9-Paper 6- 96A268 Soleimanizadeh et al-2jab.uk.ac.ir/article_2016_f28ce859d981df3eb558385c7d5bda4f.pdf · 1396 $ 5ˆ@ ˇ ˆ˙ ٨۵ Journal of Agricultural Biotechnology; Printing

مجله بيوتكنولوژي كشاورزي

ISCپژوهشي و -علمي

Anti-VEGF بيان نانوباديميزان بر سازي كدوني بررسي اثر بهينه

، فاطمه كاظمي لمعه 5، مهدي بهداني4، عليرضا سيفي∗∗∗∗3، مختار جاللي جواران2، عبدالرضا باقري1مژگان سليماني زاده

6دشت

.مشهد، ايرانفردوسي مشهد، دانشگاه كشاورزي، دانشكده كشاورزي، بيوتكنولوژي دكتري دانشجوي1 .مشهد، ايرانفردوسي مشهد، دانشگاه كشاورزي، دانشكده نژادي گياهي،و به استاد گروه بيوتكنولوژي2

.تهران، ايرانمدرس، تربيت دانشگاه كشاورزي، دانشكده كشاورزي، بيوتكنولوژي گروه دانشيار3

مشهد، ايران.وسي مشهد، فرد دانشگاه كشاورزي، دانشكده نژادي گياهي،و به استاديار گروه بيوتكنولوژي4

تهران، ايران.دانشيار بخش بيوتكنولوژي، مركز تحقيقات بيوتكنولوژي، انستيتوپاستور ايران، 5

تهران، ايران.استاديار بخش بيوتكنولوژي، مركز تحقيقات بيوتكنولوژي، انستيتوپاستور ايران، 6

30/10/1396، تاريخ پذيرش: 15/09/1396تاريخ دريافت:

چكيدهويژه ههاي نوتركيب (بانواع پروتئين براي توليد بيوراكتورهاي ارزشمند عنوانبهداليل متعددي به ياهانگهاي ويروسي گياهي استفاده از ناقل برداري قرار گيرند.توانند مورد بهرهمي و...) هاي مونوكلونالباديآنتي

ها در مقياس باال بادياز قبيل آنتيدارويي مهم هايمفيد براي توليد پروتئين استراتژيبراي بيان موقت، يك دومين عامل مرگ و مير در جامعه بشري سرطان ، امروزه. دشوو در يك دوره زماني خيلي كوتاه پيشنهاد مي

دليل نقش ضروريش در به )VEGF( اندوتليال عروقي رشد دهد كه فاكتورشواهد قانع كننده نشان مي .است Anti-VEGFنانوباديقطعات مختلف در اين مطالعه .باشدي درمان سرطان ميرگزايي يك هدف مهم برا

(Nb42) با استفاده از ناقل ويروسي مبتني بر انداز قوي ويروسي در گياه كدو تحت كنترل راهطور موقت بهZYMV نانوبادي (توالي معمولي اين قطعات شامل . گرديدبيانNb42I( ي نانوبادي برا بهينه شده توالي و

در Nb42 يژنقطعات مختلف هاي حضور رونوشتي گياهان، كوبپس از مايه .بودند) Nb42II( بيان در گياهبا نوتركيب شناسايي گرديد. همچنين بيان پروتئين RT-PCRكدو با استفاده از آزموني شده كوبمايهاهان گي

تائيد گرديد. بر اساس االيزاو وسترنگذاري لكه، SDS-PAGE، ايگذاري نقطهلكه هاياستفاده از آزمونميكروگرم در هر گرم بافت برگي بود. 8/6 و 2به ترتيب Nb42II وNb42I نانوبادي بيان ميزان ، االيزانتايج

طور موثر در گياه كدو بيان گردد و سيستم بياني مبتني بر تواند بهمي Nb42نانوبادي نوتركيب در مجموع،ZYMV خواهد خانواده كدوئيان هاي نوتركيب در گياهان پروتئينبيان ناسب براي مسيستم توليدي يك

بود.

.نانوبادي ،ويروسي ناقل، زراعت مولكولي ،سازي كدونيبهينه بيان موقت،: كليدي كلمات

[email protected] :mailE 09123091917 تلفن: مختار جاللي جواران ول: نويسنده مسئ∗

)1396، زمستان 4، شماره 9مجله بيوتكنولوژي كشاورزي (دوره

٨٢ Journal of Agricultural Biotechnology; Printing ISSN: 2228-6705, Electronic ISSN: 2228-6500

مقدمه

و بروز سرطان در كشورهاي در حال توسعه

باشد. بنابراين توسعه يافته در حال افزايش مي

و جديد براي درمان هاي ارزان توليد مولكول

. )Pereira et al., 2011( باشدسرطان ضروري مي

هاي سرطان شامل شيمي درماني، جراحي و درمان

ا گرانترين هاي طوالني مدت سرطان رديگر درمان

,.Moussavou et al( سازدبيماري براي درمان مي

. مطالعات آزمايشگاهي و باليني نشان داده )2015

وموري توليد هاي ضد تيكي از پاسخاست كه

ها براي كشتن مستقيم باديتعداد زيادي از آنتي

ر، كشتن سلول تومور بواسطه سلول تومو

et Scott(باشد مي 1كني عروقزايي و ريشهايمني

al., 2012(. كلونال مونوبادي با آنتيسرطان درمان

عوامل ، آلودگي بالقوه به دليل قيمت باالبه

پذيري محدود سيستم انساني و مقياس بيماريزاي

اي نداردسلولي پستانداران كاربرد گسترده

)Moussavou et al., 2015(هاي سلولي . كارخانه

ي براي توليد تر و ارزانترگياهي روش ايمن

هاي مونوكلونال ضد سرطان ارائه باديآنتي

، قيمت پايين 2باال پذيري دليل مقياسدهند و بهمي

بادي مونوكلونالسرهم كردن آنتي توليد و توانايي

;Ma et al., 2003( مورد توجه ويژه قرار دارند

Moussavou et al., 2015(.

عنوان زراعت مولكولي، استفاده از گياهان به

هاي نوتركيب ابزارهايي براي توليد پروتئين

هاي داروئي و صنعتي ارزشمند از قبيل پروتئين

1 Vascular ablation 2 High scalability

بادي اولين آنتي 1989در سال باشد.مي

Hiatt( شد توليدمونوكلونال در گياهان تراريخته

et al., 1989(هاي . از آن زمان تاكنون شكل

هاي مونوكلونال در باديمختلفي از آنتي

ي هاي بيانبا استفاده از سيستم هاي گياهيسيستم

پايدار توليد تراريختي يا موقت مبتني بر ويروس

پايدار زمان تراريخته د. براي توليد گياهانانهشد

و عملكرد پروتئين معموال پايين استزيادي الزم

بيان ،. در مقابل)Huang et al., 2010( باشدمي

هاي ويروسي گياهي يك ناقلموقت با استفاده از

سطوح سريع براي توليد كننده راهبرد اميدوار

Lico( باشدميدر گياهان خارجي باالي پروتئين

2008., et al( .3ويروس موزائيك زرد كدو

براي 4ويروسمبتني بر پوتيناقل عنوان يك به

هاي نوتركيب در گياهان بيان موقت پروتئين

Hsu et( شده است دستورزيخانواده كدوئيان

al., 2004(.

