REPLIKACIJA, ODRAVANJE I REARANIRANJE GENOMSKE DNA
REPLIKACIJA, ODRAVANJE I PRESLAGIVANJE GENOMSKE DNA
Osnovni bioloki proces razmnoavanja zahtijeva vjerni prijenos
genske informacije s roditelja na potomstvo. Zbog toga je tona
replikacija genomske DNA kljuna za ivot svih stanica i organizama.
Svaki puta kada se stanica dijeli, njen cjelokupni genom mora biti
udvostruen, pri emu je za kopiranje velikih DNA molekula koje
izgrauju prokariotske i eukariotske kromosome potrebno prisutsvo
cijelog niza enzima. Uz to, stanice su razvile mehanizme za
popravljanje pogreaka koje se ponekad dogaaju za vrijeme umnaanja
DNA te za popravak oteenja koja nastaju kao rezultat djelovanja
imbenika okolia kao to je zraenje. Nepravilnosti u ovim procesima
rezultiraju nemogunou tone replikacije i odravanja genomske DNA
grekom koja moe imati katastrofalne poslijedice kao to je razvoj
karcinoma.
Unato vanosti precizne replikacije i odravanja DNA, stanini
genomi su ipak podloni promjenama. Da bi se vrste evolucijski
razvijale, potrebno je prisutstvo mutacija i preslagivanja gena
kako bi se odrala genetika varijabilnost izmeu jedinki.
Rekombinacija homolognih kromosoma za vrijeme mejoze igra vanu
ulogu u ovom procesu dozvoljavajui roditeljskim genima da
preslagivanjem (rearanmanom) stvaraju nove kombinacije u narednim
generacijama. Smatra se da preslagivanjesljedova DNA unutar genoma
stvaranjem novih kombinacija genetikih informacija takoer doprinosi
evolucijskom razvoju. Uz to su neki oblici preslagivanja DNA
programirani za regulaciju ekspresije gena tijekom diferencijacije
i razvoja individualnih stanica i organizama. Karakteristian
primjer tog procesa kod ljudi predstavlja preslagivanje
imunoglobulinskih gena tijekom razvoja imunolokog sustava. Stoga je
za razvoj pojedinanih organizama kao i za evoluciju vrsta potrebna
suptilna ravnotea izmeu odravanja i varijabilnosti naslijednih
informacija.
5.1 Replikacija DNA
Kao to je navedeno u treem poglavlju, replikacija DNA
predstavlja semikonzervativni proces u kojem svaki roditeljski
lanac slui kao kalup za sintezu novih, komplementarnih lanaca keri.
Glavni enzim ukljuen u ovaj proces je DNA-polimeraza koja
katalizira spajanje deoksiribonukleozid 5'-trifosfata (dNTP-a)
rastueg DNA lanca. Ipak, DNA replikacija je znatno kompleksnija i
zahtijeva vie od jedne enzimske reakcije. U cjelokupan proces su
ukljueni brojni drugi proteini, a nuna je i prisutnost korigirajuih
mehanizma kako bi se osiguralo da tonost replikacije bude
kompatibilna s malom uestalou pogreaka to je potrebno za normalno
odvijanje stanine reprodukcije. Dodatni proteini, kao i specifini
DNA sljedovi, potrebni su i za inicijaciju replikacije i kopiranje
krajeva eukariotskih kromosoma.
5.1.1 DNA-polimeraze
DNA-polimerazu prvi je otkrio Arhtur Kornberg 1956. u lizatima
bakterije E.coli. Sposobnost ovog enzima da tono kopira DNA kalup
pruila je biokemijsku podlogu za model replikacije DNA molekule
kojeg su prvotno predloili Watson i Crick, tako da njena izolacija
predstavlja jedno od temeljnih otkria molekularne biologije.
Ironino, prva identificirana DNA-polimeraza (danas zvana polimeraza
I) nije glavni enzim odgovoran za replikaciju DNA E.coli. Umjesto
toga danas znamo da i prokariotske i eukariotske stanice sadre
nekoliko DNA-polimeraza koje imaju razliite uloge u replikaciji i
popravku DNA.
Viestrukost DNA-polimeraza prvi put je otkrivena izolacijom
mutantnog soja E.coli s nedostatkom polimeraze I (slika 5.1).
Kulture E.coli tretitane su kemijskim imbenikom (mutagen) koji
inducira veliku uestalost mutacija, nakon ega su izolirane i
ispitane pojedinane bakterijske kolonije kako bi se identificirao
mutirani soj s nedostatkom polimeraze I. Analiza nekoliko tisua
kolonija dovela je do izolacije eljenog mutanta kojemu je gotovo u
potpunosti nedostajala aktivost polimeraze I. Zaudo, mutirana
bakterija rasla je normalno to je vodilo do zakljuka da polimeraza
I nije potrebna za replikaciju DNA. S druge strane, mutirane
bakterije bile se iznimno osjetljive na imbenike koji oteuju DNA
(primjerice UV zraenje) ukazujui na to da je polimeraza I ukljuena
prvenstveno u popravak DNA oteenja, a ne u replikaciju DNA per
se.
Zakljuak da polimeraza I nije potrebna za replikaciju implicirao
je da E.coli mora sadravati druge DNA-polimeraze te su naknadni
eksperimenti doveli do identifikacije dva enzima, danas poznatih
kao DNA-polimeraza II i III. Potencijalna uloga ovih enzima
ispitana je izolacijom odgovarajuih mutanata. Pokazalo se da sojevi
E.coli s mutacijom polimeraze II rastu normalno, a uloga ovoga
enzima u posebnom obliku popravka DNA sklonom pogrekama (prikazanom
u odjeljku ''Popravak DNA'') tek je nedavno utvrena. Nasuprot tome,
temperaturno osjetljivi mutanti s nedostatkom polimeraze III nisu
bili u mogunosti replicirati svoju DNA pri visokoj temperaturi, a
daljnje studije su potvrdile da je polimeraza III glavni
replikacijski enzim E.coli.
Danas je poznato da je za replikaciju DNA E.coli uz polimerazu
III potrebna i prisutnost polimeraze I. Prvotno opisani mutant za
polimerazu I nije bio u potpunosti deficitaran za taj enzim, a
daljnji eksperimenti pokazali su da prisutna aktivnost polimeraze I
u tom soju igra kljunu ulogu u replikacijskom procesu. Replikacija
DNA E.coli prema tome ukljuuje dvije razliite DNA-polimeraze ije su
specifine uloge raspravljene u daljnjem tekstu.
Eukariotske stanice sadre pet tipinih DNA-polimeraza: (, (, (, (
i (. Polimeraza ( se nalazi u mitohondrijima i odgovorna je za
replikaciju mitohondrijske DNA. Preostala etiri enzima smjetena su
u jezgri i stoga je bilo opravdano vjerovati da su ukljueni u
replikaciju jezgrine DNA. Polimeraze (, ( i ( najaktivnije su u
stanicama koje se dijele, to sugerira njihovu ulogu za vrijeme
replikacije. Nasuprot tome, polimeraza ( i ( podjednako su aktivne
i u stanicama koje se dijele i u onima koje se ne dijele, to je u
skladu s njihovom funkcijom u popravku DNA oteenja.
Dva tipa eksperimenata pruila su daljnje dokaze koji ukazuju na
uloge polimeraza (, ( i ( u procesu replikacije DNA. Prvo,
replikacija DNA nekih animalnih virusa poput SV40 moe se prouavati
u bezstaninim (od engl. cell-free) ekstraktima. Prouavanje
replikacije in vitro omoguilo je izravnu identifikaciju odgovornih
enzima, a analiza takvih bezstaninih sustava pokazala je da su
polimeraze ( i ( nune za replikaciju DNA virusa SV40. Drugo,
polimeraze (, ( i ( naene su u kvascima kao i u stanicama sisavaca
to je omoguilo direktno testiranje njihovih biolokih uloga na
modelu kvasaca (vidi poglavlje 3). Studije genetike kvasaca ukazuju
da su mutanti kvasaca s nedostatkom bilo kojeg od tri navedena
enzima nesposobni za proliferaciju implicirajui kritinu ulogu
polimeraze ( kao i polimeraze ( i ( u replikaciji DNA. Ipak,
daljnje studije su pokazale da esencijalna funkcija polimeraze ( u
kvascima ne zahtijeva njezino enzimsko djelovanje u svojstvu
DNA-polimeraze. Stoga, uloga polimeraze ( u replikaciji DNA ostaje
nejasna iako je mogue da funkcionira slino kao i polimeraza ( koja
moe katalizirati DNA replikaciju u odsutnosti polimeraze (, kako u
bezstaninim sustavima tako i u intaktnim kvascima.
Sve poznate DNA-polimeraze dijele dva osnovna svojstva koja su
od presudne vanosti za replikaciju DNA (slika 5.2). Prvo, sve
polimeraze sintetiziraju DNA samo u 5' ( 3' smjeru dodajui dNTP na
3' hidroksilnu skupinu rastueg lanca. Drugo, DNA-polimeraze mogu
dodati nove dNTP samo na prethodno formirani lanac poetnice koji je
vodikovim vezama spojen s kalupom - one nisu u mogunosti zapoeti
sintezu DNA de novo katalizirajui polimerizaciju slobodnih
dNTP-ova. S obzirom na to, DNA-polimeraze se razlikuju od RNA
polimeraza koje mogu zapoeti sintezu novog RNA lanca u odsustvu
poetnice. Kao to je opisano dalje u ovom poglavlju, navedene
karakteristike DNA-polimeraza ine se kljunima za odravanje visoke
vjernosti DNA replikacije potrebne za razmnoavanje stanica.
5.1.2 Replikacijske ralje
DNA molekule u procesu replikacije prvi je analizirao John
Cairns u eksperimentima u kojima je E. coli uzgajana u prisutnosti
radioaktivnog timidina to dozvoljava naknadnu vizualizaciju
novoreplicirane DNA pomou autoradiografije (slika 5.3). U nekim
sluajevima mogue je opaziti kompletne krune molekule u procesu
replikacije. Ove DNA molekule sadre dvije replikacijske ralje koje
predstavljaju podruja DNA sinteze. U svakim raljama roditeljski
lanci DNA molekule su razdvojeni i sintetiziraju se dva nova lanca
keri.
Sinteza novih DNA lanaca komplementarnih roditeljskim lancima
DNA molekule postavlja vaan problem za razumijevanje biokemijskih
procesa ukljuenih u replikaciju DNA. Budui da lanci dvolanane DNA
uzvojnice teku u suprotnim (antiparalelnim) smjerovima,
kontinuirana sinteza dvaju novih lanaca u replikacijskim raljama
zahtijevala bi da jedan lanac bude sintetiziran u 5' ( 3' smjeru,
dok se drugi sintetizira u suprotnom (3' ( 5') smjeru. No,
DNA-polimeraza katalizira polimerizaciju dNTPa samo u 5' ( 3'
smjeru. Kako se onda vri sinteza drugog DNA lanca?
Ova enigma rijeena je eksperimentima koji pokazuju da se samo
jedan lanac DNA molekule sintetizira kontinuirano u smjeru
sveukupne DNA replikacije dok se drugi formira iz kratkih
diskontinuiranih ulomaka DNA (1-3 kb) koji se sintetiziraju unatrag
u odnosu na smjer kretanja replikacijskih ralji (slika 5.4). Ovi
mali ulomci novosintetizirane DNA (prema njihovom otkrivau, nazvani
Okazakijevi fragmenti) spajaju se djelovanjem DNA-ligaze stvarajui
cjeloviti novi DNA lanac. Kontinuirano sintetizirani lanac naziva
se vodei lanac jer njegovo produljenje u smjeru kretanja
replikacijskih ralji izlae kalup koji se koristi za sintezu
Okazakijevih fragmenata drugog novog takozvanog zaostajueg ili
tromog lanca.
Premda otkrie diskontinuirane sinteze tromog lanca daje
mehanizam za produljenje oba DNA lanaca u replikacijskim raljama,
ono postavlja sljedee pitanje: budui da DNA-polimeraza zahtijeva
poetnicu i ne moe zapoeti sintezu de novo, kako zapoinje sinteza
Okazakijevih fragmenata? Odgovor je da kratki fragmenti RNA slue
kao poetnice za DNA replikaciju (slika 5.5).
Nasuprot DNA sintezi, sinteza RNA moe zapoeti de novo, a enzim
zvan primaza sintetizira kratke fragmente RNA (primjerice dugake
3-10 nukleotida) komplementarne kalupu tromomog lanca u
replikacijskim raljama. Okazakijevi fragmenti se zatim
sintetiziraju produljenjem ovih RNA poetnica djelovanjem
DNA-polimeraze. Otkrie RNA-DNA spojeva u novosintetiziranim
Okazakijevim fragmentima pruilo je kljuni dokaz za ulogu RNA
poetnica u replikaciji DNA.
