69 6 PROTEIN REKOMBINAN 6.1 PENDAHULUAN Protein adalah bahan yang paling penting dari semua bahan yang membentuk organisme hidup. Protein terkandung dalam setiap sel hidup pada semua organisme, tanpa pengecualian, dan di dalam sel, protein berada dalam jumlah yang sangat banyak dengan berbagai bentuk atau jenis. Semua karakteristik dari organisme ditentukan oleh aktivitas protein. 6.2 LATAR BELAKANG Dalam biologi molekuler, yang disebut “Central Dogma”, menyatakan bahwa informasi gen yang tersimpan di dalam DNA dipindahkan ke RNA dan kemudian dipindahkan ke protein. Proses transfer dari DNA ke RNA disebut proses transkripsi, sedangkan proses transfer dari RNA ke protein disebut proses translasi. Kode-kode gen dalam protein disebut gen struktural karena mereka bertanggung jawab untuk mengekspresikan informasi gen ke dalam unit struktural pada manusia, seperti warna mata, kulit dan rambut. 6.3 DEFINISI Rekombinan protein adalah suatu bentuk manipulasi dari protein, yang dihasilkan dalam berbagai cara untuk menghasilkan sejumlah besar protein, memodifikasi urutan gen dan memproduksi produk komersial yang bermanfaat. Pembentukan protein rekombinan dilakukan melalui perantara khusus yang dikenal sebagai vector. Teknologi rekombinan adalah proses yang terlibat dalam pembentukan protein rekombinan.
17
Embed
6 PROTEIN REKOMBINAN - ashfar.staff.gunadarma.ac.idashfar.staff.gunadarma.ac.id/Downloads/files/68139/6_PROTEIN+REKOMBINAN.pdfWell established large scale production and downstream
This document is posted to help you gain knowledge. Please leave a comment to let me know what you think about it! Share it to your friends and learn new things together.
Transcript
69
6
PROTEIN REKOMBINAN
6.1 PENDAHULUAN
Protein adalah bahan yang paling penting dari semua bahan yang membentuk organisme
hidup. Protein terkandung dalam setiap sel hidup pada semua organisme, tanpa pengecualian,
dan di dalam sel, protein berada dalam jumlah yang sangat banyak dengan berbagai bentuk
atau jenis. Semua karakteristik dari organisme ditentukan oleh aktivitas protein.
6.2 LATAR BELAKANG
Dalam biologi molekuler, yang disebut “Central Dogma”, menyatakan bahwa informasi gen
yang tersimpan di dalam DNA dipindahkan ke RNA dan kemudian dipindahkan ke protein.
Proses transfer dari DNA ke RNA disebut proses transkripsi, sedangkan proses transfer dari
RNA ke protein disebut proses translasi. Kode-kode gen dalam protein disebut gen struktural
karena mereka bertanggung jawab untuk mengekspresikan informasi gen ke dalam unit
struktural pada manusia, seperti warna mata, kulit dan rambut.
6.3 DEFINISI
Rekombinan protein adalah suatu bentuk manipulasi dari protein, yang dihasilkan dalam
berbagai cara untuk menghasilkan sejumlah besar protein, memodifikasi urutan gen dan
memproduksi produk komersial yang bermanfaat. Pembentukan protein rekombinan
dilakukan melalui perantara khusus yang dikenal sebagai vector. Teknologi rekombinan
adalah proses yang terlibat dalam pembentukan protein rekombinan.
70
6.3.1 Rekombinasi
Rekombinasi adalah suatu proses dimana suatu progeny (keturunan) dikembangkan menjadi
kombinasi gen-gen yang berbeda dari gen-gen kedua orang tua nya, yang menghasilkan satu
set DNA baru.
Gambar 6.1. Penyilangan molekul DNA untuk menghasilkan protein rekombinan
Ditunjukkan pada gambar 6.1 adalah proses dari rekombinasi protein, diadaptasi dari
artikel dari Pusat Informasi Nasional Bioteknologi (NCBI).
