This document is posted to help you gain knowledge. Please leave a comment to let me know what you think about it! Share it to your friends and learn new things together.
Transcript
Naciones Unidas NTIMICROBIAL La SEÑORES Y C Hemoterapia,octubre de 2008, p. 3648-3663 Vol. 52, N ° 10
Efectos de los antibióticos sobre Quorum Sensing en
Pseudomonas aeruginosa
Mette E. Skindersoe, 1 † Morten Alhede,
1 Richard Phipps,
1 Liang Yang,
1 Pedro O. Jensen,
3
Thomas B. Rasmussen, 2 Thomas Bjarnsholt, 1 Tim Tolker-Nielsen, 1
Niels Høiby, 3 y Michael Givskov
1 *
Biomédica Microbiología, BioSys, Bldg. 227, de la Universidad Técnica de Dinamarca, Kgs. Lyngby DK-2800,
1 Fisiología, culturas y División de enzimas, Chr-Hansen A / S, Bøge Alle' 10-12, Hørsholm DK-2970,
2 y el
Departamento de Microbiología Clínica, Rigshospitalet, Universidad de Copenhague, Copenhague DK-2100, 3
Dinamarca
Recibido 19 de septiembre 2007 / devueltos para el 23 de octubre de 2007 de modificación / Aceptado 11 de
junio 2008
Durante la Infección, Pseudomonas aeruginosa Emplea la Comunicación bacteriana (deteccion de quórum [QS]) Parr Coordinar la Expresión de Factores Que Danan los Tejidos. La expresión génica controlada-QS juega un papel fundamental en la virulencia de P. aeruginosa, y los mutantes-QS deficientes causan infecciones menos graves en modelos de
infección animal.El tratamiento de la fibrosis quística (FQ) infección crónica con P. aeruginosa con el antibiótico azitromicina macrólido (AZM) se ha demostrado para mejorar el resultado clínico.Varios estudios indican que AZM puede cumplir su acción beneficiosa en los pacientes con FQ al impedir QS, reduciendo así la patogenicidad de P. aeruginosa. Esto nos llevó a investigar si
la inhibición de QS es una característica común de los antibióticos. Se presentan los resultados de una investigación de 12 antibióticos por sus actividades QS-inhibitorias mediante un selector descrito previamente inhibidor QS 1 cepa. Tres de los antibióticos probados, AZM, ceftazidima (CFT) y ciprofloxacina (CPR), eran muy activos en el ensayo y se examinaron más por sus efectos
sobre la producción de factor de virulencia regulados por QS en P. aeruginosa.Los efectos de los tres antibióticos administrados a concentraciones subinhibitorias se investigaron mediante el uso de micromatrices de ADN. Resultados consistentes de las pruebas de factor de virulencia, transcriptasa reversa-PCR, y los microarrays de ADN apoyan la conclusión de que AZM, CFT, y
RCP disminuir la expresión de una serie de factores de virulencia regulados por QS. Los datos sugieren que el mecanismo subyacente puede ser mediada por cambios en la permeabilidad de la membrana, lo que influye en el flujo de N -3-oxo-dodecanoyl- lactona L -homoserina.
Descarg
ado d
e a
ac.a
sm
.
El patógeno oportunista Pseudomonas aeruginosa causa infecciones graves, sobre todo en inmunodeprimidos indi-
UALs y pacientes con fibrosis quística (FQ).El progresivo deterioro de los pulmones causada por P. crónica infecciones
aeruginosa y, por lo tanto, la inflamación persistente son actualmente las principales causas de morbilidad y mortalidad
en los pacientes con FQ (55).Tratamiento antipseudomónica Intensivos (mantenimiento del ther-APY) ha mejorado en
gran medida las perspectivas de los pacientes con FQ (26, 29, 72). Un efecto secundario grave de la terapia antibiótica es
el desarrollo de resistencia a los antibióticos utilizados (3, 15, 28, 54). P. aeruginosa biofilms forma durante el proceso
de infección, que se suma a las dificultades de la erradicación de las infecciones por la intervención anti-bióticos, ya que
las células bacterianas que viven como biopelículas son mucho más tolerantes a los antibióticos que sus contrapartes ses-
planctónicos (4, 14, 17).Cuando la infección entra en un estado crónico, los domina, el fenotipo de alginato
superproductoras mucoides (22). Los macrólidos tales como eritromicina, claritromicina, eritromicina y la azitromicina
derivado (AZM) han sido demostrado que inhibe la actividad enzimática de guanosina-diphosphoman nariz
deshidrogenasa en la ruta biosintética de alginato de mucoide P. aeruginosa cepas en concentraciones muy por debajo de
la MIC (44, 49).Alginato induce una reacción antígeno-anticuerpo continua localmente en las vías respiratorias pequeñas.
Por lo tanto, un menor nivel de
* Autor para correspondencia. Dirección postal: Biomédica Microbiología, BioSys, Bldg 227, de la Universidad Técnica de
Cepas bacterianas aplicadas en este estudio. El secuenciado P. aeruginosa PAO1 de tipo salvaje cepa se obtuvo del Genetic Stock Center
Pseudomonas (cepa PAO0001; www.pseudomonas.med.ecu.edu).El mutante lasI-rhlI se construyó mediante el uso de un sistema de eliminación se informó
anteriormente (7).El QSI selector QS deformación selector inhibidor 1 (QSIS1) fue descrito previamente (73). Pantalla bacteriana para la inhibición de QS. QSIS1 Strain se ha descrito previamente en detalle (73).El elemento de QS se deriva del sistema QS
regulado LuxR de Vibrio fischeri y se clonó en Escherichia coli, donde se responde a una amplia gama de AHL y los inhibidores de QS (2, 73, 74).QSIS1
alberga plásmido pUC18Not- luxR- P luxI -RBSII- pHLA T -T 0 1 Ap r mantenido en CSH37 (59), una E. coli cepa que constitutivamente expresa galactosidasa.El concepto general de la
selector
sistema implica la presencia de un regulador de QS (luxR o un homólogo) gen y un promotor QS-controlado fusionado a un gen que codifica un producto
génico tóxico.En la presencia de moléculas de señal, el gen bajo control QS se expresa, causando la muerte celular. Sin embargo, en presencia de un
compuesto QSI, la producción del producto del gen tóxico está apagado y las bacterias son rescatados y capaz de crecer normalmente. El producto del gen
tóxico del sistema selector QSIS1 es citolítica fosfolipasa A, que se origina a partir de Serratia liquefaciens MG1 (33, 34).Ser causa moléculas señal se
añaden al ensayo de una fuente externa, QSIs dirigidas a la sintetasa AHL no están identificados, mientras que los compuestos que en-Hance la degradación
de AHL, impide la absorción de AHL, o bloquear la interacción de AHL con la proteína luxR son encontrado.
