BIOAKTIFITAS DAN IDENTIFIKASI SENYAWA SIKLO DIPEPTIDA YANG DIHASILKAN OLEH Streptomyces sp A11 Rofiq Sunaryanto 1,2 , Bambang Marwoto 1 , Tun Tedja Irawadi 2 , Zainal Alim Mas’ud 2 , Liesbetini Hartoto 2 1 Balai Pengkajian Bioteknologi BPPT Kawasan PUSPIPTEK Serpong Tangerang Selatan Banten 15340 Telp/fax.021-7560208 2 Sekolah Pasca Sarjana Institut Pertanian Bogor (IPB) Kampus IPB Dermaga, Bogor. Email: [email protected]Abstract Determination of Minimum Inhibitory Concentration (MIC) and chemical structure elucidation of antibiotic produced by Streptomyces sp A11 have been carried out. Broth of antibiotic was obtained by liquid fermentation using Streptomyces sp A11. Purification of antibiotic was carried out by silica gel column chromatography and preparative HPLC. Structure elucidation was carried out using ESI-MS, 1 HNMR, 13 CNMR, and 13 C DEPT NMR. Pure antibiotic showed inhibition activity to gram negative and gram positive bacteria. MIC to Escherichia coli ATCC 25922 was 27 µg/mL, Pseudomonas aeroginosa ATCC27853 68,7 µg/mL, Staphylococcus aureus ATCC25923 80,2 µg/mL, and Bacillus Subtilis ATCC 66923 73,7 µg/mL. Identification using ESI-MS showed that molecular weight of this antibiotic was 260 g/mol, and molecule formula was C 14 H 16 N 2 O 3 . Elucidation of chemical structure using 1 HNMR, 13 CNMR, and 13 C DEPT NMR showed that antibiotic was cyclo (tyrosyl-prolyl). They have maximum UV visible absorbance at 210 and 274.5 nm. Keywords : Antibiotic, Streptomyces, Minimum Inhibitory Concentration, Structure Elucidation PENDAHULUAN Meningkatnya resistensi mikroba akibat penggunaan antibiotik dan munculnya mikroba patogen baru telah mengilhami pencarian antibiotik baru dari mikroba. Keadaan ini mendorong semakin pentingnya usaha untuk mendapatkan bahan antibiotik yang murah tersedia secara kontinu dalam jumlah besar dan memiliki semua unsur-unsur yang dibutuhkan untuk pembuatan antibiotik tersebut. 1
This document is posted to help you gain knowledge. Please leave a comment to let me know what you think about it! Share it to your friends and learn new things together.
Transcript
BIOAKTIFITAS DAN IDENTIFIKASI SENYAWA SIKLO DIPEPTIDA YANG DIHASILKAN OLEH Streptomyces sp A11
Rofiq Sunaryanto1,2, Bambang Marwoto1, Tun Tedja Irawadi2, Zainal Alim Mas’ud 2, Liesbetini Hartoto2
1 Balai Pengkajian Bioteknologi BPPT Kawasan PUSPIPTEK Serpong Tangerang Selatan Banten 15340 Telp/fax.021-7560208
2 Sekolah Pasca Sarjana Institut Pertanian Bogor (IPB) Kampus IPB Dermaga, Bogor.Email: [email protected]
AbstractDetermination of Minimum Inhibitory Concentration (MIC) and chemical structure elucidation of antibiotic produced by Streptomyces sp A11 have been carried out. Broth of antibiotic was obtained by liquid fermentation using Streptomyces sp A11. Purification of antibiotic was carried out by silica gel column chromatography and preparative HPLC. Structure elucidation was carried out using ESI-MS, 1HNMR, 13CNMR, and 13C DEPT NMR. Pure antibiotic showed inhibition activity to gram negative and gram positive bacteria. MIC to Escherichia coli ATCC 25922 was 27 µg/mL, Pseudomonas aeroginosa ATCC27853 68,7 µg/mL, Staphylococcus aureus ATCC25923 80,2 µg/mL, and Bacillus Subtilis ATCC 66923 73,7 µg/mL. Identification using ESI-MS showed that molecular weight of this antibiotic was 260 g/mol, and molecule formula was C 14H16N2O3. Elucidation of chemical structure using 1HNMR, 13CNMR, and 13C DEPT NMR showed that antibiotic was cyclo (tyrosyl-prolyl). They have maximum UV visible absorbance at 210 and 274.5 nm.
Dari informasi ESI-MS yang menunjukkan bobot molekul 260 g/mol, 1HNMR, dan 13CNMR, diduga
struktur molekul senyawa aktif tersebut adalah sebagai berikut:
Gambar 5. Struktur molekul senyawa aktif yang dihasilkan oleh Streptomyces sp A11
Data spektrum 1HNMR, 13CNMR yang menunjukkan tata letak atom hidrogen dan atom karbon
disajikan dalam Tabel 3.
Tabel 3.
