storage proteins and their functions. Food Rev. Int. 7, 353-381.
Furtado, A. and Henry, R.J., 2005. The wheat Em promoter drives reporter gene expression in embryo and aleurone tissue of transgenic barley and rice. Plant Biotechnology Journal 3(4), 421-434.
Galili, G., 1995. Regulation of lysine and threonine synthesis. Plant Cell 7, 899–906. Galili, G., 2002. New insights into the regulation and functional significance of lysine
metabolism in Plant. Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology 53, 27–43.
Gibbon, B.C., Larkins, B.A., 2005. Molecular genetic approaches to developing quality protein maize. Trends in Genetics 21, 227-233.
108
Geisel, J., 2003. Folic acid and neural tube defects in pregnancy – a review J. Perinat. Neonat. Nurs. 17, 268-279.
Golovkin, M.V., Ábrahám, M., Mórocz, S., Bottka, S., Fehér, A., Dudits, D., 1993. Production of transgenic maize plants by direct DNA uptake into embryogenic protoplasts. Plant Science Limerick 90, 41-52.
Gordon-Kamm, W.J., Baszczynski, C.L., Bruce, W.B., Tomes, D.T., 1999. Transgenic cereals: Zea mays (maize). Molecular Improvement of Cereal Crops. In Vasil IK (eds), Advances in Cellular and Molecular Biology of Plants V, 189-253. Kluwer Academic Publishers, The Netherlands.
Gorinstein, S., Jaramillo, N.O., Medina, O.J., Rogriques, W.A., Tosello, G.A. and Paredes-Lopez, O., 1999. Evaluation of Some Cereals, Plants and TubersThrough Protein Composition Journal of Protein Chemistry 18(6), 687-693.
Gras, P.W., Békés, F., Gupta, R.B., MacRitchie, F., 1992. in ’Proceedings of the 24nd RACI Cereal Chemistry Conference’ (V.J. Humphrey-Taylor, ed.) RACI, Parkville, Australia. pp 171-180.
Gras, P.W., Varga, J., Rath, C., Tömösközi, S., Fogod, D., Salgo, A. and Békés, F., 2000. Screening for improved water absorption and mixing properties using four grams of flour: A new small-scale Farinograph –type mixer. In Proceeding of 11th International Cereal and Bread Congress, Broadbeach, QLd, Australia.
Gras, P.W., Anderssen, R.S., Keentok, M., Békés, F., Apples, R., 2001. Gluten protein functionality in wheat flour processing: a review. Aust. J. Agric. Res. 52, 1311-1323.
Grimwade, B., Tatham, A.S., Freedman, R.B., Shewry, P.R., Napier, J.A., 1996. Comparison of the expression patterns of genes coding for wheat gluten proteins and proteins involved in the secretory pathway in developing caryopses of wheat. Plant Mol Biol 30, 1067-1073.
Gupta, R.B., Singh, N.K., Shepherd, K.W., 1989. The cumulative effect of allelic variation in LMW and HMW glutenin subunits on physical dough properties in progeny of two bread wheats. Theor. Appl. Genet. 77, 57-64.
Gupta, R.B., Shepherd, K.W., McRitchie, F., 1991a. Genetic control and biochemical properties of some high molecular weight albumins in bread wheat. J. Cereal Sci. 13, 221-235.
Gupta, R.B., Békés, F., Wrigley, C.W., 1991b. Prediction of physical dough properties from glutenin subunit composition in bread wheats: correlation studies. Cereal Chemistry 68, 328–333.
Gupta, R.B., Batey, I.L., MacRitchie, F., 1992. Relationship between protein composition and functional properties of wheat flours. Cereal Chemistry. 69, 125-131.
Gupta, R.B. and McRitchie, F., 1994. Allelic variation at glutenin subunit and gliadin loci, Glu-1, Glu-3 and Gli-1 of common wheats. II. Biochemical basis of the allelic effects on dough properties. J. Cereal Sci. 19, 19-29.
Gupta, R.B., Popineau, Y., Lefebvre, J., Cornec, M., Lawrence, G.J., McRitchie, F., 1995. Biochemical basis of flour properties in bread wheats. II. Changes in polymeric protein –formation and dough/gluten properties associated with the loss of low M(R) or hight M(R) glutenin subunits. Journal of Cereal Science 21, 103-116.
Gupta, R.B., Masci, S., Lafiandra, D., Bariana, H.S., McRitchie, F., 1996. Accumulation of protein subunits and their polymers in developing grains of hexaploid wheats. J Exp Bot 47, 1377-1385.
Guzmán-Maldonado, S. H., Paredes-López, O., 1998. Functional products of indigenous Plant to Latin America: Amaranth, quinoa, common beans and botanicals. In Functional Foods: Biochemical and Processing Aspects. Mazza, G., Ed., Technomic Publishing: Lancaster, PA, Chapter 9, pp 293-328.
109
Hamer, R.J. and van Vliet, T., 2000. Understanding the structure and properties of gluten: An overview. pp 125-131. in Wheat Gluten. P.R. Shewry and A.S. Thatam. Eds. Royal Society of Chemistry: Cambrige, UK.
Hagan, N.D., Upadhyaya, N., Tabe, L.M., Higgins, T.J.V., 2003. The redistribution of protein sulfur in transgenic rice expressing a gene for a foreign, sulfur-rich protein. The Plant Journal 34, 1–11.
Haldrup, A., Petersen, SG., Okkels, FT., 1998. Positive selection: a plant selection principle based on xylose isomerase, an enzyme used in the food industry. Plant Cell Reports 18, 76-81.
Halverson, J. and Zeleny, L., 1988. Criteria of wheat quality. In: Wheat: Chemistry and Technology (Y. Pomeranz ed.), Vol. II., AACC, St.Paul, Minnesota, USA, pp. 15-46.
Haraszi, R., Gras, P.W., Tömösközi, S., Salgo, A., Békés, F., 2004. The application of a micro Z-arm mixer to characterize mixing properties and water absorption of wheat flour. Cereal Chem. 81, 550-560.
Harvey, A., Moisan, L., Lindup, S., Lonsdale, D., 1999. Wheat regenerated from scutellum callus as a source of material for transformation. Plant Cell Tiss Org Cult 57, 153-156.
Harwood, W.A., Ross, S.M., Cilento, P., Snape, J.W., 2000. The effect of DNA/gold particle preparation technique, and particle bombardment device, on the transformation of barley (Hordeum vulgare). Euphytica 111, 67-76.
He, D.G., Yang, Y.M., Scott, K.J., 1989. The effect of macro elements in the induction of embryogenic callus from immature embryos of wheat (Triticum aestivum L.). Plant Sci 64: 251-258.
He, G.Y., Rooke, L., Steele, S., Békés, F., Gras, P., Tatham, A.S., Fido, R., Barcelo, P., Shewry, P.R., Lazzeri, P.A., 1999. Transformation of pasta wheat (Triticum turgidum L. var. durum) with high-molecular-weight glutenin subunit genes and modification of dough functionality. Molecular Breeding 5, 377-386.
