Definitie culturi celulare
IZOLAREA VIRUSURILOR IN CULTURI CELULARE
EFECTE CITOPATICE
Direciile diagnosticului virusologic1. Izolare virala in:
Culturi de celule Ou de gaina embrionat Animal de laborator
2. Detectia directa a : Particulelor virale EM , IEM Antigene
virale ELISA, IF Genom viral PCR; Rt-PCR
3. Teste Serologice:a. Ac virus- specifici tip IgMb.
seroconversia in ac virus- specifici tip IgGAlegerea sistemului de
izolare viralaAVANTAJEDEZAVANTAJE
Animalul de laboratorInfectie naturalaCost crescut
Oul de gaina embrionatCost scazutSusceptibilitate variabila
Culturi de celuleSensibilitate buna,
disponibilitateSusceptibilitate variabila, Infectie nenaturala
Definitie culturi celulare Metodologia propagarii in vitro a
unui fragment de tesut sau a unor celule dispersate obtinute din
tesuturi cu ajutorul unor enzime proteolitice si introduse intr-un
mediu nutritiv capabil sa le asigure homeostazia si
proliferarea.CLASIFICAREA CULTURILOR CELULARE CULTURI DE ORGAN =
mentinerea in vitro a unor fragmente de organ in vederea pastrarii
arhitecturii si functiei intacte a celulelor. Corona,
rhinovirusurile nu cultiva decat pe culturi de trahee CULTURI DE
CELULE DISPERSATE = provin din disocierea tesuturilor intr-o
suspensie de celule prin tratare enzimatica asociata cu agitare
mecanica. Se clasifica dupa timpul de supravietuire in vitro:
CULTURI PRIMARE TULPINI CELULARE LINII CELULARECulturi primare
Direct din dispersia enzimatica a unui tesut proaspat recoltat
Formeaza monostrat Celulele tind sa mentina caracteristicile
organului din care deriva Pot apare proprietati de suprafata noi
(devin susceptibile pentru infectii virale noi) ex: v. polio care
nu creste in rinichiul de maimuta intact , dar creste si
distrugeaceleasi celule renale separate si aderente la sticla Se
mentine in vitro timp limitat (3-5 pasaje)Tulpinile celulare
Omogene, durata de viata 50-60 de pasaje V. respiratorii cresc
foarte bine pe tulpini derivate din piele, intestin si amigdale
Cariotipul cromozomial este cel de origine diploid Pot fi utilizate
in producerea de vaccinuri virale si pentru diagnosticul
virusologicLiniile celulare Populatii de celule derivate dintesut
normal sau malign ce pot fi subcultivate un timp nelimitat Au
caracter heteroploid (numar variabil de cromozomi) Nu pot fi
folosite in producerea de vaccinuri din cauza instabilitatii
genomului. Celule vii dispersate:-reflecta tesutul de provenienta
TESUT EMBRIONAR
TESUT ADULT
TESUT TUMORALMediu nutritiv:Sruri tamponate izotone Earle:
1)NaCl; 2) KCl; 3)MgSO4; 4)CaCl2; 5) NaH2PO4 6) D-glucoz; Sruri
tamponate izotone Hanks: 1)NaCl; 2)KCl; 3)MgCl2 ; 4) MgSO4; 5)
CaCl2; 6) KH2PO4; 6) Na2HPO4; 8) D-glucoz; Substante nutritive:
Aminoacizi eseniali: 1) L-arginin; 2) L-cistin; 3) L-fenilalanin:
4) L-glutamin; 5) L-histidin; 6) L-izoleucin; 7) L-leucin; 8)
L-lizin; 9) L-metionin; 10) L-tirozin; 11) L-treonin; 12)
L-triptofan; 13) L-valin.
SER DE VIEL 2-10%, n funcie de tipul de cultur folosit: factori
de cretere i factori de adeziune
Vitamine : 1) Colin HCl: 0,01g; 2) Acid folic: 0,01g; 3)
Inozitol: 0,02 g; 4) Nicotinamid: 0,01 g; 5) D-pantotenat de
calciu: 0,01 g; 6) Piridoxal HCl: 0,01 g; 7) Riboflavin: 0,001 g;
8) Tiamin HCl: 0,01 g.