اي بسيار يك فرايند چند مرحله، 5رگزايي

ندوتليال، اهاي لكنترل شده شامل تكثير سلو

اي و بلوغ ها به ساختارهاي لولهسازماندهي سلول

هاي پايدار اي به شكل رگلولهساختارهاي

. در شرايط ايجاد )Folkman, 1971(باشد مي

به رشد، تهاجم و متاستاز تومور، رگزايي منجر

فاكتور ). Behdani et al., 2012( گرددسرطان مي

يك مولكول ،VEGF(6( عروقي اندوتليالرشد

3 Zuchiini yellow mosaic virus 4 Potyvirus-based vector

5 Angiogenesis 6 Vascular endothelial growth factor

1396مكاران، و ه سليماني زاده

٨٣ Journal of Agricultural Biotechnology; Printing ISSN: 2228-6705, Electronic ISSN: 2228-6500

هاي گزايي تومور بوده و توسط سلولركليدي در

از شود.هنگام سرطان توليد مي سرطاني در

هاي آنبا گيرنده VEGFكنش آنجايي كه ميان

رسد، ه نظر ميبراي رگزايي تومور ضروري ب

عنوان يك تواند بهمي VEGFبنابراين مهار

رويكرد جذاب براي درمان سرطان محسوب

. )Ebrahimizadeh et al., 2015( گردد

كننده عليه هاي مونوكلونال خنثيباديآنتي

VEGF تفاده گروه مهمي از داروهاي مورد اس

باشند. مطالعات اخير روي براي درمان سرطان مي

هاي باديويژه آنتيهها بباديتوسعه آنتي

هاي هاي كوچك كه سلولمونوكلونال و مولكول

دهد، اندوتليال مرتبط با تومور را هدف قرار مي

;Youssoufian et al., 2007(متمركز شده است

Zhang et al., 2009(رغم موفقيت هاي . علي

هاي مونوكلونال از نظر باديمهم و مزيت آنتي

به يك هدف خاص، هنوز هم اين اتصال

هاي از هايي دارند. نگرانيها محدوديتباديآنتي

جمله قيمت باالي توليد، تحريك پاسخ ايمني،

هاي متراكم از قبيل دشواري نفوذ به بافت

تومورهاي فشرده، نياز به فرآيندهاي توليد و

& Kolkman(اندازه بزرگ از آن جمله مي باشند

Law, 2010( .

اي جديد در ها زمينهشناسايي نانوبادي

در واقع بادي ايجاد كرده است. آوري آنتيفن

فرد از قطعات هنانوبادي، يك نوع منحصر ب

خون بادي است كه در سرم عملكردي آنتي

زنجيره سنگين باشد.شترسانان موجود مي

بادي شتري تنها از طريق يك دومين متغير آنتي

نمايد كه به اين ژن مياقدام به شناسايي آنتي

گردد دومين متغير، نانوبادي اطالق مي

)Muyldermans et al., 2009(. ها نانوبادي

از قبيل:فردي همنحصر بهاي ويژگيدليل داشتن به

وزن مولكولي ،كمزايي سازي آسان، ايمنيهمسانه

، توليد ارزان، حالليت و كيلو دالتون) 15( پايين

پايداري باال، اختصاصيت و تمايل باال براي اتصال

كانديدهاي جالبي براي درمان سرطان ژنآنتي به

-Behdani et al., 2012; Kazemi( باشندمي

Lomedasht et al., 2015(.

هاي اصلي براي توليد يكي از چالش

هاي بياني گياهي هاي نوتركيب در سيستمپروتئين

باشد.عملكرد پايين پروتئين نوتركيب مي

هاي مولكولي از رويكرد يكيسازي كدوني بهينه

سازي كدوني بهينه د.باشاين چالش مي حلجهت

يك استراتژي براي تغيير محتوي كدوني توالي

ژن هدف مطابق با ترجيح كدوني گياه ميزبان

هاي هم باشد. نشان داده شده است كه كدونمي

داري بيان پروتئين طور معنيتوانند بهمعني مي

تغيير دهند، هدف را با كنترل تنظيم كارايي ترجمه

لذا براي بيان موثر، ژن هدف بايستي مطابق با

,.Tian et al( الگوي ژنوم ميزبان طراحي گردد

2017; Webster et al., 2017(. اين هدف از

مبتني بر يويروسناقل تحقيق استفاده از يك

سازي كدوني، ويروس براي بررسي اثر بهينهپوتي

.در گياه كدو بود Nb42بيان ژن نانوبادي ميزان بر

در ابتدا قطعات ژني مختلف نانوبادي در ناقل


٨۴ Journal of Agricultural Biotechnology; Printing ISSN: 2228-6705, Electronic ISSN: 2228-6500

سازي گرديد و پس از ويروسي مورد نظر همسانه

گياهان بيان رسي بري گياهان موردنظر، كوبمايه

-RTبا آزمون RNAي شده در سطح كوبمايه

PCR گذاري لكه هايو در سطح پروتئين با آزمون

و 9گذاري وسترنلكه، PAGE-SDS8، 7اينقطه

در اين تحقيق ما براي اولين انجام گرفت. 10االيزا

سازي كدوني را بر ميزان بيان ژن بار اثر بهينه

ز سيستم بياني با استفاده ا Nb42نانوبادي

ويروسي در گياه كدو بررسي نموديم.

هامواد و روش

) .Cucurbita pepo L(بذور گياه كدو

ايط ردر اتاقك رشد در شاصلي عنوان ميزبان به

8ساعت روشنايي و C2 ±25 ،16° دمايي

براي بستر. ندساعت تاريكي كشت داده شد

خاك استريل در تركيب با از ها گلدان كاشت

2:1:1نسبت حجمي با ورميكوليت ووست كمپ

استفاده شد.

(با Nb42دو قطعه مختلف از ژن نانوبادي

توالي آمينواسيدي مشابه) مورد بررسي قرار

بهينه نشده نانوبادي ژنكننده توالي كد گرفت.

)Nb42I توسط آزمون (PCR و با استفاده از

NbR1و NbF1 اختصاصيآغازگرهاي

(تهيه شده pHEN6c-Nb42) از ناقل 1(جدول

تكثير توسط دكتر كاظمي، انسيستو پاستور ايران)

7 Dot blot

8 Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel

electrophoresis 9 Western blot 10 Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)

) Nb42IIقطعه ژني نانوبادي بهينه شده (گرديد.

اختصاصي طور مشابه با استفاده از آغازگرهايبه

NbF2 وNbR2 از ناقل )1(جدولpUC57 در

يه ته، pUC57-Nb42HFBIبردارنده ژن هدف (

كشاورزي، ژي شده از آزمايشگاه بيوتكنولو

تكثير شد. دانشگاه تربيت مدرس)

در ناقل PCRهاي تكثير شده وردهآفردرج

(فرمنتاز، شماره دسترسي ژن pJETسازي همسانه

كيت ابق با دستورالعمل مط) EF694056.1بانك

K1232 هاي ناقل انجام گرفت. شركت فرمنتاز

و pJETNb42Iنوتركيب حاصل به ترتيب

pIETNb42II با استفاده ري شدند و سپس نامگذا

هاي مستعد روش شوك حرارتي به سلول از

شدندمنتقل DH5αسويه E. coliباكتري

)Sambrook & Russell, 2001(. زمون آColony

PCR قطعات هاي مثبت حاوي كلنيبراي انتخاب

ها، با استفاده از كلنيهدف از بين ساير يژن

انجام pJET1.2 Rو pJET1.2 Fآغازگرهاي

از استخراج پالسميد از پس .)1(جدول گرفت

مايع حاوي LBهاي رشد يافته در محيط كلني

Exprep Plasmidكيت با استفاده از بيوتيكآنتي

SV–mini و بر اساس دستورالعمل شركت

هضم آنزيمي ، كره جنوبي) ،GenaAll( سازنده

با استفاده از شده اي استخراجپالسميده

ر انجام گرديد. د KpnIو SphIي هاي برشآنزيم

يابيلياتو ،سازينهايت براي تائيد بيشتر همسانه

pJET1.2و pJET1.2 Fبا استفاده از آغازگرهاي

R شدانجام.