Hiei, Y., Ohta, S., Komari, T., Kumashiro, T., 1994. Efficient transformation of rice (Oryza sativa L.) mediated by Agrobacterium and sequence analysis of the boundaries of the T-DNA. The Plant Journal 6, 271-282.
Higgins, T.J.V., 1984. Synthesis and regulation of major proteins in seeds. Annu. Rev. Plant Physiol. 35, 191-221.
Higgins, T.J.V., Beach, L.R., Spencer, D., Chandler, P.M., Randall, P.J., Blagrove, R.J., Kortt, A.A., Guthrie, R.E., 1987. cDNA and protein sequence of a major pea seed albumin. Plant Molecular Biology 8, 37-45.
Hoa, T.T.C., Bong, B.B., Huq, E., Hodges, T.K., 2002. Cre/lox site-specific recombination controls the excision of a transgene from the rice genome. Theoretical and Applied Genetics 104, 518–525.
Howarth, J.R., Jacquet, J.N., Doherty, A., Jones, H.D., Cannell, M.E., 2005. Molecular genetic analysis of silencing in two lines of Triticum aestivum transformed with the marker gene construct pAHC25. Annals of Applied Biology 146, 311–320.
Huang, S., Adams, W.R., Zhou, Q., Malloy, K.P., Voyles, D.A., Anthony, J., Kriz, A.L., Luethy, M.H., 2004. Improving nutritional quality of maize proteins by expressing sense and antisense zein genes. Journal of Agricultural and Food Chemistry 52, 1958–1964.
Huang, S., Spielmeyer, W., Lagudah, E.S., James, R.A., Platten, J.D., Dennis, E.S., Munns, R., 2006. A sodium transporter (KHT7) is a candidate for Nax1, a gene for salt tolerance in durum wheat. Plant Physiol 142, 1718–1727.
110
Hughes, K.W., 1981. In vitro ecology: exogenous factors affecting growth and morphogenesis in plant tissue cultures. Env Exp Bot 21, 281-288.
I’Anson, K.J., Morris, V.J., Shewry, P.R., Tatham, A.S., 1992. Small-angle X-ray-scattering studies of the C hordeins of barley (Hordeum vulgare) Biochemical Journal 287, 183-185.
Iser, M., Fetting, S., Scheyhing, F., Viertel, K., Hess, D., 1999. Genotype-dependent stable genetic transformation in German spring wheat varieties selected for high regeneration potential. Journal of Plant Physiology 154, 509-516.
Ishida, Y., Saito, H., Ohta, S., Hiei, Y., Komari, T., Kumashiro, T., 1996. High efficiency transformation of maize (Zea mays L.) mediated by Agrobacterium tumefaciens. Nature Biotechnology 14, 745-750.
Jach, G., Binot, E., Frings, S., Luxa K., Schell, J., 2001. Use of red fluorescent protein from Discosoma sp. (dsRED) as a reporter for plant gene expression. The Plant Journal 28, 483-491.
Jelenska, J., Tietze, E., Tempe, J., Brevet, J., 2000. Streptothricin resistance as a novel selectable marker for transgenic plant cells. Plant Cell Reports 19, 298-303.
Jenes, B., Bittencourt, P.A.L., Csányi, Á., Pauk, J., Nagy, I., Toldi, O., Balázs, E., 1996. The GENEBOOSTER - a new microprojectile bombardment device - for genetic transformation of plants. Plant Tissue Culture and Biotechnology 2, 42-51.
Jensen, S.A. and Martens, H., 1983. The botanical constituents of wheat and wheat milling fractions. II. Quantification by amino acids. Cereal Chemistry 60, 172–177.
Jones, H., Doherty, A., Wu, H., 2005. Review of methodologies and a protocol for the Agrobacterium-mediated transformation of wheat. Plant Methods 1, 5.
Juhasz, A., Larroque, R.O., Tamas, L., Hsam, S.L., Zeller, F.J., Bekes, F., Bedo, Z., 2003. Bankuti 1201--an old Hungarian wheat variety with special storage protein composition. Theoretical Applied Genetics 107 (4), 697-704.
Kang, TJ., Loc, NH., Jang, MO., Jang, YS., Kim, YS., Seo, JE., Yang, MS. 2003. Expression of the B subunit of E. coli heat-labile enterotoxin in the chloroplasts of plants and its characterization. Transgenic Res 12, 683-691.
Karunaratne, S., Sohn, A.A., Scott, J., Steinbiss, H.H., Scott, KJ., 1996. Transformation of wheat with the gene encoding the coat protein of barley yellow mosaic virus. Australian Journal of Plant Physiology 23, 429-435.
Kermode, A.R. and Bewley, J.D., 1999. Synthesis, processing and deposition of seed proteins. In: Seed Proteins (Eds. Shewry, P.R. and Casey, R.) pp 807-841.
Kinney, A.J. Cahonn, E.B. Damude, H.G., Hitz, W.D., Kolar, C.W., Liu, Z-B., 2004. E.I. Du Pont de Nemours and Company. Production of very long chain polyunsaturated fatty acids in oilseed Plant, WO 2004/071467 A2
Kirkman, M.A., Shewry, P.R., Miflin, B.J., 1982. The effect of nitrogen nutrition on the lysine content and protein composition of barley seeds. Journal of the Science of Food and Agriculture 33, 115–127.
Kleese, R.A., Kirihara, J.A., Sandahl, G.A., 1991. Gene transfer to elevate methionine levels. In: Proceedings 46th Annual Corn and Soybean Industrial Research Conference. American Seed Trade Association, Washington DC, pp. 124–129.
Kohli, A., Gahakwa, D., Vain, P., Laurie, DA., Christou, P., 1999. Transgene expression in rice engineered through particle bombardment: Molecular factors controlling stable expression and transgene silencing. Planta 208, 88-97.
Kohli, A., Twyman, R.M., Abranches, R., Wegel, E., Stoger, E. and Christou, P., 2003. Transgene integration, organization and interaction in plants Plant Molecular Biology. 52, 247-258.
111
Komari, T., Hiei, Y., Saito, Y., Murai, N., Kumashiro, T., 1996. Vectors carrying two separate T-DNAs for co-transformation of higher plants mediated by Agrobacterium tumefaciens and segregation of transformants free from selection markers. Plant Journal 10, 165-174.
Komari, T. and Kubo, T., 1999. Methods of genetic transformation: Agrobacterium tumefaciens. In: Vasil IK (ed) Molecular Improvement of Cereal Crop, pp 43–82. Kluwer Academic, London.
Konishi, Y., Horikawa, K., Oku, Y., Azumaya, J., Nakatani, N., 1991. Extraction of two albumin fractions from amaranth grains: comparison of some physicochemical properties and the putative localization in the grains. Agric Biol Chem 55 (11), 1745-1750.
Koprek, T., Hänsch, R., Nerlich, A., Mendel, R.R. and Schulze, J., 1996. Fertile transgenic barley of different cultivars obtained by adjustment of bombardment conditions to tissue culture response. Plant Sci. 119, 79–91.
Kunkel, T., Niu, Q.W., Chan, Y.S., Chua, N.H., 1999. Inducible isopentenyl transferase as a high-efficiency marker for plant transformation. Nature Biotechnology 17, 916-919.