Da bi se formirao kontinuirani zaostajui (tromi) lanac DNA, RNA
poetnice se moraju na kraju ukloniti iz Okazakijevih fragmenata i
zamijeniti s DNA sljedovima. Kod E.coli RNA poetnice se uklanjaju
kombiniranim djelovanjem RNaze H, enzima koji degradira RNA lanac
RNA-DNA hibrida, i polimeraze I. Ovo je aspekt DNA replikacije u
E.coli u kojem DNA-polimeraza I igra kljunu ulogu. Uz njenu
DNA-polimeraznu aktivnost, polimeraza I djeluje kao egzonukleaza
koja moe hidrolizirati DNA (ili RNA) ili u 3' ( 5' ili u 5' ( 3'
smjeru. 5' ( 3' egzonukleazna aktivnost polimeraze I uklanja
ribonukleotide s 5' kraja Okazakijevih fragmenata te se oni
zamjenjuju s deoksiribonukleotidima kako bi se stvorili fragmenti u
potpunosti graeni od DNA sljedova (slika 5.6). U eukariotskim
stanicama umjesto polimeraze I poetnice uklanja druga egzonukleaza,
a pukotine izmeu Okazakijevih fragmenata popunjavaju se djelovanjem
polimeraze (. Kao i kod prokariota ovi DNA fragmenti spajaju se
zatim djelovanjem DNA-ligaze.
Vidljivo je da u replikacijskim raljama razliite DNA-polimeraze
igraju zasebne uloge (slika 5.7). U prokariotskim stanicama, glavna
replikacijska polimeraza je polimeraza III koja vri sintezu i
vodeeg lanca DNA i Okazakijevih fragmenata produljenjem RNA
poetnica. Polimeraza I zatim uklanja RNA poetnice i ispunjava
pukotine izmeu Okazakijevih fragmenata. U eukariotskim stanicama,
polimeraza ( pronaena je u kompleksu s primazom te se ini da
zajedno s njom sudjeluje u sintezi kratkih RNA-DNA fragmenata
tijekom sinteze tromog lanca. Polimeraza ( moe zatim izvriti
sintezu i vodeeg i tromog lanca produavanjem DNA poetnica prvotno
sintetiziranih djelovanjem kompleksa polimeraza (-primaza. Uz to,
polimeraza ( moe nakon ukanjanja poetnica zauzeti mjesto polimeraze
I E.coli u popunjavanju pukotina izmeu Okazakijevih fragmenata.
Premda uloga polimeraze ( jo nije u potpunosti shvaena, njezino je
djelovanje , ini se, slino djelovanju polimeraze (.
Uz polimeraze i primaze, u replikacijskim raljama aktivan je
itav niz drugih proteina. Ti dodatni proteini identificirani su
podjednako analizom mutanata E.coli defektnih za replikaciju DNA
kao i proiavanjem proteina iz sisavaca, potrebnih za in vitro
replikaciju SV40 DNA. Jedna skupina tih proteina potrebnih za
replikaciju vee se za DNA-polimeraze pojaavajui njihovu aktivnost i
zadravajui ih vezanima uz DNA kalup kako bi nastavile sintezu novog
DNA lanca. Polimeraza III E.coli i eukariotske polimeraze ( i (
zdruene su s dvije vrste pomonih proteina (proteinima kliue
stezaljke, engl. sliding-clamp proteins, i proteinima za stavljanje
stezaljke, engl. clamp-loading proteins) koji postavljaju
polimerazu na poetnicu i odravaju njenu stabilnu povezanost s
kalupom (slika 5.8). Proteini za stavljanje stezaljke (u E.coli
nazvani ( kompleks, a u eukariotima replikacijski faktor C, RFC)
specifino prepoznaju i veu DNA na mjestu spajanja poetnice i
kalupa. Proteini kliue stezaljke (( protein E.coli i proliferativni
stanini jezgrin antigen, PCNA, engl. proliferating cell nuclear
antigen) veu se na protein za stavljanje stezaljke i stvaraju
prsten oko DNA kalupa. Proteini kliue stezaljke smjetaju zatim
DNA-polimerazu u DNA na mjesto spajanja poetnice i kalupa. Prsten
stvoren proteinima kliue stezaljke odrava zdruenost polimeraze s
njezinim kalupom tijekom replikacijskog procesa dozvoljavajui
neometanu ugradnju vie tisua nukleotida u novosintetizirani DNA
lanac.
Drugi proteini razmotavaju DNA kalup i stabiliziraju jednolanana
podruja (slika 5.9). Helikaze su enzimi koji kataliziraju
razmotavanje roditeljske DNA ispred replikacijskih ralji to je
povezano s hidrolizom ATP-a. Proteini koji veu jednolananu DNA
(engl. single stranded DNA-binding proteins, primjerice eukariotski
replikacijski faktor A, RFA) nakon toga stabiliziraju razmotani DNA
kalup odravajui ga u ispruenom jednolananom stanju kako bi se mogao
kopirati djelovanjem polimeraze.
Dok se lanci roditeljske DNA razmataju, DNA ispred
replikacijskih ralji je prisiljena na rotaciju. Nekontrolirana
rotacija dovela bi do toga da se krune DNA molekule (poput SV40 DNA
i kromosoma E.coli) omotaju same oko sebe to bi na kraju blokiralo
proces replikacije (slika 5.10). Ovaj problem rijeen je djelovanjem
topoizomeraza, enzima koji kataliziraju reverzibilno cijepanje i
ponovno spajanje DNA lanaca. Postoje dvije vrste ovih enzima:
topoizomeraze tipa I cijepaju samo jedan lanac DNA, dok
topoizomeraze tipa II istovremeno cijepaju oba lanca. Prekidi
nastali djelovanjem topoizomeraza slue kao osi koje dozvoljavaju da
se dva lanaca DNA kalupa slobodno rotiraju jedan oko drugoga tako
da se replikacija moe nastaviti bez uvijanja DNA ispred
replikacijskih ralji (slika 5.10). Premda su eukariotski kromosomi
graeni od linearnih, a ne krunih DNA molekula, njihova replikacija
takoer zahtijeva djelovanje topoizomeraza jer bi se u suprotnom
kompletni kromosomi morali kontinuirano rotirati za vrijeme DNA
sinteze.
Topoizomeraza tipa II potrebna je ne samo za razmotavanje DNA ve
i za razmotavanje novorepliciranih krunih DNA molekula koje su
postale meusobno isprepletene. ini se da je topoizomeraza tipa II u
eukariotskim stanicama takoer ukljuena u kondenzaciju mitotskih
kromosoma. Ispitivanja mutanata kvasaca, kao i eksperimenti na
vonoj muici (Drosophila) te stanicama sisavaca, ukazuju da je
topoizomeraza II potrebna za razdvajanje kromatida keri u mitozi
sugerirajui njenu funkciju u razmotavanju novorepliciranih petlji
DNA eukariotskih kromosoma.
Enzimi ukljueni u DNA replikaciju djeluju na koordiniran nain
sintetizirajui istovremeno vodei i zaostajui lanac DNA u
replikacijskim raljama (slika 5.11). Ovaj zadatak postie se
stvaranjem dimera replikativnih DNA-polimeraza (polimeraza III kod
E.coli ili polimeraze (/( kod eukariota) od kojih svaka sadri i
odgovarajue pratee proteine. Jedna molekula polimeraze tada
sintetizira vodei lanac dok druga djeluje u sintezi tromog lanca.
Smatra se da zaostajui lanac stvara petlju u replikacijskim raljama
tako da se podjedinica polimeraze ukljuena u sintezu tromog lanca
kree u istom sveukupnom smjeru kao druga podjedinica koja
sintetizira vodei lanac.
5.1.3 Vjernost replikacije
Preciznost umnaanja DNA kritina je za stanino razmnoavanje, a
procjena mutacijskih stopa za razliite gene ukazuje da uestalost
greaka tijekom replikacije odgovara samo jednoj pogrenoj bazi na
svakih 109 do 1010 ugraenih nukleotida. Ova uestalost greaka znatno
je manja od one koja bi se mogla predvidjeti samo na osnovu
komplementarnosti sparivanja baza. Konkretno, razlika u slobodnoj
energiji koja proistjee iz promjena u sparivanju vodikovim vezama
izmeu korektno i nekorektno sparenih baza iznosi tek toliko da
favorizira stvaranje komplementarnog baznog para za svega tisuu
puta. Zbog toga bi izbor baza reguliran samo sparivanjem vodikovim
vezama na temelju komplementarnosti rezultirao uestalou greaka koja
odgovara ugradnji otprilike jedne pogrene baze na svakih 103
nukleotida. Mnogo vei stupanj vjernosti replikacije koji se ustvari
postie proistjee uglavnom iz aktivnosti DNA-polimeraze.
Jedan od mehanizama kojim DNA-polimeraza poveava vjernost
replikacije je taj da pomae u izboru odgovarajue baze za ugradnju u
novosintetizirani lanac. Polimeraza ne katalizira ugradnju bilo
kojeg nukleotida koji je vodikovim vezama povezan s lancem kalupa.
Umjesto toga, ona aktivno diskriminira ugradnju pogrene baze
prilagoavajui se konformaciji komplementarnog baznog para. Nedavna
ispitivanja stukture nekoliko DNA-polimeraza ukazuju na to da
vezanje korektno sparenih dNTP-ova inducira konformacijske promjene
u DNA-polimerazi koje dovode do ugradnje nukleotida u DNA. Izgleda
da sposobnost DNA-polimeraze da favorizira ugradnju pravilno
sparenih nukleotida poveava preciznost replikacije za oko tisuu
puta smanjujui time oekivanu uestalost greaka sa 10-3 na oko 10-6
puta.
Drugi glavni mehanizam odgovoran za preciznost DNA replikacije
je korigirajua (proofreading) aktivnost DNA-polimeraze. Kao to je
ve spomenuto, polimeraza I iz E.coli posjeduje 3'(5' kao i 5'(3'
egzonukleaznu aktivnost. 5'(3' egzonukleaza djeluje u smjeru DNA
sinteze i pomae u uklanjanju RNA poetnica iz Okazakijevih
fragmenata. 3'(5' egzonukleaza djeluje u suprotnom smjeru od smjera
DNA sinteze i sudjeluje u tonom oitavanju novosintetiziranog lanca
(slika 5.12). Korekcija je efikasna jer DNA-polimeraza zahtijeva
prisutnost poetnica i nije u stanju zapoeti sintezu de novo.
Tijekom sinteze radije e se koristiti one poetnice koje su
vodikovim vezama sparene s kalupom. Kada doe do ugradnje pogrene
baze vrlo je vjerojatno da e se ona ukloniti 3'(5' egzonukleaznom
aktivnou, a ne iskoristiti za nastavak sinteze. 3'(5' egzonukleazna
aktivnost DNA-polimeraze I povezana je s 3'(5' egzonukleaznom
aktivnou polimeraze III iz E.coli i eukariotskih polimeraza ( i (
koja selektivno isjeca nepravilno sparene baze ugraene na kraj
rastueg DNA lanca poveavajui time vjernost replikacije za oko sto
do tisuu puta.
Vanost korektnog oitavanja novosintetiziranog lanca moe
objasniti zato DNA-polimeraze zahtijevaju prisutnost poetnica i
kataliziraju rast lanaca DNA samo u 5'(3' smjeru. Kada se DNA
sintetizira u 5'(3' smjeru energija potrebna za polimerizaciju
proistjee iz hidrolize 5' trifosfatne skupine slobodnog dNTP-a dok
se isti dodaje na 3' hidroksilnu skupinu rastueg lanca (vidi sliku
5.2). Nasuprot tome, kada bi se DNA produivala u 3'(5' smjeru,
energija polimerizacije morala bi potjecati iz hidrolize 5'
trifosfatne skupine terminalnih nukleotida ve ugraenih u DNA. To bi
onemoguilo korektno oitavanje zbog toga to ukanjanje nepravilno
sparenog terminalnog nukleotida takoer uklanja 5' trifosfatnu
skupinu potrebnu kao izvor energije za daljnje produenje lanca.
Prema tome, iako sposobnost DNA-polimeraze da vri produenje
poetnice samo u 5'(3' smjeru ini replikaciju naizgled
kompliciranom, ona je neophodna da bi osigurala precizno umnaanje
genetikog materijala.
Uz sposobnost da razlikuje ugradnju pogreno sparene baze,
korigirajua aktivnost DNA-polimeraze dovoljna je da smanji
uestalost greaka replikacijskog procesa na otprilike jednu pogreno
sparenu bazu na svakih 109 ugraenih nukleotida. Kako bi se uklonile
pogreno sparene baze ugraene u novosintetiziranu DNA, djeluju
dodatni mehanizmi (prikazani u odjeljku ''Popravak DNA''),
osiguravajui time jo veu vjernost umnaanja genske informacije.
5.1.4 Ishodite i inicijacija replikacijeUmnaanje prokariotskih i
eukariotskih DNA zapoinje na jedinstvenom mjestu zvanom ishodite
replikacije koje slui kao specifino vezno mjesto za proteine koji
iniciraju proces replikacije. Prvo ishodite replikacije opisano je
u E.coli. Prvo je otkriveno da umnaanje uvijek zapoinje na
jedinstvenom mjestu bakterijskog kromosoma, a detaljnije analize su
pokazale da je ishodite replikacije graeno od 245 parova baza iji
djelovi slue kao vezna mjesta za proteine potrebne za inicijaciju
DNA replikacije (slika 5.13). Kljuni korak predstavlja vezanje
inicijacijskog proteina za specifini nukleotidni slijed unutar
ishodita ime zapoinje razmatanje dvostrukog heliksa. Osim toga,
inicijacijski protein regrutira i druge poteine ukljuene u sintezu
DNA. Nakon toga helikaza i proteini koji veu jednolananu DNA
djeluju u daljnjem razmotavanju DNA kalupa, a primaza zapoinje
sintezu vodeeg lanca. Formira se dvoje replikacijskih ralji u
kojima sinteza tee u suprotnim smjerovima uzdu krunog kromosoma
E.coli.
