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Dr. habil. Maria Mulisch Christian-Albrechts-Universität zu Kiel Zentrale Mikroskopie im Biologiezentrum Am Botanischen Garten 5 24098 Kiel

Prof. Dr. med. Dr. rer. nat. Ulrich Welsch Anatomische Anstalt: Anatomie II LMU München Pettenkoferstr. 11 80336 München

Wichtiger Hinweis für den BenutzerDer Verlag, die Herausgeber und die Autoren haben alle Sorgfalt walten lassen, um vollständige und akkurate Informationen in diesem Buch zu publizieren. Der Verlag übernimmt weder Garantie noch die juristische Verantwortung oder irgendeine Haftung für die Nutzung dieser Informationen, für deren Wirtschaftlichkeit oder fehlerfreie Funktion für einen bestimmten Zweck. Der Verlag übernimmt keine Gewähr dafür, dass die beschriebenen Verfahren, Programme usw. frei von Schutzrechten Dritter sind. Die Wiedergabe von Gebrauchsnamen, Handelsnamen, Warenbezeichnungen usw. in diesem Buch berechtigt auch ohne beson-dere Kennzeichnung nicht zu der Annahme, dass solche Namen im Sinne der Warenzeichen- und Markenschutz-Gesetzgebung als frei zu betrachten wären und daher von jedermann benutzt werden dürften. Der Verlag hat sich bemüht, sämtliche Rechtein-haber von Abbildungen zu ermitteln. Sollte dem Verlag gegenüber dennoch der Nachweis der Rechtsinhaberschaft geführt wer-den, wird das branchenübliche Honorar gezahlt.

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18. Auflage 2010© Spektrum Akademischer Verlag Heidelberg 2010Spektrum Akademischer Verlag ist ein Imprint von Springer

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Das Werk einschließlich aller seiner Teile ist urheberrechtlich geschützt. Jede Verwertung außerhalb der engen Grenzen des Urheberrechtsgesetzes ist ohne Zustimmung des Verlages unzulässig und strafbar. Das gilt insbesondere für Vervielfältigungen, Übersetzungen, Mikroverfilmungen und die Einspeicherung und Verarbeitung in elektronischen Systemen.

Planung und Lektorat: Dr. Ulrich G. Moltmann, Martina MechlerRedaktion: Ulrich Markmann-MulischUmschlaggestaltung: SpieszDesign, Neu–UlmTitelbild: Kryostatschnitt (16 μm) von Mausniere, der mit einer Kombination verschiedener Fluoreszenzmarker gefärbt wurde: Weizenkeimagglutinin (WGA) gekoppelt an Alexa 488 (grün), Phalloidin (bindet an Actin) gekoppelt an Alexa 568 (rot) und DAPI zur Darstellung der Zellkerne (blau). 3-Kanal Bild (CLSM: SP5 von Leica Microsystems). Aufnahme: Dr. Olga Levai, Leica Microsystems. Präparat: Molecular Probes (slide #3, F-24630)Zeichnungen und Bearbeitung: Martin Lay, Breisach a. Rh.Index: Bärbel HäckerSatz: TypoStudio Tobias Schaedla, Heidelberg

ISBN 978-3-8274-1676-6

Dr. Erna Aescht (Präparationstechniken und Färbungen von Protozoen und Wirbellosen für die Lichtmikroskopie) Biologiezentrum der Oberösterreichischen Landesmuseen Johann-Wilhelm-Klein-Straße 73 A-4040 Linz

Simone Büchl-Zimmermann (Präparationsmethoden, part., Medizinische Cytodiagnostik, Präparationstechniken u. Färbungen v. speziellen Geweben, part.) Universitätsklinikum Ulm Akademie für Gesundheitsberufe Schule für Medizinisch-technische Laboratoriumsassistenz Schlossstr. 42 b/c 89079 Ulm-Wiblingen

Dr. Anja Burmester (Präparationstechniken und Färbungen von Pflanzengewebe für die Lichtmikroskopie) Vossberg 30 23617 Stockeldorf

Stefan Dänhardt-Pfeiffer (Präparationsmethoden, part.) Microscopy Services Dähnhardt GmbH Mühlenberg 10 24220 Flintbek

Dr. Christine Desel (In Situ-Hybridisierung) Botanisches Institut und Botanischer Garten Christian-Albrechts-Universität zu Kiel Olshausenstr. 40 24098 Kiel

Dr. Christoph Hamers (Qualitative und quantitative Analysen, part.) Nikon GmbH Geschäftsbereich Mikroskope/Optische Messtechnik Tiefenbroicher Weg 25 40472 Düsseldorf

Dr. Guido Jach (Reportergene) Phytowelt GreenTechnologies GmbH Carl-von-Linné-Weg 10 D- 50829 Köln