٨۵ Journal of Agricultural Biotechnology; Printing ISSN: 2228-6705, Electronic ISSN: 2228-6500

pZGFPدر اين تحقيق از ناقل ويروسي

در گياه قطعات ژني هدفبيان موقت منظور به

منظور به .)Hsu et al., 2004( شداستفاده كدو

در ناقل قطعات ژني هدف سازي همسانه

سازي نوتركيب همسانههاي ناقل ،ويروسي

مورد هضم با pZGFPهمراه ناقل ويروسي به

پس . قرار گرفتند KpnIو SphIهاي برشي آنزيم

از جداسازي محصوالت حاصل از هضم روي ژل

به ژن هدف و ناقل قطعات مربوطآگارز،

Expin Gel SVاستفاده از كيت ويروسي با

)GeneAllشدند سازيخالص) جنوبي ، كره.

واكنش اتصال به روش قبلي به سپس محصول

وارد شد. DH5αسويه E. coliهاي مستعد سلول

سازي ژن هدف در ناقل ويروسي با تائيد همسانه

با آغازگرهاي PCR كلنياستفاده از آزمون

واكنش و ) 1(جدول هدف يژنقطعات اختصاصي

KpnIو SphIهاي برشي هضم آنزيمي با آنزيم

و pZNb42Iهاي ويروسي حاصل ناقل .شدانجام

pZNb42II .ناميده شدند

ا استفاده از ب ويروسي نوتركيب هايناقل

و بر اساس دستورالعمل كيت تخليص پالسميد

استخراج و پس ، كره) GenaAll( زندهشركت سا

استفاده از پودر دهي برگ موردنظر با از خراش

صورت مكانيكي و با استفاده از كربوراندوم، به

دو ماليده يك گوش پاك كن روي برگ گياه ك

10، مقدار هر گياه يكوبمايه براي. ندشد

ميكروگرم از پالسميدهاي استخراجي استفاده

يا عنوان شاهد به بافري شده با كوبگياه مايه گرديد.

منظور بهته شد. در نظر گرف )Mock( كنترل منفي

برداري از برگ نمونهي بيان ژن هدف، بررسانجام

روز پس از 14 ي شده و شاهدكوبهان مايهگيا

انجام پذيرفت. يكوبمايه

ي كوبكل از برگ گياهان مايه RNA استخراج

Ribospin Plantبا استفاده از كيت شده و شاهد

لعمل شركت سازنده او مطابق با دستور

)GeneAllكيفيت سپس. گرفتانجام ) ه، كر

RNA 1ژل آگارز با استفاده از استخراج شده%

،DNase Iآنزيم پس از تيمار با .شد بررسي

كيت مطابق با دستورالعمل cDNAساخت

. سپس ، كره)GeneAll( صورت گرفت مربوطه

از قطعه ساخته شده cDNA با RT-PCRواكنش

وNbF1 آغازگرهاي اختصاصيو Nb42Iژني

NbR1 همچنين باو ) 1(جدول cDNA ساخته

با آغازگرهاي Nb42IIژني يقطعه شده از

انجام )1 (جدولNbR2 وNbF2 اختصاصي

گرفت.

گرم ميلي 200 ،منظور استخراج پروتئينبه

ي شده و شاهد با كوببافت برگي از گياهان مايه

از بافر ليترلييك ميازت مايع سائيده شده و در

2 ،تريسموالر ميلي 50( ئيناستخراج پروت

1و مركاپتواتانول % EDTA 11، 04/0موالر ميلي

- ، سيگماPMSFبازدارنده پروتئاز موالر ميلي

سپس مخلوط حاصلمخلوط گرديد. )آلدريچ

ورتكس گراددرجه سانتي 4در دقيقه 10مدت به

، g15000 . در مرحله بعد سانتريفوژ درگرديد

11

Ethylenediaminetetraacetic acid


٨۶ Journal of Agricultural Biotechnology; Printing ISSN: 2228-6705, Electronic ISSN: 2228-6500

دقيقه 20مدت به گراد ودرجه سانتي 4دماي

كه حاوي پروتئين بود به روئي فازانجام گرفت.

- 80دماي و در ميكروتيوب جديد انتقال داده شد

غلظت پروتئين داري گرديد.نگه گراددرجه سانتي

آلبومين سرم محلول كل در مقايسه با پروتئين

عنوان استاندارد تخمين زده به) BSA( 12گاوي

.)Bradford, 1976( شد

ها تفكيك پروتئينبراي SDS-PAGEآزمون

شد انجام %5/12ز روي ژل اكريالميد وربا الكتروف

)Laemmli, 1970(. ،هاي نمونهبدين منظور

X5 )2گذاري همراه بافر نمونهبه پروتئيني

، گليسرول 8/6pH ،(50%(تريس موالر ميلي

10%SDS ، 1/0% 05/0و بروموفنول بلو%

درجه 95دقيقه در دماي 5مدت به) مركاپتواتانول

درون جوشانده شد و سپس گرادسانتي

الكتروفورز .بارگذاري شدند ي ژلهاچاهك

صورت 100ساعت در ولتاژ 4مدت ها بهنمونه

الكتروفورز، ابتدا اتمام از پسپذيرفت.

G13 ) ,Bradford-250با كوماسي بلو يآميزرنگ

بري مناسب صورت پذيرفت و سپس رنگ )1976

و عكسبرداري از آن انجام گرفت.

روتئين به بررسي گياهان هدف در سطح پ

به ) Dot blottingاي (گذاري نقطهروش لكه

Huang et( انجام شد و همكاران Huangروش

al., 2006(. هاي استخراج شده ابتدا پروتئين

PVDF )GEاي روي غشاء صورت نقطهبه

Healthcare امرشام، شماره كاتالوگ ،

12

Bovine serum albumin 13 Coomassie Blue G-250

اري شد. تيمار شده با متانول بارگذ) 10600023

شدن غشاء در دماي اتاق، بلوكه پس از خشك

كردن نواحي غير اختصاصي آن با استفاده از بافر

سپس مراحل . د) انجام شBSA 1%كننده ( بلوكه

و انكوبه شدن PBS-Tشستشوي غشاء با محلول

polyclonal rabbit anti-camelبادي اوليه آنتيبا

IgGs ،تهيه شده توسط دكتر بهداني)

انستيتوپاستور ايران) صورت پذيرفت. پس از

، PBS-Tغشاء با محلول شستشوي مجدد

,Goat anti-rabbit IgG-HRP)بادي ثانويه آنتي

Sigma) پايان، غشاء پس اضافه شد. در غشاءبه

به محلول PBS-Tاز شست شو با محلول

) انتقال يافت 14DAB %1سوبستراي آميزي (رنگ

غشاء با هاي رنگي و بالفاصله پس از ظهور لكه

.آب مقطر شستشو داده شد

در سطح پروتئين به هدفبررسي گياهان

Western-blotting)( گذاري وسترنلكهروش

ها با روشجداسازي پروتئينپس از ام شد. انج

SDS-PAGEغشاء ژل، ، ابتداPVDF كاغذ و

3/8(تريس موالر ميلي 48واتمن در بافر انتقال (

pH ،(39 موالرميلي 3/1، گليسين موالرميلي

SDS براي انتقال ندار داده شدقر )متانول %20و .