Prouavanje ishodita replikacije nekoliko animalnih virusa kao to
je SV40 posluilo je kao model za istraivanje inicijacije DNA
sinteze u eukariota. Ovaj virus posjeduje jedno ishodite
replikacije (graeno od 64 parova baza) koje funkcionira i u
inficiranim stanicama i u bezstaninim sustavima. Replikaciju
zapoinje T antigen - protein kodiran virusnim genomom - koji se vee
za ishodite replikacije i istovremeno djeluje kao helikaza. Za
stabilizaciju razmotanog kalupa potrebno je prisutstvo proteina
koji se vee za jednolananu DNA, a zatim kompleks DNA-polimeraza ( -
primaza zapoinje sintezu DNA.
Premda su jednostruka ishodita dovoljna za replikaciju
bakterijskih i virusnih genoma, za replikaciju mnogo veih genoma
eukariotskih stanica unutar prihvatljivog vremenskog perioda
potrebno je prisutsvo viestrukih ishodita replikacije. Tako se
primjerice sveukupni genom E.coli (4 x 106 parova baza) replicira
iz jednostrukog ishodita za otprilike 30 minuta. Kada bi se genom
sisavaca (3 x 109 parova baza) replicirao istom brzinom iz jednog
ishodita za replikaciju DNA bilo bi potrebno oko 3 tjedna (30 000
minuta). Takoer je poznato da je brzina replikacije DNA u stanicama
sisavaca ustvari oko deset puta manja nego u E.coli, vjerojatno
radi pakiranja eukariotske DNA u kromatin. Unato tome, genomi
stanica sisavaca uglavnom se repliciraju unutar nekoliko sati, to
zahtijeva koritenje vie tisua replikacijskih ishodita.
Prisutstvo viestrukih ishodita replikacije u eukariotskim
stanicama prvi put je pokazano izlaganjem kulture stanica sisavaca
radioaktivnom timidinu unutar razliitih vremenskih intervala to je
praeno autoradigrafijom kako bi se detektirala novosintetizirana
DNA. Rezultati takvih ispitivanja ukazuju da DNA sinteza zapoinje
na vie mjesta iz kojih se zatim nastavlja u oba smjera uzdu
kromosoma (slika 5.14). Ishodita replikacije u stanicama sisavaca
meusobno su udaljena za otprilike 50 do 300 kb - prema tome humani
genom ima oko 30 000 replikacijskih ishodita. Genomi jednostavnijih
eukariota takoer posjeduju viestruka ishodita; tako primjerice
replikacija u kvascima zapoinje u ishoditima meusobno udaljenim oko
40 kb.
Ishodita replikacije eukariotskih kromosoma prvi put su
prouavana u kvascu S.cerevisiae u kojem su identificirani kao
slijedovi koji podupiru replikaciju plazmida u transformiranim
stanicama (slika 5.15). To je ujedno bio funkcionalni test za ove
slijedove i do sada je izolirano nekoliko takvih elemenata (zvani
autonomno replicirajui slijedovi ili ARS). Njihova uloga kao
ishodita replikacije potvrena je direktnom biokemijskom analizom ne
samo u plazmidima ve i u kromosomskoj DNA kvasaca.
Funkcionalni ARS elementi obuhvaaju oko 100 parova baza,
ukljuujui slijed dug 11 parova baza koji je prisutan u mnogim
razliitim ARS elementima (slika 5.16). Ovaj izvorni slijed (engl.
core sequence) nuan je za funkciju ARS elemenata te predstavlja
vezno mjesto za proteinski kompleks (zvan kompleks ishodita
replikacije ili ORC od engl. origin replication complex) koji je
potreban za inicijaciju DNA replikacije u ishoditima S.cerevisiae.
ini se da ORC kompleks regrutira druge proteine prema ishoditu
(ukljuujui DNA-helikazu), to dovodi do inicijacije replikacije.
Mehanizam zapoinjanja DNA replikacije u S.cerevisiae prema tome
izgleda slian onome u prokariotskim i eukariotskim virusima -
inicijacijski protein se specifino vee za nukleotidni slijed
ishodita replikacije.
Daljnja ispitivanja su pokazala da je uloga ORC proteina kao
inicijatora replikacije konzervirana u svim eukariotima od kvasaca
do sisavaca. Ipak, ishodita replikacije drugih eukariota znatno su
manje definirana od ARS elemenata S. cerevisiae. Ishodita
replikacije u genomu S. pombe nalaze se unutar nukleotidnog sljeda
dugog 1 kb. Ona nemaju jasno definiranih ORC veznih mjesta kao to
su ARS elementi S. cerevisiae ali sadre ponavljajue sljedove bogate
AT bazama koji vjerojatno slue kao vezno mjesto za ORC kompleks.
Otkriveno je da ishodite replikacije vone muice obuhvaa preko 2 kb
dugi nukleotidni sljed te da sadri nekoliko ORC veznih mjesta ije
sekvence jo nisu poznate. Kod sisavaca je lokalizirano nekoliko
ishodita u podrujima genoma koja obuhvaaju nekoliko kilobaza. U
drugim sluajevima, replikacija moe zapoeti u viestrukim ishoditima
s velikom ''inicijacijskom zonom'' koja obuhvaa 10-50 kb. Stoga se
ini da sekvence koje definiraju ishodite replikacije znatno
variraju unutar eukariota iako je uloga ORC proteina kao
inicijatora replikacije vrlo konzervirana.
5.1.5 Telomere i telomeraze: umnaanje krajeva kromosoma
Budui da DNA-polimeraze produuju poetnice samo u 5'(3' smjeru,
one ne mogu kopirati krajnje 5' djelove linearnih DNA molekula.
Zbog toga su za replikaciju terminalnih sljedova linearnih
eukariotskih kromosoma potrebni posebni mehanizmi. Terminalni
djelovi kromosoma (telomere) graeni su od uzastopnih ponavljanja
jednostavnih DNA sljedova (vidi poglavlje 4). Telomere se odravaju
djelovanjem posebnog enzima, zvanog telomeraza, koji je sposoban
replicirati krajnje DNA sljedove u odsutnosti DNA kalupa.
Telomeraza je reverzna-transkriptaza, tip DNA-polimeraze koji
sintetizira DNA uz pomo RNA kalupa, a prvi je puta otkrivena u
retrovirusima (vidi poglavlje 3). Vano je napomenuti da je
telomeraza enzimski kompleks koji sadri svoj vlastiti RNA kalup
komplementaran s ponavljajuim telomernim sljedovima kromosoma.
Koritenje RNA kalupa omoguuje telomerazi da stvori viestruke kopije
ponavljajuih sljedova telomera odravajui ih na taj nain u odsustvu
konvencionalnog DNA kalupa.
Mehanizam telomerazne aktivnosti objasnili su 1985. godine Carol
Greider i Elizabeth Blackburn prouavajui protozou Tetrahymena
(slika 5.17). Telomeraza Tetrahymena nalazi se u kompleksu s 159
nukleotida dugom RNA koja sadri slijed 3'-AACCCCAAC-5'. Ovaj je
slijed komplementaran s telomernim ponavljanjem Tetrahymena
(5'-TTGGGG-3') i slui kao kalup za sintezu telomerne DNA. Koritenje
ove RNA kao kalupa dozvoljava telomerazi da produi 3' kraj
kromosomske DNA za jednu ponavljajuu jedinicu vie od originalne
duljine. Komplementarni lanac se moe tada sintetizirati djelovanjem
kompleksa polimeraza (-primaza koritenjem konvencionalne RNA
poetnice. Uklanjanje RNA poetnice ostavlja jednolanani 3' kraj
kromosomske DNA koji moe stvarati petlje na kraju eukariotskih
kromosoma (vidi sliku 4.22).
Telomeraze su otkrivene u razliitim eukariotima, a geni koji
kodiraju telomerazne RNA klonirani su iz Tetrahymena, kvasaca, mia
i ovjeka. Telomerazna RNA uvijek sadri sljedove komplementarne s
ponavljajuim slijedom telomere organizma iz kojeg je izolirana
(vidi tablicu 4.4). Uloga telomeraze u odravanju krajeva
eukariotskih kromosoma dokazana je i unoenjem mutiranih
telomeraznih RNA gena u kvasce to je rezultiralo odgovarajuim
promjenama ponavljajuih sljedova na krajevima kromosoma.
2 Popravak DNADNA, kao i svaka druga molekula, moe biti izloena
razliitim kemijskim reakcijama. Budui da DNA slui kao jedinstvena,
trajna kopija staninog genoma, promjene njene strukture imaju
znatno vee posljedice nego promjene drugih staninih komponenti,
poput RNA ili proteina. Mutacije mogu proizii iz ugradnje pogrene
baze za vrijeme umnaanja DNA. Uz to, u molekuli DNA dogaaju se
razliite kemijske promjene , bilo spontano (slika 5.18) bilo kao
posljedica izloenosti kemikalijama ili zraenju (slika 5.19). Takva
oteenja DNA mogu blokirati replikaciju ili transkripciju, a mogu i
rezultirati visokom uestalou mutacija ije su posljedice
neprihvatljive s gledita stanine reprodukcije. Da bi odrale
integritet svojeg genoma stanice su morale razviti mehanizme za
popravak DNA oteenja. Mehanizmi popravka DNA mogu se podijeliti u
dvije ope grupe: (1) direktni obrat kemijske reakcije odgovorne za
oteenje DNA i (2) uklanjanje oteenih baza nakon ega slijedi njihova
zamjena s novosintetiziranom DNA. U sluajevima kada zataje oba
mehanizma popravka DNA evolucija je razvila dodatne mehanizme koji
stanici pomau da se nosi s oteenjima.
2.1 Izravni obrat DNA oteenja
Veina DNA oteenja popravlja se uklanjanjem oteene baze nakon ega
slijedi ponovna sinteza uklonjenog podruja. Neke DNA lezije se ipak
mogu popraviti izravnim obratom oteenja to moe biti znatno
uinkovitiji nain borbe sa specifinim tipom DNA oteenja koji se
uestalo deava. Samo nekoliko tipova DNA oteenja popravlja se na
ovaj nain - pirimidinski dimeri nastali kao rezultat izlaganja
ultraljubiastom (UV) svjetlu i alkilirani gvaninski ostaci,
modificirani dodatkom metilne ili etilne skupine no O6 poziciju
purinskog prstena.
UV svjetlo jedan je od znaajnijih izvora DNA oteenja, a takoer
je najvie proueni tip oteenja u smislu mehanizama popravka. Na
njegovu vanost ukazuje injenica da izlaganje sunevom UV zraenju
predstavlja uzrok gotovo svih karcinoma koe kod ljudi. Glavni tip
oteenja induciran UV svjetlom je formiranje pirimidinskih dimera u
kojem su susjedni pirimidini na istom lancu DNA spojeni uz pomo
ciklobutanskog prstena nastalog zasienjem dvostruke veze izmeu
petog i etog atoma ugljika (vidi sliku 5.19A). Stvaranje ovakvih
dimera naruava strukturu DNA lanca i blokira transkripciju ili
replikaciju nizvodno od mjesta oteenja pa je njihov popravak usko
povezan sa sposobnou stanica da preive UV zraenje. Jedan od
mehanizama za popravljanje UV induciranih pirimidinskih dimera je
direktni obrat dimerizacijske reakcije. Proces se naziva
fotoreaktivacija jer se za kidanje strukture ciklobutanskog prstena
koristi energija vidljive svjetlosti (slika 5.20).
Fotoreaktivacijom izvorna pirimidinska baza, vraena u normalno
stanje, ostaje u molekuli DNA.. Kako je sunevo UV zraenje glavni
izvor oteenja molekule DNA u razliitim tipovima stanica, logino je
za oekivati da je popravak pirimidinskih dimera fotoreaktivacijom
zajedniki razliitim prokariotskim i eukariotskim stanicama,
ukljuujui E.coli, kvasce i neke vrste biljaka i ivotinja.
Zanimljivo je, ipak, da fotoreaktivacija nije univerzalana; mnoge
vrste (ukljuujui ovjeka) nemaju ovaj mehanizam popravka DNA.
Drugi oblik direktnog popravka odnosi se na oteenja proizila iz
reakcije izmeu alkilirajuih imbenika i DNA. Alkilirajui imbenici su
reaktivne komponente koje mogu prenijeti metilnu ili etilnu skupinu
na DNA bazu i time je kemijski modificirati (vidi sliku 5.19B).
Osobito vaan tip oteenja je metilacija O6 pozicije gvanina stoga to
nastali produkt, O6-metilgvanin, stvara komplementarne bazne parove
s timinom umjesto s citozinom. Ova lezija moe biti popravljena
djelovanjem enzima, zvanog O6-metilgvanin metiltransferaza, koji
prenosi metilnu skupinu s O6-metilgvanina na cisteinski ostatak u
svom aktivnom mjestu (slika 5.21). Time je uklonjena potencijalna
mutagena kemijska modifikacija i restauriran izvorni gvanin. Enzimi
koji kataliziraju ovu direktnu reakciju popravka zastupljeni su u
znatnom broju prokariotskih i eukariotskih organizama, ukljuujui i
ovjeka.
