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广东化工制药职业技术学院化妆品系　高瑞英

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第一节高效液相色谱绪论第二节高效液相色谱法的特点与仪器第三节影响分离的因素与操作条件选择第四节色谱定性和定量的方法

复习复习


色谱法的分类

色谱

液相色谱

柱色谱

纸色谱

薄层色谱

高效液相色谱HPLC

气相色谱


复　习

柱色谱法（柱层析）纸色谱法（纸层析）薄层色谱法（薄板层析）高效液相色谱法（本次学）气相色谱法（预）

液相色谱

气相色谱

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第一节高效液相色谱绪论

一、色谱法的历史与展望二、什么是高效液相色谱三、高效液相色谱分类四、高效液相色谱的应用


一、色谱法的历史与展望

一、历史： 30年代茨维特分离绿叶色素 (Tswett实验 ) 40年代 TLC，纸色谱 50年代 GC出现使色谱具备分离和在线分析功

能 60年代末 HPLC出现，使色谱分析范围进一步扩

大

二、展望： 1 ．新型固定相和检测器 2 ．联用仪器： GC-MS， HPLC-MS 3 ．智能化发展


色谱法简介 ( 复习 )


色谱法溯源 ( 复习 )

Tswett 实验


茨维特的实验（图示）

下页观看动画　


色谱三要素：色谱三要素：

固定相固定相；；流动相流动相；；待分离物质待分离物质。。

Tswett 实验


经典液相色谱法 ( 复习 )

柱层析

返回


二、什么是 HPLC

返回


三、高效液相色谱法的应用

1 、在生物化学和生物工程中的应用

2 、在药物质量检验中的应用

3 、食品分析

4 、环境分析

5 、精细化工


第二节高效液相色谱的特点与仪器

一、高效液相色谱仪二、高效液相色谱法的特点三、流程及主要部件


HPLC 常见机型

Waters LC-600Waters LC-2690

岛津LC－10A

HP1050

Agilent 1100系列


液相色谱仪（ 1 ）


液相色谱仪 (2)







Agilent 1100 系列

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二、高效液相色谱法的特点

特点：高压、高效、高速

高沸点、热不稳定有机及生化试样的高效分离分析方法。

二者比较


色谱法的特点

优点优点

Success factors

分离效率高应用范围广

灵敏度好分析速度快

不足：被分离组分的定性较为困难。Back


HPLCHPLC 与经典与经典 LCLC 区别区别主要区别：固定相差别，输液设备和检测手段1 ．经典 LC：仅做为一种分离手段柱内径 1~3cm，固定相粒径 >100μm 且不均匀常压输送流动相柱效低（ H↑， n↓）分析周期长无法在线检测2 ． HPLC：分离和分析柱内径 2~6mm，固定相粒径 <10μm（球形，匀浆装柱）高压输送流动相柱效高（ H↓， n↑）分析时间大大缩短可以在线检测