Trans-Blotها از ژل به غشاء، از دستگاه پروتئين

semi-dry )BioRad امريكا) و دستورالعمل ،

در مرحله بعد استفاده گرديد.شركت سازنده

در بافر بلوكه ساعت 5مدت به PVDF ءغشا

قرار PBS-T) %5كننده (شير خشك بدون چربي

14 Diaminobenzidine tetrahydrochloride


٨٧ Journal of Agricultural Biotechnology; Printing ISSN: 2228-6705, Electronic ISSN: 2228-6500

گذاري لكهي مراحل مشابه با آزمون گرفت. بقيه

انجام شد. اينقطه

با در گياهان هدف كمي سازي بيان پروتئين

به روش غير )ELISA( االيزا روشاستفاده از

,Engvall & Perlmann(مستقيم انجام شد

تعيين ميزان كمي و هدف از انجام آن )1971

، ابتداپروتئين موردنظر بود. به اين صورت كه

همراه بافر هاي پروتئيني موردنظر بهنمونه

هاي در سه تكرار درون چاهك 15دهندهپوشش

پليت بارگذاري شدند. سپس مراحل شستشو با

ها با محلول و بلوكه كردن چاهك PBS-Tمحلول

BSA 1% انجام شد. بعد از شستشوي مجدد با

بادي اوليه ، انكوبه شدن با آنتيPBS-Tمحلول

يرفت. در نهايت پس از افزودن صورت پذ

به هر TMB 16بادي ثانويه، محلول سوبسترايآنتي

چاهك افزوده شد و بعد از توقف واكنش آنزيمي

در طول موالر، ميزان جذب 1اسيد سولفوريك با

Microplateنانومتر با استفاده از دستگاه 450موج

reader )BioTek (خوانده شد.، امريكا

نتايج

در قطعات ژني هدفسازي انهپس از همس

با PCR، آزمون كلني pJETسازي ناقل همسانه

حاوي انتخابي روي محيط هاي رشد يافتهكلني

كثيرتو مشاهده قطعات انجام شد بيوتيكآنتي

Nb42I هايجفت بازي براي ژن 524 هطع(ق شده

15

Coating buffer 16 3, 3′, 5, 5′-Tetramethylbenzidine

pJET با استفاده از آغازگرهاي ناقل )Nb42IIو

هدف را در ناقل مذكور هايدرج ژن، )1(جدول

هضم آنزيمي .)جو الف -1(شكل تائيد نمود

(از هر يك مثبتيك كلني از شده ناقل استخراج

KpnIو SphIهاي با آنزيم نوتركيب) هاياز ناقل

كردهدف را تائيد هايسازي ژننيز همسانه

همچنين نتايج حاصل از .)دو ب -1شكل (

pJETدر ناقل يابي، صحت توالي درج شدهتوالي

سازي قطعات ژني منظور همسانهبه را تائيد نمود.

، واكنش هضم pZGFPهدف در ناقل ويروسي

سازي نوتركيب و نيز هاي همسانهآنزيمي ناقل

KpnIو SphIهاي برشي با آنزيم pZGFPناقل

ژني و ناقل انجام گرفت. پس از تخليص قطعات

ي هدف از روي ژل، واكنش اتصال بين قطعات ژن

با استفاده از PCRكلني و ناقل انجام شد. آزمون

) و 1آغازگرهاي اختصاصي ژن نانوبادي (جدول

Nb42Iهضم آنزيمي، همسانه شدن قطعات ژني

ج و -2(شكل Nb42IIالف و ب) و -2(شكل

pZGFP در ناقل ويروسي GFPد) را به جاي ژن

جفت بازي در 398ي تكثير قطعهتائيد نمودند.

با استفاده از آغازگرهاي RT-PCRتيجه آزمون ن

) در گياهان 1اختصاصي ژن نانوبادي (جدول

كوبي شده و نيز عدم تكثير آن در گياه شاهد مايه

) DNaseIتيمار شده با RNAو كنترل منفي (

ي ژني هدف در بيانگر بيان موفق از هر دو قطعه

هاي نوتركيب در كوبي شده با ناقلگياهان مايه

).3ح رونويسي بود (شكل سط


٨٨ Journal of Agricultural Biotechnology; Printing ISSN: 2228-6705, Electronic ISSN: 2228-6500

-8تا 1هاي : چاهك%1روي ژل آگارز Nb42I ژن PCRالف) آشكارسازي محصول كلني - 1شكل

- 1: چاهك %1روي ژل آگارز pJETNb42Iهاي رشد يافته روي محيط ب) هضم آنزيمي ناقل كلني

روي Nb42II ژن PCRناقل برش يافته ج) آشكارسازي محصول كلني -2ناقل برش نيافته، چاهك

هاي رشد يافته روي محيط د) هضم آنزيمي ناقل كلني - 10تا 1هاي : چاهك%1ژل آگارز

pJETNb42II ناقل برش يافته، -2ناقل برش نيافته، چاهك -1: چاهك %1روي ژل آگارزM -

الگو). DNAكنترل منفي (بدون - Kb1 ،-Cنشانگر مولكولي Figure 1- Detection of colony PCR product of Nb42I gene on the 1% agarose gel: lanes

1-8- colonies grown on the medium b) Enzyme digestion of pJETNb42I vector on the

1% agarose gel: lane 1- undigested vector, lane 2- digested vector c) Detection of colony

PCR product of Nb42II gene on the 1% agarose gel: lanes 1-10- colonies grown on the

medium d) Enzyme digestion of pJETNb42II vector on the 1% agarose gel: lane 1-

undigested vector, lane 2- digested vector, M- 1Kb molecular marker, C-- negative

control (without template DNA).


٨٩ Journal of Agricultural Biotechnology; Printing ISSN: 2228-6705, Electronic ISSN: 2228-6500

-7تا 1هاي : چاهك%1روي ژل آگارز Nb42I ژن PCRالف) آشكارسازي محصول كلني - 2شكل

روي I42pZNbب) هضم آنزيمي ناقل 42Nb-c6pHENناقل -C+هاي رشد يافته روي محيط، كلني

لني محصول ك ناقل برش يافته ج) آشكارسازي -2ناقل برش نيافته، چاهك -1: چاهك %1ژل آگارز

PCR ژن II24Nb هاي رشد يافته روي محيط، كلني -9تا 1هاي : چاهك%1روي ژل آگارز+C - ناقل

pUC57-Nb42HFBI د) هضم آنزيمي ناقلpZNb42II ناقل برش -1: چاهك %1روي ژل آگارز

و). الگ DNAكنترل منفي (بدون -Kb1 ،-Cنشانگر مولكولي -Mناقل برش يافته، - 2نيافته، چاهك Figure 2- Detection of colony PCR product of Nb42I gene on the 1% agarose gel: lanes

1-7- colonies grown on the medium, C+- pHEN6c-Nb42 vector b) Enzyme digestion of

pZNb42I vector on the 1% agarose gel: lane 1- undigested vector, lane 2- digested vector

c) Detection of colony PCR product of Nb42II gene on the 1% agarose gel: lanes 1-10-

colonies grown on the medium, C+- pUC57-Nb42HFBI vector d) Enzyme digestion of

pZNb42II vector on the 1% agarose gel: lane 1- undigested vector, lane 2- digested

vector, M- 1Kb molecular marker, C-- negative control (without template DNA).

هاي گياهان در اين كوبي برگهدف از مايه

تحقيق، بيان موقت پروتئين نوتركيب نانوبادي

Nb42 هايي كه در باشد. اگرچه با بررسيمي

هاي انجام شد، بيان اين ژن در برگ RNAسطح

لزوما اما درج ژن ؛كوبي شده تائيد گرديدمايه

معني توليد پروتئين نوتركيب نيست، بنابراين به

الزم است پروتئين هدف رديابي گردد و مقدار

توليدي پروتئين هدف مشخص گردد.