Se añadió BT me-Dium (medio B [16] más 2,5 mg de tiamina por litro) que contiene 2% de agar (peso / vol) se fundió, 10% A10 tampón (16):
Brevemente, la preparación de pantallas de QSIS1 se realizó como sigue , y la mezcla se enfrió a 45 ° C. Para el agar ABT resultante entonces se añadieron
N -3-oxo-hexanoil- lactona L -homoserina (Sigma-Aldrich, Alemania), ampicilina (VepiDan, Dinamarca), 5-bromo-4-cloro-3-indoxyl- - D -
galactopiranósido (X-Gal; Apolo Scientific, Reino Unido), y 1-metil-2-pyrrelidon (Merck, Alemania) a concentraciones finales de 100 nM, 100 g / ml, 40 g /
ml, y 0,2% (vol / vol ), respectivamente; y el medio fue suplementado con 0,5% (peso / vol) de glucosa y 0,5% (peso / vol) casaminoácidos.Un cultivo de
una noche de QSIS1 (cultivados en medio ABT-sup complementado con 0,5% [peso / vol] de glucosa, 0,5% [peso / vol] Casamino Acids, y 100 g / ml de
ampicilina) se añadió a una concentración final de 0,4%.
Placas para el ensayo de selección fueron posteriormente hicieron vertiendo la mezcla en una caja para dar un espesor de 5 mm de agar. Wells con
diámetros de 5 mm se hicieron en las placas de agar. Tras la solidificación, 50 l de un 1 a 10 g / ml solución del antibiótico a ser probado para la actividad
QSI se añadió a los pocillos. La placa se incubó a 30 ° C durante 16 h. La aparición de una zona circular de crecimiento (que apareció azul debido a la
presencia de hidrolizado X-Gal) indicó la presencia de compuestos con actividad QSI en la muestra ensayada.
Preparación de la muestra para P. análisis aeruginosa GeneChip.Se inoculó ABT medio sup-complementado con 0,5% de casaminoácidos con
crecimiento exponencial Células de P. aeruginosa PAO1 a una densidad óptica a 600 nm (OD 600) de 0,05, y el las células se cultivaron a 37 ° C y 200 rpm en cinco matraces de
500 ml que contenían 100 ml cada uno. Cuando el OD 600 fue de 0,3, AZM (8 y 2 g / ml; Zithromax, Pfizer), CPR (0,04 g / ml; Fluka), o CFT (0,25 g / ml; Fortum, GlaxoSmithKline) se
añadió.Estas concentraciones de antibióticos no afectaron el crecimiento de P. aeruginosa. Se recuperaron muestras cuando el OD 600 alcanzó 2,0,
inmediatamente transferido a 2 volúmenes de RNAlater (Ambion), y se almacenaron a 80 ° C. Se aisló el ARN con un kit de purificación RNeasy Mini
(Qiagen), de acuerdo con el protocolo proporcionado por el fabricante, incluyendo el tratamiento de ADNasa en columna.La síntesis de ADNc se realizó con
12 g de RNA, 300 ng / l cebadores aleatorios (Invitrogen), 1500 U superíndice III transcriptasa inversa (Invitrogen), y 30 U SUPERase En inhibidor de
RNasa (Ambion), de acuerdo con el análisis Affymetrix expres-sion protocolo. El ADNc sintetizado se purificó con un kit de purificación QIAquick PCR
(Qiagen), y de 3 a 4 g de cDNA fue fragmentado con 0,2 U FPLC puro DNasa I (Amersham Bioscience) por g de ADNc. El cDNA fragmentado se marcó en
el extremo con biotina-ddUTP (Enzo kit de marcaje terminal de Bioarray) y se hibridó durante 18 h a 55 ° C a una P. aeruginosa microarrays genoma
GeneChip (Affymetrix).Los chips se lavaron y se tiñeron según el protocolo de Affymetrix. La intensidad de la señal de microarrays de hibridación se redujo
a un promedio general de la señal de 500; y el microarray se evaluó la presencia, la presencia marginal, o la ausencia de la sonda fija (en representación de
diferentes genes o marcos de lectura abiertos) por el uso de Affymetrix GeneChip sistema (versión 1.4) de software que operan. Los valores de la expresión
única de la sonda fija esti acoplado-como "presente" se incluyeron en los análisis posteriores. Los experimentos de microarrays se llevaron a cabo dos veces
por los cultivos tratados con antibióticos (dos matrices de 2 g / ml AZM, dos conjuntos de 8 g / ml AZM, dos matrices de 0,04 g / ml CPR, y dos matrices de
0,25 g / ml CFT) , mientras que los controles no tratados (referencias) se ensayaron en cuatro repeticiones. Los datos aquí p resentados están basados en el
promedio de cada serie.
La cuantificación de mRNA por PCR en tiempo real. (I) Primer diseño. Los cebadores usados para la amplificación del ARNm (Tabla 1) fueron
diseñados por el uso de software integrado de ADN Tecnologías Primer Quest (http://www.idtdna.com). Brevemente, los tamaños del amplicón diseñados
variaron de 80 a 200 pb, y las temperaturas de fusión de cebadores fueron diseñados para 60 ° C, con una diferencia de temperatura de fusión de menos de 2
° C para cada par de cebadores.Las secuencias de los cebadores también se sometieron a un análisis BLAST contra la P. aeruginosa PAO1 secuencia del
genoma para eliminar la posibilidad de unión no específica.
(Ii) PCR en tiempo real. Cada tiempo real mezcla de PCR (volumen final, 20 l) con-contenida 9 l de ADNc, 10 l de verde SYBR 2 cuantitativa mezcla
maestra de PCR (Fermentas), y 0,5 M de cada uno hacia adelante y cebador inverso.PCR en tiempo real se realizó con un detector en tiempo real Chromo4
(Bio-Rad [anteriormente MJ Research
Descarg
ad
o d
e a
ac.a
sm
.org
por e
l 18 d
e o
ctu
bre
200
9
3650 SKINDERSOE ET AL.
TABLA 1. Los cebadores utilizados para la PCR en tiempo
búsqueda]) utilizando los siguientes parámetros de ciclación: una desnaturalización inicial a 95 ° C durante 10 min antes de 40 ciclos de 95 ° C durante 15 s,
60 ° C durante 30 s, y 72 ° C durante 30 s. Los datos se analizaron por el método de cuantificación relativa eficiencia corregida (71). La expresión de los
genes diana se normalizó a la expresión de referirse-cia gen rpoD, como el análisis de microarrays de ADN mostró que la expresión de este gen era estable
en todas las condiciones.Además, Savli et al. (77) han encontrado que entre los genes de limpieza, este gen tiene la expre-sión más estable. Para controlar las
variaciones entre carreras, la limpieza de genes y los diversos genes diana para cada tratamiento individual se amplificaron al mismo tiempo en una placa de
96 pocillos. Los cambios en los niveles de expresión de los genes diana en las muestras tratadas se calcularon en relación con el nivel medio de expresión del
gen respectivo en la muestra no tratada. La eficiencia de la transcripción inversa-PCR (RT-PCR) para los pares de genes (bajo tratados frente a condiciones
no tratados) varió de menos de 5%.
