6_Tipos_de_PCR

26/02/2009

1

Tipos de PCRTipos de PCREduardo Paulino Castan

Tipos de PCR

Tipos de PCRTipos de PCR

•PCR-RFLP •Competitive

• RAPD

• AFLP

• PCR-colony

• Hot Start

• In situ

• Multiplex

• Long

• Touchdown

• Degenerate

• RT-PCR *

Tipos de PCR

• Inverse

• Nested

• Real-Time PCR *

26/02/2009

2

PCRPCR--RFLP RFLP (Polimorfismo do Tamanho do Fragmento de Restrição)(Polimorfismo do Tamanho do Fragmento de Restrição)

Tipos de PCR


Normal Mutante

Tipos de PCR

26/02/2009

3


• Variabilidade genética• Identificação de espéciesIdentificação de espécies

Rhizoprionodon lalandii

Gene mit RNAr 16S

R. lalandii R. porosus

Digestão SspI

Tipos de PCR

Rhizoprionodon porosus

Digestão SspI


• Mapeamento genômico • Análise de doenças genéticasç g

Fator V Leiden humano

Relação com propensão a trombose profunda

Tipos de PCR

Raias 2 e 3: pacientes que não apresentaram a mutação analisada; raias 4 e 6: pacientes com amutação Fator V Leiden em heterozigose; raia 5: paciente com a mutação Fator V Leiden emhomozigose.

26/02/2009

4

RAPD RAPD (DNA Polimórfico Amplificado Aleatoriamente)(DNA Polimórfico Amplificado Aleatoriamente)

Tipos de PCR

DNA Genômico Primers randômicos


Tipos de PCR

26/02/2009

5


• Identificação dos níveis de diversidade genética populacional

Rio AmazonasEstação de piscicultura ‐ CEPTA

Brycon cephalus (matrinchã da Amazônia)

Tipos de PCR

estoque natural (S) estoques cultivados diversidadegenética

diversidadegenética

AFLP AFLP (Polimorfismo do Tamanho de Fragmentos Amplificados)(Polimorfismo do Tamanho de Fragmentos Amplificados)

(a) Preparação de AFLP

Enzimas de restrição (EcoR1e Mse1) e DNA

ligase

Tipos de PCR

DNA genômico Adaptadores

26/02/2009

6


(b) Restrição e ligação

Tipos de PCR


(c) Amplificação seletiva com um nucleotídeo

Tipos de PCR

26/02/2009

7


(c) Amplificação seletiva com três nucleotídeo

Tipos de PCR


Alburnus alburnus

Tipos de PCR

26/02/2009

8

PCR PCR ColonyColony

• Verificar a presença do fragmento de interesse

Tipos de PCR

Hot Start PCRHot Start PCR

• DNA polimerases podem demonstraruma pequena atividade à temperaturaambiente durante a montagem doambiente, durante a montagem doexperimento

• Essa in/eficiente atividade pode catalisara extensão de qualquer extremidade 3’anelada

• Atividade exonuclease 5'-3' degradaqualquer extremidade 5' parcialmente

Tipos de PCR

anelada, destruindo o primer e osubstrato molde

• Anelamento inespecífico de primers etemplates

26/02/2009

9

Hot Start PCRHot Start PCR

• Técnicas manuais

• Uso de Barreiras físicas

• Inativação reversível da DNA polimerase- Inibidores de ligação não covalente

1. Polipeptídio2. Anticorpo3. Aptamer

Tipos de PCR

In In SituSitu PCRPCR

• PCR que ocorre dentro da célula em uma lâmina. Pode ser realizada em células ou tecidos fixados

Tipos de PCR

26/02/2009

10

PCR InversaPCR Inversa

• Limitação da PCR convencional: as regiões 5' e 3' que flanqueiam seu fragmentode DNA de interesse devem ser conhecidas

• Inverse PCR permite a PCR quando você possui informação de apenas umaseqüência interna

EcoR1 EcoR1Digestão enzimáticaDigestão enzimática

DNA DNA ligaseligase

Tipos de PCR

PCR InversaPCR Inversa

• Sequenciamento de uma região desconhecida– Vários primers de espécies próximasVários primers de espécies próximas

Tipos de PCR

Região codificadora do gene da MyoD

26/02/2009

11

LongLong PCRPCR

• PCR cuja extensão é mais longa que as PCR convencionais (acima de 5 Kb);

• Para obtenção de uma alta precisão → mistura de polimerases específicas:

– Ex: Proficient polymerases + Accurate polymerases (Pfu)

Tipos de PCR

PCR PCR MultiplexMultiplex

• PCR com dois ou mais conjuntos de primers para amplificar diferentes fragmentosde uma mesma amostra

• Um tubo• Um template

• Dois pares de primers

Tipos de PCR

• Dois fragmentos amplificados

26/02/2009

12

NestedNested PCRPCR

• Variação da PCRconvencional, na qual sãoutilizados dois pares deprimers (ao invés de um),para amplificar um mesmofragmento

Tipos de PCR

CompetitiveCompetitive PCRPCR• Usada para quantificação• Densitometria de imagem• Adiciona-se à reação, uma quantidade conhecida de um fragmento de DNA

(competidor). Esse competidor deve conter sequências para os mesmos primers utilizados para amplificar o alvo

Tipos de PCR

Quantidade de DNA alvo pode ser determinada pela razão Alvo (T) /competidor (C)

26/02/2009

13

TouchdownTouchdown PCRPCR• Modificação da PCR convencional, que pode resultar na diminuição de amplificações não-específicas

• Temperatura de anelamento:

‐ 95° 30 s

‐ 95° 30 s, 60° 30 s, 72° 1min (3 ciclos)

• Inicialmente mais alta que a temperatura ótima dos primers

• Diminuição de 1°C a cada um ou dois ciclos, até atingir temperatura específica

• Após atingir temperatura específica (touchdown), ela é mantida nos ciclos restantes

Tipos de PCR

95 30 s, 60 30 s, 72 1min (3 ciclos)

‐ 95° 30 s, 56° 30 s, 72° 1min (3 ciclos)

‐ 95° 30 s, 53° 30 s, 72° 1min (3 ciclos)

‐ 95° 30 s, 50° 30 s, 72° 1min (25 ciclos)

‐ 72° 5 min

‐ 4° infinito

DegenerateDegenerate PCRPCR

O que são primers degenerados?

Primers que possuem um número de opções em várias posições na sequênciaPrimers que possuem um número de opções em várias posições na sequência

Exemplos:

5’-TCG AAT TCV CCY AAY TGR CCN T-3’

5’-TCB AAT TCG CHC AAA TKA CCG T-3’

A+C+G V

A+C+G+T N

A+T+G D

T+C+G B

A+T+C H

A+T W

Tipos de PCR

C+G S

T+G K

A+C M

C+T Y

A+G R

26/02/2009

14

DegenerateDegenerate PCRPCR

Aplicações:

Tipos de PCR

Tipos de PCR

6_Tipos_de_PCR

Documents

tiposdepcr tiposdepcr

interesse tiposdepcr

aptamer tiposdepcr

pcr convencional

primers e templates

situ pcr pcr que ocorre

y r tiposdepcr

touchdown pcr modificao