٩٠ Journal of Agricultural Biotechnology; Printing ISSN: 2228-6705, Electronic ISSN: 2228-6500

روي ژل آگارز Nb42Iژن RT-PCRاستخراج شده و محصول RNAالف) آشكارسازي -3شكل

هاي چاهك ،I42pZNbكوبي شده با ناقل گياه مايه RNA -2گياه شاهد، چاهك RNA -1.: چاهك %1

ازيب) آشكارس )I42pZNb كنترل مثبت (ناقل - I42pZNb، +C ناقل با كوبي شدهمايهگياهان -7تا 3

RNA استخراج شده و محصولRT-PCR ژنNb42II 1.: چاهك %1روي ژل آگارز- RNA گياه

كوبي مايهگياهان -7تا 3هاي چاهك ،pZNb42IIكوبي شده با ناقل گياه مايه RNA -2شاهد، چاهك

3تا Kb1، 1-Cنشانگر مولكولي -II42pZNb(، M كنترل مثبت (ناقل -II42pZNb، +C ناقل با شده-C -

باشند.و گياه شاهد) مي RNAهاي منفي (آب، كنترل

Figure 3- a) Detection of extracted RNA and of RT-PCR product of Nb42I gene on the

1% agarose gel: lane 1- control plant RNA, lane 2- inoculated plant RNA with pZNb42I,

lane 3-7- inoculated plants with pZNb42I vector, C+- positive control (pZNb42I vector)

b) Detection of extracted RNA and of RT-PCR product of Nb42II gene on the 1%

agarose gel: lane1- control plant RNA, lane 2- inoculated plant RNA with pZNb42II,

lane 3-7- inoculated plants with pZNb42II vector, C+- positive control (pZNb42II vector),

M- 1Kb molecular marker, C-1- C-

3- negative controls (water, RNA, and control plant).


٩١ Journal of Agricultural Biotechnology; Printing ISSN: 2228-6705, Electronic ISSN: 2228-6500

.pJETآغازگرهاي اختصاصي طراحي شده براي تكثير و تاييد درج ژن هدف در ناقل -1جدول

Table 1- Specific primers designed for the amplification and confirmation of the target

gene insertion into the pJET vector.

اي حضور گذاري نقطهنتايج آزمون لكه

را در عصاره پروتئيني Nb42Iپروتئين نوتركيب

كوبي شده با استخراج شده از برگ گياهان مايه

ايسه با گياه شاهد (گياه در مق pZNb42Iناقل

الف) و همچنين -4كوبي شده با بافر) (شكل مايه

را در عصاره Nb42IIحضور پروتئين نوتركيب

كوبي پروتئيني استخراج شده از برگ گياهان مايه

در مقايسه با گياه شاهد pZNb42IIشده با ناقل

اين نتايج بيانگر بيان ب). -4نشان داد (شكل

Nb42IIو Nb42Iي نوتركيب هاموفق پروتئين

هدف بود.هاي زني شده با ناقلمايهدر گياهان

، مقايسه الگوي SDS-PAGEپس از انجام آزمون

كوبي شده و شاهد تفاوت باندي گياهان مايه

ي مورد انتظار باندي قابل تشخيصي را در محدوده

منظور به د. لذابراي قطعات ژني هدف نشان ندا

روتئين نوتركيب از آزمون بررسي بيشتر بيان پ

استفاده گرديد. آزمون گذاري وسترنلكه

بادي اختصاصي نانوبادي با آنتي گذاري وسترنلكه

)polyclonal rabbit anti-camel IgG روي (

كوبي هاي استخراج شده از گياهان مايهپروتئين

ي شده، حضور يك باند مشخص را در محدوده

قطعات ژني ) براي kDa17-11 موردانتظار (

Nb42I وNb42II 15در مقايسه با باند

عنوان كنترل به Nb42كيلودالتون پروتئين نانوبادي

مثبت نشان داد. هيچ گونه باند مشابهي در مورد

پروتئين استخراج شده از گياه شاهد مشاهده نشد

).5(شكل

آغازگر نام Primer

name

تواليSequence

اندازه قطعات

)bpتكثيري (

جايگاه برشي

(زيرخط دار)

Restriction site (Underlined)

NbF1 CAGGTCCAGCTGGCATGCATGC-5′ CAGGAGTC-3′

398 SphI

NbR1 TGAGGAGACGGTGGTACCTCGA-5′ GACCTGGGTCC-3′

398 KpnI

NbF2 CAAGTTCAATTGCGCATGCATGC-5′ AAG-3′

398 SphI

NbR2 AGAAGAAACAGTAGGTACCTCGA-5′ ACTTG-3′

398 KpnI

pJET1.2

F

5'-CGACTCACTATAGGGAGAGCGGC-3' 524 -

pJET1.2

R

5'-AAGAACATCGATTTTCCATGGCAG-3' 524 -


٩٢ Journal of Agricultural Biotechnology; Printing ISSN: 2228-6705, Electronic ISSN: 2228-6500

و گياه شاهد:pZNb42I ناقل كوبي شده باگياهان مايه ايگذاري نقطهالف) آزمون لكه -4شكل

گياهان ايگذاري نقطهب) آزمون لكه Nb42Iكننده هاي پروتئيني گياهان بياننمونه -7تا 1هاي لكه

كننده نهاي پروتئيني گياهان بيانمونه - 6تا 1هاي شاهد: لكه و II42pZNb ناقل كوبي شده بامايه

II42Nb ،+C- 42كنترل مثبت (پروتئينNb خالص شد ،(ه از باكتري-C - نمونه پر) وتئيني كنترل منفي

.گياه شاهد)Figure 4- a) Dot blot analysis of inoculated plants with pZNb42I vector and control

plant: spots 1-7- protein samples of plants expressing Nb42I b) Dot blot analysis of

inoculated plants with pZNb42II vector and control plant: spots 1-6- protein samples of

plants expressing Nb42II, C+- positive control, bacterial purified Nb42 protein, C--

negative control (protein sample of control plant).

در نهايت، جهت برآورد كمي پروتئين

كوبي شده از هان مايهنوتركيب توليد شده در گيا

آزمون االيزا استفاده شد. اين آزمون تفاوت

داري بين ميزان جذب نوري پروتئين گياهان معني

شده و شاهد براي قطعات ژني مختلف كوبيمايه

شود مشاهده مي 6نشان داد. همانطور كه در شكل

و 1گياه شماره Nb42Iبراي پروتئين نوتركيب

5گياه شماره Nb42IIبراي پروتئين نوتركيب

بيشترين تفاوت ميزان جذب را نسبت به گياه

الف و ج). -6شاهد نشان دادند (شكل

اين گياهان با بيشترين ميزان جذب به

ميكروگرم پروتئين 8/6و 2ترتيب حاوي

– 6باشند (شكل نوتركيب در گرم بافت برگي مي

منظور به دست آوردن ميزان بيان، ب و د). به

هاي جذب خوانده شده براي هر گياه داده ميانگين

، در معادله رگرسيوني ELISA Readerبا دستگاه

هاي مشخص به دست آمده با استفاده از غلظت

پروتئين كنترل مثبت (نانوبادي بيان شده در

باكتري) قرار داده شد و ميزان پروتئين بيان شده

در برگ گياهان هدف تعيين گرديد.