Por consiguiente, las eficiencias promedio de cada gen en este estudio fueron muy similares para las condiciones en comparación, lo que permite un
análisis preciso. Los sobrenadantes de pruebas de factor de virulencia. P. aeruginosa Culturas PAO1 eran
crecido ya sea para 16 a 20 h (para el ensayo de hemólisis) o a un OD 600 de 2,0 (para la proteasa, quitinasa, y los ensayos de elastasa), como se describe
anteriormente, con 8 o 2 g / ml AZM, 0,04 g / ml CPR, 0,25 g / ml CFT, o ningún antibiótico (control). Las P. aeruginosa PAO1 QS mutante lasI - rhlI también se cultiva junto con el
tratado y sin tratar P. culturas aeruginosa PAO1.Las células se recogieron por-ción centrifuga, y los sobrenadantes se filtraron esterilizados (filtro de jeringa
de TPP; tamaño de poro, 0,22 m). Los sobrenadantes se utilizaron inmediatamente o se almacenaron a 20 ° C.
Ensayo de hemólisis. Los sobrenadantes de filtro esterilizado se trataron en autoclave para destruir actividad enzimática y se mezcla con la sangre venosa
de un individuo sano en una relación volumétrica de 30: 1 (sobrenadante a la sangre), observado para la hemólisis después de 20 min, y se dejó a temperatura
ambiente durante 4 h para permitir la sedimentación de eritrocitos intactos.Actividad hemolítica se observó como un claro y una coloración rojo-ing
nonprecipitat de la solución de sangre, mientras que la falta de actividad hemolítica se caracteriza por la precipitación de los eritrocitos intactos. El
experimento se llevó a cabo cuatro veces con sobrenadantes de cuatro crecimiento individual expe-mentos.
Ensayo de la proteasa. Los sobrenadantes de filtro esterilizado (300 l cada uno) se añadieron a los pocillos de placas de agar (medio ABT ABT
suplementado con 2% de agar) 5% de leche desnatada con-que contiene, y las placas se incubaron durante la noche a 37 ° C. Las zonas de aclaramiento
(radios) se midieron en las fotografías de las placas mediante el uso de una regla.El experimento se realizó tres veces como cuatro repeticiones con los
sobrenadantes de tres experimentos de crecimiento individuales. Los valores de las cuatro réplicas se promediaron y se utilizan como un valor para
representar cada uno de los tres experimentos.
Ensayo de elastasa. Los sobrenadantes de filtro esterilizado se mezclaron 2: 1 con tampón de phos-fosfato (0,1 M, pH 6,3), y se añadieron 2 mg / ml
elastina rojo Congo (Sigma). La mezcla se incubó a 37 ° C con agitación (200 rpm) durante 1 semana. Después de la centrifugación, la absorbancia del
sobrenadante a 495 nm se midió con un espectrofotómetro a cero en una muestra de rojo Congo elastina se incubaron con medio solo. El procedimiento se
modificó del descrito previamente (63). El experimento se realizó tres veces por triplicado con los sobrenadantes de tres experimentos de crecimiento
individuales. Los valores de los experimentos por triplicado se promediaron y se utilizan como un valor para representar cada uno de los tres experimentos.
Ensayo de quitinasa. La quitinasa se midió mediante un ensayo de azul de quitina modificado (30, 36).Los sobrenadantes de filtro esterilizado se
mezclaron 2: 1 con tampón de citrato de sodio (0,1 M, pH 4,8), y se añadieron 0,5 mg / azul quitina ml (Sigma). Las mezclas azules-quitina sobrenadantes se
incubaron a 37 ° C con agitación (200 rpm) durante 1 semana. Las muestras se centrifugaron a 15.000 g durante 10 min, y la absorbancia a 570 nm se
determinó.Las muestras se compararon con espacios en blanco incubadas con medio solamente. El experimento se realizó tres veces por triplicado con los
sobrenadantes de tres experimentos de crecimiento individuales. Los valores de la Un NTIMICROB. Un HEMOTHER SEÑORES C.
experimentos por triplicado se promediaron y se utilizan como un valor para representar cada uno de los tres experimentos.
Cuantificación de ramnolípido. Una curva estándar para B ramnolípido (concen tración frente a la corriente total de ionización) se calculó a partir de
datos líquidos chromatogra-PHY-electrospray-espectrometría de ionización de masas (MS). Para reducir al mínimo las posibles diferencias en los niveles de
ionización de ramnolípido entre las muestras, los estándares ramnolípido utilizados para calcular la curva de concentración se analizaron inmediatamente
antes, así como después se analizaron las muestras. La corriente total de ionización se determinó sobre la ion [M NH 4] a lo largo de los 7 668,4 s sobre el
cual ramnolípido B se eluyó.Cromatografía líquida de alta presión (LC) -MS análisis se realizó con una serie 1100 cromatógrafo líquido de alta presión
Agilent conectado a un tiempo de vuelo de masa spec-espectrómetro Micromass LCT. La concentración de ramnolípido en el cultivo sin tratar se ajusta igual
a un valor de índice de 100.
Soporte de AZM, CFT, y RCP en contra del LBD de la proteína LasR. La De rayos X estructura cristalográfica del dominio de unión al ligando
(LBD) de la proteína LasR (Protein Data Bank adhesión no.2UV0) se utilizó para el atraque de AZM, CFT, y RCP para el sitio receptor LasR mediante el
programa Molegro Docker virtual (86) y el modelo de acoplamiento plantilla con la configuración predeterminada. OdDHL se estableció como el ligando
plantilla en el LBD de la proteína LasR. Los ligandos se clasificaron mediante el uso de la puntuación rerank func-ción Molegro Docker virtual.
Análisis de datos y estadísticas. Se utilizó el análisis unidireccional de varianza seguido por la prueba de Dun-Nett para evaluar los efectos de AZM,
CFT, y el tratamiento CPR y el efecto de la mutación lasI-rhlI sobre la expresión de las elastasas, quitinasa, y proteasa en comparación con su expresión en
sin tratar cepa de tipo salvaje P. aeruginosa PAO1.Las pruebas se realizaron con el programa de software Graph-Pad InStat (versión 3) (San Diego, CA).
Las diferencias se consideraron significativas si el valor de p fue de 0,05 o menos.
Microarray número de acceso de datos. Los datos de microarrays de ADN (CHP, CEL, y archivos CAD) se han presentado a la base de datos de la
Expresión Génica Omnibus (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/) y puede ser encontrado con el número serie de experimentos GSE8953.
RESULTADOS
La detección de actividad QSI. AZM se ha demostrado que inhibe la expresión de una subfracción de genes
controlados QS-(60, 84).Junto con AZM, hemos investigado otros 11 antibióticos (incluyendo un compuesto antifúngico,
griseofulvina) por sus habilidades para interferir con QS bacterianas utilizando una sencilla pantalla de difusión en placa
basado en QSIS1 (73). Mediante el empleo de nuestras condiciones stan-dard (73), se encontró que el cloranfenicol,
genta-micin, griseofulvina, kanamicina, piperacilina, spectinamycin, tet-racycline, tobramicina y la estreptomicina mostró
bajos niveles de o ninguna actividad QSI, mientras AZM, de conformidad con investigaciones previas, era muy activo. La
CPR fluoroquinolona y la cefalosporina CFT también mostraron actividades QSI fuertes en el ensayo con QSIS1 (Fig. 1).