2.2 Ekscizijski popravak
Premda je direktni popravak efikasan nain noenja s odreenim
tipovima DNA oteenja, ekscizijski popravak predstavlja openitiji
nain popravka iroke skupine kemijskih promjena DNA molekule. Prema
tome, razliiti tipovi ekscizijskog popravka predstavljaju najvanije
mehanizme popravka DNA kako u prokariotskim tako i u eukariotskim
stanicama. U ekscizijskom popravku, oteena DNA biva prepoznata i
uklonjena bilo u vidu slobodnih baza ili nukleotida. Nastala
pukotina se zatim popunjava sintezom novog DNA lanca koritenjem
neoteenog komplementarnog lanca kao kalupa. Tri tipa ekscizijskog
popravka ekscizija baza, ekscizija nukleotida i popravak krivo
sparenih baza (engl. mismatch repair) omoguavaju stanicama da se
bore sa irokim spektrom razliitih DNA oteenja.
Popravak molekule DNA koja sadri uracil predstavlja dobar
primjer popravka ekscizijom baza, u kojem jedna oteena baza biva
prepoznata i uklonjena iz DNA molekule (slika 5.22). Uracil se moe
pojaviti u DNA putem dva mehanizma: (1) Uracil (kao dUTP
deoksiuridin-trifosfat) se povremeno ugrauje na mjestu timina za
vrijeme DNA sinteze i (2) uracil se moe pojaviti u DNA deaminacijom
citozina (vidi sliku 5.18A). Drugi mehanizam je od mnogo vee
bioloke vanosti budui da mijenja normalni obrazac komplementarnog
sparivanja baza i time predstavlja mutageni dogaaj. Ekscizija
uracila katalizirana je djelovanjem DNA-glikozilaze, enzima koji
kida vezu izmeu baze (uracila) s deoksiribozom DNA okosnice. Ova
reakcija stvara slobodni uracil i apirimidinsko mjesto eer bez
pridruene baze. DNA-glikozilaze takoer prepoznaju i uklanjaju druge
nepravilne baze ukljuujui hipoksantin stvoren deaminacijom adenina,
pirimidinske dimere, alkilirane purine (osim O6-alkil gvanina) i
baze oteene oksidacijom ili ionizirajuim zraenjem.
Rezultat aktivnosti DNA-glikozilaze je formiranje apirimidinskog
ili apurinskog mjesta (uobiajeno zavano AP mjesto) u DNA. Slina AP
mjesta nastaju kao rezultat spontanog gubitka purinskih baza (vidi
sliku 5.18B), to se dogaa s znaajnom uestalou u normalnim staninim
uvjetima. Tako se primjerice procjenjuje da svaka stanica u
ljudskom tijelu dnevno gubi nekoliko tisua purinskih baza. Ta
mjesta se popravljaju djelovanjem AP-endonukleaze koja cijepa DNA
lanac uz AP mjesto (vidi sliku 5.22). Preostali deoksiribozni
ostatak se zatim ukloni, a nastala pukotina od jedne baze popunjava
se djelovanjem DNA-polimeraze i ligaze.
Dok DNA-glikozilaze prepoznaju samo specifine oblike oteenih
baza, drugi sustavi ekscizijskog popravka prepoznaju iroku skupinu
oteenih baza koje naruavaju strukturu DNA molekule, ukljuujui
pirimidinske dimere inducirne UV zraenjem i velike skupine dodane
bazama DNA kao rezultat interakcije mnogih kancerogen s DNA (vidi
sliku 5.19C). Ovaj iroko rasprostranjeni oblik DNA popravka poznat
je kao popravak ekscizijom nukleotida jer se oteene baze
(primjerice dimeri timina) uklanjaju kao dio oligonukleotida koji
sadri odreenu leziju (slika 5.23).
Kod E.coli popravak ekscizijom nukleotida kataliziran je
djelovanjem produkata tri gena (uvrA, B i C) koji su otkriveni
zahvaljujui injenici da mutacije ovih lokusa rezultiraju ekstremnom
osjetljivou na UV svjetlo. Protein UvrA prepoznaje oteenu DNA i
regrutira UvrB i UvrC k mjestu lezije. UvrB i UvrC zatim cijepaju
lanac na 3' i 5' strani oteenog mjesta odvajajui oligonukleotid
graen od 12 ili 13 baza. UvrABC kompleks se esto naziva
ekscinukleaza, imenom koje odraava njegovu sposobnost da direktno
isjeca (engl. excise) odreeni oligonukleotid. Nakon toga je
potrebna aktivnost helikaze kako bi se iz dvolanane DNA molekule
uklonio oligonukleotid koji sadi oteenje, a nastala pukotina
popunjava se djelovanjem DNA-polimeraze i ligaze.
Sustav popravka ekscizijom nukleotida takoer je intenzivno
prouavan u eukariotskim organizmima, ukljuujui kvasce, glodavce i
ovjeka. U kvascima, kao i u E.coli, otkriveno je nekoliko gena
ukljuenih u popravak DNA (nazvanih RAD geni engl. radiation
sensitivity) izolacijom mutanata s poveanom osjetljivou na UV
svjetlo. U ovjeka su geni DNA popravka otkriveni uglavnom
prouavanjem osoba koje pate od nasljednih bolesti uzrokovanih
nemogunou popravka DNA oteenja. Najintenzivnije prouavana od ovih
bolesti je Xeroderma pigmentosum (XP), rijetki genetski poremeaj
koji pogaa otprilike jednu od 25 000 osoba. Pojedinci s ovom boleu
su ekstremno osjetljivi na UV zraenje i razvijaju multiple
karcinome koe na podrujima tijela izloenima sunevom svijetlu. James
Cleaver je 1968. godine doao do kljunog otkria da su kultivirane
stanice izolirane iz pacijenata koji pate od Xeroderma pigmentosum
deficitarne u sposobnosti provoenja popravka ekscizijom nukleotida.
Ovo opaanje ne samo da je pruilo prvu vezu izmeu popravka DNA i
karcinoma, ve je takoer predloilo koritenje XP stanica kao
eksperimentalnih sustava za identifikaciju humanih gena ukljuenih u
popravak DNA. Humani geni ukljueni u popravak DNA otkriveni su osim
toga i prouavanjem druge dvije bolesti ljudi koje nastaju kao
posljedica defekata u popravku DNA (Cockayne-ov sindrom i
trihotiodistrofija), te prouavanjem UV senzitivnih staninih linija
glodavaca. Vrata eksperimentalne analize popravka ekscizijom
nukleotida u sustavima sisavaca otvorilo je kloniranje gena
zaduenih za popravak DNA oteenja. Tome su pridonijeli eksperimenti
prijenosa gena provedeni u stanicama sisavaca s defektima u
popravku DNA, a koji se baziraju na sposobnosti alela divljeg tipa
da restauriraju normalnu UV senzitivnost mutiranih stanica.
Molekularnim kloniranjem otkriveno je sedam razliitih gena
popravka (oznaenih XPA do XPG) koji su mutirani kod osoba oboljelih
od Xeroderma pigmentosum, a otkriveni su i geni mutirani u osoba
koje pate od Cockayne-ovog sindroma i trihotiodistrofije, te geni u
UV senzitivnim mutantama staninih linija glodavaca. Proteini
kodirani ovim genima popravka oteenja DNA u sisavaca usko su srodni
proteinskim produktima RAD gena kvasaca, to ukazuje na visoku
konzerviranost mehanizma popravka ekscizijom nukleotida u
eukariotskim organizmima. Kada su klonirani geni popravka u kvasaca
i sisavaca bilo je mogue dobiti i proteine koje oni kodiraju u
istom obliku te razviti in vitro sustave za ispitivanje njihove
uloge u mehanizmima popravka (slika 5.24). Poetni korak popravka
ekscizijom nukleotida u stanicama sisavaca ukljuuje prepoznavanje
krivo sparenih baza pomou kompleksa graenog od XPC proteina i
proteina pod imenom hHR23B, homolognog kvaevom Rad23 proteinu.
Nakon toga slijedi usmjeravanje XPB, XPD i XPG proteina ka mjestu
DNA oteenja. XPB i XPD proteini su komponente transkripcijskog
faktora TFIIH, graenog iz vie podjedinica, a koji je potreban za
inicijaciju transkripcije eukariotskih gena (vidi poglavlje 6.) -
oni djeluju kao helikaze, odmatajui otprilike 30 parova baza DNA
oko mjesta oteenja. XPA protein zatim potvruje oteenje i usmjerava
heterodimer XPF i ERCC1 protein (protein popravka identificiran u
UV senzitivnim staninim linijama glodavaca) ka mjestu oteenja.
XPF/ERCC1 i XPG su endonukleaze koje cijepaju DNA u 5'(3' smjeru od
oteenog mjesta. Tim cijepanjem se izrezuje oligonukleotid duljine
od otprilike 30 baza. Nastala pukotina popunjava se djelovanjem
DNA-polimeraze ( ili ( (uz suradnju RFC i PCNA) i ligaze.
Dok XPC/hHR23B kompleks moe prepoznati oteenja DNA bilo gdje u
genomu, alternativni oblik popravka ekscizijom nukleotida, zvan
popravak povezan s transkripcijom, specifian je za popravak oteenja
unutar gena koji se prepisuju. Veza izmeu transkripcije i popravka
gena prvi puta je dokazana nakon eksperimenata koji pokazuju da se
transkribirani lanac DNA popravlja znatno bre od netranskribirajueg
lanca, kako u E. coli tako i u stanicama sisavaca. Budui da oteenje
DNA blokira transkripciju stanica favorizira popravak za vrijeme
transkripcije jer joj omoguava da popravi prvenstveno oteenja gena
koji se eksprimiraju. Kod E.coli mehanizam povezanosti
transkripcije i popravka ukljuuje prepoznavanje RNA polimeraze
zakoene pri leziji u DNA lancu koji se prepisuje. Zakoenu RNA
polimerazu prepoznaje protein, zvan faktor povezan s
transkripcijskim popravkom, koji uklanja RNA polimerazu i usmjerava
UvrABC excinukleazu prema mjestu oteenja.
U stanicama sisavaca, popravak povezan s transkripcijom ukljuuje
prepoznavanje zakoene RNA polimeraze djelovanjem CSA i CSB proteina
koji su kodirani genima odgovornim za Cockayne-ov sindrom (slika
5.25). Za razliku od pacijenata koji pate od Xeroderma pigmentosum,
pacijenti s Cockayne-ovim sindromom pokazuju specifian defekt
popravka povezanog s transkripcijom to je u skladu s ulogom CSA i
CSB proteina kao faktora povezanih s transkripcijskim popravkom .
CSA i CSB djeluju analogno XPC/ERCC1 kompleksu usmjeravajui XPB,
XPD i XPG ka mjestu oteenja. Nakon toga slijedi mobiliziranje XPA
proteina i XPF/ERCC1 kompleksa te ekscizija oteenog
oligonukleotida. Popravak povezan s transkripcijom se prema tome
nastavlja slino uobiajenom popravku ekscizijom nukleotida s
izuzetkom poetnog prepoznavanja zakoene RNA polimeraze djelovanjem
CSA i CSB proteina, a ne direktnim prepoznavanjem DNA oteenja pomou
XPC/hHR23B kompleksa.
Trei ekscizijski mehanizam popravka prepoznaje krivo sparene
baze ugraene za vrijeme DNA replikacije. Mnoge od tih krivo
sparenih baza uklanjaju se ''proofreading'' aktivnou
DNA-polimeraze. Preostale krivo sparene baze objekt su kasnijeg
korekcijskog mehanizma zvanog popravak krivo sparenih baza (engl.
mismatch repair system) koji provjerava novorepliciranu DNA.
Mehanizmi ovog popravka sposobni su otkriti i specifino izrezati
krivo sparenu bazu iz novosintetiziranog DNA lanca omoguivi time
korekciju greke i restauraciju izvornog slijeda.
Kod E. coli, sposobnost sustava popravka krivo sparenih baza da
razlikuje roditeljski od novosintetiziranog DNA lanca bazira se na
injenici da je DNA ove bakterije modificirana metilacijom
adeninskih ostataka unutar slijeda GATC ime se adenin pretvara u
6-metiladenozin (slika 5.26). Kako se metilacija odvija nakon
replikacije, novosintetizirani DNA lanci nisu metilirani i mogu se
specifino prepoznati enzimima popravka pogreno sparenih baza.
Popravak pogreno sparenih baza zapoinje djelovanjem proteina MutS
koji prepoznaje krivo sparene baze te tvori kompleks s dva druga
proteina zvana MutL i MutH. MutH endonukleaza zatim cijepa
nemetilirani DNA lanac unutar GATC slijeda. MutL i MutS djeluju
nakon toga zajedno s egzonukleazom i helikazom isjecajui DNA izmeu
prekida lanca i krivo sparenih baza, a nastala pukotina popunjava
se djelovanjem DNA-polimeraze i ligaze.
