TEKNIK ELECTROSPINNING UNTUK MENGENDALIKAN DEPOSISI DAN PENYESUAIAN STRUKTUR WADAH NANOFIBROUS UNTUK ORIENTASI SELULER DAN REORGANISASI SITOSKELETAL Joke K. Wise, Michael Cho, Eyal Zussman, Constantine M. Megaridis, dan Alexander L. Yarin 2.1 PENDAHULUAN Fibril sel dan matriks ekstraseluler (ECM), pada sebagian besar jaringan, tidak random, tetapi yang jelas menunjukkan pola dan orientasi spasial tertentu. Temuan terbaru menunjukkan bahwa biopolimer berorientasi berbasis wadah nanofibrous memiliki potensi untuk pembuluh darah rekayasa [1], jaringan saraf [2], dan jaringan ligamen [3]. Selain itu, telah terbukti bahwa sel adhesi dan proliferasi [1] secara signifikan meningkat pada wadah berbasis nanofibrous. Teori pedoman yang berhubungan menunjukkan bahwa sel memiliki probabilitas migrasi terbesar dalam orientasi yang lebih disukai yang berhubungan dengan sifat kimia, struktural, dan mekanis dari substrat [4-6]. Oleh karena itu, dapat disimpulkan bahwa wadah berbasis nanofibrous akan memandu deretan sel sepanjang nanofibers. Susunan sel ke nanofibrous wadah berorientasi bisa disebabkan paduan yang berhubungan dan/atau reorganisasi sitoskeletal. Sel yang selaras 17
37
Embed
9 Teknik Electrospinning Untuk Mengendalikan Deposisi Dan Penyesuaian Struktur Perancah Nanofibrous Untuk Orientasi Seluler Dan Reorganisasi Sitoskeletal
This document is posted to help you gain knowledge. Please leave a comment to let me know what you think about it! Share it to your friends and learn new things together.
Transcript
TEKNIK ELECTROSPINNING UNTUK MENGENDALIKAN DEPOSISI DAN PENYESUAIAN STRUKTUR WADAH NANOFIBROUS UNTUK
ORIENTASI SELULER DAN REORGANISASI SITOSKELETAL
Joke K. Wise, Michael Cho, Eyal Zussman, Constantine M. Megaridis, dan Alexander L. Yarin
2.1 PENDAHULUAN
Fibril sel dan matriks ekstraseluler (ECM), pada sebagian besar jaringan,
tidak random, tetapi yang jelas menunjukkan pola dan orientasi spasial tertentu.
Temuan terbaru menunjukkan bahwa biopolimer berorientasi berbasis wadah
nanofibrous memiliki potensi untuk pembuluh darah rekayasa [1], jaringan saraf
[2], dan jaringan ligamen [3]. Selain itu, telah terbukti bahwa sel adhesi dan
proliferasi [1] secara signifikan meningkat pada wadah berbasis nanofibrous.
Teori pedoman yang berhubungan menunjukkan bahwa sel memiliki probabilitas
migrasi terbesar dalam orientasi yang lebih disukai yang berhubungan dengan
sifat kimia, struktural, dan mekanis dari substrat [4-6]. Oleh karena itu, dapat
disimpulkan bahwa wadah berbasis nanofibrous akan memandu deretan sel
sepanjang nanofibers. Susunan sel ke nanofibrous wadah berorientasi bisa
disebabkan paduan yang berhubungan dan/atau reorganisasi sitoskeletal. Sel yang
selaras kemudian bisa digunakan untuk mengubah bentuk dan memodulasi
regenerasi dan lingkungan mikro ECM [7].
Tujuan khusus untuk pekerjaan ini adalah untuk merencanakan konsep
seperti jaringan yang akan meniru zona dangkal dari kartilago artikular. Diketahui
bahwa kartilago artikular secara garis besar terdiri dari setidaknya empat zona
berbeda, masing-masing dengan sel tertentu dan organisasi atau orientasi ECM [8-
10]. Zona ini dikenal sebagai zona dangkal atau tangensial, menengah atau
transisi, dalam atau radial, dan zona kalsifikasi. Penyusunan sel khusus dan ECM
dalam setiap zona kartilago dapat dikaitkan dengan riwayat perkembangan dan
masing-masing zona kartilago ini terkena daya mekanik, sehingga mendukung
fungsi keseluruhan jaringan artikular kartilago [12,13]. Beberapa laporan yang
diterbitkan telah difokuskan pada susunan zonal dari kondrosit dalam polimer
17
18
biokompatibel untuk rancangan rekayasa jaringan kartilago artikular [14-18].