RCP y CFT se emplean en la clínica como tratamientos antipseudomonas, mientras AZM exhibe un bajo nivel de, en su
caso, bactericida o efecto bacteriostático contra P. aeruginosa.RCP apunta ADN girasa (topoisomerasa II) y por lo
tanto inhibe la síntesis de ADN bacteriano.CFT es una beta-lactama y funciones mediante la interrupción de la síntesis de
la capa de peptidoglicano de la pared celular bacteriana. El modo de acción de AZM es para unirse a la subunidad 50S del
ribosoma bacteriano, inhibiendo así la traducción de ARNm. Por tanto, estos tres antibióticos exhiben diversos
mecanismos de acción antimicrobiana, y que son estructuralmente muy diferente. Elegimos seguir investigando los
efectos en P. aeruginosa QS-gen regulado ex-presión y la producción de factor de virulencia con AZM, CPR, y CFT
como representantes de estos muy diversos grupos de antibióticos.Las curvas de crecimiento para P. aeruginosa PAO1
cultivar en la presencia o ausencia de AZM, CPR, y CFT a diferentes concentraciones (incluyendo concentraciones con
efectos ligeramente inhibidoras del crecimiento) y para el mutante lasI rhlI se presentan
Descarg
ad
o d
e a
ac.a
sm
.org
por e
l 18 d
e o
ctu
bre
200
9
V OL. 52, 2008 EFECTOS ANTIBIÓTICOS EN DETECCIÓN DE QUORUM EN P. AERUGINOSA 3651
FIG. 4. Contenidos ramnolípido, en unidades relativas (RU), en Superna-tantes de P. culturas aeruginosa crecen bien sin
antibióticos (barra de color negro) o en presencia de 2 g / ml AZM (barra con líneas horizontales), 8 g / ml AZM (barra con líneas verticales), 0,25 g / ml CFT (barra gris oscuro), o 0,04 g / ml CPR (barra gris claro).El lasI - mutante rhlI de PAO1 también fue incluido en el experimento, pero no produjo una concentración medible de ramnolípido (última ranura [ninguna columna-visi ble]).La concentración de ramnolípido en el cultivo sin tratar se ajusta igual a un valor de índice de 100. El gráfico está basado en el promedio de
los índices de tres experimentos independientes. *, P 0,05; **, P 0.01 (post test de Dunnett).
lasI - rhlI mutante.RCP y CFT también redujeron la elastasa actividad (Fig. 6). Quitinasa. Las actividades de quitinasa en los sobrenadantes de P. culturas aeruginosa PAO1 (no tratados o
cultivados con AZM, CPR, o CFT) y QS mutantes lasI - culturas rhlI se quan-tificado mediante la medición de la
degradación de la quitina azul.AZM y CPR reducción de la actividad quitinolítica de PAO1 casi hasta el nivel de que para
el lasI - mutante rhlI.CFT no disminuir la actividad quitinasa tanto como lo hicieron AZM y RCP, aunque todavía tenía un
efecto (Fig. 7).
El análisis de microarrays de ADN de la expresión génica en presencia de AZM, CFT, y CPR. Con el fin de
obtener el conocimiento de la mecanismo por el cual la producción del factor de virulencia fue alterada por la presencia de
los tres antibióticos, se realizó análisis de microarrays de ADN con P. culturas aeruginosa tratados con AZM, CPR, y
CFT en concentraciones que no afectan
FIG. 6. Actividades elastolíticas de sobrenadantes de cultivos PAO1 cultivaron hasta una DO 600 de 2,0, ya sea sin antibióticos (bar
negro) o en la presencia de: 2 g / ml AZM (barra con líneas horizontales), 8 g / ml AZM (barra con líneas verticales) , 0,25 g / ml CFT (barra gris oscuro), o 0,04 g / ml CPR (barra gris claro).La actividad elastolítico del lasI - mutante rhlI de PAO1 también se muestra
(barra blanca).El gráfico está basado en los resultados medios de tres experimentos independientes. *, P 0,05; **, P 0.01 (post test de
Dunnett).
crecimiento. El medio con crecimiento exponencial P. culturas aeruginosa (OD 600, 0,1) se suplementó con cualquiera
AZM (2 y 8 g / ml), CFT (0,25 g / ml), o CPR (0,04 g / ml) o el medio se dejó sin tratar como un control.Mediante la
aplicación de las condiciones de crecimiento se describe en Materiales y Métodos, una DO 600 de 2,0 corresponde a la
transición de la fase exponencial a la fase estacionaria, y en este punto una fracción sustancial de genes regulados-QS
están regulados al máximo (inducido o re- presionado) (80). Por lo tanto, una DO 600 de 2,0 fue elegido como el punto de muestra para el análisis transcriptómica.ARN total fue extraído de las muestras y se sometió a síntesis de ADNc. Los valores absolutos de expresión de cultivos crecidos en
presencia de antibióticos se compararon con los de los cultivos tratados con la ONU, y se presentan los cambios en la
expresión. Como se ha descrito previamente (38, 89), se tuvieron en cuenta cambios en la expresión de menos de cinco
veces. Sonda fija Sólo que estaban presentes, como validado con Affymetrix GeneChip operativo sys-tem (versión 1.4) de
software, se incluyeron en los análisis. Ac-acuerdo con estos criterios, las concentraciones no inhibidoras del crecimiento
de AZM alterada la expresión de 477 (8 g / ml) y 323 (2 g / ml) genes, con la mayoría de genes (419 y 277,
respectivamente) se downregulated. Concentraciones no inhibidoras del crecimiento de
Descarg
ad
o d
e a
ac.a
sm
.org
por e
l 18 d
e o
ctu
bre
200
9
FIG. 5. Actividades de proteasa de los sobrenadantes de P. aeruginosa cul-turas cultivan ya sea sin antibióticos (barras negro) o en
presencia de 2 g / ml AZM (barra con líneas horizontales), 8 g / ml AZM (barra con líneas verticales), 0,25 g / ml CFT (barra gris oscuro ), o 0,04 g / ml CPR (barra gris claro).El lasI - mutante rhlI de PAO1 también se incluyó en el experimento, pero no produjo una concentración medible de la proteasa (última ranura [columna no visible]).El gráfico está basado en los resultados medios de tres
experimentos independientes. *, P 0,05; **, P 0.01 (prueba de Dunnett).
FIG. 7. Actividades quitinasa de sobrenadantes de cultivos PAO1 cultivaron hasta una DO 600 de 2,0, ya sea sin antibióticos (bar
negro) o en la presencia de: 2 g / ml AZM (barra con líneas horizontales), 8 g / ml AZM (barra con líneas verticales) , 0,25 g / ml CFT (barra gris oscuro), o 0,04 g / ml CPR (barra gris claro).La actividad quitinasa del lasI - mutante rhlI de PAO1 también se muestra
Como se describe en este documento y por otros (53, 94), sub-MIC de antibióticos pueden tener diversos efectos sobre
las bacterias que son totalmente diferentes a los efectos de dosis altas; por ejemplo, pueden mejorar la formación de
biopelículas, alterar los patrones de motilidad, aumentar la citotoxicidad, y provocar cambios en la expresión de factores
de virulencia (39, 53, 60). Se ha sugerido que los antibióticos en la naturaleza pueden funcionar como señales
intermicrobial no como balas destinadas a matar a los enemigos para defender nichos o los alimentos (53). Esta hipótesis
ofrece una explicación evolutiva de por qué algunos antibióticos pueden ser capaces de inter-sufri- con la expresión de
genes controlados por el QS. De acuerdo con los resultados presentados en el presente informe, se ha demostrado
recientemente que OdDHL (y otros 3-oxo-AHL), así como su producto de degradación del ácido tetrámico exhibe
actividades contra bacterias gram-positivas (48), lo que sugiere que la señal topo-cules, como algunos antibióticos, poseen
actividades duales. Además, más, nuestros datos sugieren que los antibióticos que funcionan para abajo-regulan QS en P.
aeruginosa puede administrarse en sub-MICs (donde hay una presión de selección reducido para la unificación de
desarrollar resistencia) para bloquear QS y con ello atenuar la actividad del patógeno.Tales propiedades interesantes
destacan el enorme potencial inexplorado de la utilización de compuestos derivados de los andamios naturales en la
búsqueda de nuevos fármacos con una variedad de objetivos (es decir, antimicrobianos multifuncionales). Parece que no
hemos explorado y explotado el po-tencial de las drogas que hoy conocemos.