Istilah “protein” digunakan karena protein adalah struktur yang mendukung DNA dan
merupakan blok bangunan materi hidup. Digunakan istilah “DNA rekombinan” untuk
menggambarkan urutan DNA baru yang telah dihasilkan dari rekombinasi gen dari kedua
orang tuanya. Proses rekombinan tersebut menjadi landasan terhadap kejadian evolusi dari
makhluk hidup.
6.4 PROTEIN REKOMBINAN
Teknologi DNA rekombinan adalah salah satu cara mempelajari fungsi dan interaksi dari
protein. Hal ini dilakukan dengan mengisolasi urutan DNA target dan kemudian
memindahkannya ke vektor kloning yang memiliki kemampuan untuk mereproduksi diri.
Urutan DNA dari vektor kloning berinteraksi dengan DNA target dan menghasilkan cetak
biru informasi gen baru yang disebut DNA rekombinan. DNA rekombinan tersebut
ditransfer ke RNA, yang pada proses berikutnya menghasilkan protein rekombinan.
6.4.1 Produksi protein rekombinan
Rekombinan DNA merupakan bidang ilmu pengetahuan yang hangat diperbincangkan yang
berhubungan dengan pembuatan organisme – mulai dari bakteri hingga kambing --
memproduksi protein yang biasanya tidak dihasilkan oleh suatu organisme. Penelitian di
bidang ini telah menghasilkan berbagai macam aplikasi dimana pada beberapa tahun yang
lalu masih belum memungkinkan. Penderita diabetes yang biasanya bergantung pada insulin
71
dari babi, dimana mirip dengan manusia tetapi tidak persis sama, sekarang dapat memiliki
insulin dari manusia yang pada saat ini telah dapat diproduksi oleh bakteri. Penderita
hemophilia dapat menggunakan faktor pembekuan yang telah diproduksi dalam susu
kambing. Sementara ilmu pengetahuan yang kompleks, dapat diuraikan ke dalam konsep
yang lebih sederhana.
Gambar 6.2. Skema rekombinasi protein
Dalam rangka untuk memahami bagaimana protein rekombinan dibuat, sebelumnya
kita perlu memahami bagaimana semua protein dibentuk. DNA berada didalam inti sel, DNA
memegang semua petunjuk yang diperlukan untuk membentuk suatu organisme. Seiring
dengan itu rangkaian helai panjang dari DNA adalah suatu instruksi untuk terbentuknya
berbagai protein.
6.4.2 Struktur DNA
DNA adalah dasar genetik untuk semua makhluk hidup dan seluruh kehidupan pada dasarnya
mempunyai struktur DNA yang sama. Untai panjang dari DNA pada dasarnya terdiri dari
jutaan unit berulang yang disebut nukleotida. Setiap nukleotida memiliki tiga bagian: gula,
gugus fosfat dan basa nitrogen. Struktur akhir DNA adalah dua helai yang terhubung di
bagian tengah, mirip sebuah tangga atau tangga spiral. Masing-masing sisi terdiri dari fosfat
dan gula yang berulang-ulang terus dan penghubung diantaranya terdiri dari dua basa
nitrogen yang bergabung bersama-sama. Hanya ada empat basa nitrogen dan mereka
direpresentasikan dengan kode-kode TCAG. Sebuah DNA dari organisme merupakan jutaan
72
basa-basa panjang tetapi urutan dari Ts, Cs, As dan Gs yang membuat kita mempunyai
perbedaan satu dengan yang lainnya.
