80 Evaluación de la expresión de factores de crecimiento involucrados en la reparación de heridas mucosas en tejido conectivo mucoso artificial 5.3.3 Unión de los factores recombinantes humanos De acuerdo con el análisis de los sensogramas obtenidos en los ensayos de unión para cada factor recombinante, se evidenció una correlación directa entre la respuesta obtenida en Unidades de Resonancia y la concentración de cada uno de los factores, como se puede apreciar en la Tabla 5.9. Los ensayos para cada concentración (20, 100, 250, 500 ,1500 y 2500 ng/mL) fueron realizados por triplicado, mostrando reproducibilidad y conservando la tendencia característica de las gráficas de unión. La solución buffer vehículo se escogió de acuerdo con la naturaleza química de cada factor. Tabla 5. 9. Unión de los Factores recombinantes evaluados en diferentes concentraciones, en Unidades de Resonancia CONCENTRACION (ng/mL) FACTOR EGF IL-4 Ang-2 TNF- α TGF-ß1 VEGF 2500 18,433 15,333 574,200 981,650 0,000 1034,600 1500 10,013 10,400 322,400 221,633 939,750 492,667 500 13,100 6,300 102,167 80,633 335,900 371,000 250 8,967 6,467 96,950 43,867 335,900 0,000 100 7,067 4,567 54,167 32,033 114,250 100,433 20 6,200 2,833 15,600 5,100 0,000 22,033 Figura 5.16 5.17 5.18 5.19 5.20 5.21
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80 Evaluación de la expresión de factores de crecimiento involucrados en la reparación de heridas mucosas en tejido conectivo mucoso artificial
5.3.3 Unión de los factores recombinantes humanos
De acuerdo con el análisis de los sensogramas obtenidos en los ensayos de unión para
cada factor recombinante, se evidenció una correlación directa entre la respuesta
obtenida en Unidades de Resonancia y la concentración de cada uno de los factores,
como se puede apreciar en la Tabla 5.9. Los ensayos para cada concentración (20, 100,
250, 500 ,1500 y 2500 ng/mL) fueron realizados por triplicado, mostrando
reproducibilidad y conservando la tendencia característica de las gráficas de unión. La
solución buffer vehículo se escogió de acuerdo con la naturaleza química de cada factor.
Tabla 5. 9. Unión de los Factores recombinantes evaluados en diferentes concentraciones, en Unidades de Resonancia
Los datos de UR de los ensayos de unión de los diferentes analitos, llevados a cabo con
concentraciones diferentes de los mismos se muestran en las Figuras 5.17 a 5.22.
Figura 5. 17 Ensayo de unión del factor recombiante humano EGF. Se muestran los valores de unión del EGF en diferentes diluciones (20, 100, 250, 500 ,1500 y 2500 ng/mL), en unidades de resonancia, encontrados en función del tiempo.
82 Evaluación de la expresión de factores de crecimiento involucrados en la reparación de heridas mucosas en tejido conectivo mucoso artificial
Figura 5. 18 Ensayo de unión del factor recombiante humano IL-4. Se muestran los valores de unión de IL-4 en diferentes diluciones (20, 100, 250, 500,1500 y 2500 ng/mL.), en unidades de resonancia (UR), encontrados en función del tiempo.
Capítulo 5 83
Figura 5. 19 Ensayo de unión del factor recombiante humano Ang-2. Se muestran los valores de unión de Ang-2 en diferentes diluciones (20, 100, 250, 500 ,1500 y 2500 ng/mL.), en unidades de resonancia (UR), encontrados en función del tiempo.
84 Evaluación de la expresión de factores de crecimiento involucrados en la reparación de heridas mucosas en tejido conectivo mucoso artificial
Figura 5. 20 Ensayo de unión del factor recombiante humano TNF-α. Se muestran los valores de TNF-α unión de en diferentes diluciones (20, 100, 250, 500 ,1500 y 2500 ng/mL.), en unidades de resonancia (UR), encontrados en función del tiempo.