Laemmli, U.K., 1970. Cleavage of structural proteins during the assembly of bacteriophage. Nature 227:680-685.
Lai, J., Messing, J., 2002. Increasing maize seed methionine by mRNA stability. The Plant Journal 30, 395–402.
Larroque, O.R., Bekes, F., 2000. Rapid size-exclusion chromatography analysis of molecular size distribution for wheat endosperm protein. Cereal Chemistry 77, 451–453.
Laursen, C.M., Krzyzek, R.A., Flick, C.E., Anderson, P.C., Spencer, T.M., 1994. Production of fertile transgenic maize by electroporation of suspension culture cells. Plant Molecular Biology 24, 51-61.
Lawrence, G.J. and Shepherd, K.W., 1980. Variation in glutenin protein subunits of wheat. Aust. J. Biol. Sci. 33, 221-233.
Lee, Y.K., Békés, F., Gras, P., Ciaffi, M., Morell, M.K., Appels, R., 1999a. The low-molecular-weight glutenin subunit proteins of primitive wheats. IV. Functional properties of products from individual genes. Theor Appl Genet 98, 149-155.
Lee, T.T.T., Chung, M.-C., Kao, Y.-W., Wang, C.-S., Chen, L.-J., Tzen, J.T.C., 2005. Specific expression of a sesame storage protein in transgenic rice bran. Journal of Cereal Science 41, 23–29.
Lehmann, J. W., 1996. Case history of grain amaranth as an alternative crop. Cereal Foods World 41, 399-411.
León, E., Marín, S., Giménez, M.J., Piston, F., Rodríguez-Quijano, M., Shewry, P.R., Barro, F., 2009. Mixing properties and dough functionality of transgenic lines of a commercial wheat cultivar expressing the 1Ax1, 1Dx5 and 1Dy10 HMW glutenin subunit genes. Journal of Cereal Science 49(1), 148-156.
Lörz, H., Baker, B., Schell, J., 1985. Gene transfer to cereal cells mediated by protoplast transformation. Molecular and General Genetics 199, 178-182.
Lu, S., Van Eck, J., Zhou, X., Lopez, A.B., O'Halloran, D.M., Cosman, K.M., Conlin, B.J., Li, L., 2006. The cauliflower Or gene encodes a DnaJ cysteinerich domain-containing protein that mediates high levels of beta-carotene accumulation. Plant Cell 18, 3594–3605.
Lucca, P., Hurrell, P., Potrykus, I., 2001. Genetic engineering approaches to improve the bioavailability and the level of iron in the rice grains. Theoretical and Applied Genetics 102, 392–397.
112
Machii, H., Mizuno, H., Hirabayashi, T., Li, H., Hagio, T., 1998. Screening wheat genotypes for high callus induction and regeneration capability from anther and immature embryo cultures. Plant. Cell. Tiss. Org. Cult. 53, 67–74.
Maheshwari, N., Rajyalakshmi, K., Baweja, K., 1995. In-vitro culture of wheat and genetic-transformation-retrospect and prospect. Critical reviews in plant sciences 14(2), 149-178.
Marchylo, BA., Kruger, JE., Hatcher, DW., 1989. Quantitative RP-HPLC analysis of wheat storage proteins as a potential quality prediction tool. J Cereal Sci 9, 113-130.
Marcone, M.F., 1999. Evidence confirming the existence of a 7S globulin-like storage protein in Amaranthus hypochondriacus seed. Food Chem. 65, 533-542.
Margiotta, B., Urbano, M., Colaprico, G., Johansson, E., Buonocore, F., D’Ovidio, R., Lafiandra, D., 1996. Detection of y-type subunit at the Glu-A1 locus in some Swedish bread wheat lines. J. of Cer. Sci. 23, 203-211.
Marion, D. and Dubreil, L., 1998. Lipids, lipid-protein interactions and the quality of baked cereal products. In: Interactions: The Keys to Cereal Quality (R.J. Hamer and R.C. Hoseney eds.) AACC, St. Paul, Minnesota, USA, pp 131-167.
Martínez, E.N., Castellani, O.F., Anón M.C., 1997. Common Molecular Features among Amaranth Storage Proteins. J. Agric. Food Chem. 45, 3832-3839.
Maruta, Y., Ueki, J., Saito, H., Nitta, N., Imaseki, H., 2001. Transgenic rice with reduced glutelin content by transformation with glutelin A antisense gene. Mol. Breed. 8, 273-284.
Masci, S., Lafiandra, D., Porceddu, E., Lew, E.J.L., Tao, H.P., Kasarda, D.D., 1993. D-glutenin subunits: N-terminal sequences and evidence for the presence of cysteine. Cereal Chem. 70, 581-585.
Masci, S., D’Ovidio, R., Scossa, F., Patacchini, C., Lafiandra, D., Anderson, O.D., Blechl, A.E., 2003. Production and characterization of a transgenic bread wheat line over-expressing a low-molecular-weight glutenin subunit gene. Mol Breeding 12, 209–222.
McElroy, D., Blowers, A.D., Jenes, B., Wu, R., 1991. Construction of expression vectors based on the rice actin 1 (Act1) 5’ region for use in monocot transformation. Molecular and General Genetics 231, 150-160.
McRitchie, F., 1987. Evaluation of combinations from wheat protein fractions to dough mixing and breadmaking. Journal of Cereal Science 6, 259-268.
McRitchie, F., Kasandra, D.D., Kuzmicky, D.D., 1991. Characterization of wheat protein fractions differing in contributions to breadmaking quality. Cereal Chemistry 68, 122-130.
McRitchie, F. and Gupta, R.B., 1993. Functionality-composition relationships of wheat flour as a result of variation in sulfur availability. Aust. J. Agr. Res. 44, 1767-1774.
Melo, M.M., Xavier-Filho, J., Lima, M.S., Prouvost-Danon, A., 1994. Allergenicity and tolerance to proteins from Brazil nut (Bertholletia excelsa H.B.K.). Food and Agricultural Immunology 6, 185-195.
Mertz, E.T., Bates, L.S., Nelson, O.E., 1964. Mutant gene that changes protein composition and increases lysine content of maize endosperm. Science 145, 279–280.
Mossé, J., Huet, J.-C., 1990. Amino acid composition and nutritional score for ten cereals and six legumes or oilseeds: causes and ranges of variations according to species and to seed nitrogen content. Sciences des Alimentations 10, 151–173.
Munck, L., Karlsson, K.E., Hagberg, A., Eggum, B.O., 1970. Gene for improved nutritional value in barley seed protein. Science 168, 985–987.
113
Murashige, T. and Skoog, F., 1962. A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures. Plant Physiology 15, 473-497.
Newman, C.W. and McGuire, C.F., 1985. Nutritional Quality of Barley. In: Rasmussen DC (Ed.), Barley, Agronomy Monograph 26. ASACSSA- SSSA, Madison, WI, 403–456.
Nordlee, J.A., Taylor, S.L., Townsend, J.A., Thomas, L.A., Bush, R.K., 1996. Identification of a Brazil nut allergen in transgenic soybeans. New England Journal of Medicine 334, 688-692.