Selanjutnya, jurnal yang baru-baru ini diterbitkan telah menggunakan kondrosit
dan sel induk mesenkimal manusia (hMSCs) dan tiga dimensi polimer wadah
secara acak untuk rancangan jaringan nanofibrous kartilago [19-23]. Namun,
upaya khusus untuk rancangan zona superfisial dari kartilago artikular
menggunakan hMSCs dan wadah berbasis nanofibrous belum dilaporkan. Zona
superfisial dari jaringan artikular kartilago alam tampak rata, kondrosit seperti
ellipsoid dan fibril kolagen skala nano, yang berorientasi sejajar terhadap bidang
permukaan artikular, dengan derajat signifikan dengan orientasi pada bidang [8-
1]. Meskipun hanya beberapa lapis tipis, pentingnya zona superfisial ini sering
ditekankan karena memberikan daya tarik tinggi yang dipertahankan oleh
orientasi sel dan fibril kolagen [12,13], dan karena itu sangat penting untuk fungsi
normal di artikular permukaan kartilago. Langkah pertama menuju rancangan
jaringan fungsional dari zona superfisial kartilago memerlukan evaluasi kuantitatif
dari adhesi dan orientasi sel.
Untuk berfungsi dengan baik, pembenihan sel dalam wadah harus mampu
berhubungan dengan lingkungan mereka melalui sinyal biokimia, bioelectrical,
dan topologi yang tepat. Topografi dan komposisi mikro (yaitu, ECM asli)
mempengaruhi fungsi seluler, seperti adhesi, pertumbuhan, motilitas, sekresi,
ekspresi gen, dan apoptosis. Hal ini juga diketahui bahwa struktur fisik dari ECM
asli memiliki dimensi nano. Permukaan luas-volume rasio tinggi dari wadah
nanofibrous dan diameter nano dari serabut cenderung memberikan kondisi yang
baik untuk perlekatan dan pertumbuhan sel. Sebagai contoh, karena kolagen
merupakan komponen ECM paling banyak, wadah berbasis kolagen terdiri dari
fibril dalam kisaran diameter 10-300 nm tidak hanya biokompatibel tetapi juga
bisa memberikan salah satu struktur nanofibrous paling ideal untuk merancang
jaringan [24]. Memang, sel telah diketahui untuk menempel padam dan tersusun
di sekitar serabut dengan diameter lebih kecil daripada sel tersebut [24,25].
Sel induk memiliki sifat unik untuk pembaruan diri tanpa diferensiasi
sampai dan setidaknya selama sinyal biologis dan fisik yang sesuai tersedia.
Dalam konteks rekayasa jaringan, penggunaan sel induk memiliki banyak
19
keuntungan. Tidak seperti konstruksi jaringan rekayasa menggunakan sel
didiferensiasi, sel induk (1) memiliki kapasitas proliferatif yang lebih tinggi, (2)
menyediakan kemampuan regeneratif yang sangat baik yang memungkinkan
integritas dan fungsi dari jaringan rekayasa yang diinginkan, (3) memungkinkan
untuk melihat konstruksi jaringan multifungsi (misalnya, jaringan osteochondral),
dan (4) mengurangi atau menghilangkan penolakan jaringan dan kegagalan.
Sekarang juga ditetapkan bahwa hMSCs dapat dibudidayakan dan dikembangkan
secara in vitro, dan dapat didorong untuk berkembang biak dan berdiferensiasi
menjadi jaringan sel fenotipe spesifik seperti khondrogenik, sel osteogenik,
adipogenik, dan myogenik dengan menggunakan rangsangan biologis dan fisik
[26-29], dan karena itu menyediakan potensi untuk perbaikan dan regenerasi
jaringan otot. Sementara potensi terapi hMSCs yang besar telah diakui untuk
pengobatan jaringan yang rusak atau sakit, kompleksitas peristiwa yang berkaitan
dengan transformasi sel-sel prekursor meninggalkan pertanyaan yang belum
terjawab tentang perubahan morfologi, struktur, proteomika, dan fungsional
dalam sel batang.