Capítulo 5 85
Figura 5. 21 Ensayo de unión del factor recombiante humano TGF-ß1. Se muestran los valores de unión de TGF-ß1 en diferentes diluciones (20, 100, 250, 500 ,1500 y 2500 ng/mL.), en unidades de resonancia, encontrados en función del tiempo.
86 Evaluación de la expresión de factores de crecimiento involucrados en la reparación de heridas mucosas en tejido conectivo mucoso artificial
Figura 5. 22 Ensayo de unión del factor recombinante humano VEGF. Se muestran los valores de unión de VEGF en diferentes diluciones (20, 100, 250, 500 ,1500 y 2500 ng/mL.), en unidades de resonancia, encontrados en función del tiempo.
5.3.4 Curvas de calibración patrón de los factores recombinantes Una vez inmovilizados los diferente anticuerpos anti-analito, se realizaron los ensayos de
unión específica de cada uno de los factores evaluados. La inyección de cada uno de
ellos se efectuó por triplicado con mínimo seis puntos de dilución, en concentraciones de
20, 100, 250, 500 ,1500 y 2500 ng/mL. Para la elaboración de las curvas de calibración
de los patrones estándar, se hicieron regresiones lineales de los datos utilizando el
programa Origin 8. Los valores correspondientes a cada factor fueron graficados y las
líneas rectas trazadas entre los puntos fueron empleadas para establecer las
concentraciones de los analitos presentes en los medios de cultivo del TCAA a los 3 y 7
días ( Figuras 5.22-5.27 ). Para cada una de las curvas se presenta la ecuación de la
recta, la interpolación en Y, el valor de R2 y el error estándar.
Capítulo 5 87
Figura 5. 23 Curva de calibración factor recombiante humano EGF. En la elaboración de la curva de calibración, se utilizaron diferentes concentraciones del factor (20, 100, 250, 500 ,1500 y 2500 ng/mL.), R2: 0.7885.
88 Evaluación de la expresión de factores de crecimiento involucrados en la reparación de heridas mucosas en tejido conectivo mucoso artificial
Figura 5. 24 Curva de calibración factor recombiante humano IL-4. En la elaboración de la curva de calibración, se utilizaron diferentes concentraciones del factor (20, 100, 250, 500 ,1500 y 2500 ng/mL.). R2: 0.867.
Capítulo 5 89
Figura 5. 25 Curva de calibración factor recombiante humano Ang-2. En la elaboración de la curva de calibración, se utilizaron diferentes concentraciones del factor (20, 100, 250, 500 ,1500 y 2500 ng/mL.). R2: 0.871.
90 Evaluación de la expresión de factores de crecimiento involucrados en la reparación de heridas mucosas en tejido conectivo mucoso artificial
Figura 5. 26 Curva de calibración factor recombiante humanoTNF- α. En la elaboración de la curva de calibración, se utilizaron diferentes concentraciones del factor (20, 100, 250, 500 ,1500 y 2500 ng/mL.). R2: 0.860.
Capítulo 5 91
Figura 5. 27 Curva de calibración factor recombiante humano TGF-ß 1. En la elaboración de la curva de calibración, se utilizaron diferentes concentraciones del factor (20, 100, 250, 500 ,1500 y 2500 ng/mL.). R2: 0.767.
92 Evaluación de la expresión de factores de crecimiento involucrados en la reparación de heridas mucosas en tejido conectivo mucoso artificial
Figura 5. 28 Curva de calibración factor recombiante humano VEGF. En la elaboración de la curva de calibración, se utilizaron diferentes concentraciones del factor (20, 100, 250, 500 ,1500 y 2500 ng/mL.), R2: 0.930.
5.3.5 Cuantificación de los factores en medios de cultivo Las muestras de los medios de cultivo a los días 3 y 7, tanto para TCAA elaborados en
soportes de colágeno con estructuras unidireccionales y multidireccionales, previamente
centrifugadas para eliminar residuos solidos del soporte, fueron inyectadas con diferentes
factores de dilución (1:3) para el tercer día y (1:27) para el séptimo día. El medio de
dilución fue agua destilada.