O’Kennedy, M.M., Grootboom, A., Shewry, P.R., 2006. Harnessing sorghum and millet biotechnology for food and health. Journal of Cereal Science 44, 224–235.
Olmos, S., Distelfeld, A., Chicaiza, O., Schlatter, A.R., Fahima, T., Echenique, V., Dubcovsky, J., 2003. Precise mapping of a locus affecting grain protein content in durum wheat. Theoretical and Applied Genetics 107, 1243–1251.
Oria, M.P., Hamaker, B.R., Axtel, J.D., Huang, C.-P., 2000. A highly digestible sorghum mutant cultivar exhibits a unique folded structure of endosperm protein bodies. Proceedings of the National Academy of Sciences USA 97, 5065–5070.
Osuna-Castro, J.A., Rascón-Cruz, Q., Napier, J., Fido, R.J., Shewry, P.R. and Paredes-López, O., 2000. Overexpression, Purification, and in Vitro Refolding of the 11S Globulin from Amaranth Seed in Escherichia coli. J. Agric. Food Chem. 48, 5249-5255.
Osborne,T.B., 1924. The Vegetable Proteins. 2nd edn. Longmans, Green and Co., London, p 154.
Oszvald, M., Kang, T.J., Tömösközi, S., Tamás, C., Tamás, L., Kim, T.G., Yang, MS., 2007. Expression of a synthetic neutralizing epitope of porcine epidemic diarrhea virus fused with synthetic B subunit of E. coli heat labile enterotoxin in rice endosperm, Molecular Biotechnology 35, 215-224.
Oszvald, M., Gardonyi, M., Tamas, C., Takacs, I., Jenes, B., Tamas L., 2008. Development and Characterization of a chimaeric tissue-specific promoter in wheat and rice endosperm. In Vitro Cell.Dev.Biol.-Plant 44, 1-7.
Oszvald, M., Tamás, C., Rakszegi, M., Tömösközi, S., Békés, F., Tamás L., 2009. Effects of incorporated amaranth albumins on the functional properties of wheat dough. Journal of the Science of Food and Agriculture DOI 10.1002/jsfa.3528
Paine, J.A., Shipton, C.A., Chaggar, S., Howells, R.M., Kennedy, M.J., Vernon, G., Wright, S.Y., Drake, R., 2005. Improving the nutritional value of Golden Rice through increased pro-vitamin A content. Nat. Biotechnol. 23, 482–487.
Paredes-López, O., Mora-Escobedo, R., Ordorica-Falomir, C., 1988. Isolation of amaranth proteins. LWT - Food Science and Technology 21, 328-333.
Pauk, J. and Szarka, B., 1991. Protoplast isolation and investigations in common wheat (Triticum aestivum L.). Physiologia Plantarum 82, 1.
Paul, A.A., and Southgate, D.A.T., 1978. McCance and Widdowson’s The Composition of Foods, fourth ed. Elsevier, Amsterdam
Pawlowski, W.P. and Somers, D.A., 1998. Transgenic DNA integrated into the oat genome is frequently interspersed by host DNA. Proc Natl Acad Sci USA 95, 12106–12110.
Payne, P.I., Holt, L.M., Jackson, E.A. and Law, C.N., 1984. Wheat storage proteins: their genetics and their potential for manipulation by plant breeding. Phil Trans R Soc Lond B 304, 359-371.
114
Pellegrineschi, A., McLean, S., Salgado, M., Velazquez, L., Hernandez, R., Brito, R.M., Noguera, M., Medhurst, A., Hoisington, D., 2000. Transgenic wheat plants: A powerful breeding source. In Bedı, Z., Láng, L. (eds), Wheat in a Global Environment pp 325-330.
Pellegrineschi, A., Noguera, M., Skovmand, B., Brito, R.M., Velazquez, L., Salgado, M., Hernandez, R., Warburton, M., Hoisington, D., 2002. Identification of highly transformable wheat genotypes for mass production of fertile transgenic plants. Genome 45, 421-430.
Perutto, A.D.B., Pogna, N.E., Curioni, A., 1996. Evidence for the presence of disulphide bonds between β-amylase and low molecular weight glutenin subunits, pp 312-315. in: Gluten ’96. C.W.Wrigley, Ed. RACI, Melbourne, Australia
Petolino, J.F., Hopkins, N.L., Kosegi, B.D., Skokut, M., 2000. Whisker-mediated transformation of embryogenic callus of maize. Plant Cell Reports 19, 781-786.
Phillips, R.L., McClure, B.A., 1985. Elevated protein-bound methionine in seeds of a maize line resistant to lysine plus threonine. Cereal Chemistry 62, 213-218.
Pomeranz, Y., 1988. Chemical composition of kernel structures. pp 97-158. in: Wheat Chemistry and Technology, Vol. 1, 3rd edition. Y. Pomeranz, Ed. Am. Assoc. Cereal Chem., St Paul, MN, USA.
Pons, J.L., de Lamotte, F., Gautier, M.F., Delsuc M.A., 2003. Refined solution structure of a liganded type 2 wheat nonspecific lipid transfer protein. J. Biol. Chem. 278, 14249-14256.
Pónya, Z., Finy, P., Fehér, A., Mityko, J., Dudits, D., Barnabás, B., 1999. Optimisation of introducing foreign genes into egg cells and zygotes of wheat (Triticum aestivum L.) via microinjection. Protoplasma 208, 163-172.
Popineau, Y., Deshayes, G., Lefebvre, J., Fido, R., Tatham, A.S., Shewry, P.R., 2001. Prolamin aggregation, gluten viscoelasticity, and mixing properties of transgenic wheat lines expressing 1Ax and 1Dx high molecular weight glutenin subunit transgenes. J Agric Food Chem 49, 395–401.
Potenza, C., Aleman, L., Sengupta-Gopalan, C., 2004. Targeting transgene expression in research, agricultural, and environmental applications: Promoters used in plant transformation. In Vitro Cellular and Developmental Biology-Plant 40(1), 1-22.
Potrykus, I., 1990. Gene transfer to cereals: an assessment. Bio/Technol. 8, 535–542. Prasanna, B.M., Vasal, S.K., Kassahun, B., Singh, N.N., 2001. Quality protein maize. Current
Science 81, 1308–1319. Pauk, J., Hänsch, R., Schwarz, G., Nerlich, A., Monostori, T., Mészáros, A., Jenes, B.,
Kertész, Z., Matuz, J., Schulze, J., Mendel, R.R., 1998. Genetic transformation of wheat (Triticum aestivum L.) in Hungary. Növénytermelés 47, 241-251.
Qi, B., Fraser, T., Mugford, S., Dobson, G., Sayanova, O., Butler, J., Napier, J.A., Lazarus, C.M., 2004. Production of very long chain polyunsaturated ω-3 and ω-6 fatty acids in Plant. Nat. Biotechnol. 22, 739–745.
Raina, A. and Datta, A., 1992. Molecular cloning of a gene encoding a seed-specific protein with nutritionally balanced amino acid composition from Amaranthus. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 11774-11778.
Rakszegi, M., Bekes, F., Lang, L., Tamas, L., Shewry, P.R., Bedo, Z., 2005. Technological quality of transgenic wheat expressing an increased amount of a HMW glutenin subunit. J Cereal Sci 42, 15–23.