6.4.3 Struktur dan Fungsi protein
DNA yang kita miliki menentukan dengan tepat bagaimana kita akan terlihat dan bagaimana
setiap sifat yang kita miliki, tetapi semua DNA hanya merupakan kode-kode sederhana untuk
protein-protein yang berbeda. Sebenarnya protein tersebut yang membuat kita menjadi
bentuk seperti sekarang ini. Protein merupakan rangkaian rantai panjang dari asam amino
sama seperti DNA yang juga merupakan rantai panjang dari nukleotida. Terdapat 20 asam
amino pada keberadaan protein dan setiap organisme menggunakan 20 asam amino tersebut
dalam kombinasi yang berbeda-beda untuk membentuk setiap protein .
Urutan asam amino ini sangat penting karena urutan tersebut memberikan bentuk
akhir dari protein. Bentuk dari protein sangat penting, hal tersebut memberikan karakteristik
dari protein. Inilah sebabnya mengapa protein rekombinan sangat penting. Menggunakan
insulin babi, yang memiliki struktur sedikit berbeda dengan insulin manusia, selalu berisiko
karena beberapa orang akan menolaknya. Namun, insulin rekombinan mempunyai urutan
asam amino yang persis sama seperti insulin manusia, kecuali yang dihasilkan oleh bakteri.
Hanya karena bakteri memiliki kode genetik didalamnya tidak berarti bahwa bakteri
akan segera memulai membuat suatu protein rekombinan. Para ilmuwan harus merekayasa
bagian promotor untuk melampirkan kode yang diinginkan sebelumnya dan kemudian
mereka dapat mengaktifkannya. Setelah semua ini ditambahkan ke dalam bakteri atau
organisme lain, sel-sel mulai membuat protein baru, karena urutan dari asam amino yang
sama maka produk protein akan 100% identik dengan sumbernya dank arena itu lebih aman
untuk digunakan.
6.4.4 Pilihan host untuk amplifikasi protein
Sistem host tersedia dalam beberapa bentuk termasuk fag, bakteri, ragi, tumbuhan, jamur
berserabut, serangga atau sel mamalia yang tumbuh dalam kultur dan hewan transgenik.
Pilihan terakhir dari host akan bergantung pada persyaratan yang spesifik dan aplikasi untuk
protein rekombinan. Pemilihan host tidak hanya mempengaruhi amplifikasi dan isolasi dari
protein, tetapi juga cara dimana produk kemudian dapat dimurnikan. Dalam rangka untuk
memutuskan host mana yang paling cocok dalam jumlah dan tingkat kemurnian produk serta
integritas biologis dan potensi toksisitas sebaiknya dipertimbangkan. Sebagai contoh, sistem
73
ekspresi bakteri tidak cocok jika modifikasi pasca-translasi diperlukan untuk menghasilkan
produk rekombinan yang dapat berfungsi penuh.
Lokasi produk dalam host akan mempengaruhi pilihan metode untuk isolasi dan
pemurnian dari produk. Sebagai contoh, sebuah host bakteri dapat mensekresikan protein ke
dalam media pertumbuhan, mentransportnya ke dalam ruang periplasmik atau menyimpannya
sebagai badan inklusi yang tidak dapat larut dalam sitoplasma.
Tabel 6.1. Keuntungan dan kerugian dalam pemilihan host
Host Advantages Disadvantages
Bacteria
e.g.Escherichia coli
Many references and much experience
available
No post-translational modification
Wide choice of cloning vectors
Gene expression easily controlled Biological activity and immunogenicity may differ
from natural protein
Easy to grow with high yields (product can
form up to 50% of total cell protein)
High endotoxin content in gram negative bacteria
Product can be designed for secretion into the
growth media
Bacteria e.g.