Dr. Manfred Kässens (Mikroskopische Verfahren, Part 1.2 Elektronenmikroskopie) Olympus Soft Imaging Solutions GmbH Technical Product Information Johann-Krane-Weg 39 48149 Münster

Prof. Dr. Josef Makovitzky (Einsatz der Polarisationsmikroskopie für die medizinische Diagnostik) Abt. Neuropathologie Universität Heidelberg Im Neuenheimer Feld 220 D-69120 Heidelberg

Dr. habil. Maria Mulisch (Präparationsmethoden, Immunlokalisation, Tissue-Printing) Christian-Albrechts-Universität zu Kiel Zentrale Mikroskopie im Biologiezentrum Am Botanischen Garten 5 24098 Kiel

PD Dr. Barbara Nixdorf-Bergweiler (Präparationsmethoden, part.) Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg Institut für Physiologie und Pathophysiologie Universitätsstraße 17

Detlef Pütz (Qualitative und quantitative Analysen, part.) Nikon GmbH Geschäftsbereich Mikroskope/Optische Messtechnik Digital Imaging Tiefenbroicher Weg 25 40472 Düsseldorf

Bernd Riedelsheimer (Präparationsmethoden, part.; Färbungen, Präparationstech-niken u. Färbungen v. speziellen Geweben, part.; Laborsicherheit) Anatomische Anstalt: Anatomie II LMU München Pettenkoferstr. 11 80336 München

Dr. Frank van den Boom (Qualitative und quantitative Analysen, part.) Nikon GmbH Geschäftsbereich Mikroskope/Optische Messtechnik Tiefenbroicher Weg 25 40472 Düsseldorf

Dr. Rainer Wegerhoff (Mikroskopische Verfahren, part.) Olympus Europa Holding Knowledge Management and Service Marketing – Microscopy Wendenstr. 14-18 20097 Hamburg

Prof. Dr. med. Dr. rer. nat. Ulrich Welsch (Präparationsmethoden, Färbungen, Enzymhistochemie, Cytogenetik; Präparationstechniken u. Färbungen v. speziel-len Geweben) Anatomische Anstalt: Anatomie II LMU München Pettenkoferstr. 11 80336 München

Benno Romeis wurde am 3. April 1888 in München als Sohn des Architekten und kgl. Professors an der Kunstgewerbeschu-le Leonhard Romeis geboren. Er besuchte das Humanistische Gymnasium in München und begann im Jahre 1906 mit dem Studium der Medizin an der Ludwig Maximilians Universität München. Er war schon früh von der Welt der mikroskopi-schen Anatomie fasziniert und richtete sich ab dem 3. Semester zuhause ein kleines histologisches Laboratorium ein. In seiner Freizeit arbeitete er gern in einer chirurgischen Privatpraxis in München. Ab 1909 erhielt er einen Hilfsassistentenvertrag am histologisch-embryologischen Institut der Anatomischen Anstalt der Universität München (Direktor Prof. Siegfried Mollier). 1910 besuchte er für einige Monate die Zoologische Station in Neapel. 1911 beendete er das Medizinstudium und promovierte mit summa cum laude über die Architektur des verkalkenden Knorpels zum Dr. med. Im gleichen Jahr wur-de er Assistent am histologisch-embryologischen Institut der Münchener Anatomie und arbeitete hier insbesondere unter der Anleitung des Prosektors Alexander Böhm. Von August 1914 bis Dezember 1918 leistete er den Heeresdienst als Kriegsfreiwilliger; er versah militärärztlichen Lazarettdienst und blieb gleichzeitig in der Anatomischen Anstalt tätig, wo er im Bereich Mikroskopie und Makroskopie unterrichtete und außerdem sogar noch wichtige endokrinologische For-schungen durchführte. 1918 habilitierte er sich mit einer ex-perimentellen Arbeit über die Entwicklung von Kaulquappen, 1923 wurde er planmäßiger a. o. Professor und Leiter der Ab-teilung für experimentelle Biologie an der Anatomischen An-stalt in München. In den folgenden Jahren erhielt er zahlreiche Ehrungen und wurde u. a. Mitglied der Leopoldina in Halle und der Bayerischen Akademie der Wissenschaften. 1944 wurde er zum o. ö. Professor für Anatomie an der Universität München berufen, und dies in einer Zeit, in der er, auch in Vorlesungen, mutig aus seiner klaren Abneigung gegen das Gedankengut und das Vorgehen der Nationalsozialisten nie einen Hehl gemacht hat. Ab 1933 verfolgte jüdische Kollegen, u. a. den Anatomen Professor Fritz Wassermann, schützte er aufrecht auch gegen den politisch-ideologischen Widerstand im Institut und in der Universität solange irgend möglich. Nach dem Zusammenbruch war er 1945 einer der wenigen, die der Medizinischen Fakultät der Universität München un-

verzüglich und unbelastet zur Verfügung standen. Er wurde bis 1947 kommissarischer Leiter der gesamten Anatomie und arbeitete unter widrigen Bedingungen für Neuaufbau und Neubeginn nach Krieg und Nationalsozialismus. Nach 1947 war er Inhaber des Lehrstuhls für Histologie und Embryologie in der Anatomischen Anstalt. Sein Unterricht für Medizinstu-denten galt allgemein als anspruchsvoll.