115
Rascon-Cruz, Q., Sinagawa-Garcia, S., Osuna-Castro, J.A., Bohorova, N., Paredes-Lopez, O., 2004. Accumulation, assembly, and digestibility of amarantin expressed in transgenic tropical maize Theoretical and Applied Genetics 108, 335-342.
Rasco-Gaunt, S. and Barcelo, P., 1999. Immature inflorescence culture of cereals: a highly responsive system for regeneration and transformation. In Hall RD (eds), Methods in Molecular Biology: Plant Cell Culture Protocols pp 71-81. Humana Press Inc., Totowa, NJ.
Rasco-Gaunt, S., Riley, A., Barcelo, P., Lazzeri, P.A., 1999a. Analysis of particle bombardment parameters to optimize DNA delivery into wheat tissues. Plant Cell Reports 19, 118-127.
Rasco-Gaunt, S., Riley, A., Lazzeri, P., Barcelo, P., De Block, M., 1999b. A facile method for screening for phosphinothricin (PPT)-resistant transgenic wheats. Molecular Breeding 5, 255-262.
Rasco-Gaunt, S., Riley, A., Cannell, M., Barcelo, P., Lazzeri, P.A., 2001. Procedures allowing the transformation of a range of European elite wheat (Triticum aestivum L.) varieties via particle bombardment. Journal of Experimental Botany 52, 865-874.
Rascon-Cruz, Q., Sinagawa-Garcia, S., Osuna-Castro, J.A., Bohorova, N., Paredes-Lopez, O., 2004. Accumulation, assembly, and digestibility of amarantin expressed in transgenic tropical maize Theoretical and Applied Genetics 108, 335-342.
Regina, A., Bird, R., Topping, D., Bowden, S., Freeman, J., Barsby, T., Kosar-Hashemi, B., Li, Z., Rahman, S., Morell, M., 2006. High-amylose wheat generated by RNA interference improves indices of large-bowel health in rats. Proc Natl Acad Sci USA 103, 3546–3551.
Regina, A., Bird, R., Li, Z., Rahman, S., Mann, G., Chanliaud, E., Berbezy, P., Topping, D., Morell, M.K., 2008. Bioengineering Cereal Carbohydrates to Improve Human Health. Cereal Foods World 52(4), 182-187.
Robbins, G.S., Pomeranz, Y., Briggle, L.W., 1971. Amino acid composition of oat groats. Journal of Agricultural Food Chemistry 19, 536–539.
Roesler, K.R., Rao, A.G., 1999. Conformation and stability of barley chymotrypsin inhibitor-2 (CI-2) mutants containing multiple lysine substitutions. Protein Engineering 12, 967-973.
Roesler, K.R., Rao, A.G., 2000. A single disulfide bond restores thermodynamic and proteolytic stability to an extensively mutated protein. Protein Science 9, 1642-1650.
Romero-Zepeda, H. and Parades-López, O., 1996. Isolation and characterization of amarantin, the 11S amaranth seed globulin. Journal of Food Biochemistry 19, 329-339.
Rooke, L., Békés, F., Fido, R., Barro, F., Gras, P., Tatham, A.S., Barcelo, P., Lazzeri, P., Shewry, P.R., 1999. Overexpression of a gluten protein in transgenic wheat results in greatly increased dough strength. Journal of Cereal Science 30, 115-120.
Rothfus, J.A. and Kennel, S.J., 1970. Properties of wheat β-amylase adsorbed on glutenin. Cereal Chem. 47, 140-146.
Ruiz, M. and Carrillo, J.M., 1993. Linkage relationships between prolamin genes on chromosomes 1A and 1B of durum wheat. Theor Appl Genet 87, 353-360.
Russell, D.A., Fromm, M.E., 1997. Tissue-specific expression in transgenic maize of four endosperm promoters from maize and rice. Transgenic Research 6, 157-168.
Sanford, J.C., 1988. The biolistic process - a new concept in gene transfer and biological delivery. Trends Biotechnology 6, 229-302.
116
Sapirstein, H.D. and Fu, B.X., 1996. Characterization of an extra-strong wheat functionality
of 1) gliadin- and glutenin-rich fractions, 2) total HMW and LMW subunits of glutenin assessed by reduction-oxidation. In ’Gluten ’96, Proceedings of the 6th International Gluten Workshop’, (C.W: Wrigley, ed.) The Royal Australian Chemical Institute, Melbourne. Australia. 212-216.
Schropp, P., Belitz, H.D., Weiser, H., 1995. Reoxidation of high molecular weight subunits of glutenin. Cereal Chem 72, 406-410.
Schropp, P. and Weiser, H., 1996. Effects of high molecular weight subunits of glutenin on the rheological properties of wheat gluten. Cereal Chemistry 73, 410-413.
Segal, G., Song, R., Messing, J., 2003. A new opaque variant of maize by a single dominant RNA-interference-inducing transgene. Genetics 165, 387–397.
Segura-Nieto, M., Vázquez-Sánchez, N., Rubio-Velázquez, H., Olguín-Martínez, L., Rodriguez-Nester, C. and Herrera-Estrella, L., 1992. Characterization of Amaranth (Amaranthus hypochondriacus) seed proteins. Journal of Agricultural and Food Chemistry 40, 1553-1558.
Segura-Nieto, M., Barba de la Rosa, A.P., Parades-López, O., 1994. Biochemistry of amaranth proteins. In: Amaranth: Biology, Chemistry and Technology. (ed. Parades-López, O.) CRC Press, Boca Ratón FL. Chap 5. pp 75-106.
Segura-Nieto, M., Shewry, P.R., Parades-López, O., 1999. Globulins of Pseudocereals: Amaranth, Quinoa, and Buckwheat. In: Seed proteins. Shewry, P.R., Casey R. (Eds.), Kluwer Academic Publishers, Netherlands, pp 453-475.
Serik, O., Ainur, I., Murat, K., Tetsuo, M., Masaki, I., 1996. Silicon carbide fiber-mediated DNA delivery into cells of wheat (Triticum aestivum L.) mature embryos. Plant Cell Reports 16, 133-136.
Shewry, P.R., Franklin, J., Parmar, S., Smith, S.J., Miflin, B.J., 1983. The effects of sulfur starvation on the amino acid and protein compositions of barley grain. Journal of Cereal Science 1, 21–31.
Shewry, P.R., 1993. Barley seed proteins. In: MacGregor, A.W., Bhatty, R.S. (Eds.), Barley: Chemistry and Technology. AACC, St. Paul, MN, pp. 131–197
Shewry, P.R. and Tatham, A.S., 1997. Disulphide bonds in wheat gluten proteins. J. of Cer. Sci. 25, 207-227.
Shewry, P.R., Tatham, A.S., Halford, N.G., 1999. The prolamins of the Triticeae. pp 35-78. in: Seed Proteins. P. R. Shewry and R. Casey (Eds.), Kluwer Academic Publishers: Dordrecht, The Netherlands.
Shewry, P.R., Tatham, A.S., 2000. Wheat. The Royal Society of Chemistry. Cambridge CB4 OWF, UK: 335–339.