Eukarioti imaju slian sustav popravka krivo sparenih baza premda
se mehanizam kojim eukariotske stanice prepoznaju novorepliciranu
DNA razlikuje od onog koritenog u E.coli. ini se da u stanicama
sisavaca specifinost pogreno sparene baze u novosintetiziranom
lancu nije odreena metilacijom DNA. Umjesto toga, prisustvo
jednolananog loma (u ovom sluaju u novosintetiziranom lancu DNA)
ili pak povezivanje eukariotskih homologa proteina MutS i MutL s
replikacijskom mainerijom mogli bi odrediti koji je lanac potrebno
popraviti. Homolozi MutS i MutL proteina veu se zatim za krivo
sparenu bazu i upravljaju isjecanjem DNA izmeu loma lanca i krivo
sparenih baza, kao i u sluaju E coli. Vanost ovog mehanizma
popravka dramatino je ilustrirana injenicom da su mutacije ljudskih
homologa MutS i MutL gena odgovorne za uobiajeni tip nasljednog
karcinoma debelog crijeva (nasljedni nepolipozni kolorektalni
karcinom ili HNPCC). HNPCC predstavlja jedno od najuobiajenijih
nasljednih oboljenja s uestalou od jedne na 200 osoba, a odgovoran
je za 15 % svih kolorektalnih karcinoma u SAD-u. Povezanost izmeu
HNPCC i poremeaja u popravku krivo sparenih baza otkrivena je 1993.
godine kada su dvije grupe znanstvenika klonirale ljudski homolog
MutS gena i pronale da je mutacija u ovom genu odgovorna za
otprilike polovinu HNPCC sluajeva. Naknadna ispitivanja pokazala su
da je veina preostalih sluajeva HNPCC rezultat mutacije jednog od
tri ljudska homologa MutL gena. ini se da defekti ovih gena
rezultiraju visokom uestalou mutacija drugih staninih gena s
odgovarajuom visokom vjerojatnou da e neke od njih na kraju dovesti
do razvoja karcinoma.
2.3 Popravak sklon pogrekama
Mehanizmi direktnog obrata DNA oteenja i ekscizijskog popravka
popravljaju DNA oteenje prije replikacije tako da se DNA moe
sintetizirati koritenjem neoteenog DNA lanca kao kalupa. U sluaju
da ovi mehanizmi zakau, stanica ipak posjeduje alternativne
mehanizme za popravak oteenja DNA u replikacijskim raljama.
Pirimidinski dimeri i mnogi drugi tipovi lezija ne mogu se kopirati
normalnom aktivnou DNA-polimeraza pa je replikacija na mjestima tih
oteenja blokirana. No, stanice takoer posjeduju nekoliko
specijaliziranih DNA-polimeraza koje su u stanju izvriti
replikaciju i uzdu mjesta s DNA oteenjem. Replikacija oteene DNA
djelovanjem takvih specijaliziranih polimeraza moe dovesti do
uestalog ugraivanja neodgovarajuih baza pa se ovaj oblik borbe s
DNA oteenjima naziva popravak sklon pogrekama (engl. error - prone
repair).
Prva DNA-polimeraza sklona pogrekama otkrivena je u E. coli
1999. godine. Ovaj enzim, nazvan polimeraza V, induciran je u
odgovoru na ekstenzivno UV zraenje. Polimeraza V moe sintetizirati
novi lanac DNA molekule uzdu mjesta s timinskim dimerima (slika
5.27). Druge dvije DNA-polimeraze u E. coli, polimeraza II i IV, na
slian nain su inducirane DNA oteenjem i djeluju umehanizmu popravka
sklonom pogrekama. Eukariotske stanice takoer sadre vie
DNA-polimeraza sklonih pogrekama. Devet takvih enzima je do sada
otkriveno u stanicama ovjeka.
Sve DNA-polimeraze sklone pogrekama iskazuju malu vjernost
izvornom kalupu kad kopiraju neoteenu DNA, sa stopama greaka u
rasponu od 100 do 10 000 puta veim no to su stope pogreaka
normalnih replikacijskih DNA-polimeraza (primjerice polimeraze III
u E. coli ili polimeraze ( i ( u eukariota). Uz to, polimeraze
sklone pogrekama nemaju 3'(5' korigirajuu aktivnost svojstvenu
normalnim replikacijskim DNA-polimerazama (vidi sliku 5.12).
Vano je ipak da su polimeraze sklone pogrekama specijalizirane
za ugradnju odgovarajuih baza smjetenih nasuprot specifinim
lezijama u oteenoj DNA i stoga su u mogunosti tono sintetizirati
novi lanac koristei neke oblike oteenog lanca kao kalupa. Tako na
primjer polimeraza V u E. coli specifino prepoznaje timinske dimere
i korektno ugrauje AA na nasuprotnom mjestu novosintetiziranog
lanaca. Dakle, ovi enzimi sposobni su specifino ugraditi
odgovarajuu bazu smjetenu nasuprot nekim oblicima DNA oteenja,
premda su sklone pogrekama u ugraivanju baza smjetenih nasuprot
drugih oblika oteene DNA ili u sintezi DNA koritenjem normalnog
neoteenog kalupa.
2.4 Rekombinacijski popravak
Drugi nain popravka DNA, rekombinacijski popravak, bazira se na
zamjeni oteene DNA rekombinacijom s neoteenom molekulom. Ovaj
mehanizam se uestalo koristi za popravak oteenja na koja se nailazi
za vrijeme DNA replikacije kada prisutnost timinskih dimera ili
drugih lezija, koje ne mogu biti kopirane djelovanjem normalne
replikativne DNA-polimeraze, blokira napredovanje replikacijskih
ralji. Rekombinacijski popravak ovisi o injenici da je jedan lanac
roditeljske DNA ostao neoteen, i stoga je bio kopiran za vrijeme
replikacije, dajui normalnu sestrinsku molekulu koja tada moe biti
iskoritena za popravak oteenog lanca.
Premda molekularni mehanizmi rekombinacijskog popravka nisu u
potpunosti poznati i mogu varirati meu razliitim tipovima stanica
opi ilustrativni model prikazan je na slici 5.28. U ovom primjeru
normalna replikacija blokirana je prisustvom timinskog dimera u
jednom lancu DNA molekule. Ipak, nizvodno od mjesta oteenja
replikacija moe opet biti zapoeta sintezom Okazakijevog fragmenta i
moe se nastaviti uzdu oteenog lanca kalupa. Rezultat toga je
sestrinski lanac koji sadri pukotinu nasuprot mjestu oteenja
roditeljskog lanca. Neoteeni roditeljski lanac, koji je repliciran
dajui normalni sestrinski lanac, moe zatim biti upotrijebljen za
popunjavanje pukotine nasuprot mjestu oteenja pomou rekombinacije
homolognih DNA sljedova (vidi daljnji tekst). Budui da je tako
nastala pukotina u prethodno intaktnom roditeljskom lancu smjetena
nasuprot neoteenom lancu ona moe biti popunjena djelovanjem
DNA-polimeraze . Iako druga roditeljska molekula i dalje sadri
izvorno oteenje (timinski dimer), ono sada lei nasuprot normalnom
lancu i moe se kasnije popraviti ekscizijskim popravkom.
Rekombinacijski popravak takoer prua glavni mehanizam za
popravljanje dvolananih lomova koji se mogu pojaviti u molekuli DNA
kao posljedica ionizirajueg zraenja (primjerice X zrake) ili
djelovanja nekih kemijskih imbenika (slika 5.29). Kako ovaj tip
oteenja pogaa oba lanca DNA osobito je teak za popravak.
Rekombinacija sa homolognim DNA slijedom u neoteenom kromosomu
osigurava mehanizam za popravljanje ovakvih oteenja i restauriranje
normalnog DNA slijeda. Alternativno, dvolanani lomovi mogu se
popraviti jednostavno spajanjem prekinutih krajeva zahvaene DNA
molekule, no to bi rezultiralo visokom uestalosti greaka koje
nastaju uslijed delecije baza oko mjesta oteenja. Treba napomenuti
da geni odgovorni za nasljedni karcinom dojke (BRCA1 i BRCA2)
kodiraju proteine koji su ukljueni u popravak dvolananih lomova
posredstvom homologne rekombinacije, to sugerira da defekti ovog
tipa DNA popravka mogu imati za posljedicu nastanak jednog od
najuestalijih karcinoma u ena.
3 Rekombinacija izmeu homolognih DNA sljedova
Precizna replikacija DNA i popravak DNA oteenja nuni su za
odranje genetske informacije i osiguranje njenog tonog prijenosa s
roditelja na potomstvo. Kao to je raspravljano u prethodnom tekstu,
rekombinacija predstavlja vaan mehanizam za popravak DNA oteenja.
Uz to, rekombinacija je kljuna za stvaranje genetske raznolikosti,
osobito vane s evolucijskog gledita. Genetska razliitost meu
jedinkama prua osnovni startni materijal prirodne selekcije koji
dozvoljava vrstama da evoluiraju i prilagode se promjenjivim
uvjetima okolia. Rekombinacija igra centralnu ulogu u tom procesu,
dozvoljavajui genima da se presloe u razliite kombinacije. Tako
primjerice genetska rekombinacija rezultira izmjenom gena u
sparenim homolognim kromosomima za vrijeme mejoze. Uz to,
rekombinacija je ukljuena u preslagivanje specifinih DNA sljedova
koji mijenjaju ekspresiju i funkciju nekih gena tijekom razvoja i
diferencijacije. Stoga, rekombinacija igra vanu ulogu u ivotu
pojedinanih stanica i organizama, a istovremeno doprinosi genetskoj
raznolikosti vrsta.
U ovom dijelu poglavlja raspravljeni su mehanizmi rekombinacije
izmeu DNA molekula iji su sljedovi izrazito homologni. Primjeri
ukljuuju homolognu rekombinaciju za vrijeme popravka DNA kao i
rekombinaciju izmeu sparenih eukariotskih kromosoma tijekom mejoze
te rekombinaciju izmeu bakterijskih kromosoma za vrijeme seksualnog
razmnoavanja. Budui da ovaj tip rekombinacije podrazumijeva izmjenu
genske informacije izmeu dvije homologne DNA molekule, on ne dovodi
do promjene u sveukupnom aranmanu gena na kromosomu. Drugi tipovi
rekombinacije ne zahtijevaju izrazitu homolognost DNA sljedova i
stoga se mogu odvijati i izmeu nesrodnih DNA molekula.
Rekombinacijski dogaaji tog tipa dovode do preslagivanja gena o emu
e biti govora kasnije u ovom poglavlju.
3.1 DNA molekule se rekombiniraju lomljenjem i ponovnim
spajanjem
Genetika rekombinacija je prvi put definirana kada je primijeeno
da se geni na razliitim kopijama homolognih kromosoma vone muice
mogu presloiti tijekom mejoze. Nedugo zatim, otkrie DNA kao
materijala od kojeg su graeni geni dalo je dva alternativna modela
za objanjenje rekombinacije na molekularnoj razini (slika 5.30).
Model izbora kopije (engl. copy choice model) pretpostavlja da
rekombinantna DNA molekula nastaje za vrijeme DNA sinteze na taj
nain da DNA-polimeraza prvo zapone kopiranje jednog roditeljskog
DNA kalupa, a zatim se prebaci na kopiranje drugog roditeljskog
lanca. Alternativni prijedlog kae da rekombinacija rezultira lomom
i ponovnim spajanjem dvije roditeljske DNA molekule, a ne sintezom
nove DNA molekule.
Ova dva modela prvi put su predloena 1961. godine na temelju
zapaanja prilikom analize rekombinacije izmeu genoma bakterijskih
virusa (slika 5.31). Poznato je da infekcija E.coli virusima koji
nose razliite genske markere dovodi do nastanka rekombinantnih
potomaka. Da bi se odgovorilo na pitanje ukljuuje li ova
rekombinacija lom i ponovno spajanje roditeljskih DNA molekula,
jedan od roditeljskih virusa uzgajan je u mediju koji sadri teki
izotop ugljika (13C) i duika (15N) dok je drugi uzgajan u mediju
koji sadri normalne lake izotope (12C i 14N). Time su dobiveni
roditeljski virusi razliite gustoe koji se mogu razdvojiti
centrifugiranjem u gradijentu gustoe CsCl. Nakon toga je E.coli
inficirana razliito obiljeenim roditeljskim virusima u uvjetima
koji inhibiraju replikaciju, a novostvorene virusne estice su
analizirane prema njihovoj gustoi i genetskim karakteristikama.
Dobiveni su genetski rekombinirani virusi intermedijarne gustoe to
ukazuje na to da nose DNA molekule oba roditelja kao to je
predvieno modelom loma i ponovnog spajanja, ali ne modelom izbora
kopije.
3.2 Modeli homologne rekombinacije
Otkrie da se rekombinacija odvija lomom i ponovnim spajanjem
postavlja novo kljuno pitanje: kako dvije roditeljske DNA molekule
mogu biti prekinute tono na istom mjestu tako da se mogu ponovo
spojiti, a da pri tome ne nastanu mutacije zbog delecija odnosno
adicija nukleotida u mjestu loma? Za vrijeme rekombinacije izmeu
homolognih DNA molekula (opi tip homologne rekombinacije) takvo
poravnavanje omogueno je sparivanjem baza komplementarnih DNA
lanaca (slika 5.32). Preklapajui jednolanani krajevi izmjenjuju se
izmeu homolognih DNA molekula dovodei do stvaranja heterodupleksa u
kojem dva lanca rekombinantne dvolanane uzvojnice potjeu od
razliitih roditelja. Kada se DNA molekule hetrodupleksa genetiki
razlikuju, DNA molekula koja nastaje sadri dva razliita genska
biljega. U nekim sluajevima krivo sparene baze u heterodupleksu
mogu biti prepoznate i ispravljene mehanizmom popravka krivo
sparenih baza na nain koji je opisan ranije u ovom poglavlju.
Molekularni model rekombinacije predloen je 1964. godine na temelju
ispitivanja rekombinacije u gljivicama i bakterijama kada su
dobiveni prvi genetiki dokazi za stvaranje i popravak
heterodupleksa. Ovaj model, poznat kao Holliday-ev model (nazvan
prema istraivau Robinu Hollidayu), premda modificiran stjecanjem
novih podataka i danas prua osnovu poimanja rekombinacijskih
mehanizama.