Sein wissenschaftlicher Schwerpunkt lag im Bereich der Erforschung der Funktionen endokriner Organe. Er bediente sich dazu eines breiten Spektrums histologischer Techniken, die er meisterlich anwendete und interpretierte und deren methodische Grenzen er immer respektierte. So gelang es ihm mit sicherem Gespür z. B. die wesentlichen Zelltypen der Adenohypophyse verlässlich zu identifizieren. Den sei-nerzeitigen Wissensstand zur Histo-Physiologie der Hypo-physe fasste er auf 600 Seiten 1940 zusammen. Unter vielem anderen erkannte er schon zu diesem Zeitpunkt in der Adenohypophyse Stammzellen, die er auch so nannte, und deren Proliferationswege. Eine gewisse Tragik lag darin, dass ihm noch keine immunhistochemischen Methoden zur Ver-fügung standen, die seine Hypophysenforschung schneller vorangebracht hätte. Ein weiterer Forschungsschwerpunkt waren das Altern von Geweben im Laufe des Lebens und die Auswirkungen experimenteller „Verjüngungsmaßnahmen“ des Menschen.

Ab 1917 betreute Benno Romeis das „Taschenbuch der mikroskopischen Technik“. Die Bearbeitung und Herausgabe dieses Buches ab der 8. Auflage wurde eine Lebensaufgabe, die ihn über 8 Auflagen bis 1968 begleitete.

Er war als unbestechlicher Forscher hoch geachtet und war als „Augenmensch“ offen für Schönheit und Vielfalt der Natur und besaß eine enge Beziehung zur bildenden Kunst verschiedener Epochen und Kulturen. Unglücklicherweise wurde sein Leben von stetig zunehmender Schwerhörigkeit überschattet, für die es seinerzeit noch keine effektiven The-rapien gab.

Auch nach seiner Emeritierung 1956 kam er noch viele Jahre täglich in sein Labor und arbeitete dort unter Auf-rechterhaltung regelmäßiger Korrespondenz mit in- und ausländischen Kollegen bis kurz vor seinem Tod am 30. November 1971 in München.

Im Jahr 1890 ist ein von Alexander Böhm und Albert Op-pel verfasstes „Taschenbuch der mikroskopischen Technik“ erschienen, das eine kurze Anleitung zur mikroskopischen Untersuchung der Gewebe und Organe der Wirbeltiere und des Menschen enthielt (unter Berücksichtigung der emb-ryologischen Technik). Das Werk konnte in rascher Folge neu aufgelegt werden.

1917 wurde der Anatom und Histologe Benno Romeis zur Weiterführung des Taschenbuchs aufgefordert. Die Be-treuung und Herausgabe wurde zu seiner Lebensaufgabe, die ihn von der 8. Auflage (1919) bis zur 16. Auflage (1968) begleitete. Stetig ergänzte und erweiterte er den Text des Buches, das bald in allen medizinisch-histologischen Labo-ratorien der Welt als umfassendes Methodenbuch geschätzt und verwendet wurde. Seit der 15. Auflage (1948) erschien das Werk unter dem Titel „Mikroskopische Technik“. Seit-dem wurde auch der Name ROMEIS synonym für die-ses Standardreferenzwerk der Mikroskopie, das optimale Methoden für alle Gewebe- und Organtypen, auch emb-ryonale, berücksichtigt. Die allermeisten der enthaltenen Anweisungen wurden von Romeis nachgeprüft und durch eigene Erfahrungen vervollständigt. Er scheute sich nicht, auf alle möglichen Fehlermöglichkeiten hinzuweisen und behandelte das Handwerkliche der Laborarbeit überaus sorgfältig, sodass das Buch zum unentbehrlichen Ratgeber für ungezählte Studierende, Forscher und technische Assis-tentinnen wurde. Die 17. Auflage (1989) wurde von Peter Böck (Institut für Mikromorphologie und Elektronenmik-roskopie der Universität Wien) mit Beiträgen von mehreren Fachkollegen herausgegeben.