Shewry, P.R. and Jones, H.D., 2005. Transgenic wheat: where do we stand after the first 12 years. Ann Appl Biol 147, 1–14.
Shewry, P.R., 2007. Improving the protein content and composition of cereal grain. Journal of Cereal Science 46, 239–250.
Shewry, P.R., Baudo, M., Lovegrove, A., Napier, J.A., Ward, J., Baker, J., Beale, M.A., 2007. Is GM wheat different to conventionally bred wheat. Trends in Food Science and Technology 18, 201–209.
Shintani, D. and Della-Penna, D., 1998. Elevating the vitamin E content of Plant through metabolic engineering. Science 282, 2098–2100.
117
Shoup, F.K., Pomeranz, Y., Deyoe, C.W., 1966. Amino acid composition of wheat varieties and flours varying widely in bread-making potentialities. Journal of Food Sci 31, 94–101.
Silva-Sanchez, C.J., Gonzalez-Castaneda, J., De Leon-Rodriguez, A., De La Rosa, APB., 2004. Functional and rheological properties of amaranth albumins extracted from two Mexican varieties. Plant Foods for Human Nutrition 59, 169-174.
Simmonds, N.W., 1995. The relation between yield and protein in cereal grain. Journal of the Science and Food in Agriculture 67, 309–315.
Singh, N.K., Shepherd, K.W., Langridge, P., Gruen, L.C., 1991. Biochemical characterization of triticin, a legumin-like protein in wheat endosperm. J Cereal Sci 13, 207–219.
Singh, N.K. and MacRitchie, F., 2001. Application of polymer science to properties of gluten. J. cereal Sci. 33, 231-243.
Soriano-Santos, J., Iwabuchi, S., and Fujimoto, K., 1992. Solubility of Amaranth seed protein in sodium sulfate and sodium chloride: the main factor in quantitative extraction for analysis. Int. Journ. of Food Sci and Techn. 27, 337-346.
Sparks, C.A., and Jones, H.D., 2004. Transformation of wheat by biolistics. In: (Curtis I, ed) Transgenic Crops of the World. Kluwer Academic Publ., pp 1-16.
Srivastava, V., Anderson, O.D., Ow, D.W., 1999. Single-copy transgenic wheat generated through the resolution of complex integration patterns. Proceeding of the National. Academy of Science 96, 11117-11121.
Stacey, J., Isaac, P.G., 1994. Isolation of DNA from plants. In: Isaac PG (ed.) Methods in Molecular Biology – Protocols for Nucleic Acid Analysis by Nonradioactive Probes. Humana Press Inc, Totowa, NJ. vol. 28, pp 9–15.
Stewart, Jr C.N., 2001. The utility of green fluorescent protein in transgenic plants. Plant Cell Reports 20, 376–382.
Stoger, E., Williams, S., Keen, D., Christou, P., 1998. Molecular characteristics of transgenic wheat and the effect on transgene expression. Transgenic Res. 7, 463–471.
Stoger, E., Williams, S., Christou, P., Down, R.E., Gatehouse, J.A., 1999. Expression of the insecticidal lectin from snowdrop (Galathus nivalis agglutinin; GNA) in transgenic wheat plants: effect on predation by the grain aphid Sitobion avenae. Molecular Breeding 5, 65-73.
Sugita, K., Matsunaga, E., Ebinuma, H., 1999. Effective selection system for generating marker-free transgenic plants independent of sexual crossing. Plant Cell Reports 18, 941-947.
Svitashev, S.K., Pawlowski, W.P., Makarevitch, I., Plank, D.W., Somers, D.A., 2002. Complex transgene locus structures implicate multiple mechanisms for plant transgene rearrangement. Plant J 32, 433-445.
Takumi, S. and Shimada, T., 1996. Production of transgenic wheat through particle bombardment of scutellar tissues: frequency is influenced by culture duration. Journal of Plant Physiology 149, 418-423.
Tamás, L., Békés, F., Greenfield, J., Tatham, A.S., Gras. P.W., Shewry, P.R., Apples, R., 1998. Heterologous expression and dough mixing studies of wild-type and mutant C hordeins Journal of Cereal Science 27, 15-22.
Tamás, C., Tamás, L., Morell, KM., Appels, R., 1999. The use of GFP gene as a reporter gene in wheat transformation. 4th Congress of the Hungarian Genetical Society, p 166.
Tamás C., Rakszegi M., Szőcs P., Tamás L., Bedı Z., 2000. Temperature, light and medium optimisation for plant regeneration of winter wheat varieties. 6th International Wheat Conference, p. 308. Budapest, Hungary, 5-9 June 2000.
118
Tamás, L., Gras, P.W., Solomon, R.G., Morell, M.K., Apples, R., Békés, F., 2002. Chain extension and termination as a function of cysteine content and the length of the central repetitive domain in storage proteins. Journal of Cereal Science 36, 313-325.
Tamás, C., Szucs, P., Rakszegi, M., Tamás, L., Bedo, Z., 2004. Effect of combined changes in culture medium and incubation conditions on the regeneration from immature embryos of elite varieties of winter wheat. Plant Cell Tissue and Organ Culture 79, 39-44.
Tamás, L. and Shewry, P.R., 2006. Heterologous expression and protein engineering of wheat gluten proteins. Journal of Cereal Science 43, 259-274.
Tatham, A.S. and Shewry, P.R., 1995. The S-poor prolamins of wheat, barley and rye. J. of Cer. Sci. 22, 1-16.
Terzi, V., Pastori, G., Shewry, P.R., Di Fonzo, N., Stanca, A.M., Faccioli, P., 2005. Real-time PCR-assisted selection of wheat plants transformed with HMW glutenin subunit genes. Journal of Cereal Science 41, 133–136.
Thorpe, T.A., 1980. Organogenesis in vitro: Structural, physiological and biochemical aspects. Int Rev Cytol Suppl 11, 71-111.
Tingay, S., McElroy, D., Kalla, R., Fieg, S., Wang, M., Thornton, S., Brettell, R., 1997. Agrobacterium tumefaciens-mediated barley transformation. The Plant Journal 11, 1369-1376.
Tosi, P., D’Ovidio, R., Napier, J.A., Bekes, F., Shewry, P.R., 2004. Expression of epitope-tagged LMW glutenin subunits in the starchy endosperm of transgenic wheat and their incorporation into glutenin polymers. Theor Appl Genet 108, 468–476.
Tosi, P., Masci, S., Giovangrossi, A., D’Ovidio, R., Bekes, F., Larroque, O., Napier, J., Shewry, P.R., 2005. Modification of the low molecular weight (LMW) glutenin composition of transgenic durum wheat: effects on glutenin polymer size and gluten functionality. Molecular Breeding 16, 113–126.
Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J., 1979. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets - Procedure and some applications. Proc Natl Acad Sci USA 76:4350-4354.
Tömösközi, S., Varga, J., Gras, P.W., Rath, C., Salgó, A., Nánási, J., Fogor, D. and Békés, F., 2000. Scale down possibilities in development of dough testing methods. in Proc. 7th International Workshop Gluten 2000, ISBN 0-85404-865-0, Univ. of Bristol, UK.