Antibiotice si antifungice: penicilin i streptomicin //
griseofulvinaSER DE VIEL 2-10%
pentru cultivarea celulelor renale de maimu si liniei celulare
ICRM23 se adaug 2% ser de viel,
pentru cultivarea celulelor de embrion de gin i unele linii
celulare (BSC, Vero, FL etc.), se adaug 5% ser de viel,
pentru cultivarea celulelor embrionare de hamster, rinichi de
hamster, alte linii celulare (KB, HeLa, Hep, etc.) se adaug 10% ser
de viel.
De importan deosebit este calitatea serului de viel utilizat,
care trebuie testat n prealabil. Condiii necesare pentru pstrarea n
via a celulelor din cultura celular: pH adecvat
temperatur constant
atmosfer cu 10% CO2
condiii aseptice
Obtinerea unei culturi celulare-se prelev esutul surs n condiii
aseptice
- se fragmenteaz esutul n buci, se spal cu soluie salin
tamponat
- disocierea enzimatic a celulelor: tripsinizarea n soluie de
tripsin 0,25%
-suspendarea celulelor n mediu nutritiv
-controlul viabilitii celulelor cu coloraie vital albastru de
tripan
- repartizarea celulelor in volume egale n flacoane de culturi
celulare
-incubare n poziie culcat
- urmrirea formrii culturii cu microscopul invers
Subcultivarea culturilor celulareDup 5-7 zile de la realizarea
culturii se epuizeaz substanele nutritive, sursele de energie, se
acidific mediul.
Pentru meninerea celulelor n via, acestea trebuie pasate,
subcultivate.
Celulele se detaeaz de pe peretele flaconului cu soluie de
tripsina siEDTA , se centrifugheaz, se spal cu soluie salina
tamponata i se resuspendeaz n mediu nutritiv.
Se verific viabilitatea celulelor, se numr celulele i se
ajusteaz la concentraia optim.
Se repartizeaz volume egale n flacoane de cultur celular.
Culturile primare pot fi subcultivate de cteva ori, 3-5x.
Tulpinile celulare pot fi subcultivate de mai multe ori,
50-60x.
Liniile celulare pot fi subcultivate la infinit.
Culturi provenite din celule
- normale: celulele se ataeaz de peretele flaconului, se
multiplic pn acoper peretele flaconului, realizeaz o cultur
monostrat
- tumorale: se multiplic i dup acoperirea suprafeei disponibile,
cresc n mai multe straturi i n suspensie
CELULELE TRANSFORMATESunt linii celulare care au suferit o
modificare stabila, spontana sau prin expunere la diferiti agenti
(virali, chimici, radiatii), modificare care este mentinuta
indefinit prin cultivare in vitro sau transplant in vivo.
Sunt morfologic distincte si se dispun dezordonat Inoculate la
animale produc tumori Multiplica haotic: nu au inhibitie de
contact, nu adera la substratul de izolare Cerinte nutritive mici,
se divid la concentratii mici de ser fetal de vitel Prezinta
antigene de suprafata diferite de celulele normale Prezinta
modificari cromozomiale, cariotip aneuploid
Inocularea virusurilor n culturile celulare Se arunca mediul
nutritiv i se introduce suspensia viral. Incubare 1 or (adsorbtia
virusurilor n celulele receptive). Se adaug mediu de ntreinere, se
incubeaz. n 3-5 zile apar modificrile survenite n cultura
celular.
Izolare:urmrirea efectelor citopatice = ECP
EFECTE CITOPATICE SINCITIAL: HIV, v rujeolos, VRS PICNOTIC
LITIC: enterovirusuri INCLUZIONAR: Intranuclear acidofil:
papovavirusuri Intranuclear bazofil: adenovirusuri
Intracitoplasmatic acidofil: v rabic, v vaccina Mixt: v herpetice,
v rujeolos
ECP SINCITIAL
BindingFusionReverse transcriptionNuclear
localizationUncoatingIntegrationTranscriptionSplicingRNA
exportGenomic
RNAmRNATranslationModificationBuddingAssemblyMaturationEndocytosisLysosome
INCLUZII CITOPLASMATICE (RABIE)Sus - neuron fara incluzii
NegriJos neuron cu incluzii Negri (col HE)
INCLUZII INTRANUCLEARE (BOALA CU INCLUZII CMV)
HSV corpii Cowdry tip A
Infectia CU adenovirusurise multiplica in nucleu unde proteinele
capsidare, produse in exces, formeaza incluziile intranucleare
Reovirus
HPV
ECP picnotic litic