Zurzeit erlebt die Mikroskopie in Biologie und Medizin einen ungeheuren Aufschwung. Die in den letzten Jahren sequenzierten Gene und Proteine werden nicht mehr iso-liert im „Reagenzglas“ betrachtet, sondern es interessieren ihre Rolle in der Zelle, ihr Zusammenspiel mit anderen Molekülen und Zellstrukturen, ihre zeitliche und räumli-che Verteilung. Durch neue mikroskopische Geräte und moderne Präparations- und Markierungsmethoden können diese wissenschaftlichen Fragestellungen an lebenden oder lebensnah erhaltenen Zellen geklärt werden. Antikörper ermöglichen es, krankhafte Veränderungen im Präparat

zu identifizieren, bevor sie strukturell erkennbar werden. Gleichzeitig steigt das Interesse an eingebetteten und ge-schnittenen Präparaten für die Untersuchung der Morpho-logie und Ultrastruktur einer steigenden Zahl von Mutan-ten und gentechnisch veränderten Organismen. Für die neuen Fragestellungen wurden und werden ständig neue Geräte, Rezepte und Substanzen entwickelt. Es wurde also dringend Zeit für eine Aktualisierung des ROMEIS.

Die Konzeption der neuen 18. Auflage war eine Her-ausforderung. Welche Rezepte sind überholt, welche müs-sen unbedingt erhalten bleiben? Welche modernen Metho-den sollen integriert werden? Welcher Wissensstand kann bei den Nutzern vorausgesetzt werden? Der neue ROMEIS sollte wieder ein Laborhandbuch und Nachschlagewerk für alle im Labor tätigen Mediziner, Naturwissenschaftler, Studierende und Lehrer werden. So ergab es sich, dass medizinisch geprägte Abschnitte neben naturwissenschaft-lich ausgerichteten stehen. Er sollte einen Überblick über die aktuellen mikroskopischen Methoden vermitteln und damit Hilfestellung geben können, welche Techniken für eine bestimmte Fragestellung einzusetzen sind. Er soll-te zudem genügend Hintergrundwissen vermitteln, um beispielhafte Anleitungen an andere Fragestellungen und andere Objekte adaptieren zu können. Schließlich umfasst die moderne Biologie ein wirklich weites (und sich ständig erweiterndes) Spektrum an Probenmaterial und Fragestel-lungen. Damit ergeben sich hohe Ansprüche an Inhalt und Verständlichkeit.

Die klassische Histologie ist Standardlehrstoff in Schu-len für Medizinisch-Technische Assistentinnen. In der Aus-bildung von Medizin- und Zahnmedizinstudierenden mit Pflichtkurs „Histologie und Mikroskopische Anatomie“ ist sie präsent wie in allen medizinischen Laboratorien, z.B. in der Pathologie, wo sie tagtäglich tausende Male angewendet wird. Da der Umfang der Neuauflage nicht über ein hand-habbares Maß vermehrt werden sollte, wurde die große An-zahl von bewährten klassischen histologischen Methoden von Fachleuten auf ihre Aktualität hin überprüft, gestrafft und oft in Details abgewandelt und aktualisiert.

Der neue ROMEIS ist farbig und übersichtlich gestaltet – was bei der Vielzahl und Vielfalt der Präparationsmög-

lichkeiten nicht einfach war. Er enthält leicht auffindbare, standardisierte und technisch eindeutige Anleitungen, die bei der Lösung wissenschaftlicher Fragestellungen erprobt wurden. Alte Begriffe wurden durch neue ersetzt, „Al-kohol“ durch Ethanol (oder entsprechende Lösungsmit-tel), Wasser (H2O) steht für chemisch reines Wasser (z.B. Millipore-gefiltertes Wasser); ansonsten wurde die entspre-chende Wasserqualität (z.B. Leitungswasser, Aqua bidest) eingesetzt. Die Zusammensetzungen häufig verwendeter Lösungen (z.B. Puffer) werden im Tabellen-Anhang auf-geführt, ebenso gebräuchliche Fluoreszenzfarbstoffe und Filterkombinationen.

Der Anstoß zur Neubearbeitung des Werkes kam vom Biologie-Programmleiter des Spektrum Verlags Ulrich G. Moltmann, der bei der Konzeption und Koordination des Werkes geholfen hat. Viel Zeit und Mühe hat die Projekt-lektorin Martina Mechler in das Lektorat und die Herstel-lung des Werkes investiert. Ulrich Markmann-Mulisch hat unter großem Zeitaufwand die Abschnitte der verschiede-nen Autoren formal und wissenschaftlich redigiert und mit Unterstützung durch Herrn Bernd Riedelsheimer stilistisch und terminologisch vereinheitlicht. Ihnen allen gilt unser ausdrücklicher Dank.