٩٣ Journal of Agricultural Biotechnology; Printing ISSN: 2228-6705, Electronic ISSN: 2228-6500

- 3تا 1هاي : چاهكNb42Iبراي تاييد بيان پروتئين نوتركيب گذاري وسترنلكه آزمون الف) -5شكل

تئين براي تاييد بيان پرو گذاري وسترنب) آزمون لكه Nb42Iگياهان كدو حاوي پروتئين نوتركيب

كنترل -II42Nb ،+Cگياهان كدو حاوي پروتئين نوتركيب -3تا 1هاي : چاهكII42Nbنوتركيب

(گياه كنترل منفي -C-نشانگر پروتئيني (سيناژن)، - Mخالص شده از باكتري)، 42Nbپروتئين مثبت (

.شاهد)Figure 5- a) Western blot analysis for confirmation of Nb42I recombinant protein

expression: lanes 1-3- cucurbit plants containing the Nb42I recombinant protein b)

Western blot analysis for confirmation of Nb42II recombinant protein expression: lanes

1-3- cucurbit plants containing the Nb42II recombinant protein, C+- positive control

(bacterial purified Nb42 protein), M- protein marker (cinnagen), C--negative control

(control plant).

گيريبحث و نتيجه

هاي زراعت مولكولي و توليد پروتئين

هاي ارزشمندي نوتركيب در ايران با موفقيت

ي داروئي مهم هاهمراه بوده است. توليد پروتئين

، )Bagheri et al., 2013(از قبيل اينترفرون گاما

ي عال كننده، ف)Yarbakht et al., 2015(انسولين

,.Abdoli-Nasab et al( پالسمينوژن بافتي

، نانوبادي عليه گيرنده فاكتور رشد )2013

et al Mirzaee ,.( 17هاي عروق خونيسلول

17

Anti-Vascular endothelial growth factor receptor

و غيره توسط تيم تحقيقاتي دكتر جاللي )2017

در آزمايشگاه بيوتكنولوژي دانشكده كشاورزي

هايي از اين دانشگاه تربيت مدرس، نمونه

براي گياهان تراريخته نسل باشند.ها ميموفقيت

هاي مورد استفاده سوم با هدف توليد پروتئين

داروئي و صنعتي، چالش اصلي دسترسي به سطح

باشد.تئين ميباالي بيان پرو


٩۴ Journal of Agricultural Biotechnology; Printing ISSN: 2228-6705, Electronic ISSN: 2228-6500

در مقايسه با Nb42I نوتركيب پروتئينبيان كننده كدو براي گياهان االيزاالف) نمودار آزمون -6شكل

-7 ن، ستوpZNb42I ي شده با ناقل ويروسي نوتركيبكوبمايهگياهان -6 تا 1هاي ستون. گياه شاهد

1هاي نر گرم بافت برگي گياهان كدو: ستودر ه Nb42Iميزان تجمع پروتئين نوتركيب ب) گياه شاهد

بيان كننده دو براي گياهان كااليزا ج) نمودار آزمون بيان كننده پروتئين نوتركيبگياهان كدو - 6تا

ي شده با ناقل كوبمايهگياهان -6تا 1هاي ستون. در مقايسه با گياه شاهد Nb42IIنوتركيب پروتئين

ر هدر Nb42IIميزان تجمع پروتئين نوتركيب ) د گياه شاهد - 7 ون، ستpZNb42IIويروسي نوتركيب

بيان كننده پروتئين نوتركيب.كدو گياهان -6تا 1هاي گرم بافت برگي گياهان كدو: ستونFigure 6- a) ELISA chart for cucurbit plants expressing the Nb42I recombinant protein

compared with control plant: columns 1-6- inoculated plants with pZNb42I recombinant viral vector, column 7- control plant b) The amount of Nb42I recombinant

protein accumulation per gram of leaf tissue from cucurbit plants: columns 1-6-

cucurbit plants expressing the recombinant protein c) ELISA chart for cucurbit plants

expressing the Nb42II recombinant protein compared with control plant: columns 1-6-

inoculated plants with pZNb42II recombinant viral vector, column 7- control plant d)

The amount of Nb42II recombinant protein accumulation per gram of leaf tissue from

cucurbit plants: columns 1-6- cucurbit plants expressing the recombinant protein.


٩۵ Journal of Agricultural Biotechnology; Printing ISSN: 2228-6705, Electronic ISSN: 2228-6500

رويكردهاي مختلفي براي افزايش سطح بيان

گياهان تراريخته پيشنهاد پروتئين هدف در

از قبيل: انتخاب پيشبرنده مناسب، عناصر شودمي

گيري سازي كدوني، هدف، بهينه18افزايش دهنده

پايداري پروتئين ، سلولي پروتئين نوتركيبدرون

et al Benchabane ,.2008 ;(غيره و هدف

; Streatfield 2007; ., 2016et al Gerasimova

2015., et al Ullrich( .هاي اخير نشان در دهه

داده شده است كه يك فاكتور موثر مهم در

سازي ئين نوتركيب بهينهافزايش سطح بيان پروت

طور به. )et al Webster ,.2017( كدوني است

450P توالي ژن 5′توالي نوكلئوتيدي انتهاي ال، مث

ن توتون تغيير مطابق با ترجيح كدوني گياه ميزبا

افزايش سطوح و اين تغيير منجر به داده شد

خيلي پايين بيان گرديد و پروتئين نوتركيب با

قابل شناسايي گذاري وسترنلكهاستفاده از آزمون

هنگامي طور مشابه به. )et al Batard ,.2000( بود

مطابق با ترجيح CTB19توالي نوكلئوتيدي ژن كه

بيان ژن بهينه داده شد،تغيير توتونكدوني گياه

برابر افزايش 15شده در مقايسه با ژن بهينه نشده

A6cry همچنين ژن .)et al Kang ,.2004( يافت

هاي هم معني هاي نادر با كدونبا تغيير كدون

خود در گياه گوجه فرنگي بهينه گرديد. بيان

شكل تغيير نيافته آن قابل تشخيص پروتئين در

كه ژن تغيير يافته توسط آزمون نبود در حالي

,.Li et al( شناسايي گرديدگذاري وسترن لكه

18 Enhancer elements 19

Cholera toxin B subunit

بهينه كردن توالي ژن رمز كنندهبعالوه، . )2007

مطابق با ترجيح كدوني گياه فاكتور رشد اپيدرمي

شده منجر به افزايش بيان اين پروتئين ،توتون

.)Thomas & Walmsley 2014(است

در تحقيق حاضر، قطعات مختلف نانوبادي

)Nb42I و Nb42IIطور موقت با استفاده از ) به

ناقل ويروسي و تحت كنترل پيشبرنده ويروسي

ويروس موزائيك كلم گل در گياه كدو S35قوي

سازي موفق ام همسانهبيان شدند. پس از انج

قطعات مختلف ژني در ناقل ويروسي، آزمون

RT-PCR رونويسي از قطعات مختلف ژني

واكنش پروتئين استخراج هدف را تائيد نمود.

سبت به كوبي شده نمايهشده از برگ گياهان

با استفاده از روش اختصاصي نانوباديبادي آنتي

االيزا مون آز نتايجمورد آزمون قرار گرفت. االيزا

نوتركيبهاي نشان داد كه ميزان بيان پروتئين

Nb42I وNb42II ميكروگرم 8/6و 2به ترتيب

كه در باشدگرم بافت برگي ميهر پروتئين در

خي از تحقيقات انجام شده در مقايسه با بر

باالتر بودبيان نانوبادي در گياهان يزمينه

)Korouzhdehy et al., 2011; Magee et al.,

) Nb42Iهينه شده نانوبادي (بيان شكل ب. )2004

) Nb42IIبرابر شكل بهينه نشده ( 5/3تقريبا

در مقايسه با برخي تحقيقات انجام كه باشدمي

سازي كدوني بررسي اثر بهينه يدر زمينه شده

,.Batard et al., 2000; Li et al( بيشتر بود

اين افزايش بيان نشان داد كه فاكتور . )2007


٩۶ Journal of Agricultural Biotechnology; Printing ISSN: 2228-6705, Electronic ISSN: 2228-6500

عنوان يك فاكتور تواند بهسازي كدوني ميبهينه

موثر براي افزايش بيان پروتئين در نظر گرفته

شود.