Las actividades duales de algunos antibióticos (por ejemplo, AZM, CFT, y RCP, investigado aquí) puede ayudar a
explicar por qué CFT ha demostrado ser superior a la comparada, regímenes de antibi ótica antipseudomonas para los
pacientes con FQ en el centro CF danés (69). Se debe tener cuidado, sin embargo. El cambio posterior al CFT como el
antibiótico antipseudomónica predominante en el centro danés CF llevó a la propagación de la epidemia de una cepa
nonmucoid-multiresis tante (68). Un estudio anterior (35) mostró que la sub-CIM de antibióticos pueden todavía modular
la transcripción pat-charranes en los miembros de la flora humana beneficiosos, causando una
variedad de efectos no deseados. Asimismo, se ha demostrado que el uso a largo plazo de AZM por pacientes con CF y P.
crónica
infecciones aeruginosa pueden provocar resistencia a los macrólidos en Staphylococcus aureus en estos pacientes
(87).Esto pone de relieve la exigencia de un mayor desarrollo de QSIs sin bactericida clásica o actividad bacteriostática.
AGRADECIMIENTOS
Este trabajo fue apoyado por becas de la ev alemán Mukoviszidose, Deutsche Forschungsgemeinshaft, y el Consejo Danés de
Investigación (STF concesión no. 2052-03-0013) para MG
Referencias
1. Ader, F., R. Le Berre, K. Faure, P. Gosset, O. épaulard, B. Toussaint, B. Polack, E. Nowak, NB Viget, E. Kipnis, y BP Guery. 2005.
Alveolar respuesta a Pseudomonas aeruginosa: papel del sistema de secreción tipo III.Infect. Immun. 73: 4.263-4.271. 2. Andersen, JB, A. Heydorn, M. Hentzer, L. Eberl, O. Geisenberger, BB Christensen, S. Molin, y M. Givskov. 2001. gfp -basado N monitores acil-homoserina-lactona de la comunicación para la detección bacteriana.Appl. Environ. Microbiol. 67: 575-585. 3. Andrade, SS, RN Jones, CA Gales, y HS Sader. 2003. Creciente prevalencia de la resistencia a los antimicrobianos entre Pseudomonas
aeruginosa iso-lates en centros médicos de América Latina: informe de 5 años del Programa de Vigilancia Antimicrobiana SENTRY (1997-2001).J.
Antimicrob. Che-madre. 52: 140-141.
4. Anwar, H., y JW Costerton. 1990. Actividad mejorada de combinación de tobramicina y piperacilina para la erradicación de las células del
biofilm aeruginosa sésiles de Pseudo-monas.Antimicrob. Agentes Chemother. 34: 1666-1671.
5. Bajolet-Laudinat, O., S. Girod-de Bentzmann, JM Tournier, C. Madoulet, MC Plotkowski, C. Chippaux, y E. Puchelle. 1994.
Citotoxicidad de Pseudomonas aeruginosa lectina interna PA-I a las células epiteliales respiratorias en cultivo primario.Infect. Immun. 62: 4.481-4.487. 6. Baumann, U., M. King, EM App, S. Tai, A. Konig, JJ Fischer, T. Zimmermann, W. Sextro, y H. von der Hardt. 2004. Terapia azithro-
micina a largo plazo en pacientes con fibrosis quística: un estudio sobre los niveles de fármaco y propiedades de esputo. Can. Respir. J. 11: 151-155.
7. Beatson, SA, CB Whitchurch, ABT Semmler, y JS Mattick. 2002. La detección de quórum no se requiere para crispar la motilidad en
Pseudomonas aeruginosa.J. Bacteriol. 184: 3.598 a 3.604.
8. Berger, M. y M. Konstan. 1999. Inmunopatogénesis de la fibrosis quística enfermedad pulmonar, p. 115-143.En JR Yankaskas y MR Knowles (ed.), La fibrosis quística en adultos.Lippincott-Raven, Philadelphia, PA. 9. Berka, RM, y ML Vasil. 1982. Fosfolipasa C (hemolisina termolábil) de Pseudomonas aeruginosa: purificación y caracterización preliminar.J. Bacteriol. 152: 239-245. 10. Blèves, S., C. Soscia, P. Nogueira-Orlandi, A. Lazdunski, y A. Filloux.
2005. La detección de quórum controla negativamente tipo de secreción III regulon expres-sion en Pseudomonas aeruginosa PAO1.J. Bacteriol. 187: 3.898 hasta 3.902. 11. Bottomley, MJ, E. Muraglia, R. Bazzo, y A. Carfi. 2007. Molecular penetraciones en la detección de quórum en el patógeno humano
Pseudomonas aerugi-nosa de la estructura del regulador de la virulencia LasR unido a su auto-inductor.J. Biol. Chem. 282: 13.592 hasta 13.600.
12. Brazas, MD, y RE Hancock. 2005. Ciprofloxacino inducción de un determinante sus-sus- en Pseudomonas aeruginosa.Antimicrob.
Agentes Che-madre. 49: 3222 hasta 3227. 13. Bubunenko, M., T. Baker, y DL Corte. 2007. La esencialidad de ribosomal y proteínas antitermination transcripción analizados por
sistemática de genes re-colocación en Escherichia coli.J. Bacteriol. 189: 2844-2853.
Descarg
ad
o d
e a
ac.a
sm
.org
por e
l 18 d
e o
ctu
bre
200
9
3662 SKINDERSOE ET AL.
14. Ceri, H., ME Olson, C. Stremick, RR Lee, D. Morck, y A. Buret.
1999. El dispositivo biofilm Calgary: nueva tecnología para la determinación rápida de susceptibilidad antibiótica de biopelículas bacterianas. J. Clin.
Microbiol. 37: 1771- 1776.
15. Ciofu, O., V. Fussing, N. Bagge, C. Koch, y N. Hoiby. 2001. Carácter-ización de emparejado mucoide / no mucoide de Pseudomonas
aeruginosa aisladas de pacientes con fibrosis quística danesas: resistencia a los antibióticos, la actividad de la beta-lactamasa y RiboPrinting. J.