Capítulo 5 93
Figura 5. 29 Cuantificación del factor recombinante humano (EGF). La figura presenta las concentraciones (µg/mL) de EGF en los medios de TCAA a los 3 y 7 días de cultivo.
Figura 5. 30 Cuantificación de IL-4. La figura presenta las concentraciones (µg/mL) de IL-4 en los medios de TCAA a los 3 y 7 días de cultivo.
0 100 200 300 400 500 600 700
Día 3 Dia 7
µg/m
L
Tiempo de cultivo
Cuantijicación de EGF
0 50 100 150 200 250 300 350 400
Día 3 Día 7
µ/mL
Tiempo de cultivo
Cuantijicación de IL-‐4
94 Evaluación de la expresión de factores de crecimiento involucrados en la reparación de heridas mucosas en tejido conectivo mucoso artificial
Figura 5. 31 Cuantificación factor recombinante humano Ang-2. La figura presenta las concentraciones (µg/mL) de Ang-2 en los medios de TCAA a los 3 y 7 días de cultivo.
Figura 5. 32 Cuantificación factor recombinante humano TNF- α. La figura
presenta las concentraciones (µg/mL) de TNF- α en los medios de TCAA a los 3
y 7 días de cultivo.
0
5
10
15
20
25
30
Día 3 Día 7
µg/m
L
Tiempo de cultivo
Cuantijicación de Ang-‐2
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
3,5
Día 3 Día 7
µg/m
L
Tiempo de cultivo
Cuantijicación de TNF-‐α
Capítulo 5 95
Figura 5. 33 Cuantificación factor recombinante humano TGF-ß 1. La figura muestra las concentraciones (µg/mL) de TGF-ß 1 en los medios de TCAA a los 3 y 7 días de cultivo.
Figura 5.34. Cuantificación factor recombinante humano VEGF. La figura muestra las concentraciones (µg/mL) deVEGF en los medios de TCAA a los 3 y 7 días de cultivo.
0 0,5 1
1,5 2
2,5 3
3,5 4
Día 3 Día 7
µg/m
L
Tiempo de cultivo
Cuantijicación de TGF-‐β1
0 0,2 0,4 0,6 0,8 1
1,2 1,4 1,6
Día 3 Día 7
µg/m
L
Tiempo de cultivo
Cuantijicación de VEGF
Capítulo 5 97
6. Discusión
Ante la pérdida de la mucosa de revestimiento de la cavidad oral por diferentes motivos:
y síntesis de proteínas de la matriz extracelular; en este momento los fibroblastos
sembrados comienzan a adherirse a la matriz de colágeno tipo I (Rumalla 2001; Werner 2003;
Enoch S 2008; Kornacker M. 2008).
La cuantificación en tiempo real de los factores, fue posible gracias a la tecnología de los
biosensores, novedosa en nuestro país. Aunque los coeficientes de correlación sugieren
variabilidad, el error estándar calculado con el programa Origin 8 indicó que el nivel de
confianza de las cuantificaciones era aceptable. En consecuencia, en este trabajo se
estandarizó una metodología de cuantificación con un biosensor óptico tipo SPR, de
factores proteicos presentes en el medio de cultivo de TCAA que intervienen en el cierre
de heridas mucosa. La cantidad de ligandos (anticuerpos anti-factores) inmovilizada
sobre la superficie del chip CM5, estuvo entre las 7000 y 14500 unidades de resonancia,
comparable con lo reportado en otros estudios (Wong M. S 1999; Pflegerl K 2001).
Capítulo 5 101
En los ensayos de regeneración de la superficie de los chips realizados en este estudio,
no se logró la regeneración con la solución recomendada por el fabricante (10 mM
glicina-HCl, pH 2,5), razón por la cual fue necesario realizar el test de regeneración
propuesto por Andersson y colaboradores en 1999, probando diferentes soluciones
escogidas dependiendo de la naturaleza química de los ligandos. La estabilidad del
sistema establecido se demuestra con la prueba de rendimiento de superficie en la que la
línea de base se mantiene constante entre cada ciclo.