Der Wert des neuen ROMEIS ist aber erst durch die Expertise der Autoren entstanden. Es ist uns gelungen, Fachleute aus Forschung, Lehre und Industrie zu gewinnen, die die neusten mikroskopischen Methoden eingebracht haben.

Folgenden Kollegen sind wir für die freundliche Über-lassung von Präparaten, Fotos, Färbeanleitungen und Prä-parationstechniken sehr dankbar:

Patrick Adam, Institut für Pathologie der Universität WürzburgGerald Assmann, Institut für Pathologie der LMU Mün-chenJoachim Diebold, Institut für Pathologie am Luzerner KantonsspitalAdelheid Egdmann, MTA-Schule NürnbergBernd Feyerabend, Institut für Pathologie der Universi-tät KielMichael Frotscher, Anatomisches Institut der Universi-tät Freiburg

Maja Hempel, Institut für Humangenetik der TU Mün-chenThomas Meitinger, Institut für Humangenetik der TU MünchenElisabeth Messmer, Augenklinik der LMU MünchenCornelius J.F. Van Noorden, Department of Cell Biolo-gy and Histology, University of AmsterdamUdo Schumacher, Anatomisches Institut der Universität HamburgAnette Serbin, Histologisches Labor, Augenklinik der LMU MünchenCaroline Sewry, Imperial College, Division of Medicine, LondonSybille Warmuth, MTA-Schule der LMU MünchenRainer Wimmer, Institut für Humangenetik der LMU MünchenMarita Beese, Zentrale Mikroskopie der CAU, Kiel

Folgende Mitarbeiter der Anatomischen Anstalt der LMU München haben die Entstehung des Werkes unterstützt: Beate Aschauer, Andrea Asikoglu, Ursula Fazekas, Claudia Köhler, Astrid Sulz, Sabine Tost, Pia Unterberger und Gitta Ziegleder. Karin Müller vom Histopathologischen Labor der UKSH Kiel hat den Abschnitt „Fixierungen“ kritisch durchgesehen und ergänzt. Jan-Hendrik Wegner half bei der Bildbearbeitung.

Zum Gelingen des neuen ROMEIS beigetragen haben weitere, hier ungenannte Kollegen und Mitarbeiter, die ihre Zeit, ihr Wissen und ihre Erfahrungen, beispielhafte Präpa-rate, laborerprobte Rezepte oder wunderbare Abbildungen für das Buch zur Verfügung gestellt haben. Vielen, vielen Dank an alle dafür.

Ein besonderer Dank von M. M.: Ich danke meinem Mann, der mich sehr ermutigt und unterstützt hat; und ich danke Klaus Hausmann, der mir die Grundlagen (und die Freude an) der Mikroskopie vermittelte.

Die Herausgeber, Kiel und München, im Frühjahr 2010Maria Mulisch (Zentrale Mikroskopie im Biologiezentrum der Universität Kiel)Ulrich Welsch (Anatomische Anstalt der LMU München)

Erst zu Beginn des 19. Jahrhunderts entwickelte sich das Mikroskop vom Apparat der Volksbelustigung zum äußerst wichtigen wissenschaftlichen Instrument in der Medizin und in den Naturwissenschaften – und das, obwohl es bereits im 17. Jahrhundert aus diesen Wissenschaften nicht wegzuden-ken war. So bemerkte Goethe: »Nachdem man in der zweiten Hälfte des 17ten Jahrhunderts dem Mikroskop so unendlich viel schuldig geworden war, so suchte man zu Anfang des 18. Jahrhunderts dasselbe geringschätzig zu behandeln«. Aber auch noch im 19. und 20. Jahrhundert wurden die Kon-strukteure hochwertiger Mikroskope – im Unterschied zu den Anwendern – oft nur beiläufig erwähnt (Abb. 1.1).

Seit über 400 Jahren ist das zusammengesetzte, aus Objektiv und Okular bestehende, Mikroskop bekannt. Lässt sich der Erfinder auch nicht mehr mit Sicherheit ermitteln, so steht fest, dass holländische Optiker einen wesentlichen Beitrag in den Anfängen der Entwicklung des Mikroskops geleistet haben. Unumstritten ist jedoch, dass der Begriff „Mikroskop“ (aus dem Griechischen, mikros = klein und skopein = sehen) im Jahre 1625 durch Johannes Faber von Bamberg in Analogie zu dem Begriff „Teleskop“ (aus dem Griechischen, tele = entfernt) eingeführt wurde. Um das Mikroskop für den wissenschaftlichen Einsatz zu optimie-ren, mussten besonders die mechanischen und optischen Eigenschaften verbessert werden. Besonders in der Früh-phase der Mikroskopie stellte die Mechanik der oftmals aus Holz und Pappe gebauten Instrumente den limitierenden Faktor dar. Dies galt vor allem bei der Herstellung zusam-mengesetzter Mikroskope, sodass es nicht überrascht, dass ihnen das einfache, also einlinsige, Mikroskop auch noch über 50 Jahre nach der Erfindung des zusammengesetzten Mikroskops weit überlegen war. Dies zeigt sich in beein-druckender Weise durch die Entdeckungen von Antoni van Leeuwenhoek (1632–1723), der mit einem einfachen Mikroskop Schimmelpilze, Blut, Zahnbelag und Sperma bis hin zu Vogelfedern und Fischschuppen untersuchte. Er entdeckte dabei unter anderem die Erythrocyten, die Spermien, einzellige Lebewesen und die Fotorezeptoren der Retina. Damit leistete er einen wesentlichen Beitrag zu den Grundlagen der wissenschaftlichen Mikroskopie. Im Unterschied zu (den meisten) heutigen Wissenschaftlern