HPLCHPLC与与 GCGC 差别差别

相同：兼具分离和分析功能，均可以在线检测主要差别：分析对象的差别和流动相的差别1.分析对象： GC：能气化、热稳定性好、且沸点较低的样品，高沸点、挥发性差、

热稳定性差、离子型及高聚物的样品不可检测，占有机物的 20%

HPLC：溶解后能制成溶液的样品，不受样品挥发性和热稳定性的限制，分子量大、难气化、热稳定性差及高分子和离子型样品均可检测，用途广泛，占有机物的 80%。

2.操作条件： GC：加温操作 HPLC：室温；高压（液体粘度大，峰展宽小）3.流动相


高效液相色谱法与其他分离方法的比较项目分馏结晶提取经典柱色谱 TLC GC HPLC

分离效率低低低低高高高

分离速度慢慢慢慢较快快快

应用范围窄窄广广广较窄广

样品用量多多多多少少少

可否用于制备可可可可尚可可可

可否用于痕量分析否否否否可可可

分析鉴定可可否否可可可

分析灵敏度低低 - - 高高高

高效液相色谱法与其他分离方法的比较


1. 流程

三、流程及主要部件

2. 主要部件


1. 流　程


高效液相色谱简单动画



典型的仪器配置

色谱泵及控制器数据处理及控制

进样器

色谱柱检测器Waters 486

Back


归纳归纳 HPLCHPLC 的组成的组成

输液系统

进样系统

色谱柱

检测系统

数据处理


2.HPLC 的主要部件

1.泵2.梯度淋洗装置3. 进样装置4.色谱柱5.检测器6. 数据处理

下一节


Aglient1100 HPLC 结构图


2. 主要部件

高压输液泵单活塞往复泵隔膜型往复泵双活塞往复泵

梯度淋洗装置高压梯度低压梯度

进样装置六通阀进样器正确进样方式自动进样器

高效分离柱各种色谱柱各种色谱柱填充柱与毛细管柱的比较填充柱与毛细管柱的比较填充柱的填装填充柱的填装机械振动产生空隙机械振动产生空隙


（ 1 ）高压输液泵


（ 1 ）高压输液泵

单活塞往复泵隔膜型单活塞往复泵双活塞往复泵

（见液相色谱真机演示）


单活塞往复泵结构示意（动画）

gaory

注意两个单相阀的运动和作用

下一页


隔膜型往复泵的结构（动画）


双活塞往复泵的构造（图示）

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(2) 梯度淋洗装置


(2) 梯度淋洗装置

如不用梯度，分离效果不理想


如不用梯度：分离不理想

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(3) 进样装置


六通阀进样器

通常使用耐高压的六通阀进样装置，如图所示：


六通阀进样原理

转动手柄

（见液相色谱真机演示）


六通阀的使用原理（动画）


正确的手动进样方式


手动进样器


手动进样器结构


自动进样器


Agilent 1100 自动进样器工作原理


Agilent 1100 自动进样器工作原理


视频：自动进样器

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(4) 高效分离柱


(4) 高效分离柱

柱体为直型不锈钢管，内径 1 ～ 6 mm ，柱长 5 ～ 40

cm 。发展趋势是减小填料粒度和柱径以提高柱效。


各种色谱柱


高效液相色谱的核心是色谱柱


高效液相色谱的核心是色谱柱

高效填料——小颗粒 (10、 7、 5、 3um) 无机氧色谱柱关键化物作基质 , 在这些基质上键合各种化学基团或涂渍各种聚合物。装柱技术——有干法湿法两种，有专门的装置（高压泵）

高效填料——小颗粒 (10、 7、 5、 3um) 无机氧色谱柱关键化物作基质 , 在这些基质上键合各种化学基团或涂渍各种聚合物。装柱技术——有干法湿法两种，有专门的装置（高压泵）

下一内容


色谱柱结构示意图


液相色谱柱的结构（动画）


填充柱和毛细管柱的比较


色谱柱内的结构（放大）

柱

试样分子

固定相颗粒流动相


如果我们使用更小颗粒度的填料会发生什么情况？

HPLC 填料颗粒尺寸的演变

10 min

从 80 年代到现在1.5~5µm 球形微多孔填料1500~4000 psi50,000~80,000 塔板数 /米3.9×300mm

70 年代末期10µm 不规则微多孔填料1000~2500 psi25,000 塔板数 /米3.9×300mm

10 min

70 年代早期40µm 薄壳非多孔基质上涂布100~500 psi1000 塔板数 /米1m 长色谱柱

10 min

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填充柱的填装

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色谱柱化学及外形结构的关系

液相色谱柱

填料柱管

颗粒表面性质颗粒度长度内径材料

∶化学性质 k£¬

分辨率

∶机械因素 N

寿命，柱效，速度，溶剂消耗


机械振动产生空隙不要撞击色谱柱如色谱柱掉落或柱压急剧变

化。

8 9

4 5 6

1 2 3

7

0

xxxx

xxxx

xxxx

xxxx

xxxx

xxxx

xxxx

xxxx xxxx

000 0 000 0

LC-10AD :::::::