Pengetahuan yang lebih rinci mengenai sifat hMSC akan memungkinkan
pendekatan yang lebih baik dan lebih efektif untuk ekspansi sel in vitro, dan
regulasi keterkaitan mereka terhadap fenotip tertentu. Sebagai contoh, kontrol
orientasi, proliferasi, dan diferensiasi hMSC telah terbukti memodulasi aspek
fungsional konstruksi jaringan rekayasa [30,31]. Rekayasa lingkungan yang
kondusif untuk orientasi, adhesi, proliferasi, dan diferensiasi hMSC, oleh karena,
itu sangat penting dalam rekayasa jaringan.
Electrospinning [32-37] adalah teknik menjanjikan untuk menciptakan
arsitektur pola serabut untuk mengatur interaksi seluler dan molekuler dari adhesi,
proliferasi, diferensiasi, dan orientasi sel induk. Berbagai polimer alam atau
sintetis telah digunakan dalam rangka electrospinning untuk membuat dan
merancang wadah nanofibrous yang biokompatibel untuk aplikasi jaringan
rekayasa. Sebagai contoh, polikaprolakton (PCL) adalah bahan biodegradable
yang menunjukkan hampir tidak ada toksisitas, degradasi terkendali, dan tidak
mahal [38]. PCL adalah polimer yang semikristalin milik keluarga dari poliester
20
α-hidroksi (misalnya, PLA, PGA) dan secara signifikan dapat meningkatkan sifat
mekanik dari wadah karena modulus tarik yang tinggi (400 MPa; [39401]). Sifat
mekanik tersebut melebihi modulus elastisitas jaringan kartilago (~ l0 MPa) dan
di kisaran modulus elastis dari serat kolagen (~500 MPa), menunjukkan bahwa
wadah PCL nanofibrous menunjukkan kemungkinan yang sangat baik untuk
rekayasa jaringan kartilago. Selanjutnya, PCL baru-baru ini telah digunakan untuk
menunjukkan kompatibilitas untuk benih dan mengakomodasi hMSCs dan
mendukung diferensiasi multi-lineage [20,21,38].
Pada penelitian ini, pertama kita meninjau teknik berbeda yang digunakan
untuk menyelaraskan nanofibers selama electrospinning. Pada bagian berikutnya,
kami bertujuan untuk mengatur dan mengukur orientasi hMSC paling tidak pada
dua wadah PCL nanofibrous berbeda yang dibuat menggunakan electrospinning.
Dengan menggunakan analisis citra canggih, orientasi hMSC pada wadah
berorientasi nanofibrous acak dan dihitung selama periode kultur 18 hari. Selain
itu, kelangsungan hidup sel jangka panjang, reorganisasi cytoskeletal, dan adhesi
sel-nanofiber dieksplorasi dan berkaitan dengan kontak yang disebabkan orientasi
hMSC pada nanofibers. Terapi aplikasi stem sel dan jaringan rekayasa dapat
ditingkatkan dan difasilitasi oleh pendekatan fisik, seperti yang disajikan di sini,
untuk mengendalikan lingkungan mikro untuk pertumbuhan dan diferensiasi sel.
2.2 PEMBUATAN WADAH NANOFIBER DENGAN ELECTROSPUN
Teknik untuk baris pintalan nanofibers in situ menggunakan daya repulsi
elektrostatik untuk kembali bekerja [41,42] dimana lensa elektrostatik pertama
untuk electrospinning diperkenalkan. Ide dari lensa elektrostatik pada
electrospinning didapatkan dengan cepat dalam penelitian lain [43-46] dimana
beberapa pengaturan tambahan menggunakan prinsip ini digunakan. Sebuah
sketsa dari pengaturan eksperimental digunakan pada referensi [41.42] yang
ditunjukkan pada Gambar 2.1. Pancaran mengalir ke bawah dari permukaan
tetesan tambahan larutan polimer berhenti pada akhir jarum menuju roda kolektor
21
yang berputar dan ditempatkan pada jarak 120 mm di bawah tetesan itu. Roda
aluminium (dengan diameter
200 mm) memiliki tepi runcing dengan sudut setengah dari 26,6° untuk membuat
medan elektrostatik yang sangat konvergen. Sebuah perbedaan potensial listrik
sekitar 8 kV awalnya diterapkan antara permukaan tetesan cairan dan roda
berputar. Ketika beda potensial antara
tetesan dan roda meningkat, tetesan mengakuisisi bentuk kerucut seperti (kerucut
Taylor).