Die Verwendung von mikroskopischen Verfahren hat sich in den letzten Jahrzehnten mehrfach und umfangreich den neuen Anwendungen und Anforderungen in den biomedizi-nischen und auch materialwissenschaftlichen Anwendungen angepasst. Im gleichen Zuge haben Neuentwicklungen im opto-digitalen Umfeld zur verbesserten Beantwortung von Fragestellungen und zur Verwendung neuer Verfahren bei-getragen. Heutige Mikroskopie spannt den Bogen von visua-lisierenden Routineaufgaben, wie die Begutachtung von Zell-kulturen, hin zur analytischen Laserscanning-Mikroskopie.

Um diesen Bogen, in aller gebotenen Kürze, für die An-wendung der heutigen Mikroskopie hier darzulegen, haben folgende Mitarbeiter der Firma Olympus mit unterschied-lichsten Beiträgen zur Realisierung beigetragen: Dr. Bülent Peker, Dr. Winfried Busch, Heiko Gäthje, Wolfgang Hempel, Dr. Hauke Kahl, Martin Maass, Dr. Jens Marquardt und Klaus Willeke.

Es gehört zu den alten Menschheitsträumen, ferne Dinge nah (Teleskop) und kleine Dinge groß sehen zu können (Mikroskop). Dass dabei nicht immer wissenschaftliches Interesse im Vordergrund stand, verdeutlicht insbeson-dere antiquarische Literatur mit Buchtiteln wie „Mikro-skopische Gemüths- und Augen-Ergötzung“ von Martin Frobenius Ledermüller (1719–1769), dem Assistenten des Naturalienkabinetts in Bayreuth.

fertigte er seine Mikroskope selbst und teilte diese Kennt-nis mit niemandem.

Als Meilensteine in der Entwicklung der Optik für Mi-kroskope gelten unter anderem die Beseitigung von Bild-fehlern wie der chromatischen und sphärischen Aberration (Kap. 1.1.5.1). Der erste wesentliche Schritt erfolgte 1733 durch Chester Moor Hall, dem es gelang, durch die Verkit-tung einer Kronglas- und einer Flintglaslinse die chroma-tische Aberration zu korrigieren. Hall machte diese Entde-ckung jedoch nicht publik. Bekannt wurde diese bahnbre-chende Erfindung erst 1758 durch John Dollond und seinen Sohn Peter, die diese Versuche vermutlich unabhängig von Hall durchführten. Jedoch wurde ihre Entdeckung zunächst nur bei der Konstruktion von Fernrohren berücksichtigt. Erst um 1770 bauten Jan van Deyl und sein Sohn Harmanus das erste achromatische Mikroskopobjektiv. Es dauerte je-doch wegen der Schwierigkeit, kleine Kittglieder zu fertigen, mehrere Jahrzehnte, bis Achromaten serienmäßig hergestellt wurden. Zum Durchbruch verhalfen letztlich die Pariser Optiker Jacques Louis Vincent Chevalier (1770–1841) und Charles Louis Chevalier (1804–1859), durch deren Arbeiten Achromaten in der Mikroskopie einen Siegeszug antraten.

Neben der Vergrößerung eines mikroskopischen Sys-tems ist insbesondere das Auflösungsvermögen von Be-deutung (Kap. 1.1.5.2). Der Zusammenhang zwischen Öff-nungswinkel des Objektivs und Auflösung wurde erstmals 1810 von Joseph Jackson Lister erkannt, was zu einem Um-denken beim Bau von Mikroskopobjektiven führte. Bereits drei Jahre später schlug Sir David Brewster, der Erfinder des Kaleidoskops, die Ölimmersion vor. Er war jedoch der Überzeugung, damit Achromasie erzeugen zu können, was, wie wir heute wissen, ein Trugschluss war. Der italieni-sche Instrumentenbauer Giovanni Battista Amici entdeckte 1847 die Wasserimmersion als Möglichkeit, eine höhere Auflösung zu erzielen. Seine Versuche mit Anisöl als Im-mersionsmittel (immergere, lat. = eintauchen) fanden aller-dings wenig Beachtung. Heute werden Öle und Wasser oft als optische Immersionsmedien eingesetzt, um eine höhere Auflösung zu erzielen (Abb. 1.1).