Tömösközi, S., Nádosi, M., Ercsey, K., Nánási, J., Varga, J., 2005. Development of small-scale methods for measuring wheat quality - A new instrument for determination of sedimentation value. 50 YEARS ICC JUBILEE CONFERENCE 1955-2005”Cereals - The future challange” Vienna, Austria July 3-6.
Tulecke, W.R., 1953. The pollen of Ginko biloba. In vitro culture and tissue formation. Am. J. Bot. 44, 602-608.
Tzafrir, I., Torbert, K.A., Lockhart, B.E.L., Somers, D.A., Olszewski, N.E., 1998. The sugarcane bacilliform badnavirus promoter is active in both monocots and dicots. Plant Molecular Biology 38, 347-356.
Uauy, C., Distelfeld, A., Fahima, T., Blechl, A., Dubcovsky, J., 2006. A NAC gene regulating senescence improves grain protein, zinc and iron content in wheat. Science 314, 1298–1301.
Ullrich, S.E., 2002. Genetics and breeding of barley feed quality attributes. In: Slafer, G.A., Molina-Cano, J.L., Savin, R., Araus, J.L., Romagosa, I. (Eds.), Barley Science: Recent Advances from Molecular Biology to Agronomy of Yield and Quality. Food Products Press, pp. 115–142.
119
Uthayakumaran, S., Békés, F., Gras, P.W., 1997. Effect of varying protein content and gliadin to glutenin ratio on the functional properties of wheat dough. In ’Proceedings of the 47th RACI Conference’ (A.W. Tarr, A.S. Ross, and C.W. Wrigley, eds.) The Royal Australian Chemical Institute, Melbourne, Australia, pp 212-216.
Uthayakumaran, S., Gras, P.W., Békés, F., 1998. A systematic study of the wheat storage proteins and their functionality. In ’Proceedings of the 48th RACI Conference’ (A.W. Tarr, A.S. Ross, and C.W. Wrigley, eds.) The Royal Australian Chemical Institute, Melbourne, Australia. 150-155.
Uthayakumaran, S., Gras, P.W., Stoddard, F.L., Békés, F. 1999. Effect of varying protein content and glutenin-to-gliadin ratio on the functional properties of wheat dough. Cereal Chemistry 76, 389-394.
Uthayakumaran, S., Gras, P.W., Stoodard, F.L., Békés, F., 2000. Optimized methods for incorporating glutenin subunits into wheat dough for extension and beaking studies. Cereal Chemistry 77, 731-736.
Uthayakumaran, S., Tömösközi, S., Savage, A.W.J., Tatham, A., Gianibelli, M.C., Stoddard, F.L. and Békés, F., 2001. Effects of gliadin fractions on the functional properties of wheat dough depend on molecular size and hydrophobicity. Cereal Chem. 78, 138-141.
Uthayakumaran, S., Lukow, O.M., Jordan, M,C., Cloutier, S., 2003. Development of genetically modified wheat to assess its dough functional properties. Molecular Breeding 11(4), 249-258.
Van Eenennaam, A.L., Lincoln, K., Durrett, T.P., Valentin, H.E., Shewmaker, C.K., Thorne, G.M., Jiang, J., Baszis, S.R., Levering, C.K., Aasen, E.D., Hao, M., Stein, J.C., Norris, S.R., Last, R.L., 2003. Engineering vitamin E content: From Arabidopsis mutant to soy oil. Plant Cell 15, 3007–3019.
Vasco-Méndez, N.L. and Parades-López, O., 1995. Antigenic homology between amaranth glutelins and other storage proteins. Journal of Food Biochemistry 18, 227-238.
Vasil, I.K., Bean, S., Zhao, J., McCluskey, P., Lookhart, G., Zhao, H.- P., Altpeter, F., Vasil, V., 2001. Evaluation of baking properties and gluten protein composition of field grown transgenic wheat lines expressing high molecular weight glutenin gene 1Ax1. J Plant Physiol 158, 521–528.
Vasil, I.K., 2007. Molecular genetic improvement of cereals: transgenic wheat (Triticum aestivum L.) Plant Cell Rep 26, 1133–1154.
Veraverbeke, W.S., Verbruggen, I.M., Delcour, J.A., 1998. Effects of increased high molecular weight glutenin subunits content of flour on dough mixing behaviour and breadmaking. Journal of Agricultural and Food Chemistry 46, 4830-4835.
Vogel, K.P., Johnson, V.A., Mattern, P.J., 1978. Protein and lysine contents of endosperm and bran of the parents and progenies of crosses of common wheat. Crop Science 18, 751–754.
Wakasa, K., Hasegawa, H., Nemoto, H., Matsuda, F., Miyazawa, H., Tozawa, Y., Morino, K., Komatsu, A., Yamada, T., Terekawa, T., Miyagawa, H., 2006. Highlevel tryptophan accumulation in seeds of transgenic rice and its limited effects on agronomic traits and seed metabolite profile. Journal of Experimental Botany 57, 3069-3078.
Weegels, P.L., Marseille, J.P., Bosveld, P., Hamer, R.J. l994. Large-scale separation of gliadins and their bread-making quality. Journal of Cereal Science 20, 253-264.
Weeks, T., 1998. USDA Agricultural Research Report.
120
Weir, B., Gu, X., Wang, M.B., Upadhyaya, N., Elliot, A.R., Brettell, R.I.S., 2001. Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation of wheat using suspension cells as a model system and green fluorescent protein as a visual marker. Australian Journal of Plant Physiology 28, 807-818.
White, P.J., Broadley, M.R., 2005. Biofortifying crops with essential mineral elements. Trends in Plant Science 10, 586-593.
Wieser, H., Seilmeier, W. and Kieffer, R. 1994. Relationship between the amount of gluten protein on rheological properties of different wheat cultivars. Pages 141-150. in: Gluten prteins 1993. Assoc. Cereal Res.:Detmold, Germany.
Wang, H.-Artim-Moore, L.: 2001. Efficient biolistic transformation of maize (Zea mays L.) and wheat (Triticum aestivum L.) using the phosphomannose isomerase gene, pmi, as the selectable marker. Plant Cell Reports 20, 429–436.
Wrigley, C.W., and Bietz, J.A., 1988. Proteins and amino acids. pp 159-275. in: Wheat: Chemistry and Technology Vol. 1, 3rd edition. Y. Pomeranz, Ed. Am. Assoc. Cereal Chem., St Paul, MN, USA.
Wu, H., Sparks, C.A., Jones, H.D., 2006. Characterization of T-DNA loci and vector backbone sequences in transgenic wheat produced by Agrobacterium-mediated transformation. Mol Breed 18, 195–208.
Wu, H. X. Doherty, A. Jones, H. D., 2007. Efficient and rapid Agrobacterium-mediated genetic transformation of durum wheat (Triticum turgidum L-var. durum) using additional virulence genes. Transgenic Research 17(3), 425-436.
Xia, G.M., Li, Z.Y., He, C.X., Chen, H.M., Brettell, R., 1999. Transgenic plant regeneration from wheat (Triticum aestivum L.) mediated by Agrobacterium tumefaciens. Acta Phytophysiologica Sinica 25, 22-28.