Pada beda potensial cukup tinggi, pancaran stabil muncul dari corong dan pindah
ke bawah
menuju roda. Pancaran mengalir jauh dari tetesan dalam garis hampir lurus dan
kemudian ditekuk ke dalam jalur kompleks yang berada dalam wilayah yang
berbentuk kerucut (sampul kerucut, [32]), dengan puncaknya di bagian atas.
Kemudian, pada suatu titik tertentu di atas roda, sampul kerucut mulai menyusut,
menghasilkan sebuah sampul kerucut terbalik dengan puncaknya di tepi roda.
Selama proses elektrospinning, roda diputar pada kecepatan konstan untuk
mengumpulkan nanofibers yang berkembang ke tepi yang tajam. Ketika pintalan
nanofiber mencapai tepi roda, mereka akan bersinggungan di sekitar roda. Sebuah
meja kecil (5 x 4 mm) yang terbuat dari aluminium juga dapat ditempelkan pada
tepi roda untuk memudahkan pengumpulan berikutnya dari nanofibers. Meja ini
dapat diputar pada sumbu Z (lihat Gambar 2.1) ketika rotasi roda berhenti untuk
sementara, maka, arah nanofibers dikumpulkan dapat dikendalikan. Nanofibers
dikumpulkan biasanya selama 10 detik. Susunan nanofiber dua dimensi yang khas
dibuat dari poli(etilena oksida) (PEO) dengan metode ini ditunjukkan pada
Gambar 2.2. Kecepatan linear di ujung kolektor disk adalah 11 rn/s dalam kasus
ini. Diameter nanofibers pada Gambar 2.2A tidak seragam dan bervariasi 250-400
nm, dan 200-500 nm. Pemisahan antara nanofibers paralel bervariasi dari 1
sampai 2 µm di kedua gambar.
22
Gambar 2.1 Skema proses electrospinning menunjukkan pancaran sampul
kerucut ganda. Roda kolektor dapat dilengkapi dengan meja yang membantu
untuk mengumpulkan nanofibers. Lempengan ini dapat diputar mengelilingi
sumbu Z-ketika rotasi roda untuk sementara berhenti untuk memungkinkan
pengambilan lapisan demi lapis pada sudut yang diinginkan antara susunan
lapisan nanofiber. (dari Zussman, E., Theron, A., dan Yarin, AL, Appl Phys Lea.,
82, 973, 2003. dengan izin.)
Sebuah bagian dari nanofiber yang panjang disimpan di meja tetap
dihitung untuk periode singkat. Karena itu, ketika putaran baru nanofiber
mengendap ke meja, nanofiber itu sebelumnya ditolak oleh bagian yang
mengendap, yang mana masih tetap dihitung. Mekanisme ini memungkinkan
pembentukan susunan dua dimensi di meja yang sama dengan yang ditunjukkan
pada Gambar 2.2. Kecepatan rotasi linier roda memainkan peran penting dalam
peregangan dan penyesuaian bagian nanofiber pada meja setelah pendaratan
mereka (lihat Gambar 2.3). Pada kecepatan rotasi roda linear 5-10 m / s,
keselarasan nanofiber cukup bisa dicapai (Gambar 2.3c dan e). Sudut (terhadap
arah rotasi roda) distribusi yang ditunjukkan pada Gambar 2.3b, d, dan f
mengungkapkan bahwa pada kecepatan rendah tidak ada serabut yang diinginkan
23
yang tercapai (Gambar 2.3b); pada kecepatan yang lebih tinggi, distribusi sudut
menunjukkan serat yang diinginkan menjadi sempit dengan kecepatan rotasi
meningkat linier (Gambar 2.3d dan f). Mekanisme yang sama pada dasarnya
bekerja ketika electrospun nanofibers pada Mandril berputar [46-48]. Namun,
ketika tidak ada pembatasan lateral yang dikenakan oleh tepi tajam roda (lensa
elektrostatik), ekskursi lateral dari serat yang cukup signifikan dan tingkat lebih
rendah dari keselarasan mungkin terjadi. Sebuah varian menengah sesuai dengan
pita logam (yang setara dengan meja sempit memanjang) dipasang di atas tepi
roda yang tajam. Akumulasi strip nanofiber seperti pada pita juga bisa
disesuaikan. Ini merupakan alasan mengapa tikar nanofiber terorientasi yang
digunakan dalam bagian berikutnya dari buku ini adalah nanofiber electrospun
pada pita yang ditempatkan di atas roda tajam yang berputar.