Die Geschichte des Lichtmikroskops wurde Mitte des 20. Jahrhunderts von vielen Wissenschaftlern für beendet erklärt, nicht zuletzt durch die Erfindung des Elektro-nenmikroskops. Dass dies ein Irrtum war, zeigen zahl-reiche Weiterentwicklungen in der Lichtmikroskopie wie z. B. das konfokale Laserscanning-Mikroskop (cLSM), das im Wesentlichen auf ein Patent durch Marvin Minsky im Jahre 1957 zurückzuführen ist oder die Zwei-Photonen-Mikroskopie, deren Grundstein bereits 1931 durch Maria Goeppert-Mayer gelegt wurde. In Zusammenarbeit von Mikroskopherstellern und Biowissenschaftlern wurden und werden stets neue Techniken für immer anspruchs-vollere Fragestellungen entwickelt, sodass das Ende des Mikroskopierens mit Licht nicht in Sicht ist. Im Gegenteil: Die wissenschaftlichen Publikationen mit lichtmikroskopi-

schen Techniken in der Biomedizin nehmen in Anzahl und Qualität ständig zu. Geschichtlich interessierte Leser seien auf die Homepage des virtuellen Mikroskop-Museums un-ter www.mikroskop-museum.de verwiesen, wo die Histo-rie des Lichtmikroskops von Anfang an bis in die jüngste Vergangenheit beschrieben wird.

Um die verschiedenen traditionellen und modernen licht-mikroskopischen Verfahren einzuordnen und in ihrer Bild-gebung zu interpretieren, ist das grundsätzliche Verständnis einiger physikalischer Grundlagen von Bedeutung. Die hier in aller Kürze aufgezeigten Grundlagen mögen dem inte-ressierten Leser als Anhaltspunkt für weitere Recherche

dienen. An dieser Stelle sei exemplarisch auf die vielfältige Webseiten der Florida State University zur Mikroskopie und der damit verbundenen physikalischen Hintergründe hin-gewiesen (www.microscopy.fsu.edu/primer/index.html).

Sprachgebräuchlich wird als Licht der Anteil der elek-tromagnetischen Strahlung bezeichnet, den wir mit den Augen sehen können. Dies umfasst ein Wellenlängenspek-trum von ca. 400–750 nm.

Die mit dem Auge erkennbaren Farben des Lichtes ent-stehen durch die unterschiedlichen Wellenlängen und de-ren Mischung (Abb. 1.2). In der Lichtmikroskopie werden zudem die angrenzenden Spektren aus dem tief roten und infraroten Bereich (bis 1200 nm) sowie des nahen ultravi-oletten Lichtes (200–380 nm) verwendet. Auch wenn diese Anteile des Spektrums für unsere Augen nicht sichtbar sind, so können sie doch über geeignete Detektoren wie z. B. CCD Kameras aufgenommen werden und über einen Monitor für die Bildgebung oder Analyse zur Verfügung gestellt werden. In Methoden wie der Fluoreszenzmikro-skopie werden zudem kurzwellige Strahlen für die Anre-gung von Fluorochromen verwendet.

Die vom Auge empfundene Helligkeit des Lichtes ist abhängig von der Anzahl der Photonen, die unser Auge pro Zeiteinheit erreicht und wird hier vereinfacht, mit dem Maß der Auslenkung einer Welle (Amplitude) gleichgesetzt (Abb. 1.3). Weitere Faktoren sind die Farbe (Wellenlängen-spektrum) und auch der Kontrast zum Hintergrund sowie dessen Ausdehnung. Die Hellempfindlichkeit des Auges hat ihr Maximum bei grün-gelben Farbtönen (500–560 nm), wobei kleine Lichtpunkte als heller interpretiert werden als größere mit gleicher physikalischer Lichtstärke. Unser Auge kann gut 50–60 Helligkeitsunterschiede bei Graustufenbil-dern wahrnehmen. Ein Computermonitor zeigt Bilder mit 256 Graustufen (8 bit) an und Digitalkameras können je nach Modell bis zu 4096 Graustufen (12 bit) aufnehmen – sofern diese überhaupt im Bild vorliegen. Diese Werte weisen darauf hin, dass mittels der digitalen Bildaufnahme andere Dimensionen der Bildanalyse erreicht werden kön-nen, als die, die sich unserem Auge bei direkter Sichtung des Präparates darstellen.