Izvorna verzija Holliday-evog modela predlae da rekombinacija
zapoinje uvoenjem ureza (engl. nick) u istom mjestu obiju
roditeljskih molekula (slika 5.33). DNA lanci sa urezom djelomino
se razmotaju i svaki izvri nukleofilni napad na drugu molekulu na
taj nain da se spari s komplementarnim neprekinutim lancem.
Ligacija prekinutih lanaca stvara zatim ukrtanje poznato kao
Holliday-eva struktura koja predstavlja glavni meuprodukt u
rekombinaciji. Direktni prikaz Holliday-eve strukture dobiven uz
pomo elektronskog mikroskopa dao je jasnu potporu za ovaj model
rekombinacije (slika 5.34).
Jednom stvorena Holliday-eva struktura moe biti razrijeena
kidanjem i ponovnim spajanjem ukrtenih lanaca to dovodi do
stvaranja rekombinantne molekule (slika 5.35). To se moe dogoditi
na dva razliita naina ovisno o orijentaciji Holliday-eve strukture
koja zapravo odreuje dva razliita izomera. U izomeru koji nastaje
iz poetne izmjene lanaca ukrteni su oni lanci koji su zarezani na
poetku rekombinacijskog procesa. No, jednostavna rotacija ove
strukture daje drugaiji izomer u kojem su ukrteni neprekinuti
roditeljski lanci. Razrjeenje razliitih izomera ima razliite
genetike posljedice. U prvom sluaju nastale molekule imaju
heterodupleksna podruja, ali DNA koja omeuje ta podruja nije
rekombinirana. Ako doe do izomerizacije, kidanje i spajanje
ukrtenih lanaca rezultirat e molekulama ija su podruja koja omeuju
heterodupleks rekombinirana.. Stvaranja rekombiniranih i
nerekombiniranih heterodupleksa odreeno je upravo Holliday-evom
strukturom to je u skladu sa genetikim podacima na kojima je
baziran Holliday-ev model.
Kao to je u poetku reeno, Holliday-ev model nije u stanju
objasniti kako dolazi do inicijacije rekombinacije istovremenim
zarezivanjem obiju roditeljskih molekula na istovjetnom poloaju.
ini se da rekombinacija openito poinje dvolananim lomom kako za
vrijeme DNA popravka tako i za vrijeme rekombinacije izmeu
homolognih kromosoma tijekom mejoze (slika 5.36). Oba lanca DNA na
mjestu dvolananog loma se prvo razgrade djelovanjem nukleaze koja
razgrauje DNA u 5'(3' smjeru stvarajui jednolanane krajeve. Ti
jednolanani krajevi izvre nukleofilni napad na drugu roditeljsku
molekulu pri emu se spare komplementarne baze. Pukotine se zatim
popunjavaju sintezom kao pri popravku DNA, a lanci spajaju
ligacijom stvarajui molekulu sa dvostrukom Holliday-evom vezom koja
moe biti razrijeena dajui ili rekombinantne ili nerekombinantne
heterodupleksne molekule kao to je to ranije opisano.
3.3 Enzimi ukljueni u homolognu rekombinaciju
Veina enzima za koje se danas zna da su ukljueni u rekombinaciju
prvotno je identificirana analizom rekombinacijski defektnih
mutanata E.coli. Takve genetike analize utvrdile su da
rekombinacija zahtijeva specifine enzime, zajedno s proteinima (kao
to su DNA-polimeraza, ligaza i proteini koji veu jednolananu DNA)
koji imaju viestruke uloge u metabolizmu DNA. Otkrie gena potrebnih
za efikasnu rekombinaciju u E.coli omoguilo je izolaciju njima
kodiranih proteina ije su karakteristike ispitane biokemijskom
analizom u bezstaninim sustavima. Ta ispitivanja razjasnila su
djelovanje nekoliko enzima koji kataliziraju stvaranje i razrjeenje
Holliday-evih struktura.
Sredinji protein ukljuen u homolognu rekombinaciju je RecA koji
promovira izmjenu lanaca izmeu homolognih DNA molekula to rezultira
stvaranjem heterodupleksa (slika 5.37). Aktivnost RecA proteina moe
se opisati u tri koraka. RecA protein se prvo vee za jednolananu
DNA stvarajui pri tome protein-DNA nit. Budui da sadri dva vezna
mjesta za DNA, RecA protein vezan za jednolananu DNA moe vezati i
drugu, dvolananu DNA, stvarajui tako kompleks izmeu dvije DNA
molekule. Ovo nespecifino povezivanje, posredovano RecA proteinom,
popraeno je specifinim sparivanjem baza izmeu jednolanane DNA i
njoj komplementarnog podruja dvolanane DNA. Zatim jednolanani kraj
DNA molekule, obavijen RecA proteinom, zamijeni homologni lanac
dvolanane DNA molekule formirajui pri tome heterodupleks. Ovaj
proces kataliziran je samim RecA proteinom. Stoga je RecA protein
sposoban da sam katalizira reakcije izmjene lanaca koje imaju
sredinju ulogu u stvaranju Holliday-evih struktura. Za genetiku
rekombinaciju kao i za popravak dvolananih lomova kod kvasaca
potreban je RecA proteinu srodan protein nazvan RAD51. Osim to je
strukturno slian RecA proteinu RAD51 je takoer sposoban
katalizirati izmjenu lanaca in vitro. Proteini srodni proteinu
RAD51 otkriveni su u i sloenijim eukariotskim organizmima,
ukljuujui ovjeka, to ukazuje da proteini srodni RecA proteinu imaju
kljune uloge u homolognoj rekombinaciji kako u prokariotskim tako i
u eukariotskim stanicama.
Kad se Holliday-eva struktura formira, u rekombinaciju se
ukljuuje kompleks sastavljen od sljedea tri proteina bakterije
E.coli, a to su RuvA, RuvB i RuvC (slika 5.38). RuvA prepoznaje
Holliday-evu strukturu i regrutira RuvB. Ruv B djeluje kao motor
koji upravlja migracijom mjesta u kojem su ukrteni DNA lanci
mijenjajui na taj nain veliinu heterodupleksa i poloaj na kojem e
ukrteni lanci biti pocijepani i ponovno spojeni. RuvC razrjeuje
Holliday-evu strukturu cijepajui ukrtene DNA lance. Proces zavrava
ponovnim spajanjem prekinutih lanaca ligacijom na taj nain da se
stvore dvije rekombinantne molekule. Eukariotske stanice ne
posjeduju homologe proteina RuvA, RuvB i Ruv C koje nalazimo u E.
coli. Umjesto toga, razrjeavanje Holliday-eve strukture u
eukariotskim stanicama posredovano je nekim drugim proteinima koji
nisu jo u potpunosti poznati.
4 Preslagivanje DNA
Homologna rekombinacija rezultira preraspodjelom gena izmeu
homolognih kromosoma pri emu se ne mijenjanja sadraj genoma.
Nasuprot tome, druge vrste rekombinacijskih dogaaja dovode do
preslagivanja genomske DNA. Neki od tih preslagivanja DNA vani su u
kontroli ekspresije gena u specifinim tipovima stanica, dok drugi
doprinose genetikoj raznolikosti pri emu mogu biti vani za
evoluciju.
Otkrie da se geni mogu premjetati na razliita mjesta u
kromosomima potjee iz istraivanja kukuruza koje je etrdesetih
godina prolog stoljea provela Barbara McClintock. Ona je samo na
osnovi genetike analize opisala nove genske elemente koji se mogu
pomicati na razliita podruja u genomu kukuruza te mijenjati
ekspresiju susjednih gena. No, prolo je skoro tri desetljea prije
no to je fizika osnova njenog zapaanja rasvijetljena otkriem
pokretnih elemenata u bakterijama ime je ideja o pokretnim
genetikim elementima postala iroko prihvaena od strane znanstvene
javnosti. Danas je poznato nekoliko tipova preslagivanja DNA koji
se zbivanju u eukariotskim i prokariotskim genomima, ukljuujui i
premjetanje elemenata koje je prva opisala Barbara McClintock.
Nadalje, danas znamo da pokretni genetiki elementi ine veliki dio
genoma biljaka i ivotinja, ukljuujui i humani genom gdje njihov
udio gotovo 50%.
4.1 Mjesno specifina rekombinacija (engl. site-specific
recombination)
Za razliku od uobiajene homologne rekombinacije, koja se dogaa
na svakom veem podruju homologije nukleotidnih sljedova, mjesno
specifina rekombinacija odvija se izmeu specifinih sljedova u
podrujima DNA manje homologije. Glavna interakcija u ovom procesu
nije posredovana komplementarnim sparivanjem baza ve aktivnou
proteina koji prepoznaju specifini ciljni nukleotidni slijed.
Prototip rekombinacije u specifinom mjestu dobiven je
istraivanjem bakteriofaga (. Kad bakteriofag ( inficira E.coli, on
se moe ili replicirati uzrokujui lizu stanica ili integrirati u
bakterijski kromosom formirajui profag koji se tada odrava kao dio
genoma E.coli (lizogeni ciklus) (slika 5.39). U povoljnim
okolnostima DNA integracija moe biti reverzna, to kao rezultat ima
eksciziju DNA bakterofaga ( i inicijaciju litike virusne
replikacije. I integracija i ekscizija DNA bakteriofaga ( ukljuuje
site-specific rekombinaciju izmeu DNA sljedova virusa i stanice
domaina.
DNA E.coli i DNA bakteriofaga ( rekombiniraju se u specifinom
mjestu zvanom mjesto privrivanja (engl. attachment site, att).
Stoga, integracija DNA bakteriofaga ( ukljuuje rekombinaciju izmeu
att mjesta faga (attP) dugog otprilike 240 nukleotida i att mjesta
bakterije (attB) dugog otprilike 25 nukleotida (slika 5.40). Proces
je posredovan proteinom bakteriofaga ( zvanim integraza (Int) koji
se specifino vee i za attP i za attB slijed. Int se poetno vee za
attP stvarajui kompleks u kojem je DNA att mjesta faga omotana oko
viestrukih kopija Int proteina. Int-attP kompleks se zatim vee za
attB poravnavajui att mjesta bakteriofaga ( i bakterije. Nakon toga
fag i bakterija izmjenjuju DNA lance ova se izmjena deava izmeu 15
nukleotida zajednikih za attP i attB mjesto (slika 5.41). Int
protein ree unutar ovog slijeda od 15 nukleotida u attB i attP
mjestu na taj nain da ostavlja nazubljene (ljepljive) krajeve,
zatim katalizira izmjenu lanaca i povezuje prekinute lance ime se
DNA bakteriofaga ( integrira u kromosom E.coli. Protein Int takoer
sudjeluje u eksciziji profaga (, to je u osnovi obrnuto od procesa
integracije.
Mjesno specifina rekombinacija vana je ne samo u interakciji
virusa, poput bakteriofaga (, sa stanicama domaina, ve i u
programiranim preslagivanjima gena unutar staninih genoma. Kod
kraljenjaka je mjesno specifina rekombinacija kritina za razvoj
imunog sustava koji prepoznaje strane tvari koje uu u tijelo
(antigene) i titi od infekcija. Dvije su glavne grupe imunolokog
odgovora posredovane B odnosno T limfocitima. B limfociti izluuju
protutijela (imunoglobulini) koja reagiraju s topljivim antigenima
dok T limfociti izluuju proteine stanine povrine (receptori T
stanica) koji reagiraju sa antigenima prisutnim na povrini drugih
stanica. Kljuna osobina imunoglobulina i receptora T stanica je
njihova iznimno velika raznolikost koja omoguuje prepoznavanje
irokog spektra stranih antigena. Tako je primjerice svaka osoba
sposobna stvoriti vie od 1011 razliitih protutijela, to je znatno
vie od ukupnog broja gena u humanom genomu (30 000-40 000). Ta
razliita imunoglobulinska protutijela (kao i receptori T stanica)
nisu kodirana jezgrinim genima germinativnih stanica, ve
jedinstvenim limfocitnim genima koji se formiraju tijekom razvoja
imunolokog sustava kao rezultat mjesno specifine rekombinacije
izmeu razliitih segmenata imunoglobulina i gena za receptore T
stanica.
Ulogu mjesno specifine rekombinacije u stvaranju
imunoglobulinskih gena prvi put je 1976. godine prikazao Susumu
Tonegawa. Imunoglobulini su graeni od dva identina para tekog i
lakog polipeptidnog lanca (slika 5.42). Oba lanca sadre konstantno
podruje na C kraju te varijabilno podruje na N kraju. Varijabilno
podruje, koje ima razliit slijed aminokiselina u razliitim
imunoglobulinskim molekulama, odgovorno je za vezanje antigena i
upravo ta raznolikost aminokiselinskog slijeda varijabilnog podruja
omoguava razliitim protutijelima da prepoznaju specifine antigene.
Premda je svaka osoba u stanju stvoriti irok spektar razliitih
protutijela, svaki B limfocit stvara samo jedan tip protutijela. S.
Tonegawa je otkrio da je svako protutijelo kodirano jedinstvenim
genom stvorenim mjesno specifinom rekombinacijom tijekom razvoja B
limfocita. Preslagivanje gena stvara razliite imunoglobulinske gene
u razliitim B limfocitima tako da je populacija od otprilike 1012 B
limfocita ovjejeg tijela sposobna stvoriti protutijela protiv
irokog spektra stranih antigena.