(a)
(b)
24
Gambar 2.2 Pengamatan gambar nanofibers dengan elektron mikroskop (SEM)
dengan PEO yang dikumpulkan pada pita karbon yang menempel pada tepi roda
kolektor. Dalam (a), diameter serat bervariasi 250-400 nm. Pada (b), diameter
serat bervariasi 200-500 nm. Lemparan (pusat ke pusat) bervariasi dari 1 sampai 2
guci di kedua gambar. (Dari Theron, A., Zussman, E., dan Yarin, AL.,
Nanorechnology, 12, 384, 2001 Dengan izin..)
Ditekankan bahwa tarikan pada bagian nanofiber setelah pendaratan
pertama pada kolektor yang berputar, di samping meningkatkan kekuatan tarik,
juga diharapkan untuk sejumlah aplikasi biomedis [46-48].
Susunan tiga dimensi nanofiber yang khas (lintang) digambarkan pada
Gambar 2.4. Kumpulan nanofiber PEO menunjukkan derajat tinggi kesesuaian.
Diameter nanofibers dalam hal ini juga seragam dan bervariasi di kisaran 100-800
nm. Ketika nanofibers yang electrospun ke tepi tajam roda tanpa meja, diperoleh
bundel (tali) nanofiber. Gambaran khas dari tali nanofiber dilepaskan dari tepi
roda ditunjukkan pada Gambar 2.5. Lamanya proses pengumpulan pada kasus ini
adalah 60 detik. Tali itu secara manual terlepas dari tepi roda [41]. Dua detail tali
serat polimer SEM yang dihasilkan dengan cara ini diperlihatkan pada Gambar
2.6. Para nanofibers berada dalam kontak, dan hampir tetap paralel hingga jarak
jauh.
25
Gambar 2.3 Orientasi nanofiber pada berbagai kecepatan rotasi roda linear: (a)
2,9 m / s; (b) orientasi distribusi serabut yang sesuai dinyatakan dalam sudut
sehubungan dengan arah rotasi roda (standar deviasi, SD = 23,44°) ; (c) 5,3 m/s ;
(d) distribusi yang sesuai orientasi sudut serabut (SD = 3,7°); (e) 7,7 m/s (f)
distribusi yang sesuai orientasi sudut serabut (SD = 1,8°). Bagian gelombang
serabut pada (e) tersebut diberikan merupakan bagian terakhir dari filamen yang
dikumpulkan saat medan listrik telah dimatikan. Nanofiber electrospun dari 4 wt
% polietilen oksida, PEO (MW = 1000 kDa) dalam etanol / air.
26
Gambar 2.4 Gambaran khas SEM susunan silang dari PEO berbasis nanofibers
dikumpulkan di meja aluminium. Struktur crossbar diperoleh dalam proses
perakitan berurutan dengan arah penempatan tabel ortogonal. (a) kumpulan dua
lapisan dan (b) kumpulan empat lapisan. (dari Zussman, E., Theron, A., dan
Yarin, AL, Appl Phys Len.., 82, 973, 2003. dengan izin.)
Gambar 2.5 Sebuah bundel (tali) dari nanofibers manual terlepas dari kolektor.
Hampir semua nanofibers dikumpulkan di tepi roda kolektor yang tajam. (dari
Theron, A., Zussman, E., dan Yarin, AL., Nanoteknologi, 12, 384, 2001 dengan
izin.)
27
Gambar 2.6 Gambaran khas SEM dua bundel (tali) nanofibers dengan PEO.
Kepadatannya sekitar 100 nanofibers per mikrometer persegi. (Dari Theron, A.,
Zussman, E., dan Yarin, AL, Nanoteknologi, 12, 384, 2001 dengan izin.)