Intepretasi struktur molekul senyawa aktif ini diperkuat oleh data 13C DEPT yang ditunjukkan dalam Gambar 6.
Gambar 6.
Dua singlet atom karbon pada geseran kimia δ 170.795 (s) merupakan atom karbon no.1 (C1) dan δ
166.935 (s) merupakan (C4) (lihat Tabel 3 dan Gambar 5). Analisis lebih lanjut dengan 13C NMR, dua atom
karbon yang tidak tersubstitusi (C1’) ditunjukkan pada geseran kimia δ 127.651 , C4’ ditunjukkan pada geseran
kimia δ 157.699. Enam karbon methine ditunjukkan pada δ 57.926 (C3) yang mengikat nitrogen dan karbon
alifatik, δ 60.082 (C6) yang mengikat nitrogen dan karbon alifatik, δ 132.135 (C2’), δ 116.315 (C3’), δ 116.215
(C5’), δ 132.135 (C6’), dan empat karbon methylene [δ 29.42 (C7), δ 22.477 (C8), δ 45.942 (C9) yang mengikat
atom nitrogen dan karbon alifatik, δ 37.694 (C10)]. Spektrum DEPT 450 pada Gambar 6. menunjukkan ada empat
atom karbon yang tidak tersubstitusi [δ 127.651 (C1’), δ 157.699 (C4’), δ 170.795 (s) (C1), dan δ 166.935 (C4)].
DEPT 1350 and 900 menunjukkan bahwa ada 6 karbon methine [δ 57.926 (C3), 60.082 (C6), 132.135 (C2’),
116.315 (C3’), 116.215 (C5’), 132.135 (C6’)] dan ada 4 karbon methylene [δ 29.42 (C7), 22.477 (C8), 45.942
(C9). DEPT 1350 menunjukkan tidak adanya karbon methyl dalam senyawa ini.
6
Karbon pada posisi 3’ dan 5’ terlihat lebih upfield dari pada C2’ and C6’. Hal ini disebabkan oleh efek
terlidungi (shielding) oleh adanya gugus hidroksi C4’ diantara atom karbon C3’ dan C5’. Hal yang sama terjadi
pada C1’ (membentuk kopel para dengan C4’) yang menyebabkan pergeseran kimianya lebih upfield
dibandingkan dengan C2’ dan C6’. Dari hasil intepretasi tersebut diatas senyawa aktif tersebut adalah Cyclo
tyrosil-prolyl yang merupakan senyawa antibiotik golongan siklo dipeptida. Senyawa ini telah diketahui
sebelumnya yang dihasilkan oleh fungi Alternaria alternata dan digunakan sebagai antibiotik herbisida yang
memiliki sifat fitotoksin terhadap tanaman rumput-rumputan spotted knapweed (Stierle et al, 1988). Namun
demikian pada penelitian ini, senyawa aktif Cyclo tyrosil-prolyl ini dihasilkan oleh Streptomyces sp A11 yang
merupakan isolat lokal actinomycetes yang diambil dari sedimen laut.
KESIMPULAN.
Dari hasil penelitian ini dapat ditarik kesilpulan sebagai berikut;
Senyawa aktif yang diisolasi dari Streptomyces sp A11 memiliki daya hambat dengan spektrum luas terhadap
bakteri gram positif maupun gram negatif. Terhadap Escherichia coli ATCC 25922, senyawa ini memiliki MIC
sebesar 27 µg/mL, Pseudomonas aeroginosa ATCC27853 memiliki MIC sebesar 68,7 µg/mL, Staphylococcus
aureus ATCC25923 memiliki MIC sebesar 80,2 µg/mL, dan terhadap Bacillus Subtilis ATCC 66923 memiliki
MIC sebesar 73,7 µg/mL. Dari hasil elusidasi struktur kimia, senyawa aktif termasuk dalam golongan antibiotik
dipeptida dengan nama Cyclo tyrosil-prolyl, rumus molekul C14H16N2O3 dan bobot molekul sebesar 260 g/mol.
Senyawa ini memiliki serapan maksimum UVvis pada panjang gelombang 210 dan 274,5 nm.
UCAPAN TERIMA KASIH.
Penulis ucapkan terima kasih kepada Dr.Anis Masuhah, Dr Hardaning pranamuda, dan segenap
pembantu peneliti di Balai Pengakajian Bioteknologi BPPT sehingga penelitian ini dapat diselesaikan dengan
baik. Demikian juga kami ucapkan terima kasih kepada Islamic Development Bank (IDB) yang telah memberikan
dana untuk penyelesaian studi S3 kepada penulis.
DAFTAR PUSTAKA
7
Andrews,J.M, 2001, ”Determination of Minimum Inhibitory Concentratin”, Journal of Antimicrobial Chemotherapy, 48 suppl.S1, p.5-16
Boman, H,1995, “Peptide antibiotics and their role in innate immunity”, Annu. Rev. Immunol, Vol. 13. p.61–92.