输液时不要打开排液阀

Back


（ 5 ）液相色谱检测器


检测器的种类

996

电化学示差折光电化学

脉冲安培荧光

电导固定波长紫外

光电二极管矩阵

/可调波长紫外可见

/可编程紫外可见

∶其他放射性、质谱 LALLS热能、蒸发质量、粘度


(5) 液相色谱检测器

紫外－可见光检测器光电二极管阵列检测器示差折光检测器荧光检测器蒸发光散射检测器电化学检测器

部分检测模式比较


紫外 - 可见光检测器

(基于样品池 S)中的样品对光产生吸收，有信号差如是可变波长检测器，还有分光系统(光珊)，见下页。

灯流动池

光电二极管R

S样品入口

Hg 254Zn 214Cd 229D2 ¿É±ä

应用最广


紫外检测器紫外检测器

参比池

样品池

光线

硅光电池板

返回


反射镜1＃

反射镜 2＃

氘灯

光源透镜滤光片（钬玻璃 /遮光）

入射狭缝

光栅

分光器

参比光电二极管数模转换板

样品光电二极管数模转换板

流通池

Agilent 1100 紫外检测器工作原理

Back


b. 光电二极管阵列检测器


光电二极管阵列检测器



光电二极管阵列检测器： 1024 个二极管阵列，各检测特定波长，计算机快速处理，三维立体谱图，如图所示。



Back


c. 示差折光效应

示差折光效应的危害产生假的紫外吸收变化∶

• 定量误差，光谱图不准确• 梯度时严重的基线漂移

梯形池设计最初的专利设计

这是示差折光效应的一个例子，光从一个介质到另一个介质发生折射现象


示差折光检测器

除紫外检测器外，最常用的检测器

LAMPS

LED orIncandescent

R

R

S

To Amplifier

No sample

With sample

Back


d.荧光检测器

高灵敏度、高选择性；对多环芳烃，维生素 B 、黄曲霉素、卟啉类化合

物、农药、药物、氨基酸、甾类化合物等有响应； Back


e.蒸发光散射检测器原理（动画）

Back


f.电化学检测器随着化合物被氧化或还原，产生正比于浓度的电流

Back


液相色谱的检测模式

示差折光电导紫外荧光电化学

响应通用选择性选择性选择性选择性灵敏度毫克纳克纳克 Picogram Picogram

线性范围流速敏感是是否否是温度敏感是是否否是梯度淋洗不可有限制可以可以脉冲的可以

104 106 105 10 103~ 106

灵敏度、选择性、及适应能力

Back


色谱工作站登录界面

Back


下列建议将会延长溶剂过滤器的使用寿命并维持泵的运行。下列建议将会延长溶剂过滤器的使用寿命并维持泵的运行。

使用灭过菌的溶剂瓶来减缓藻类生长。使用灭过菌的溶剂瓶来减缓藻类生长。

使用新鲜配制的流动相，特别是水溶剂或盐缓冲液建议不超过使用新鲜配制的流动相，特别是水溶剂或盐缓冲液建议不超过两天。两天。

如果应用许可，在溶剂中加人如果应用许可，在溶剂中加人 0.00010.0001－－ 0.001 0.001 MM 的叠氮化钠。的叠氮化钠。

避免溶剂瓶暴露在直射阳光下。避免溶剂瓶暴露在直射阳光下。

用氩气或氦气置换流动相上层的空气。用氩气或氦气置换流动相上层的空气。

防止堵塞溶剂过滤器


1 ）什么是色谱技术？它哪几种形式？2 ）色谱分离过程中，柱内样品组分分子运动具有那些基本特

征？3 ）试比较色谱分离与萃取、蒸馏等分离之间的区别？4 ）根据你所掌握的分析化学知识，比较色谱分析法与其他分

析方法（化学分析、电分析、光谱分析等）的区别，说明色谱分析法在分析化学中的地位和作用。

5) 从分离效率、分离速度、灵敏度、样品容量、操作技术等方面，列表比较经典液体柱色谱、气相色谱、高效液相色谱的异同点。

思考题


作　业

P79 1, 2，4


第二节　影响分离因素和操作条件的选择

热力学理论：塔板理论热力学理论：塔板理论————平衡理论基础平衡理论基础动力学理论：速率理论动力学理论：速率理论———— VanderVander 方程方程

一、塔板理论二、速率理论三、 HPLC 法中分离条件的选择


一、塔板理论一、塔板理论

理理 nLH / 22

21

2 )(16)(54.5)(W

t

W

ttn RRR

理

effeff nLH / 2

21

'2

'

)(54.5)(16W

t

W

tn RReff

0

'

t

tk R

2)1

(k

knneff

理


色谱流出曲线及参数



液相色谱名词术语（ 1 ）








HPLC 图形结果


问题∶什么样的分离结果是好的 ? 分辨率 ?