Staphylococcus aureus
Secretes fusion proteins into the growth media Does not express such high levels as E. coli
Pathogenic
Mammalian cells Same biological activity as native proteins Cells can be difficult and expensive to grow
Mammalian expression vectors available Cells grow slowly
Can be grown in large scale cultures Manipulated cells can be genetically unstable
Low productivity as compared to micro-organisms
Yeasts Lacks detectable endotoxins Gene expression less easily controlled
Generally Regarded As Safe (GRAS) Glycosylation not identical to mammalian systems
Fermentation relatively inexpensive
Facilitates glycosylation and formation of
disulphide bonds
Only 0.5% native proteins are secreted so
isolation of secreted product is simplified
Well established large scale production and
downstream processing
Cultured insect cells
Baculovirus vector
Many processing mechanisms similar to
eukaryotic cells
Lack of information on glycosylation mechanisms
Safe, since few arthropods are adequate hosts
for baculovirus
Product not always fully functional
Baculovirus vector received FDA approval for
a clinical trial
Few differences in functional and antigenic properties
between product and native protein
Virus stops host protein amplification. High
level expression of product
74
Tabel 6.1. (Lanjutan) Keuntungan dan kerugian pemilihan host
Host Advantages Disadvantages
Fungi Well established systems for
fermentation High level of expression not yet achieved
e.g.Aspergillus sp. of filamentous fungi
Growth inexpensive Genetics not well characterized
A.niger is GRAS No cloning vectors available
Can secrete large quantities of product into growth
media, source of many industrial enzymes
Plants Low transformation efficiency
Long generation time
6.4.5 Pilihan Vektor
Dalam rangka untuk mengkloning gen yang diinginkan semua vector yang telah direkayasa
memiliki pilihan situs hilir restriksi unik dari urutan promotor transkripsi. Pilihan keluarga
vector diatur oleh host/inang nya. Setelah host telah dipilih, berbagai macam vector yang
berbeda dapat dipertimbangkan, dari ekspresi vector yang sederhana hingga vector yang
mengeluarkan/mensekresikan protein fusi.
Namun, seperti untuk pemilihan dari system host yang sesuai, pilihan terakhir dari
vector harus mempertimbangkan persyaratan khusus dari aplikasi dan tentu saja akan
dipengaruhi oleh perilaku dari protein target. Salah satu faktor kunci yang telah menyebabkan
meningkatnya penggunaan vector protein fusi adalah amplifikasi dari protein fusi yang berisi
tag dengan ukuran yang telah diketahui dan fungsi biologis sangat mudah untuk
menyederhanakan isolasi, pemurnian dan selanjutnya deteksi. Dalam beberapa kasus hasil
protein juga dapat ditingkatkan.
Pemeliharaan dan protokol kloning sangat spesifik untuk setiap vector dan petunjuk
yang diberikan oleh pemasok harus diikuti dengan hati-hati.
Table 6.2. Memberikan tinjauan beberapa fitur amplifikasi fusi protein yang dapat
mempengaruhi pilihan terakhir dari vektor.
Advantages Disadvantages
Fusion proteins
Cell compartments can be targeted Tag may interfere with protein structure and
affect folding and biological activity
Provide a marker for expression Cleavage site is not always 100% specific if tag
needs to be removed
Simple purification using affinity chromatography
under denaturing or non-denaturing conditions
Easy detection
75
Refolding achievable on a chromatography column
Ideal for secreted proteins as the product is easily
isolated from the growth media
Non- fusion proteins
No cleavage steps necessary Purification and detection not as simple
Problems with solubility may be difficult to overcome,
reducing potential yield
6.4.6 Vektor untuk protein non-fusion
Tabel 6.3. Menunjukkan contoh vektor non-fusion
Vector
family Comments
pTrc 99 A Prokaryotic vector for expression of proteins encoded by inserts lacking a start codon, inducible
by IPTG
pKK223-3 For over-expression of proteins under the control of the strong tac promotor in prokaryotes
pSVK 3 For in vivo expression in mammalian cell lines
PSVL SV40 For high level transient expression in eukaryotic cells
pMSG For inducible expression in mammalian cells
6.4.7 Vektor untuk protein fusi
Tabel 6.4. Menunjukkan contoh dari vector untuk protein fusi bersama dengan produk