Antimicrob. Chemother. 48: 391-396. 16. Clark, DJ, y O. Maaloe. 1967. Replicación del ADN y el ciclo de división en Escherichia coli.J. Mol. Biol. 23: 99-112. 17. Costerton, JW, PS Stewart, y EP Greenberg. 1999. Biopelículas bacterianas: una causa común de infecciones persistentes.Science 284: 1318-
1322. 18. Daikos, GL, GG Jackson, VT Lolans, y DM Livermore. 1990. Resistencia a antibióticos aminoglucósidos adaptativa desde primera
exposición baja regulación. J. Infect. Dis. 162: 414-420. 19. Davey, ME, NC Caiazza y GA O'Toole. 2003. Ramnolípido producción surfac-tante afecta a la arquitectura de biopelículas en Pseudomonas aeruginosa PAO1.J. Bacteriol. 185: 1027-1036.
20. Davies, DG, MR Parsek, JP Pearson, BH Iglewski, JW Costerton y EP Greenberg. 1998. La participación de las señales de célula a célula
en el desarrollo de una biopelícula bacteriana.Ciencia 280: 295-298. 21. de Nys, R., M. Givskov, N. Kumar, S. Kjelleberg, y PD Steinberg. 2006. Furanonas. Prog. Mol. Subcelda. Biol. 42: 55-86. 22. DeVries, CA, y DE Ohman. 1994. Mucoide-a-nonmucoid conversión en alginato productoras de Pseudomonas aeruginosa a menudo
resulta de mutaciones espontáneas en ALGT, que codifica un factor sigma alternativo putativo, y muestra evidencia para la autorregulación.J. Bacteriol. 176: 6677 a 6.687.
23. Diggle, SP, RE Stacey, C. Dodd, M. Camara, P. Williams, y K. Winzer.
2006. La lectina galactophilic, Leca, contribuye al desarrollo del biofilm en Pseudomonas aeruginosa. Environ. Microbiol. 8: 1095-1104. 24. DIMANGO, E., HJ Zar, R. Bryan, y A. Prince. 1995. Pseudomonas Diversos aeruginosa productos génicos estimulan a las células epiteliales
respiratorias para producir interleucina-8.J. Clin. Investig. 96: 2204-2210. 25. Dong, YH, XF Zhang, HM Soo, EP Greenberg, y LH Zhang. 2005. El regulador de respuesta de dos componentes ppRb modula la
producción de la señal de detección de quórum y la expresión génica global en Pseudomonas aeruginosa. Mol. Microbiol. 56: 1287-1301.
26. Elborn, JS, DJ Shale, y JR Britton. 1991. La fibrosis quística: actual supervivencia y estimaciones de población para el año 2000.Tórax 46:
881-885. 27. Equi, A., IM Balfour-Lynn, A. Bush, y M. Rosenthal. 2002. A largo plazo azitromicina en niños con fibrosis quística: un ensayo aleatorizado,
cruzado, controlado con placebo acondicionado.Lancet 360: 978-984. 28. Flamm, RK, MK Tejedor, C. Thornsberry, ME Jones, JA Karlowsky, y DF Sahm. 2004. Los factores asociados con tasas relativas de
antibiótico resistencia en las cepas aisladas de Pseudomonas aeruginosa en los laboratorios clínicos en los Estados Unidos desde 1999 hasta 2002.Antimicrob. Agentes Chemother. 48: 2431-2436.
29. Fogarty, A., R. Hubbard, y J. Britton. 2000. Comparación internacional de la edad media en el momento de la muerte de la fibrosis
quística.Pecho 117: 1656-1660. 30. Carpetas, J., J. Algra, MS Roelofs, LC van Loon, J. Tommassen, y W. amargo. 2001. Caracterización de Pseudomonas aeruginosa
quitinasa, una proteína secretada grad-dualmente.J. Bacteriol. 183: 7044-7052. 31. Gambello, MJ, y BH Iglewski. 1991. Clonación y caracterización de el gen de Pseudomonas aeruginosa LASR, un activador
transcripcional de la expresión de la elastasa.J. Bacteriol. 173: 3.000-3.009. 32. Givskov, M., R. De Nys, M. Manefield, L. Gram, R. Maximilien, L. Eberl, S. Molin, PD Steinberg, y S. Kjelleberg. 1996. Interferencia
con eucariota homoserina lactona-señalización mediada procariota.J. Bacteriol. 178: 6618- 6622. 33. Givskov, M. y S. Molin. 1993. La secreción de Serratia liquefaciens phos-pholipase de Escherichia coli. Mol. Microbiol. 8: 229-242. 34. Givskov, M., L. Olsen, y S. Molin. 1988. Clonación y expresión en Esch-erichia coli del gen de la fosfolipasa A1 extracelular de Serratia liquefaciens.J. Bacteriol. 170: 5.855-5.862. 35. Goh, EB, G. Yim, W. Tsui, J. McClure, MG Surette, y J. Davies. 2002. La modulación transcripcional de la expresión génica bacteriana por
concentraciones subinhibitorias de antibióticos. Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 99: 17.025 a 17.030. 36. Hackman, RH, y M. Goldberg. 1964. Nuevos sustratos para su uso con chiti-NAS. Anal. Biochem. 8: 397-401. 37. Hentzer, M. y M. Givskov. 2003.La inhibición farmacológica de quórum detección para el tratamiento de infecciones bacterianas crónicas.J.
Clin. Investig. 112: 1300-1307. 38. Hentzer, M., H. Wu, JB Andersen, K. Riedel, la tuberculosis Rasmussen, N. Bagge,
N. Kumar, MA Schembri, Z. Song, P. Kristoffersen, M. Manefield, JW Costerton, S. Molin, L. Eberl, P. Steinberg, S.
Kjelleberg, N. Hoiby, y M. Givskov. 2003.Atenuación de Pseudomonas aeruginosa virulencia por los inhibidores de detección quo-ron. EMBO
J. 22: 3803.
39. Hoffman, LR, DA D'Argenio, MJ MacCoss, Z. Zhang, RA Jones, y
S. I. Miller. 2005. Antibióticos aminoglucósidos inducen biofilm bacteriano para-mación. Naturaleza 436: 1171-1175. 40. Hoffmann, N., B. Lee, M. Hentzer, TB Rasmussen, Z. Song, HK Johan-sen, M. Givskov y N. Hoiby. 2007. Bloques de azitromicina
detección de quórum Un NTIMICROB. Un HEMOTHER SEÑORES C.
y la formación de polímero de alginato y aumenta la sensibilidad al suero y estacionaria de crecimiento en fase matanza de Pseudomonas aeruginosa y atenúa la infección crónica P. aeruginosa en pulmón Cftr / ratones.Antimicrob. Agentes Chemother. 51: 3677 a 3687.
41. Hoiby, N. 1995.Microbiología de la fibrosis quística, p. 75-98. En ME Hodson y DM Geddes (ed.), la fibrosis quística.Chapman & Hall
Medical, Londres, Reino Unido.
42. Hooi, DS, BW Bycroft, SR Chhabra, P. Williams, y DI Pritchard.
2004. Diferencial actividad inmunomoduladora de moléculas señal de detección de quórum Pseudomonas aeruginosa.Infect. Immun. 72: 6463 hasta 6470.
43. Howe, RA y RC Spencer. 1997. Los macrólidos para el tratamiento de Infecciones por Pseudomonas aeruginosa?J. Antimicrob. Chemother.
40: 153-155.