什么是色谱的分辨率？

分辨率的公式：

)(21

12

12

WW

VVR


（三）吸附剂和流动相的选择：（三）吸附剂和流动相的选择：

1. 被测组分性质（极性大小）：烃＜ - - - - - - - - ＜羧酸，醇 ( 见下页 )2. 吸附剂的活性：吸附剂的活性↑大，对被测组分的吸附能力↑强强极性物质——选择弱吸附剂弱极性物质——选择强吸附剂3. 流动相的极性：流动相极性↑大，对被测组分的洗脱能力↑大 “相似相溶”原则：根据组分性质、吸附剂的活性，选择适当极性的流动相。


极性问题

CH3

COOCH3

溶剂

样品的官能团

极性非极性 THF CH水甲醇异丙醇乙腈乙酸乙酯 2Cl 2 CHCl 3 己烷

NH3X/ ArOH/ RCOOH CNH2 ROH RCN / N(R)醛酮 2 NO2 卤代烷烃烷烃



思　考　

如何评价色谱分离的好坏？或者说色谱分析追求的目标什么？

分离度、分析时间、样品量？


Sig

time

Sig

time

Sig

time

在色谱中相邻两组分(“ 物质对” ) 的分离度：R

t t

W W

t t

W Wr r r r

2 1 2 1

1

2

2

1 21 2( )

( )

●热力学：保留值的差别要足够大

●动力学：色谱峰要足够窄


通常用 R=1.5作为相邻两组分已完全分离的标志。实际工作 R 要多少？

补充材料


初始

k、 N 、对分离的影响

增大 k

增大 N

t

改变

S

t


二、速率理论： van Deemter 方程式

A 项（颗粒度和柱床填装的优良程度）

Heig

ht

Eq

uiv

ale

nt

to T

heore

tica

l Pla

te

线速度 U （mm/sec ）

HETP

最低 HETP => 最优化的塔板数

HC 项（传质）

B 项（轴向扩散）

三项加在一起最终得到的 “ van Deemter 曲线”

HETP PLATES

A 项 + B 项 + C 项

Cuu

BAH


Van Deemter 方程

H=A+B/u+Cu

涡流扩散项纵向扩散项传质阻抗项

（可忽略不计）C=Cm+Csm+Cs

Cm=Cm'(dp2/Dm)

Csm=Csm'(dp'/Dm)



色谱柱中溶质谱带展宽的几种主要因素


三、三、 HPLCHPLC 法中分离条件的选择法中分离条件的选择

1. 固定相与装柱方法的选择：选粒径小的、分布均匀的球形固定相（ dp≤10μm ）首选化学键合相，匀浆法装柱2. 流动相及其流速的选择：选粘度小、低流速的流动相——甲醇， 1ml/min

3. 柱温的选择：选室温 250C左右


影响分离的因素影响分离的因素1．

2

2

1

1

4 k

knR

uCAH

流动相采用粘度小、低流速的

匀的固定相：采用粒度小、填充均n

'

'

'

'

1

2

1

2

1

2

1

2

R

R

R

R

V

V

t

t

k

k

K

K

温影响小）质和固定相性质（受柱：调整流动相种类、性

0

'

t

t

V

VK

VC

VC

W

Wk R

m

s

mm

ss

m

s

小）的配比（受柱温影响较：调整流动相和固定相k


第三节　色谱定性定量的方法

一、定性二、定量


一、用保留时间定性

保留时间相同，可能是同一组分；保留时间不同，肯定不是同一组分。


外标法在液相色谱中用的最多在液相色谱中用的最多内标法准确，但是麻烦准确，但是麻烦在标准方法中用的最多在标准方法中用的最多峰面积百分比法峰面积百分比法由于检测技术的影响，在液相色谱中由于检测技术的影响，在液相色谱中不常用不常用