2.3 METODE DAN MATERIAL
2.3.1 Elektrospinning dari Wadah Nanofiber PCL
Nanofibers dengan diameter beberapa ratus nanometer diproduksi dengan
menggunakan electrospinning seperti yang telah dijelaskan sebelumnya
[32,33,41,42] (lih. Bagian 2.2). Semua wadah polimer nanofiber electrospun
dibuat dari PCL dengan berat molekul 80 kDa (Sigma-Aldrich) electrospun dari
10wt% dari larutan metilen klorida / dimetilformamida dengan perbandingan 75/2
(volume). Dua jenis wadah nanofiber PCL electrospun yang berbeda diperoleh
dan ditandai sebagai random atau terarah. Wadah acak diproduksi oleh
electrospinning polimer nanofibers ke sebuah substrat aluminium datar,
menghasilkan wadah nonwoven tanpa orientasi nanofiber yang terpilih. Wadah
terarah diproduksi dengan mengumpulkan nanofibers pada pita logam sempit di
tepi sebuah roda yang berputar [41,42] (lih. Bagian 2.2), menghasilkan wadah
nanofibrous dengan orientasi yang jelas. Cairan electrospun polimer dari
semprotan 5 ml melekat pada jarum hipodermik (diameter bagian dalam 0,1 mm)
dan menggunakan laju aliran 1 mL / jam. Sebuah elektroda tembaga ditempatkan
dalam larutan polimer dan akhirnya electrospun menuju tepi yang tajam dari
kolektor listrik beralas (Gambar 2.1). Kekuatan medan listrik adalah 1,1 kV / cm.
28
Kecepatan linier dari tepi kolektor roda adalah 10 rn/s. Semua percobaan
dilakukan pada suhu kamar (~25° C) dengan kelembaban relatif udara 40%. SEM
digunakan untuk mendapatkan gambar dari setiap jenis wadah nanofibrous PCL.
Pengamatan SEM dari wadah PCL dibuat dengan mikroskop S-3000N variabel
tekanan elektron hitachi. Instrumen ini memiliki sumber elektron tungsten dan
mampu mencitrakan spesimen dalam tekanan variabel mulai 1-270 Pa. Di bawah
tekanan variabel, spesimen nonconducting dapat dicitrakan tanpa lapisan film
konduktif. Tegangan mempercepat dapat bervariasi selama rentang 0,3-30 kV
dengan resolusi 5 nm pada 25 kV. Diameter nanofiber diperkirakan dengan
menggunakan prosesor gambar (MetaMorph, Device Molekuler Corp.,
Downingtown, Pennsylvania).
2.3.2 Kulturasi Sel Stem Mesenkimal Manusia dan Pembibitan dalam
Wadah Nanofibrous PCL
hMSCs diperoleh dari Sumber Sel Stem Mesenkimal Dewasa (Tulane
University, New Orleans, Louisiana). Sel dikultur dalam medium pertumbuhan
lengkap yang terdiri dari medium Dulbecco eagle yang dimodifikasi (DMEM)
ditambah dengan 15% serum janin sapi (FBS), 2 mM L-glutamin, 1%antibiotik,
antimikotik (konsentrasi akhir: penisilin 100 µg/mL, streptomisin 100 g/mL, dan
amfoterisin B 0,25 µg/mL). Sel pada tahap 6 yang digunakan dalam percobaan
yang ini. Dari material anyaman dan strip nanofibrous electrospun dalam jumlah
besar, piringan wadah kecil dengan luas sekitar 0,3 cm2 cocok untuk kultur sel dan
percobaan penyemaian. Wadah awalnya direndam dalam etanol 70% selama 1
jam, kering, dan disterilkan di bawah sinar UV selama 6 jam di setiap sisi, dan
sebelumnya dibasahi dengan merendam dalam medium kultur sel lengkap dengan
serum selama 48 jam untuk meningkatkan adsorpsi protein. Untuk pembenihan
hMSCs ke wadah nanofiber PCL, sel dipipet langsung ke wadah dengan
kepadatan sel 7,5 x 104 sel/cm2. Medium kultur ditambahkan dan untuk
pembiakan jangka panjang, diganti setiap 2 sampai 3 hari.
29
2.3.3 Pengamatan Microscopy Laser Confocal dan Analisis Orientasi
Sampel diamati pada hari pertama (24 jam setelah pembibitan awal sel
induk ke wadah), dan kemudian pada hari-hari 4, 8, 12, 15, dan 18. Untuk analisis
sel orientasi, satu set sampel diwarnai dengan CellTracker CMFDA (15 µM, 5-