44. Ichimiya, T., K. Takeoka, K. Hiramatsu, K. Hirai, T. Yamasaki, y M. Nasu. 1996. La influencia de la azitromicina en la formación de
biopelículas de Pseudomonas aeruginosa in vitro.Quimioterapia 42: 186-191.
45. Jensen, PO, T. Bjarnsholt, R. Phipps, TB Rasmussen, H. Calum, L. Christoffersen, C. Moser, P. Williams, T. Pressler, M. Givskov y N.
Hoiby. 2007. Muerte necrótica rápida de los leucocitos polimorfonucleares es causada por la producción de detección de quórum controlado de
ramnolípido por aeruginosa Pseudo-monas.Microbiología 153: 1329-1338.
46. Johnson, MK, y D. Boese-Marrazzo. 1980. Producción y propiedades de hemolisina extracelular estable al calor a partir de Pseudomonas
aeruginosa.Infect. Immun. 29: 1028-1033.
47. Karlowsky, JA, MH Saunders, GA Harding, DJ Hoban y GG Zhanel. 1996. En la caracterización in vitro de la resistencia de adaptación
aminoglucósido en Pseudomonas aeruginosa.Antimicrob. Agentes Chemother. 40: 1387-1393.
48. Kaufmann, GF, R. Sartorio, SH Lee, CJ Rogers, MM Meijler, JA Moss, B. Clapham, AP Brogan, TJ Dickerson, y KD Janda. 2005.
Revisando la detección de quórum: descubrimiento de las funciones biológicas químico adicional y para el 3-oxo lactonas -acylhomoserine N.Proc. Natl.
Acad. Sci. EE.UU. 102: 309-314.
49. Kobayashi, H. 1995.Enfermedad Biofilm: su manifestación clínica y posibilidades therapeu-tic de los macrólidos. Am. J. Med. 99: 26S-30S.
50. Kobayashi, T., K. Tateda, T. Matsumoto, S. Miyazaki, A. Watanabe, T. Nukiwa, y K. Yamaguchi. 2002. Macrólidos tratados
Pseudomonas aerugi-nosa induce respuestas de acogida paradójicos en los pulmones de ratones y una alta tasa de mortalidad. J. Antimicrob. Chemother.
50: 59-66.
51. Latifi, A., MK Winson, M. Foglino, BW Bycroft, GS Stewart, A. Lazdunski, y P. Williams. 1995. Múltiples homólogos de LuxR y LuxI
controlar la expresión de los determinantes de virulencia y metabolitos secundarios a través de la detección de quórum en Pseudomonas aeruginosa
PAO1.Mol. Microbiol. 17: 333-343.
52. Lequette, Y., y EP Greenberg. 2005. El tiempo y la localización de la expresión génica síntesis rham nolipid en biopelículas de
Pseudomonas aeruginosa.J. Bacteriol. 187: 37-44. 53. Linares, JF, I. Gustafsson, F. Baquero, y JL Martínez. 2006. Antibi-antibióti- como intermicrobial agentes en lugar de armas de
señalización. Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 103: 19484-19489.
54. Livermore, DM 2002.Múltiples mecanismos de resistencia a los antimicrobianos en Pseudomonas aeruginosa: nuestra peor pesadilla?Clin.
Infect. Dis. 34: 634- 640.
55. Lyczak, JB, CL Cannon, y GB Pier. 2002. Las infecciones pulmonares asociadas con fibrosis quística.Clin. Microbiol. Rev. 15: 194-222.
56. Manefield, M., TB Rasmussen, M. Henzter, JB Andersen, P. Steinberg, S. Kjelleberg, y M. Givskov. 2002.Furanonas halogenados inhiben
quórum detección a través acelerada rotación LuxR.Microbiología 148: 1119-1127.
57. McClure, CD, y NL Schiller. 1992. Efectos de Pseudomonas aeruginosa ramnolípidos en macrófagos derivados de monocitos humanos.J.
Leukoc. Biol. 51: 97-102.
58. McClure, CD, y NL Schiller. 1996. La inhibición de macrófagos phago-cytosis por Pseudomonas aeruginosa ramnolıpidos in vitro e in vivo.
Curr. Microbiol. 33: 109-117.
59. Miller, JH 1972.Los experimentos en genética molecular. Cold Spring Harbor Laboratorio, Cold Spring Harbor, Nueva York.
60. Nalca, Y., L. Jansch, F. Bredenbruch, R. Geffers, J. Buer, y S. Haussler.
2006. Quórum de detección de actividades antagónicas de azitromicina en PAO1 aeruginosa Pseudomo-nas: un enfoque global.Antimicrob. Agentes Chemother. 50: 1680-1688.
61. Niga, T., H. Ito, Y. Oyamada, J. Yamagishi, M. Kadono, T. Nishino, N. Gotoh, y M. Inoue. 2005. La cooperación entre la alteración del
ADN girasa genes y la sobre expresión de MexB y mexx confiere un alto nivel de resistencia fluoro-quinolona en Pseudomonas aeruginosa cepas
aisladas de un paciente que recibió un trasplante de hígado seguido por tratamiento con fluorquinolonas.Microbiol. Immunol. 49: 443-446.
62. Ochsner, UA, y J. Reiser. 1995. Autoinductor regulación mediada de síntesis biotensioactivo ramnolípido en Pseudomonas aeruginosa.Proc.
Natl. Acad. Sci. EE.UU. 92: 6.424 a 6.428.
63. Ohman, DE, SJJ Cryz, y BH Iglewski. 1980. Aislamiento y carac-terización de Pseudomonas aeruginosa PAO mutante que produce la
elastasa alterado.J. Bacteriol. 142: 836-842. 64. Oldak, E., y EA Trafny. 2005. La secreción de proteasas por Pseudomonas
Descarg
ad
o d
e a
ac.a
sm
.org
por e
l 18 d
e o
ctu
bre
200
9
V OL. 52, 2008 EFECTOS ANTIBIÓTICOS EN DETECCIÓN DE QUORUM EN P. AERUGINOSA 3663
biofilms aeruginosa expuestos a la ciprofloxacina.Antimicrob. Agentes Che-madre. 49: 3281-3288.
65. Pamp, SJ, y T. Tolker-Nielsen. 2007. Múltiples funciones de biotensioactivos en el desarrollo del biofilm estructural por Pseudomonas
aeruginosa.J. Bacteriol. 189: 2531-2539. 66. Passador, L., y BH Iglewski. 1995. La detección de quórum y de genes de virulencia regulación en Pseudomonas aeruginosa, p. 65-78.En JA Roth (ed.), Los mecanismos de Viru-lencia de patógenos bacterianos, 2ª ed.Sociedad Americana de Microbiología, Washington, DC. 67. Pearson, JP, C. Van Delden, y BH Iglewski. 1999. Eflujo activo y difusión están involucrados en el transporte de Pseudomonas aeruginosa señales de célula a célula.J. Bacteriol. 181: 1203-1210. 68. Pedersen, SS, C. Koch, N. Hoiby, y K. Rosendal. 1986. Una epidemia propagación de Pseudomonas aeruginosa multirresistente en un centro de la fibrosis quística.J. Antimicrob. Chemother. 17: 505-516.