Licht wird unterschiedlichsten Modulationen unterworfen, um ein mikroskopisches Bild zu entwerfen. Es ist eine täg-liche Erfahrung, dass unfarbiges Licht, auch oft als weißes Licht bezeichnet, durch Absorption an Helligkeit verlieren kann. Absorption unterschiedlicher Wellenlängen verändert das Licht in seiner verbleibenden Wellenlängencharakteristik, und stellt sich uns als farbig dar. Ebenso allgegenwärtig ist Brechung, Beugung, Interferenz oder Polarisation von Licht.

300 350 400 450 500

sichtbares Licht

Wellenlänge in nm

InfrarotUltraviolett

550 600 650 700 750 800 850

l

l

A

A

Phasenverzögerung

Luft LuftGlas

Unterschiedliche transparente Medien wie Luft, Wasser oder Glas verlangsamen das durchtretende Licht (Verände-rung der Phase) in unterschiedlichem Maß aufgrund ihrer unterschiedlichen optischen Dichte. Wenn Licht in einem Winkel von einem Medium (z. B. Luft) in ein anderes mit höherer optischer Dichte (z. B. Glas) eintritt, wird dieses Licht nicht nur verlangsamt, sondern auch gebrochen. Dies bedeutet, dass es in einem für diesen Fall spezifischen Win-kel abgelenkt wird. Bei dem Wiederaustritt des Lichtes in ein Medium geringerer Dichte (z. B. Luft) ist die Geschwin-digkeit wieder die für dieses Medium spezifische und es erfährt eine umgekehrte Ablenkung. Der Lichtstrahl ist also in diesem Beispiel parallel versetzt (Abb. 1.4).

Für transparente Medien wird ein Wert angegeben, der das Maß der Brechung angibt – der Brechungsindex n (re-fraction index). Dieser wird für Luft mit 1 angegeben und steigt mit optischer Dichte des Mediums (z. B. Wasser n = 1,33). Er lässt sich wie folgt berechnen: n = Lichtgeschwin-digkeit in Vakuum / Lichtgeschwindigkeit im verwendeten Medium. Öle, die in der Mikroskopie für hoch auflösende oder stark vergrößernde Objektive zur Immersion der Frontlinse eingesetzt werden, weisen einen Brechungsindex von ca. 1,51 auf.

Unterschiedliche Lichtwellen können miteinander in Wechselwirkung treten. Hierbei können sich zeitlich und räumlich am gleichen Ort befindliche Wellenberge ad-dieren (konstruktive Interferenz) und ebenso Wellentäler und Wellenberge zu einer Subtraktion der resultierenden Amplitude führen (destruktive Interferenz).

Licht, das durch eine kleine Lochblende scheint, er-zeugt ein Muster von hellen Ringen, welches als Beu-gungsmuster bezeichnet wird. Dieses Muster aus einem zentralen hellen Anteil (direktes ungebeugtes Licht oder Hauptmaximum), gefolgt von einer Anzahl von Ringen mit deutlich geringerer Helligkeit (gebeugtes Licht oder Nebenmaxima), entsteht durch Abfolgen von destruktiver und konstruktiver Interferenz. Nach der Abbeschen Theo-rie der Auflösung entsteht ein Bild erst dann, wenn zumin-dest ein Nebenmaximum mit dem Hauptmaximum in der Zwischenbildebene interagiert. Je mehr Nebenmaxima zur Bildentstehung beitragen, desto höher ist die Auflösung.

Wenn Licht auf den Anteil reduziert wird, der sich in der gleichen Schwingungsebene befindet, so spricht man im Fol-genden von linear-polarisiertem Licht. Unser Auge kann im

Gegensatz zum Facettenauge der Bienen die Schwingungs-richtung des Lichtes nicht wahrnehmen. Dennoch ermögli-chen erst Polarisationsverfahren, wie im weiteren Verlauf be-schrieben, die Anwendung hochqualitativer Kontrastverfah-ren wie den differenziellen Interferenzkontrast (DIC). Für die Mikroskopie von doppelbrechenden Präparatstrukturen wie Kristallen bei der Gichtanalyse ist die Polarisationsmik-roskopie eine unabdingbare Voraussetzung (Kap. 2.9).

Zunehmend werden mikroskopische Präparate an Com-putermonitoren gesichtet, jedoch folgen die allermeisten Mikroskope noch einem traditionellen Design, bei dem die folgenden Hauptkomponenten leicht zu identifizieren sind; Stereo- und Makroskope werden im weiteren Verlauf separat behandelt.

Glas

Luft

Luft

direktes Licht

Hauptmaximum

gebeugtes Licht

Nebenmaxima