二、常用的定量方法

线性要求

标准曲线法

液相色谱法定量常用术语


HPLC 定量分析常用术语（ 1 ）


HPLC 定量分析常用术语（ 2 ）


定量分析的一般过程

1.取样：所取样品必须要有代表性 2.试样预处理（ 1 ）分解：分为干法和湿法分解；必须分解完全（ 2 ）分离及干扰消除：对复杂样品的必要过程 3. 测定：根据样品选择合适方法；必须准确可靠 4. 计算：根据测定的有关数据计算出待测组分的含量，必须准确无误

5.出报告：根据要求以合适形式报出


样品预处理的过程

第一步第二步按样品的物理性质差异，从基质中分离出要分析的组份


样品的富集在分析前浓缩产物到 ppm或 ppb级

步骤∶ 小柱先要用甲醇活化，然后用水平衡。

把大量 (几百毫升 ) 样品载入小柱

溶剂流出被分析的组份仍保留在柱子内最后用少量 (几毫升 )非极性溶剂洗出极性较弱的要分析的组份

/富集浓缩

/活化平衡浓缩样品溶剂流出

大量样品

样品保留在柱头上

强溶剂1. 甲醇

2. 水


固相提取产品


样品瓶


系统适应性

1) 真值（ XT）——某一物理量本身具有的客观存在的真实数值。（除理论真值、计量学约定真值和相对真值外通常未知）

2) 平均值—— n 次测量数据的算术平均值

1 2 3

1

1n

n

i

i

x x x xX x

n n


3) 准确度（ accuracy ）——在一定测量精度的条件下分析结果与真值的接近程度，常以绝对误差（ E ）和相对误差 (RE)来表示。

4) 精密度（ precision）——多次重复测定某一量时所得测量值的离散程度，常以偏差和相对偏差 (deviation)来表示。也称为再现性或重复性（注意其区别）

¤ 再现性 (reproducibility)— 不同分析工作者在不同条件下所得数据的精密度。

¤ 重复性 (repeatability)—— 同一分析工作者在同样条件下所得数据的精密度。


精密度与准确度


精密度与准确度


根据供试品与杂质的对照品保留时间相同测定各杂质峰面积 .

高效液相色谱法 (HPLC)

特点分离效能高、应用范围广，能准确、快速、分离分析同时进行

药物杂质检验


外标法定量

配制一系列已知浓度的标样

0 1 2 3 4增加溶质的浓度

工作标样

储存标样


外标法定量（二）

实际色谱图

0.00

0.05

0.10

0.15

0.20

0.25

0.30

0.00 0.50 1.00 1.50 2.00 2.50 3.00 3.50 4.00 4.50 5.00 5.50 6.00 6.50 7.00

Minutes

0.00

0.05

0.10

0.15

0.20

0.25

0.30

0.00 0.50 1.00 1.50 2.00 2.50 3.00 3.50 4.00 4.50 5.00 5.50 6.00 6.50 7.00

Minutes

0.00

0.05

0.10

0.15

0.20

0.25

0.30

0.00 0.50 1.00 1.50 2.00 2.50 3.00 3.50 4.00 4.50 5.00 5.50 6.00 6.50 7.00

Minutes

0 50 100 150 200 2500

1,000

2,000

3,000

4,000

5,000

ÑùÆ· Å̈ ¶È

响应值峰面积( )