Bonev. B, H. James, P.Judicael, 2008, “Principles of assessing bacterial susceptibility to antibiotics using the agar diffusion method”, Journal of Antimicrobial Chemotherapy 61, 1295–1301
Chinchar, V.G, J.Wang, G. Murti, C. Carey, L. Rollins-Smith, 2001, “Inactivation of frog virus 3 and channel catfish virus by esculentin-2P and ranatuerin-2P,two antimicrobial peptides isolated from frog skin”, Virology, vol. 288, p. 351-357
DE LUCCA, A.J, 2000, “Antifungal peptides: potential candidates for the treatment of fungal infections” , Expert Opinion on Investigational Drugs, vol. 9, no. 2, p. 273-299.
Dubin, A, P. Mak, G. Dubin, M. Rzychon, J. Stec-Niemczyk, B. Wladyka, K. Maziarka, D. Chmiel, 2005, “New generation of peptide antibiotics”, Acta Biocimica Polonica, vol.52. No.3.p.633-638.
Hancock, R.E.W, 2000, “Cationic antimicrobial peptides: towards clinical applications”, Expert Opinion on Investigational Drugs, vol. 9, p. 1723-1729.
Kanoh, K., Y.Matsuo., K.Adachi., K.Imagawa., M.Nishizawa., Y.Shizuri., (2005). Mechercharmycins A and B, Cytotoxic Substances from Marine-derived Thermoactinomyces sp. YM3-251. J. Antibiot. 58(4): 289–292
Marshall, S.H, 2003, “ Antimicrobial peptides: A natural alternative to chemical antibiotics and a potential for applied biotechnology” , Electronic Journal of Biotechnology, Vol.6 No.2. http://www.ejbiotechnology.info/content/vol6/issue3/full/1
Rhee, K.H, 2004, ” Cyclic dipeptides exhibit synergistic, broad spectrum antimicrobial effects and have anti-mutagenic properties”, International Journal of Antimicrobial Agents, 24 :423–427
Stierle, A., J.H. Cardellina., G.A. Strobel,1988, “Maculosin, a host-specific phytotoxin for spotted knapweed from Alternaria alternate” Proc. Natl. Acad. Sci, 85: 8008-8013.
TANAKA, K, 2001, “P-I3 - kinase p85 is a target molecule of proline-rich antimicrobial peptide to suppress proliferation of ras - transformed cells.”, Japanese Journal of Cancer Research, vol. 92, no. 9, p. 959-967
Tincu, J.A, S.W. Taylor, 2004, “Antimicrobial Peptides from Marine Invertebrates” Antimicrobial Agents And Chemotherapy, vol 48. No.10. p. 3645-3654.
VIZIOLI, J, M. SALZET, 2003, “Antimicrobial peptides: new weapons to control parasitic infections?” Trends in Parasitology, vol. 19 p.245-249
8
Tabel 1.
Tabel 1. Uji bioaktivitas ekstrak supernatan dari fermentasi isolat Streptomyces sp A11Sampel Diameter zona bening (mm)
Staphilococcus areus
Bacillus.s Pseudomonas araginosa
e.coli
Ekstrak biomasa 0 0 0 0Ekstrak supernatan 10,39 24,43 9,64 9,55kontrol (rifampin 500 ppm) 21,27 44,57 10,08 10,12Diameter of disk paper : 6 mm
Gambar 1.
Gambar 1. a. Kromatogram analisis HPLC. b. Spektrum serapan UV vis antibiotik yang dihasilkan oleh Streptomyces sp A11
Tabel 2.
Tabel 2. Konsentrasi Hambatan Minimum (MIC) senyawa aktif yang telah dimurnikan Konsentrasi Hambatan Minimum (MIC) µg/mL
Sampel Escherichia coli ATCC 25922
Staphylococcus aureus
ATCC25923Bacillus Subtilis
ATCC 66923Pseudomonas
aeroginosa ATCC27853
Senyawa hasil pemurnian
27 80.2 73.7 68.7
Tetrasiklin (senyawa
pembanding) 64,0 256 128 12,5
Gambar2
9
AU
0.00
1.00
2.00
Minutes5.00 10.00 15.00 20.00
12.0
61
AU
0.00
0.50
1.00
1.50
2.00
2.50
3.00
nm250.00 300.00 350.00
210.6
274.5
a b
Gambar 2. Spektrum ESI-MS m/z 261 (M+H)+ senyawa aktif hasil isolasi.
Gambar 3.
Gambar 3. Spektrum 1HNMR senyawa aktif yang dihasilkan oleh Streptomyces sp A11.
Gambar 4
10
Gambar 4. Spektrum 13C NMR senyawa aktif yang dihasilkan oleh Streptomyces sp A11
Gambar 5.
Gambar 5. Struktur molekul senyawa aktif (cyclotyrosil-prolyl) yang dihasilkan oleh Streptomyces sp A11
Tabel 3.
Tabel 3. Data Spektrum 1H NMR and 13CNMR senyawa aktif yang dihasilkan oleh Streptomyces sp A11.