En nuestros ensayos encontramos y cuantificamos factores que no se detectaron con el
sistema de microarreglos (método cualitativo), como el TGF ß1 en el TCAA a los 7 días
de incubación, en concentración de 0 a 3 µg/mL. Por otro lado se corroboró la presencia
de factores angiogénicos como el VEGF y Angiopoyetina 2, en todas las muestras
evaluadas al séptimo día en rangos de 0.3 a 0.5µg/mL y 14 a 18 µg/mL, respectivamente,
mientras que al tercer día no hubo una concentración de factores muy alta. El
establecimiento de una metodología para la cuantificación de factores proteicos solubles
en medios de cultivo, realizada en este trabajo, permitirá desarrollar futuros ensayos en
trabajos del grupo y de otros grupos que se quieran beneficiar de la metodología
estandarizada.
7. Conclusiones y recomendaciones
7.2. Conclusiones
• El tejido conjuntivo artificial autólogo ( TCAA ) expresa factores de crecimiento y
citoquinas involucradas en el proceso de cicatrización de heridas mucosas,
posiblemente regulando por acción paracrina y autocrina las fases de inflamación,
angiogénesis, reepitelización y remodelación de la matriz extracelular.
• El perfil de los factores secretados en el medio de cultivo del TCAA depende del
tiempo de incubación.
• El TCAA actúa en el momento de ser injertado ( 7 días de incubación) como un
tejido activo que aporta señales bioquímicas.
• Mediante la tecnología de los biosensores se pueden cuantificar en tiempo real los
factores proteicos solubles secretados por los fibroblastos que hacen parte del
TCAA.
104 Evaluación de la expresión de factores de crecimiento involucrados en la reparación de heridas mucosas en tejido conectivo mucoso artificial
7.2. Recomendaciones
• Evaluar la cinética de secreción de citoquinas pro-inflamatorias y anti-inflamatorias de
las heridas injertadas y del TCAA antes de ser injertado.
• Determinar in situ, el perfil de factores autocrinos y paracrinos que se producen en
heridas injertadas con TCAA y con SC.
• Evaluar si parámetros, como la composición y las características microestructurales
de los soportes, influyen en los perfiles de secreción y en el tipo de cicatrización de la
herida.
• Identificar y cuantificar mediante el uso del Biosensor SPR el perfil de secreción de
factores y citoquinas en TCAA elaborado en soportes de colágeno con diferente
microestructura.
A. Anexo A: Reactivos utilizados
Reactivos Elaboración de soportes de Colágeno Tipo I (SC) y Tejido Conectivo Artificial Autólogo (TCAA).
NaOH 1 M Merck
ácido acético 0,1M Suero Fetal Bovino (SFB) Sigma Chemical Co piruvato de sodio 1% Life Technologies) soluciones de colágeno (2mg/mL), medio DMEM Gibco, Invitrogen
Detección de los factores de crecimiento y citoquinas en los sobrenadantes de los cultivos de TCAA.
estreptavidina-peroxidasa de rábano (HRP). RayBiotech,
biotina. Buffer de detección RayBiotech, ácido bicinconínico Sigma Chemical Co
Albúmina de suero bovino, 0,5 mg/mL Sigma Chemical Co
Cuantificación de los factores de crecimiento y citoquinas
Thermo Scientific Brand Products, Rochester, NY, USA
Cabina de lujo laminar Thermo scientific
Incubadora Incub Safe
Microscopio Zeiss Balanza analítica Sartoriuos
Agitador CAT VM4
digitalizador de imágenes U
Genius (Syngene Laboratories, Frederick, MD, USA
Potenciómetro Sartorious
Biosensor Optico SPR 100 BIACORE
Centrífuga Beckman GP
Micropipetas
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