هاي مختلف با سطوح متغيير تاكنون نانوبادي

در مقايسه با اند. موفقيت در گياهان بيان شده

هاي انوباديي بيان موقت، هنگامي كه نسامانه

شتري در گياهان تراريخته بيان شدند، در سطوح

,.Korouzhdehy et al(خيلي كم تجمع يافتند

2011; Magee et al., 2004( .طور مثال، به

نانوباديبيان αTNF20 سميتمنظور كاهش به

تجمع و صورت گرفت توتونگياه عليه آن در

) براي TSPدرصد پروتئين كل ( 1كمتر از

Winichayakul et) نانوبادي مذكور گزارش شد

al., 2009) . نيز 2011در سالConrad و

گياهان در را TNFهمكاران نانوبادي عليه

تراريخته توتون بيان نمودند و سطح بيان آن پس

درصد 7/1به 003/0 از ELP21از الحاق به دنباله

TSP تغيير يافت)Conrad et al., 2011( . بعالوه

نيز براي نانوبادي عليه %1سطوح بيان كمتر از

گيرنده فاكتور رشد اندوتليال عروقي در گياه كاهو

.)Mirzaee et al., 2017( بدست آمده است

گذاري لكههايي گياهي كه در آزمون نمونه

با روشدر تاييد يكديگر بودند االيزاو اي نقطه

مورد آزمون قرار گرفتند.گذاري وسترن لكه

قطعات ژني كه برايي اين آزمون نشان داد نتيجه

Nb42I وNb42II 11ي بين باندهاي در محدوده

گردد كه در مشاهده ميباندي كيلودالتون 17و

20 Tumor necrosis factor α cytotoxicity 21 elastin-like pentapeptide

انگر حضور اين باندها بي وجود ندارد.گياه شاهد

هاي نوتركيب موردنظر بود.بيان موفق پروتئين

ها با اهداف تشخيصي و باديمصرف آنتي

ويژه براي درمان سرطان) روز به روزهدرماني (ب

باشد. بنابراين، ايجاد يك در حال افزايش مي

ها منظور توليد انبوه و ارزان آنبهسيستم كارا

آوريير است. فنامري ضروري و اجتناب ناپذ

هاي ويروسي بيان موقت با استفاده از ناقل

توان در مدت كند كه ميشرايطي را فراهم مي

ت بادي را چندين برابر نسبزماني اندك بيان آنتي

به گياهان تراريخته افزايش داد. از طرف ديگر

هاي اصلي كه مانع توليد اقتصادي يكي از چالش

شود ميتراريخته هاي نوتركيب در گياهان پروتئين

. باشدسطوح تجمع ناكافي پروتئين نوتركيب مي

با مطابقبهينه كردن توالي رمز كننده ژن مورد نظر

عنوان يك تواند بهميترجيح كدوني گياه ميزبان

گياهان در مناسب جهت بيان پروتئين در رويكرد

تحقيقات آينده به كار گرفته شود.


٩٧ Journal of Agricultural Biotechnology; Printing ISSN: 2228-6705, Electronic ISSN: 2228-6500

منابع Abdoli-Nasab M, Jalali-Javaran M, Cusidó RM, Palazón J, Baghizadeh A, Alizadeh H

(2013). Expression of the truncated tissue plasminogen activator (K2S) gene in tobacco

chloroplast. Molecular Biology Reports 40:5749-5758.

Bagheri K, Javaran MJ, Mahboudi F, Moeini A, Zebarjadi A (2013). Expression of human

interferon gamma in Brassica napus seeds. African Journal of Biotechnology 9:5066-

5072.

Batard Y, Hehn A, Nedelkina S, Schalk M, Pallett K, Schaller H, Werck-Reichhart D (2000).

Increasing expression of P450 and P450-reductase proteins from monocots in

heterologous systems. Archives of Biochemistry and Biophysics 379:161-169.

Behdani M, Zeinali S, Khanahmad H, Karimipour M, Asadzadeh N, Azadmanesh K, Khabiri

A, Schoonooghe S, Anbouhi MH, Hassanzadeh-Ghassabeh G (2012). Generation and

characterization of a functional Nanobody against the vascular endothelial growth factor

receptor-2; angiogenesis cell receptor. Molecular Immunology 50:35-41.

Benchabane M, Goulet C, Rivard D, Faye L, Gomord V, Michaud D (2008). Preventing

unintended proteolysis in plant protein biofactories. Plant Biotechnology Journal 6:633-

648.

Bradford MM (1976). A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram

quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical

Biochemistry 72:248-254.

Conrad U, Plagmann I, Malchow S, Sack M, Floss DM, Kruglov AA, Nedospasov SA, Rose John S, Scheller J (2011). ELPylated anti‐human TNF therapeutic single‐domain

antibodies for prevention of lethal septic shock. Plant Biotechnology Journal 9:22-31.

Ebrahimizadeh W, Gargari SLMM, Javidan Z, Rajabibazl M (2015). Production of Novel

VHH Nanobody Inhibiting Angiogenesis by Targeting Binding Site of VEGF. Applied

Biochemistry Biotechnology 176:1985-1995.

Engvall E, Perlmann P (1971). Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) quantitative

assay of immunoglobulin G. Immunochemistry 8:871-874.

Folkman J (1971) Tumor angiogenesis: therapeutic implications. New England Journal of

Medicine 285:1182-1186

Gerasimova S, Smirnova O, Kochetov A, Shumnyi V (2016). Production of recombinant

proteins in plant cells. Russian Journal Plant Physiology 63:26-37.

Hiatt A, Caffferkey R, Bowdish K (1989). Production of antibodies in transgenic plants.

Nature 342:76-78.

Hsu C-H, Lin S-S, Liu F-L, Su W-C, Yeh S-D (2004). Oral administration of a mite allergen

expressed by zucchini yellow mosaic virus in cucurbit species downregulates allergen-

induced airway inflammation and IgE synthesis. Journal Allergy Clinical Immunology

113:1079-1085.

Huang Z, Phoolcharoen W, Lai H, Piensook K, Cardineau G, Zeitlin L, Whaley KJ, Arntzen

CJ, Mason HS, Chen Q (2010). High-level rapid production of full-size monoclonal

antibodies in plants by a single-vector DNA replicon system. Biotechnology and

Bioengineering 106:9-17.

Huang Z, Santi L, LePore K, Kilbourne J, Arntzen CJ, Mason HS (2006). Rapid, high-level

production of hepatitis B core antigen in plant leaf and its immunogenicity in mice.

Vaccine 24:2506-2513.


٩٨ Journal of Agricultural Biotechnology; Printing ISSN: 2228-6705, Electronic ISSN: 2228-6500

Kang T-J, Loc N-H, Jang M-O, Yang M-S (2004). Modification of the cholera toxin B

subunit coding sequence to enhance expression in plants. Molecular Breeding 13:143-

153.

Kazemi-Lomedasht F, Behdani M, Bagheri KP, Habibi-Anbouhi M, Abolhassani M,

Arezumand R, Shahbazzadeh D, Mirzahoseini H (2015). Inhibition of angiogenesis in

human endothelial cell using VEGF specific nanobody. Molecular Immunology 65:58-

67.