标准曲线


外标法定量（三）

计算公式

特点无需各组份都被检出、洗脱需要标样标样及样品测定的条件要一致进样体积要准确

iXi

i

iX

ARFC

XR

XCRF

i

i

样品响应值∶未知组分的浓度

标样响应值标样浓度

∶校正因子

)(

)( )(

)(

Back


内标法定量（一）

配制一系列浓度的标样，其中加有内标样

0 1 2 3 4增加溶质的浓度

工作标样

储存标样 + 储存内标样

内标样浓度不变


内标法动画示意


内标法定量（二）

实际色谱图

0.00

0.20

0.40

0.60

0.80

1.00

1.20

1.40

1.60

1.80

2.00 2.50 3.00 3.50 4.00 4.50 5.00 5.50 6.00

volts

Minutes

MethylParaben

EthylParaben

PropylParaben

ButylParaben

0 50 100 150 200 2500

10

20

30

40

50

ÑùÆ· Å̈ ¶È

标样峰面积

内标样峰面积

标准曲线


内标法定量（三）

计算公式：

特点：无需各组份都被检出、洗脱需要标样，需要内标样结果与进样体积无关

..)(

)( )()(

).(

si

iXi

ii

X

A

ARFC

XCXR

SIRRF

i

i

内标峰面积样品峰面积

∶未知组分的浓度

标样浓度标样响应值内标样响应值

∶校正因子


内标法定量（四）

对内标物的要求化学结构与待测组分相似 (同系物、异构体 ) 在样品中不存在不与样品中组份发生任何化学反应保留值与待测组分接近浓度（响应值）与待测组分相当其色谱峰与其他色谱峰分离好

Back


峰面积百分比法定量

公式：

特点：各组分要全部流出、全部被检测，并对检测器的响应值一样简单，液相色谱目前很难做到这点

与进样量无关不需标样简单

%100%

iAiAC

Back


可接受的检测范围

校正曲线只有在建立这条曲线的浓度范围内有效，高或低于这些点都可能引起计算错误

最低浓度标样

最高浓度标样

所希望的检测范围

线性问题

灵敏度问题

检测器响应

样品浓度


定量校正曲线曲线 A ：

因在零浓度时仍有色谱峰，可能有杂质未分开

曲线 B ：在此浓度内，检测器的响应值是非线性的

曲线 C ：可接受的理想状态，实际情况应是∶其延长线到零点

曲线 D ：表明有样品的损失，可能是色谱柱的非特征吸附，也可能是样品制备

时的损失

A

B

C

D



柱色谱－茨维特色谱实验（动画）　

返回返回色谱三要素


广东化工制药职业技术学院化妆品系　高瑞英返回


TLC及 GC

返回


按性质不同分类



液相色谱的应用（ 1 ）


液相色谱的应用（ 2 ）


柱上洗脱过程


溶解性效应

低溶解性溶剂高溶解性溶剂

Back


练　习

色谱法分离混合物的可能性决定于试样混合物在固定相中 ______的差别。

A. 沸点差， B. 温度差， C. 吸光度， D. 分配系数。


练　习

进行色谱分析时，进样时间过长会导致半峰宽 ______ 。

A.没有变化， B. 变宽， C. 变窄， D. 不成线性。


练　习

相对保留值是指某组分 2 与某组分 1的 _______ 。

A.调整保留值之比 ;

B. 死时间之比 ;

C. 保留时间之比 ;

D. 保留体积之比。


练　习

判断对错：　对于高沸点、热稳定性差、相对

分子量大的有机物原则上可用高效液相色谱法进行分离、分析。


练习题

已知物质 A和 B 在一根 30.00 cm 长的柱上的保留时间分别为 16.40 min和17.63 min 。不被保留组分通过该柱的时间为 1.30 min 。峰底宽度分别为 1.11 min和 1.21 min ，计算：（ 1 ）柱的分离度；（ 2 ）柱的平均塔板数；（ 3 ）达到 1.5 分离度所需的柱长度。


解：（ 1 ）柱的分离度 R = 2（ 17.63 - 16.40） /（ 1.11 + 1.21） = 1.06（ 2 ）柱的平均塔板数 n = 16 (16.40 /1.11)2 = 3493

n = 16 (17.63 /1.21)2 = 3397

n 平均 = （ 3493 + 3397 ） / 2 = 3445


（ 3 ）达到 1.5 分离度所需的柱长度

R1 / R2 = ( n1 / n2 )1/2

n2 = 3445 (1.5 / 1.06)2 = 6898

L = nH = 6898(300 /3445)= 60 cm


小　结

11．泵．泵22．进样装置．进样装置3 3 ．色谱柱．色谱柱4 4 ．检测器．检测器5 5 ．数据处理器．数据处理器

.

HPLC 的基本结构

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