Ye, X., Beyer, P., 2000. Engineering the provitamin A (beta-carotene) biosynthetic pathway into (carotenoid-free) rice endosperm. Science 287, 303–305.
Yu, J., Peng, P., Zhang, X., Zhao, Q., Zhy, D., Sun, X., Liu, J., Ao, G., 2004. Seed-specific expression of a lysine rich protein sb401 gene significantly increases both lysine and total protein content in maize seeds. Molecular Breeding 14, 1–7.
Zhang, S., Cho, M.J., Koprek, T., Yun, R., Bregitzer, P., Lemaux, P.G., 1999. Genetic transformation of commercial cultivars of oat (Avena sativa L.) and barley (Hordeum vulgare L.) using in vitro shoot meristematic cultures derived from germinated seedlings. Plant Cell Reports 18, 959-966.
Zhang, L., Rybczynski, J.J., Langenberg, W.G., Mitra, A., French, R., 2000. An efficient wheat transformation procedure: transformed calli with long-term morphogenic potential for plant regeneration. Plant Cell Reports 19, 241-250.
Zhang W., Subbarao S., Addae P., Shen A., Armstrong C., Peschke V., Gilbertson L., 2003a. Cre/lox-mediated marker gene excision in transgenic maize (Zea mays L.) plants. Theoretical and Applied Genetics 107, 1157–1168.
121
Zhao, Y., Qian, Q., Wang, H., Huang, D., 2007. Heredity Behavior of bar Gene Cassette is Complex in Rice Mediated by Particle Bombardment. J of Gen and Genom 34, 824-835.
Zhao, Z.-Y., Glassman, K., Sewalt, V., Wang, N., Miller, M., Chang, S., Thompson, T., Catron, S., Wu, E., Bidney, D., Kedebe, Y., Jung, R., 2003. Nutritionally improved transgenic sorghum. In: Vasil, I.K. (Ed.), Plant Biotechnology 2002 and Beyond. Kluwer Academic Publishers, Dordrecht, pp. 413–416.
Zhu, C., Naqvi, S., Gomez-Galera, S., Pelacho, A.M., Capell, T., Christou, P., 2007. Transgenic strategies for the nutritional enhancement of Plant. TRENDS in Plant Science Vol.12 No.12.
Zuber, M.S., Darrah, L.L., 1987. Breeding, genetics and seed corn production. In: Watson, S.A., Ramstad, P.E. (Eds.), Corn: Chemistry and Technology. AACC, St. Paul, MN, pp 31–51.
122
8. FÜGGELÉK
I. táblázat İszi búza éretlen embriók szövettenyésztésében alkalmazott táptalajok Táptalaj Táptalaj összetétel BEG 2 MS makro- és mikroelemek (Murashige és Skoog, 1962). 770 µg/l glicin, 130 µg/l
MD1 Mint MD0,5 de 1 mg/l 2,4-D tartalmú MD2 Mint MD0,5 de 2 mg/l 2,4-D tartalmú R0 L7 makroelemek (Barro és mtsai., 1999), L mikroelemek, MS Fe-Na-EDTA, L
Val 4,28 4,26 4,34 (1,4) 4,34 (1,4) 4,34 (1,4) 4,34 (1,4) 4,33 (1,2) Az értékek három párhuzamos mérés átlagai. A standard error ±0,01. Zárójelben a nem transzformált búza növény lisztjében mért aminosav tartalomhoz viszonyított növekedést adtuk meg %-ban.
124
I. ábra A valorigram és a belıle leolvasható paraméterek
M A G L P
ATCAGATTAACATAATTTCACAATAAAAAAAAAAAAAAGAGCTTAAATGGCGGGATTACC 60 V I M C L K S N N N Q K Y L R Y Q S D N AGTGATTATGTGCCTAAAATCAAATAACAACCAGAAGTACTTAAGATATCAAAGTGATAA 120 I Q Q Y G L L Q F S A D K I L D P L A Q TATTCAACAATATGGTCTTCTTCAATTTTCAGCTGATAAGATTTJAGATCCATTAGCTCA 180 F E V E P S K T Y D G L V H I K S R Y T ATTTGAAGTCGAACCTTCCAAGACTTATGATGGTCTTGTTCACATCAAATCTCGCTACAC 240 N K Y L V R W S P N H Y W I T A S A N E TAACAAATATTTGGTTAGGTGGTCTCCCAATCATTATTGGATTACAGCATCAGCCAATGA 300 P D E N K S N W A C T L F K F L Y V E E ACCAGATGAAAATAAAAGCAATTGGGCATGCACATTATTCAAACCACTTTACGTAGAAGA 360 G N M K K V R L L H V Q L G H Y T E N Y AGGTAACATGAAAAAGGTTCGACTTTTGCACGTCCAATTAGGTCATTATACAGAAAATTA 420 T V G G S F V S Y L F A E S S Q I D T G TACCGTTGGTGGGTCCTTCGTATCATACTTATTTGCCGAATCAAGTCAAATTGATACCGG 480 S K D V F H V I D W K S I F Q F P K T Y CTCTAAAGACGTATTCCATGTCATAGATTGGAAATCAATCTTTCAATTTCCCAAAACATA 540 V T F K G N N G K Y L G V I T I N Q L P TGTCACATTTAAAGGAAATAATGGAAAATATTTAGGGGTTATCACAATTAATCAACTTCC 600 C L Q F G Y D N L N D P K V A H Q M F V ATGTCTACAATTTGGGTATGATAATCTTAATGATCCAAAGGTGGCTCATCAAATGTTTGT 660 T S N G T I C I K S N Y M N K F W R L S CACTTCTAATGGTACTATTTGCATTAAATCCAATTATATGAACAAGTTTTGGAGACTCTC 720 T D N W I L V D G N D P R E T N E A A A TACGGATAATTGGATATTAGTCGATGGGAATGATCCTCGCGAAACTAATGAAGCTGCTGC 760 L F R S D V H D F N V I S L L N M Q K T GTTGTTTAGGTCGGATGTGCATGATTTTAATGTGATTTCGCTTTTGAACATGCAAAAAAC 840 U F I K R F T S G K P E F I N C M N A A TTGGTTTATTAAGAGATTTACGAGTGGTAAGCCTGAGTTTATAAATTGTATGAATGCAGC 900 T Q I V D E T A I L E I I E L G S StpStp TACTCAAATTGTTGATGAAACTGCTATTTTAGAGATAATAGAATTGGGATCCAACAACTA 960 ATATATTGGATTGCTTTTAAGATTCAAATTAAAGTCTAGTTGTTAATGTAAGGAATAAAA 1020 CGTTGTAAGTCGTCTCTTTGGAAACAAGAGGGTTCTTCCTTGTATCATATCTCTATGGTC 1080 TCTTTCAGATTTTGACCATAAGATTACTATTAAATACTTGTAATGTGTTTGTCTGTGATG 1140 ATTACTCTTTGTTGGAATAAAATAATTGTTAGAATTATATTAC 1183
II. ábra Az AmA1 fehérje aminosav szekvenciája. A lizin (K) és a cisztein (C) aminosavakat
vastagított, valamint vastagított és aláhúzott betőkkel jelöltük.