69. Permin, H., C. Koch N. Hoiby, HO Christensen, AF Moller, y S. Moller. 1983. Tratamiento Ceftazidime de Pseudomonas aeruginosa
crónica infección de las vías respiratorias en la fibrosis quística.J. Antimicrob. Chemother. 12 (Suppl A): 313-323.
69a.Persson, T., TH Hansen, TB Rasmussen, ME Skindersoe, M. Givskov, y J. Nielsen.2005. Diseño racional y síntesis de nuevo la detección de
quórum inhibidores derivados de homoserinlactonas acilados y productos naturales de ajo.Org. Biomol. Chem. 21: 253-262.
70. Pesci, EC, JB Milbank, JP Pearson, S. McKnight, AS Kende, EP Greenberg, y BH Iglewski. 1999. La señalización de quinolona en la
célula de células-to- sistema de comunicación de Pseudomonas aeruginosa.Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 96: 11.229 a 11.234.
71. Pfaffl, MW 2001.Un nuevo modelo matemático para la cuantificación relativa en en tiempo real RT-PCR. Nucleic Acids Res. 29: e45. 72. Ramsey, BW 1996.Gestión de la enfermedad pulmonar en pacientes con fibrosis quística.N. Engl. J. Med. 335: 179-188. 73. Rasmussen, la tuberculosis, T. Bjarnsholt, ME Skindersoe, M. Hentzer, P. Kristof-Fersen, M. Kote, J. Nielsen, L. Eberl, y M. Givskov.
2005.La detección de inhibidores de la detección de quórum (QSI) mediante el uso de un sistema genético novela, el selector QSI.J. Bacteriol. 187:
1799-1814.
74. Rasmussen, la tuberculosis, ME Skindersoe, T. Bjarnsholt, RK Phipps, KB Christensen, PO Jensen, JB Andersen, B. Koch, A Larsen,
M. Hentzer, L. Eberl, N. Hoiby, y M. Givskov. 2005.Identidad y efectos de inhibidores producidos por especies de Penicillium quorum-
sensing.Microbiología 151: 1325-1340.
75. Roy-Burman, A., RH Savel, S. Racine, BL Swanson, NS Revadigar, J. Fujimoto, T. Sawa, DW Frank, y JP Wiener-Kronish. 2001. Tipo
III la secreción de proteínas se asocia con la muerte en las infecciones respiratorias y sistémicas inferiores Pseudomonas aeruginosa.J. Infect. Dis. 183:
1767-1774.
76. Saiman, L., C. Marshall, N. Mayer-Hamblett, JL Burns, AL Quittner, DA Cibene, S. Coquillette, AY Fieberg, FJ Accurso, y PW
Campbell III. 2003.La azitromicina en pacientes con fibrosis quística infectados crónicamente con Pseudomonas aeruginosa: un ensayo controlado
aleatorio.JAMA 290: 1749-1756.
77. Savli, H., A. Karadenizli, F. Kolayli, S. Gundes, U. Ozbek, y H. Vahabo-glu. 2003. Estabilidad Expresión de seis genes de limpieza: una
propuesta de resistencia a los estudios de cuantificación de genes de Pseudomonas aeruginosa por cuantitativa en tiempo real RT-PCR. J. Med.
Microbiol.52: 403-408.
78. Sawa, T., M. Ohara, K. Kurahashi, SS Twining, DW Frank, DB Doroques, T. Long, MA Gropper, y JP Wiener-Kronish. 1998. In vitro
toxicidad celular predice Pseudomonas aeruginosa virulencia en Infec-ciones pulmonares.Infect. Immun. 66: 3242 a 3.249. 79. Schuster, M., AC Hawkins, CS Harwood, y EP Greenberg. 2004. La
Pseudomonas aeruginosa RpoS regulon y su relación con el quórum sens-ing. Mol. Microbiol. 51: 973-985.
80. Schuster, M., CP Lostroh, T. Ogi, y EP Greenberg. 2003. Identifica-ción, el tiempo, y la especificidad de la señal de los genes quórum-con-
controlado Pseudomonas aeruginosa: un análisis del transcriptoma.J. Bacteriol. 185: 2066-2079.
81. Sharabi, Y., y N. Gilboa-Garber. 1979. La estimulación mitogénica de humano linfocitos por lectinas galactosephilic Pseudomonas
aeruginosa.FEMS Mi-crobiol. Lett. 5: 273-276. 82. Shryock, TR, SA de plata, MW Banschbach, y JC Kramer. 1984. Efecto de Pseudomonas aeruginosa en ramnolípido migra-ción de
neutrófilos humanos. Curr. Microbiol. 10: 323-328. 83. Sierra, G. 1960.Efecto hemolítico de un glicolípido producido por Pseudomonas aeruginosa.Antonie van Leeuwenhoek 26: 189-192.
83a.Smith, KM, Y. Bu, y H. Suga. 2003. Biblioteca de cribado para agonistas y antagonistas sintéticos de un autoinductor Pseudomonas
aeruginosa.Chem. Biol. 10: 563-571.
84. Tateda, K., R. Comte, JC Pechère, T. Kohler, K. Yamaguchi, y C. Van Delden. 2001. La azitromicina inhibe la detección de quórum en
85. Telford, G., D. Wheeler, P. Williams, PT Tomkins, P. Appleby, H. Sewell,
G. S. Stewart, BW Bycroft, y DI Pritchard. 1998. La Pseudomonas aeruginosa molécula señal de detección de quórum N - (3-oxododecanoil) - L-serina -homo lactona tiene actividad inmunomoduladora.Infect. Immun. 66: 36-42.
86. Thomsen, R., y MH Christensen. 2006. MolDock: una nueva técnica para de alta precisión de acoplamiento molecular.J. Med. Chem. 49:
3.315 a 3.321.
87. Tramper-Stranders, GA, TF Wolfs, A. Fleer, JL Kimpen y CK van der Ent. 2007. Tratamiento con azitromicina mantenimiento en
pacientes pediátricos con fibrosis quística: resultados a largo plazo relacionados con la resistencia a macrólidos y la función pulmonar.Pediatr. Infect.
Dis. J. 26: 8-12.
88. Tsai, WC, ML Rodríguez, KS joven, JC Deng, VJ Thannickal, K. Tateda, MB Hershenson, y TJ Standiford. 2004. Azitromicina bloques
el reclutamiento de neutrófilos en Pseudomonas infección endobronquial.Am. J. Respir. Crit. Care Med 170:. 1331-1339.
89. Wagner, VE, D. Bushnell, L. Passador, AI Brooks, y BH Iglewski.
2003. Análisis de microarrays de Pseudomonas aeruginosa quórum de detección de regu-lons: efectos de la fase de crecimiento y el medio ambiente.J. Bacteriol. 185: 2080-2095.
90. Waite, RD, A. Paccanaro, A. Papakonstantinopoulou, JM Hurst, M. Saqi, E. Littler, y MA Curtis. 2006. La agrupación de Pseudomonas
transcriptomas aerugi-nosa de cultivos planctónicos, desarrollar y bio-películas maduras revela distintos perfiles de expresión. BMC Genomics 7: 162.
91. Wang, Y., U. Ha, L. Zeng, y S. Jin. 2003. Reglamento de la membrana la permeabilidad de un sistema regulador de dos componentes en