让我们把蛋白质看作具有独特而奇妙性质的实体

Western blotting

为什么要作蛋白质印迹实验？

研究一些体外的蛋白质分子，寻找目的蛋白是否存在样品当中

蛋白质的表达情况，上调或下调表达，在不同的样品中，如疾病和正常的样品之间的表达差异性。

定义： 印迹法（ blotting ）是指将样品转移到固相载体上，而后利用相应的探测反

应来检测样品的一种方法。 1975 年， Southern 建立了将 DNA 转移到硝酸纤维素膜（ NC 膜）上，并利

用 DNA － RNA 杂交检测特定的 DNA 片段的方法，称为 Southern 印迹法。 而后人们用类似的方法，对 RNA 和蛋白质进行印迹分析，对 RNA 的印迹分

析称为 Northern 印迹法，对单向电泳后的蛋白质分子的印迹分析称为 Weste

rn 印迹法，对双向电泳后蛋白质分子的印迹分析称为 Eastern 印迹法

Towbin, H., et al. (1979). Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76, 4350-4354.

Western Blot基本原理

在电场的作用下将电泳分离的多肽从凝胶转移至一种固相支持体，然后用这种多肽的特异抗体来检测。

Western Blotting 方法一 : 直接法 优点：

1. 快速（一种抗体） 2. 没有二抗交叉反应引起的非

特异性条带 缺点：

1. 免疫反应性降低 2. 无信号二级放大 3. 抗体标记费时昂贵 , 使用不

方便

Western Blotting 方法二 : 间接法

优点： 1. 免疫特异性不受标记影响 2. 信号放大灵敏度高（多个二抗结

合位点） 3. 多种标记的二抗可供选择 4. 可选择不同的 Marker

缺点： 1. 交叉反应引起的非特异性条带 2. 额外的二抗孵育以及条件优化

间接 Western Blotting 操作流程 :

Western BlotWestern Blot 一般流程一般流程

蛋白样品的制备 SDS 聚丙烯酰胺 凝胶电泳

转膜封闭一抗杂交二抗杂交底物显色

Western Blotting Western Blotting 设计选择设计选择 分子量标准 内参 膜 转膜和封闭 抗体 显色

不可小看“蛋白标准” -- 分子量标准的选择

预混分子量标准 高分子量标准 低分子量标准 宽分子量标准

预染分子量标准 单色预染 多色预染

修饰分子量标准

预混分子量标准

高分子量标准 低分子量标准 宽分子量标准

预染分子量标准

单色预染 多色预染

修饰分子量标准

糖基化 磷酸化 荧光标记

不可不加 -- 内参的选择 原因：校正蛋白质定量、上

样过程中存在的实验误差 种类： GAPDH 、 beta-acti

n 、 beta-tubulin 用法：

二抗孵育时加入 HRP 标记内参抗体

分子量相差不大 分子量大小相差比较明显

原料是基础 -- 膜

选择种类 NC PVDF 尼龙膜

选择标准 a. 膜与目的蛋白分子的结合能力（也就是单位面积的膜能结

合蛋白的载量），以及膜的孔径（也就是拦截蛋白的大小）； b. 不影响后续的显色检测（也就是适和用于所选的显色方法，

信噪比好）； c. 后继实验有其他要求，比如要做蛋白测序或者质谱分析，

还要根据不同目的来挑选不同的转移膜

膜的特点

抗体的选择 作为 western 来讲，理论上单抗比多抗的特异性要好，但单抗种类较

少一般价格偏高，所以一般来说多抗足够了。用于 western 的抗体和用于 ELISA 的抗体，一般来说用于 western 的抗体识别的是氨基酸序列特异性；而可用于 ELISA 的抗体则要看抗原种类，有些是识别氨基酸序列特异性，有些是识别构像特异性。所以一般根据抗体说明书来确定。

做免疫印迹时选择抗体主要应考虑两个问题，一是所选抗体是否能识别凝胶电泳后转印至膜上的变性蛋白，另一个是所选抗体是否会引起交叉反应条带。

八仙过海，各“显”神通 -- 显色方法 化学显色法 : 方便、便宜、有毒、灵敏度较低、费抗体、

反应慢、线性窄、不易保存、不能重新剥离检测 化学发光法 : 灵敏、快速、节省抗体、反应快、线性宽、

无害、特异性高、可重新剥离检测 同位素法 : 灵敏度高、不安全、环境污染、不方便和半衰

期短 荧光底物法： Krypton ™ 荧光底物

两种常用检测酶系统的比较

掌握

Western blotting 的原理和主要步骤。