Geni koji kodiraju lake lance imunoglobulina graeni su od tri
podruja: V podruja koje kodira 95-96 N-terminalnih aminokiselina
varijabilnog podruja polipeptida, J podruje (engl. joining region)
koje kodira 12-14 C terminalnih aminokiselina varijabilnog podruja
proteina, i C podruje koje kodira konstantnu regiju polipeptida
(slika 5.43). Glavna skupina gena lakog lanca u mieva formira se
kombinacijom otprilike 250 V podruja i 4 J podruja s jednim C
podrujem. Tijekom razvoja limfocita mjesno specifina rekombinacija
dovodi do preslagivanja gena - jedno V podruje rekombinira s jednim
J podrujem stvarajui funkcionalni gen lakog lanca. Razliita V i J
podruja rekombiniraju u razliitim B limfocitima tako da mogue
kombiniranje 250 V podruja s 4 J podruja moe stvoriti otprilike
1000 x (4 x 250) jedinstvenih lakih lanaca.
Geni tekog lanca sadre etvrto podruje poznato kao D podruje
(engl. diversity) koje kodira aminokiseline smjetene izmeu V i J
podruja (slika 5.44). Stvaranje funkcionalnog gena tekog lanca
zahtijeva dva rekombinacijska dogaaja. D podruje se prvo
rekombinira s J podrujem, a zatim se V podruje rekombinira s
presloenim DJ podrujem. Kod mieva postoji oko 500 V podruja tekih
lanaca, 12 D podruja i 4 J podruja, tako da ukupni broj tekih
lanaca koji moe biti stvoren rekombinacijskim dogaajima iznosi 24
000 x (500 x 12 x4).
Kombiniranje otprilike 1000 razliitih lakih lanaca i 24 000
tekih lanaca stvorenih mjesno specifinom rekombinacijom moe
proizvesti oko 2 x 107 razliitih imunoglobulinskih molekula.
Raznolikost je nadalje poveana stoga to spajanje segmenata
imunoglobulinskih gena esto ukljuuje gubitak ili dodatak od jednog
do nekoliko nukleotida. Mutacije proizile zbog tih delecija i
insercija poveavaju raznolikost varijabilnih podruja imunoglobulina
za oko 100 puta, to odgovara formiranju otprilike 105 razliitih
lakih lanaca i 2x106 tekih lanaca koji se zatim mogu kombinirati
stvarajui vie od 1011 razliitih protutijela. Nakon formiranja
presloenih imunoglobulinskih gena moe se postii jo vea raznolikost
protutijela procesom somatske hipermutacije koji rezultira uestalim
mutacijama u varijabilnim podrujima gena za laki i teki lanac.
Slino tome, receptori T limfocita graeni su od dva lanca (zvani
( i (), a svaki od njih sadri varijabilna i konstantna podruja
(slika 5.45). Geni koji kodiraju ove polipeptide stvaraju se
rekombinacijom izmeu V i J podruja (( lanac) ili izmeu V, D i J
podruja (( lanac), analogno stvaranju imunoglobulinskih gena.
Mjesno specifina rekombinacija izmeu tih razliitih podruja DNA, a
takoer i mutacije koje su se desile tijekom rekombinacije, stvaraju
stupanj raznolikosti receptora T stanica slian onome
imunoglobulina. No, receptori T stanica razlikuju se od
imunoglobulina u tome to nisu podvrgnuti unoenju daljnje
raznolikosti somatskom hipermutacijom.
VDJ rekombinacija posredovana je kompleksom sainjenim od dva
proteina, RAG1 i RAG2, koji se specifino eksprimiraju u
limfocitima. RAG proteini prepoznaju takozvane sljedove
rekombinacijskog signala (RS) smjetene uz kodirajue sljedove svakog
genskog podruja i potiu preslagivanje DNA uvoenjem dvolananog loma
izmeu RS slijeda i kodirajueg slijeda (slika 5.46). Kodirajui
krajevi genskih podruja se zatim spajaju stvarajui presloene
imunoglobuline ili gene za receptore T stanica, pri emu se vrlo
esto deavaju delecije ili adicije nukleotida. Zanimljivo je da je
RAG1 usko srodan enzimima koji kataliziraju transpoziciju DNA i
integraciju retrovirusa o emu e biti objanjeno dalje u ovom
poglavlju.
4.2 Rekombinacija posredovana DNA intermedijerima
Mjesno specifina rekombinacija odvija se izmeu dva specifina
slijeda koji posjeduju barem malo homologije. Za razliku od toga,
transpozicija ukljuuje premjetanje sljedova unutar genoma i ne
zahtijeva homologiju nukleotidnih sljedova. Elementi koji se
premjetaju transpozicijom, poput onih koje je prva opisala
McClintock, zovu se pokretni elementi (engl. transposable elements)
ili transpozoni. Oni se dijele u dvije ope skupine ovisno o tome
premjetaju li se putem DNA intermedijera ili putem RNA
intermedijera. Ovdje se opisuje prva skupina pokretnih elemenata
dok se o premjetanju putem RNA intermedijera raspravlja u narednom
tekstu.
Prvi detaljno opisani transpozoni koji se premjetaju putem DNA
intermedijera naeni su u bakterijama (slika 5.47). Najjednostavniji
od tih elemenata su insercijski sljedovi ija se veliina kree u
rasponu od oko 800 do 2 000 nukleotida. Insercijski sljedovi sadre
samo gen za enzim ukljuen u transpoziciju (transpozaza) omeen
kratkim invertnim ponavljanjima koji predstavljaju mjesta
aktivnosti same transpozaze. Kompleksni transpozoni graeni su od
dva insercijska slijeda koji omeuju druge gene i premjetaju se kao
jedna cjelina.
Insercijski sljedovi premjetaju se s jednog na drugo mjesto na
kromosomu a da se pri tome ne repliciraju (slika 5.48). Transpozaza
cijepa ciljnu DNA tako da napravi nazubljene krajeve te cijepa na
krajevima obrnutih ponavljajuih sljedova transpozona. Premda
transpozaza djeluje specifino na obrnutim ponavljanjima
transpozona, ona je obino manje specifina u odnosu na slijed ciljne
DNA tako da katalizira premjetanje transpozona nasumino unutar
cjelokupnog genoma. Dok je aktivnost transpozaze specifina na
obrnutim ponavljanjima transpozona, njena specifinost za sljedove
unutar genoma (ciljne sljedove) je puno manja tako da katalizira
premjetanje transpozona nasumino uzdu genoma. DNA u genomu Nakon
cijepanja transpozona i ciljne DNA, tanspozaza spaja ljepljive
krajeve ciljane DNA s pokretnim elementom. Pukotina koja nastaje u
ciljanoj DNA popravlja se DNA sintezom nakon ega slijedi ligacija s
drugim lancem transpozona. Rezultat ovog procesa je kratko direktno
ponavljanje ciljnog slijeda s obje strane integriranog pokretnog
elementa to je karakteristino za integraciju transpozona.
Ovaj mehanizam dovodi do premjetanja transpozona s jednog na
drugo mjesto kromosoma. Drugi tipovi transpozona premjetaju se
znatno sloenijim mehanizmima kojima se istovremeno uz integraciju
na novo mjesto unutar genoma repliciraju. Kao rezultat takvog
premjetanja jedna kopija transpozona biti e integrirana na novo
mjesto u genomu dok e druga kopija ostati na svom izvornom
poloaju.
Transpozoni koji se premjetaju putem DNA intermedijera prisutni
su u eukariotskim genomima kao i u bakterijskim. Tako primjerice
humani genom sadri otprilike 300 000 DNA transpozona koji ine oko 3
% humane DNA. Pokretni elementi koje je McClintock opisala u
kukuruzu premjetaju se nereplikativnim mehanizmom kao to to ini
veina pokretnih elemenata i u drugim biljkama i ivotinjama. Poput
bakterijskih transpozona, ovi se elementi premjetaju na razliita
ciljna mjesta uzdu genoma. Takvo premjetanje na nespecifina mjesta
u genomu najvjerojatnije nije korisno za stanice u kojima se
odvija, ali je sigurno igralo veliku ulogu u evoluciji putem
preslagivanja DNA.
Nasuprot tome, u genomima kvasaca i protozoa transpozicija pomou
replikativnog mehanizma odgovorna je za programirana preslagivanja
DNA koje regulira ekspresiju gena. U tom sluaju transpozicija
zapoinje djelovanjem nukleaze koja cijepa specifino ciljano mjesto
u koje se zatim ubacuje kopija pokretnog elementa. Prema tome,
pokretni elementi se ne premjetaju samo na nespecifina mjesta uzdu
genoma ve mogu sudjelovati i u specifinim presloenim gena koji
rezultiraju programiranom promjenom ekspresije.
4.3 Transpozicija posredovana RNA intermedijerima
Veina pokretnih elemenata u eukariotskim stanicama su
retrotranspozoni koji se premjetaju putem reverzne transkripcije
RNA intermedijera. U ovjeka postoji oko 3 milijuna kopija
retrotranspozona koji ine oko 40 % ukupnog genoma (vidi tablicu
4.l). Mehanizam transpozicije ovih elemenata slian je replikaciji
retrovirusa. Stoga je mehanizam replikacije retrovirusa uzet kao
prototip za prouavanje ove skupine pokretnih DNA sljedova.
Retrovirusi sadre RNA genome u svojim virusnim esticama ali se
repliciraju sintezom DNA provirusa koji se integrira u kromosomsku
DNA inficirane stanice (vidi sliku 3.13). DNA kopija virusne RNA
sintetizira se virusnim enzimom zvanim reverzna-transkriptaza.
Reverznom transkripcijom nastaje DNA molekula koja sadri direktna
ponavljanja od nekoliko stotina nukleotida na oba svoja kraja
(slika 5.49). Ovi ponavljajui sljedovi zvani duga terminalna
ponavljanja (engl. long terminal repeats) ili LTR-ovi nastaju
duplikacijom onih mjesta virusne RNA za koja se veu poetnice kako
bi inicirale DNA sintezu. LTR sljedovi imaju prema tome centralnu
ulogu u reverznoj transkripciji, a uz to su ukljueni u integraciju
i naknadnu transkripciju provirusne DNA.
Kao sve DNA-polimeraze, reverzna-transkriptaza zahtijeva
prisutnost poetnica, a to su u sluaju retrovirusa tRNA molekule
vezane za specifina mjesta (mjesta vezanja poetnica) blizu 5' kraja
virusne RNA (slika 5.50). Budui da se DNA sinteza odvija u 5'(3'
smjeru, samo se mali dio DNA sintetizira prije no to
reverzna-transkriptaza doe do kraja svog kalupa. Nastavak DNA
sinteze nakon toga ovisi o sposobnosti reverzne-transkriptaze da se
premjesti na 3' kraj RNA kalupa. To se postie putem RNaza H
aktivnosti reverzne-transkriptaze koja degradira RNA lanac DNA-RNA
hibrida. Kao rezultat toga novosintetizirana DNA prevodi se u
jednolananu molekulu koja moe hibridizirati s kratkim ponavljajuim
slijedom prisutnim i na 5' i na 3' kraju virusne RNA. DNA sinteza
se nakon toga moe nastaviti, a kao produkt dobit e se jednolanana
DNA komplementarna virusnoj RNA. Sinteza suprotnog DNA lanca zapone
fragmentom virusne RNA koji djeluje kao poetnica na mjestu uz 3'
kraj DNA kalupa. To opet rezultira kratkim ulomkom DNA koji
ukljuuje mjesto vezanja poetnice kopirano s tRNA koja je koritena
kao inicijalna poetnica za reverznu transkripciju. Nukleotidni
slijed tRNA koji vee poetnicu zatim se degradira djelovanjem RNaze
H ostavljajui ljepljivi DNA lanac koji se opet premjeta i spari s
komplementarnnim slijedom na drugom kraju kalupa. Nakon toga DNA
sinteza se moe nastaviti pri emu na kraju nastaje linerana DNA koja
sadri LTR sljedove na oba kraja.
Linearna virusna DNA integrira se u kromosom stanice domaina
procesom koji podsjea na integraciju DNA pokretnih elemenata.
Integracija je katalizirana virusnom integrazom i odvija se u mnogo
razliitih ciljanih sljedova unutar stanine DNA. Integraza cijepa
dvije baze na krajevima virusne DNA i stvara nazubljene krajeve u
ciljnom mjestu stanine DNA. Ljepljivi krajevi stanine DNA se zatim
spajaju s krajevima virusne DNA, a nastala pukotina popunjava se
sintezom DNA. Integrirani provirus je prema tome omeen direktnim
ponavljanjima sljedova stanine DNA, slino ponavljanjima koji omeuju
integrirane DNA transpozone.
ivotni ciklus virusa nastavlja se transkripcijom integriranog
provirusa ime se stvara virusna genomska RNA te mRNA molekule koji
upravljaju sintezom virusnih proteina (ukljuujui
reverznu-transkriptazu i integrazu). Genomska RNA se zatim pakira u
virusne estice koje se oslobaaju iz stanice domaina. Tako nastale
virusne estice mogu inficirati nove stanice zapoinjui novi krug DNA
sinteze i integracije. Sveukupni efekt moe se promatrati kao
premjetanje provirusa s jednog na drugo mjesto u kromosomu putem
sinteze i reverzne transkripcije RNA intermedijera.
Drugi retrotranspozoni razlikuju se od retrovirusa po tome to se
ne pakiraju u infektivne estice i zato se ne mogu iriti s jedne
stanice na drugu. Ipak, ti retrotranspozoni se mogu premjetati na
nova mjesta u kromosomima unutar jedne stanice mehanizmom u osnovi
slinim onom koji je ukljuen u replikaciju retrovirusa.