Kolkman JA, Law DA (2010). Nanobodies–from llamas to therapeutic proteins. Drug

Discovery Today: Technologies 7:e139-e146. Korouzhdehy B, Dadmehr M, Piri I, Rahbarizadeh F, Solouki M (2011). Expression of

biological active VHH camelid single domain antibody in transgenic tobacco. African

Journal of Biotechnology 10:4234-4241.

Laemmli UK (1970). Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of

bacteriophage T4. Nature 227:680-685.

Li XQ, Wei JZ, Tan A, Aroian RV (2007). Resistance to root‐knot nematode in tomato roots

expressing a nematicidal Bacillus thuringiensis crystal protein. Plant Biotechnology

Journal 5:455-464.

Lico C, Chen Q, Santi L (2008). Viral vectors for production of recombinant proteins in

plants. Journal Cell Physiology 216:366-377.

Ma JK, Drake PM, Christou P (2003). The production of recombinant pharmaceutical

proteins in plants. Nature Reviews Genetics 4:794-805.

Magee AM, Coyne S, Murphy D, Horvath EM, Medgyesy P, Kavanagh TA (2004). T7 RNA

polymerase-directed expression of an antibody fragment transgene in plastids causes a

semi-lethal pale-green seedling phenotype. Transgenic Research 13:325-337.

Mirzaee M, Jalali-Javaran M, Moieni A, Zeinali S, Behdani M, Shams-Bakhsh M, Modarresi

M (2017). Anti-VEGFR2 nanobody expression in lettuce using an infectious Turnip

mosaic virus vector. Journal Plant Biochemical Biotechnology:1-8.

Moussavou G, Ko K, Lee J-H, Choo Y-K (2015). Production of Monoclonal Antibodies in

Plants for Cancer Immunotherapy. BioMed Research International 2015: 9p. Muyldermans S, Baral T, Retamozzo VC, De Baetselier P, De Genst E, Kinne J, Leonhardt

H, Magez S, Nguyen V, Revets H (2009). Camelid immunoglobulins and nanobody

technology. Veterinary immunology and immunopathology, 128: 178-183.

Pereira DM, Cheel J, Areche C, San-Martin A, Rovirosa J, Silva LR, Valentao P, Andrade

PB (2011). Anti-proliferative activity of meroditerpenoids isolated from the brown

alga Stypopodium flabelliforme against several cancer cell lines. Marine Drugs 9:852-

862. Sambrook JR, Russell D (2001). DW. 2001 Molecular cloning: a laboratory manual.

Quarterly Review of Biology 76:348-349.

Scott AM, Wolchok JD, Old LJ (2012). Antibody therapy of cancer. Nature Reviews Cancer

12:278-287. Streatfield SJ (2007). Approaches to achieve high‐level heterologous protein production in

plants. Plant Biotechnology Journal 5:2-15.

Thomas DR, Walmsley AM (2014). Improved expression of recombinant plant-made hEGF.

Plant Cell Reports 33:1801-1814.

Tian J, Yan Y, Yue Q, Liu X, Chu X, Wu N, Fan Y (2017). Predicting synonymous codon

usage and optimizing the heterologous gene for expression in E. coli. Scientific Reports

7:9926.

Ullrich KK, Hiss M, Rensing SA (2015). Means to optimize protein expression in transgenic

plants. Current Opinion in Biotechnology 32:61-67.


٩٩ Journal of Agricultural Biotechnology; Printing ISSN: 2228-6705, Electronic ISSN: 2228-6500

Webster GR, Teh AYH, Ma JKC (2017). Synthetic gene design-the rationale for codon

optimization and implications for molecular pharming in plants. Biotechnology and

Bioengineering 114:492-502.

Winichayakul S, Pernthaner A, Scott R, Vlaming R, Roberts N (2009). Head‐to‐tail fusions

of camelid antibodies can be expressed in planta and bind in rumen fluid. Biotechnology

and Applied Biochemistry 53:111-122.

Yarbakht M, Jalali-Javaran M, Nikkhah M, Mohebodini M (2015). Dicistronic expression of

human proinsulin-protein A fusion in tobacco chloroplast. Biotechnology and Applied

Biochemistry 62:55-63.

Youssoufian H, Hicklin DJ, Rowinsky EK (2007). Review: monoclonal antibodies to the

vascular endothelial growth factor receptor-2 in cancer therapy. Clinical cancer

research. 13:5544s-5548s. Zhang J, Yang PL, Gray NS (2009) Targeting cancer with small molecule kinase inhibitors.

Nature Reviews Cancer 9:28-39.


١٠٠ Journal of Agricultural Biotechnology; Printing ISSN: 2228-6705, Electronic ISSN: 2228-6500

Study of the effect of codon optimization on Anti-VEGF nanobody expression

Soleimanizadeh M.1, Bagheri A.R.2, Jalali javaran M.∗∗∗∗3, Seifi A.R.4, Behdani M.5, Kazemi-

lomedasht F.6

1Ph.D. Student of Agriculture Biotechnology, Agriculture Faculty, Ferdowsi University of Mashhad,

Mashhad, Iran. 2Professor of Department of Biotechnology and Plant Breeding, Agriculture Faculty, Ferdowsi

University of Mashhad, Mashhad, Iran. 3Associate Professor of Department of Biotechnology, Agriculture Faculty, Tarbiat Modares

University, Tehran, Iran.

4Assistant Professor of Department of Biotechnology and Plant Breeding, Agriculture Faculty,

Ferdowsi University of Mashhad, Mashhad, Iran. 5Associate Professor of Biotechnology Department, Biotechnology Research Center, Pasteur Institute

of Iran, Tehran, Iran. 6Assistant Professor of Biotechnology Department, Biotechnology Research Center, Pasteur Institute

of Iran, Tehran, Iran.

Abstract

Plants can be exploited for the production of various recombinant proteins as valuable

bioreactors because of many reasons. The use of plant viral vectors for the transient

expression offers as a useful strategy for the large-scale production of proteins with

pharmaceutical importance, such as antibodies within a very short time period. Today, cancer

is the second cause of death in human society. Compelling evidence suggests that vascular

endothelial growth factor (VEGF), due to its essential role in angiogenesis, is a critical target

for cancer treatment. In This study, Anti-VEGF (Nb42) nanobody different fragments were

transiently expressed under the control of a viral strong promoter in cucurbit plant using

ZYMV-based viral vector. These fragments included natural nanobody sequence (Nb42I) and

optimized nanobody sequence (Nb42II) for expression in plant. After inoculation of plants,

the presence of transcripts of the Nb42 gene fragments in cucurbit inoculated plants was

detected by using RT-PCR. Also, the recombinant protein expression was confirmed by Dot blotting, SDS-PAGE, Western blotting and ELISA. Based on the ELISA results, the

expression level of Nb42I and Nb42II nanobody fragments was 2 and 6.8 µg/g of leaf tissue

respectively. Taken together, recombinant Nb42 nanobody could be efficiently expressed in

cucurbit plant and ZYMV-based expression system would be an appropriate platform for

production of recombinant proteins in cucurbit plants

Keywords: Transient expression, Codon optimization, Molecular farming, Viral vector,

Nanobody.

[email protected] :lEmai 09123091917 +:Tel. Jalali M: Corresponding Author ∗

9-Paper 6- 96A268 Soleimanizadeh et al-2jab.uk.ac.ir/article_2016_f28ce859d981df3eb558385c7d5bda4f.pdf · 1396 $ 5ˆ@ ˇ ˆ˙ ٨۵ Journal of Agricultural Biotechnology; Printing

Documents