Neki retrotranspozoni (zvani retrovirusima-slini elementi ili
LTR retrotranspozoni) strukturno su slini retrovirusima (slika
5.51). Retrotranspozoni ovog tipa ine oko 8 % humanog genoma. Oni
sadre LTR sljedove na oba kraja; kodiraju reverznu-transkriptazu i
integrazu i premjetaju se (poput retrovirusa) putem transkripcije u
RNA molekulu, sinteze nove DNA kopije s RNA kalupa djelovanjem
reverzne-transkriptaze i integracijom u staninu DNA.
Retrotranspozoni bez LTR sljedova razlikuju se od retrovirusa po
tome to ne sadre LTR sljedove, premda kodiraju svoju vlastitu
reverznu-transkriptazu. Glavnu skupinu ovih retrotranspozona u
sisavaca ine visokoponavljajui dugi raspreni elementi (engl. highly
repetitive long interspersed elements -LINE) koji se ponavljaju oko
850,000 puta i ine oko 21 % genomske DNA (vidi poglavlje 4). Cijeli
LINE element je dug 6 do 7 kb, iako je veina lanova ove obitelji
skraena na 5' kraju (slika 5.52). Na svom 3' kraju LINE imaju
slijed bogat adeninom za koji se smatra da je nastao reverznom
transkripcijom poli A repova koji su dodani mRNA molekulama nakon
transkripcije (vidi poglavlje 6). Kao i drugi pokretni elementi,
LINE su omeeni kratkim direktnim ponavljanjima ciljanih DNA mjesta,
to ukazuje da integracija ukljuuje stvaranje nazubljenih krajeva i
popravak sintezom.
Kako LINE ne sadre LTR sljedove, mehanizam njihove reverzne
transkripcije i naknadne integracije u kromosomsku DNA se razlikuje
od onog koji koriste retrovirusi i retrotranspozoni koji sadre LTR
sljedove. Konkretno, reverzna transkripcija kao poetnicu koristi
prekinute krajeve kromosomske DNA koju je pocijepala nukleaza,
kodirana od strane retrotranspozona, na ciljnim mjestima za
integraciju retrotranspozona (slika 5.53). Reverzna transkripcija
tada zapoinje unutar poli A slijeda na 3' kraju transpozonske RNA i
nastavlja se uzdu molekule. Suprotni lanac DNA sintetizira se
koritenjem drugog prekinutog kraja ciljne DNA kao poetnice, to
rezultira istovremenom sintezom i integracijom retrotranspozonske
DNA.
Drugi sljedovi koji ne kodiraju svoju vlastitu
reverznu-transkriptazu takoer se premjetaju putem RNA
intermedijera. Ovi elementi ukljuuju visokoponavljajue kratke
rasprene elemente (engl. highly repetitive interspersed elements
SINE) koji dolaze u otprilike 1.5 milijuna kopija u genomu sisavaca
(vidi poglavlje 4). Glavna porodica ovih elemenata kod ljudi
sastavljena je od Alu sljedova dugih otprilike 300 baza. Ovi su
sljedovi na svom 3' kraju bogati adeninom i omeeni su kratkim
duplikacijama nukleotidnog slijeda ciljne DNA pa su po tome
strukturno slini retrotranspozonima bez LTR sljedova (primjerice
LINE). SINE nastaju reverznom transkripcijom malih RNA molekula
ukljuujui tRNA molekule i male citoplazmatske RNA molekule ukljuene
u transport proteina. Kako SINE elementi vie ne kodiraju
funkcionalne RNA produkte oni predstavljaju pseudogene koji nastaju
putem RNA posredovane transpozicije. Pseudogeni mnogih
protein-kodirajuih gena (zvani procesirani pseudogeni) takoer
nastaju na slian nain reverznom transkripcijom glasnikih RNA
molekula (slika 5.54). Takvi procesirani pseudogeni lako se
prepoznaju ne samo zbog toga to zavravaju sljedom nukleotida
bogatim adeninom, ve i stoga to su introni prisutni u njihovim
funkcionalno odgovarajuim genima ovdje uklonjeni tijekom
procesiranja glasnikih RNA molekula. Smatra se da se transpozicija
SINE elemenata i drugih procesiranih pseudogena odvija slino
transpoziciji LINE elemenata. No, kako ovi elementi ne posjeduju
gene za reverznu-transkriptazu ili nukleazu, njihovo premjetanje
vjerojatno ukljuuje djelovanje reverzne-transkriptaze i nukleaze
kodiranih genima koji se nalaze negdje drugdje u genomu
najvjerojatnije drugim retrotranspozonima kao to su LINE
elementi.
Premda visokoponavljajui SINE i LINE elementi ine znaajan udio
genomske DNA, njihova transpozicija na nasumina mjesta u genomu po
svemu sudei nije od koristi za stanicu u kojoj su smjeteni. Kada se
integriraju na nova ciljna mjesta ovi transpozoni induciraju
mutacije koje su i poput onih izazvanih drugim imbenicima
najvjerojatnije tetna za stanicu. I zaista, mutacije nastale
transpozicijom LINE i SINE elemenata dovedene su u vezu s nekim
sluajevima hemofilije, miine distrofije, karcinoma dojke i
karcinoma debelog crijeva. S druge strane, neke mutacije nastale
premjetanjem pokretnih elemenata mogu biti korisne na taj nain to
doprinose evolucijskom razvoju vrste. Tako se primjerice pronalo da
neki retrotranspozoni u genomu sisavaca sadre regulatorne sljedove
koji kontroliraju ekspresiju susjednih gena.
Osim to imaju mutageni uinak, retrotranspozoni su odigrali
veliku ulogu u oblikovanju genoma stimuliranjem preslagivanja DNA.
Tako primjerice preslagivanje kromosomske DNA moe nastati uslijed
rekombinacija LINE elemenata integriranih na razliita mjesta u
genomu. Nadalje, sljedovi stanine DNA susjednih LINE elemenata
uestalo se prenose tijekom transpozicije to ima za posljedicu
njihovo premjetanje na nova mjesta u genomu. Kako se LINE elementi
mogu integrirati u aktivne gene, s njima povezana transpozicija
staninih DNA sljedova moe dovesti do stvaranja novih regulatornih
i/ili kodirajuih sljedova to direktno doprinosi evolucijskom
razvoju novih gena.
Velika veina pokretnih elemenata u ljudskom genomu nije aktivna
i svega je oko 100 kopija LINE elemenata koji jo uvijek sadre
protein-kodirajue sljedove potrebne za njihovu transpoziciju. Preme
tome, svi humani DNA transpozoni i veina retrotranspozona
predstavlja evolucijske relikte, a ne trenutno funkcionalne
elemente. Ipak, to nije sluaj kod drugih vrsta ukljuujui
Arabidopsis, C. elegans, vonu muicu i mia koji imaju mnogo veu
razinu postojee transpozonske aktivnosti. Tako su u genomu mia svi
LTR retrotranspozoni, LINE i SINE elementi aktivni. Procjenjuje se
da oko 10 % svih mutacija u genomu mia nastaje aktivnou transpozona
dok je svega 1 na 600 mutacija u genomu ovjeka uzrokovana
transpozicijom. Ovakva dramatina razlika u aktivnosti transpozona u
genomu mia odnosno ovjeka intrigira i tek e se razjasniti novim
istraivanjima.
4.4 Amplifikacija ili viestruko umnaanje gena
Preslagivanja DNA o kojima se do sada govorilo mijenjaju poloaj
DNA sljedova unutar genoma. Amplifikacija gena ili viestruko
umnaanje gena moe se promatrati kao drugaiji tip izmjena strukture
genoma ona naime poveava broj genskih kopija unutar stanice.
Amplifikacija podrazumijeva ponavljajuu replikaciju DNA ime se
proizvode viestruke kopije odreenih podruja (slika 5.55). Viestruko
umnoeni DNA slijed moe se nai ili kao slobodna ekstrakromosomska
molekula ili kao niz uzastopno ponavljajuih sljedova unutar
kromosoma. U oba sluaja dolazi do poveane ekspresije amplificiranog
gena zahvaljujui jednostavnoj injenici da je prisutno vie kopija
dostupnih za transkripciju.
U nekim sluajevima amplifikacija gena odgovorna je za razvojno
programirana poveanja ekspresije gena. Tipian primjer je
amplifikacija ribosomskih RNA (rRNA) gena u oocitama vodozemaca.
Oocite su iznimno velike stanice koje zahtijevaju poveanu sintezu
proteina. S obzirom na volumen oocite vodozemaca su oko milijun
puta vee od tipinih somatskih stanica pa moraju posjedovati velike
koliine proteina tijekom ranog razvoja. To zahtijeva poveanu
sintezu rRNA molekula to se jednim dijelom postie amplifikacijom
rRNA gena. Kao to je spomenuto u poglavlju 4, u somatskim stanicama
rRNA geni dolaze u nekoliko stotina kopija to je potrebno za
sintezu dovoljne koliine rRNA molekula nunih da se zadovolje
metabolike potrebe stanica. U oocitama vodozemaca ovi su geni
amplificirani dodatnih 2 000 puta na otprilike 1 milijun kopija po
oociti. Drugi primjer programirane genske amplifikacije odvija se u
genomu vone muice. Naime, geni u stanicama jajnika enki vone muice,
koji kodiraju proteine jajne ovojnice (korionski geni),
amplificirani su zato da bi se zadovoljila potreba za velikom
koliinom ovih proteina. Poput drugih programiranih preslagivanja
gena i amplifikacija gena je relativno rijedak dogaaj koji se
odvija u visoko specijaliziranim tipovima stanica, i ne moe se
smatrati uobiajenim mehanizmom regulacije gena.
Amplifikacija gena odvija se i kao nenormalni proces u zloudnim
tumorskim stanicama gdje dovodi do poviene ekspresije gena koji
doprinose nekontroliranom rastu stanica. Ovaj tip amplifikacije
gena prvi put je uoen u stanicama karcinoma koje su postale otporne
na metotreksat, lijek koji se uobiajeno koristi u kemoterapiji
karcinoma. Metotreksat inhibira enzim dihidrofolat-reduktazu koji
je ukljuen u sintezu dTTP-a i stoga je potreban za DNA sintezu.
Otpornost na metotreksat razvija se amplifikacijom gena za
dihidrofolat-reduktazu na taj nain to metotreksat ne moe vie
inhibirati djelovanje poveane koliine enzima
dihidrofolat-reduktaze. Osim toga, amplifikacija gena u stanicama
karcinoma uestalo rezultira poveanom ekspresijom gena koji
upravljaju proliferacijom stanica (onkogeni) te tako direktno
doprinose razvoju tumora (vidi poglavlje 15). Tako se primjerice
amplifikacija onkogena erbB-2 uestalo odvija u karcinomu dojke.
Prema tome, kao i kod drugih tipova preslagivanja DNA, posljedice
amplifikacije gena mogu biti korisne ali i katastrofalne za stanicu
ili organizam.
SAETAK
DNA REPLIKACIJA
DNA-polimeraze: Razliite DNA-polimeraze igraju specifine uloge u
replikaciji i popravku DNA kako u prokariotskim tako i u
eukariotskim stanicama. Sve poznate DNA-polimeraze sintetiziraju
DNA samo u 5' ( 3' smjeru dodajui dNTP na prethodno sintetizirane
poetnice.
Replikacijske ralje: Roditeljski lanci DNA molekule se razdvoje
i slue kao kalupi za sintezu dva nova lanca u replikacijskim
raljama. Jedan novosintetizirani lanac (vodei lanac) sintetizira se
kontinuirano dok se drugi lanac (zaostajui lanac) formira spajanjem
kratkih ulomaka DNA koji se sintetiziraju u obrnutom smjeru u
odnosu na sveukupni smjer replikacije. DNA-polimeraze i razliiti
drugi proteini djeluju koordinirano sintetizirajui i vodei i
zaostajui lanac DNA.
KLJUNI POJMOVI
DNA-polimeraza, mutagen
replikacijske ralje, Okazakijevi fragmenti, DNA-ligaza, vodei
lanac, zaostajui lanac, primaza, RNaza H, egzonukleaza, helikaza,
proteini koji veu jednolananu DNA, topoizomeraza
Vjernost replikacije: DNA-polimeraze poveavaju tonost
replikacije odabirom odgovarajue baze za unos u novosintetizirani
lanac i lektoriranjem novosintetizirane DNA na taj nain da
eliminiraju krivo sparene baze.
Ishodite i inicijacija replikacije: DNA replikacija zapoinje u
specifinom ishoditu replikacije koje sadri vezna mjesta za proteine
zaslune za poetak procesa replikacije.
Telomere i telomeraze - replikacija krajeva kromosoma:
Ponavljajui sljedovi nukleotida na krajevima kromosoma (telomere)
repliciraju se djelovanjem reverzne-transkriptaze (telomeraze) koja
sadri svoj vlastiti RNA kalup.
POPRAVAK DNADirektni obrat DNA oteenja: Nekoliko tipova estih
DNA lezija, poput pirimidinskih dimera i alkiliranih gvaninskih
ostataka, popravljaju se direktnim obratom oteenja.
Proofreading ili lektorirajua sposobnost DNA-polimeraze
ishodite replikacije, autonomno replicirajui slijedovi (ARS),
kompleks ishodita replikacije (ORC)
telomere, telomeraza, reverzna-transkriptaza
pirimidinski dimeri, fotorea