Top Banner

of 20

4pcr

Aug 07, 2018

Download

Documents

Yustia Sari
Welcome message from author
This document is posted to help you gain knowledge. Please leave a comment to let me know what you think about it! Share it to your friends and learn new things together.
Transcript

  • 8/20/2019 4pcr

    1/48

    Polymerase Chain Reaction

     ( PCR )

     Teknik amplifkasi in vitro sekuen DNA spesifk dalam suatu prosessiklik yang terdiri dari 3 steps reaksi : denaturasi, anealing primerdan ekstensi primer dengan bantuan polimerase DNA yangthermostabil, primer dan dNTPs

    Dalam PCR biasanya digunakan sepasang primer yang masing-masing komplementer dengan sekuen uung DNA target! Primer-

    primer tersebut disusun sedemikian rupa sehingga reaksi ekstensiprimer akan mengarahkan sintesis DNA se"ara berhadap-hadapan!

    Dalam RAPD atau AP-PCR yang digunakan adalah bukan primer

    spesifk, tetapi primer random untuk amplifkasi target random

  • 8/20/2019 4pcr

    2/48

    Polymerase Chain Reaction (PCR)

    ww2.mcgill.ca/biology/undergra/ c200a/f07-16.gi

    DNA melting 

    Primer annealing

    DNA elongation

    Nobel Prize in !emi"try 1##$%

    at age &'(ary )ulli"

    *in+ented P, in 1#'$

    PhD

    "The Cosmological Significance

    of Time Reversal,"  

    Biochemistry from U.C. Berkeley

  • 8/20/2019 4pcr

    3/48

    Exponential nature of PCR

    amplification

  • 8/20/2019 4pcr

    4/48

      #kema reaksiPCR

  • 8/20/2019 4pcr

    5/48

    PCR methods

    • PCR amplifies a gien se!uence inan exponential fashion

    • "n a perfect #orld$ after %& cycles$one starting copy of a gene #ouldyield '% copies of that *+ fragment

    , - illion copies

    • /tarting #ith 011 copies #ould yield%.2% ug of *+$ plenty to e ale tose!uence$ clone and isuali3e on anagarose gel

    • difficult to se!uence one copy of agene and detect

    • ery easy to se!uence some of the- illion copies and detect

  • 8/20/2019 4pcr

    6/48

    Polymerase Chain Reaction

    (PCR)

    • eeloped in the mid 04-1s

    • Reolutioni3ed molecular iology• *+ fragments can e amplified in large

    amounts

    • In vitro techni!ue• 5ary 6ullis 7 *oel pri3e (044%)

  • 8/20/2019 4pcr

    7/48

    8hat do #e need for PCR9

    • /e!uence information

    • :ligonucleotide primers

    • *+

    • *ucleotides

    • ;eat7stale *+ polymerase• Taq (Thermus aquaticus)

  • 8/20/2019 4pcr

    8/48

    PCR techni!ue

    ds *+

    /tep 0

    /tep '

    /tep %

    enature

     +nneal

    Extend

  • 8/20/2019 4pcr

    9/48

    1"t

     cycle

    2nd cycle

    $rd cycle

    &t! cycle

    t! cycle

    6t! cycle

    PCR amplifies DNA (gene)

  • 8/20/2019 4pcr

    10/48

    PCR• /teps in PCR reaction

     < denaturation• separate parent strands

    in preparation ne#

    strand synthesis

    PCR

  • 8/20/2019 4pcr

    11/48

    PCR

     < annealing

    • =stick> primers to theparent strands to prime

    *+ synthesis

    • *+ synthesis re!uires

    a primer to start *+synthesis

    PCR

  • 8/20/2019 4pcr

    12/48

    PCR < extension

    • addition of nucleotides$

    one at a time$ to the

    gro#ing end of the *+strand (%? end) using

    the parent strand as the

    template

     < cycle through '&7%&

    times

  • 8/20/2019 4pcr

    13/48

    PCR animation

  • 8/20/2019 4pcr

    14/48www.biotec!lab.nwu.edu/ e/ld022.!tm

    http://www.biotechlab.nwu.edu/pe/Sld022.htmhttp://www.biotechlab.nwu.edu/pe/Sld022.htm

  • 8/20/2019 4pcr

    15/48

    6elting Point @emperature

    • enaturation

     < @he more there is A or C$ the higher @m

     < @he longer the primers$ the higer @m• 1$' m

    @m -0$&DC 1$F0(GA GC) < &&1Hn

    nnumer of nucleotides

    I @m J 'DC

  • 8/20/2019 4pcr

    16/48

     +nnealing /tate @emperature

    • ependsK

     < Concentration of primers

     < Composition of nucleotides

    • *ormally takes only fe# seconds$ ut it is

    programmed to 1$&7' minutes

    • Building starts from the %?end

  • 8/20/2019 4pcr

    17/48

    8hat time does it take9

    • enaturationK %1 7 1 sec

    •  +nnealingK %1 7 1 sec

    • ouplingK %1 7 1 sec

    • '& 7 %& cycles only (other#ise en3yme decay causes

    artifacts)

    • 2'oC for & min at end to allo# complete elongation of

    all product *+

     +ltogetherK 2 min ( -$& min) L '& (%&) %h7&h

  • 8/20/2019 4pcr

    18/48u"e 34N5 or P,3)5, "oftware

    ry for e8ual m for bot! rimer"

  • 8/20/2019 4pcr

    19/48

    Critical Mactors for /uccessful PCR

    • E!uipment

    • @hermal cycling profile N cycle numer 

    • En3yme concentration• 6gCl' Concentration

    • d*@Ps Conc.

    • Primer se!uences• @emplate

  • 8/20/2019 4pcr

    20/48

    1.Equipment :

    a! Type o$ thermo"y"ler :

      - a""urately % reprodu"ibly 3 PCR in"ubationtemperature

      - Ramp

      - "y"le bet&een temperatures repeatedly %

    reprodu"ibly

    b! Type o$ rea"tion tubes:  a'e"t heat trans$er

      - ft pre"isely into &ells

      - thin &alls

  • 8/20/2019 4pcr

    21/48

    2.Thermal cycling profle & cycle numer

    ( )nitial denaturation: "ompletely denature "omple*genomi" DNA  a""essible $or primers

    ( Primer annealin: the most "riti"al $a"tor indesigning a high spe"if"ity PCR

    ( Primer e*tension:- opt!temp $or Ta+ DNA pol!

    ./C

      - 012 basesse"! .24 5622 bp

    . Denaturation step during "y"ling:

      - 7sually 86/C .24-324,

    too lo&  in"omplete snaps ba"k no a""es $orprimers

  • 8/20/2019 4pcr

    22/48

    Cycle numer

    -  7sually .6 9 36 "y"les

    -Cy"le number in"reasesnon spe"if" produ"tsa""umulate

    - Tends to plateau e'e"t4 :

      - utili;ation o$ substrates

  • 8/20/2019 4pcr

    23/48

  • 8/20/2019 4pcr

    24/48

    inal e*tension :-usually ./C 6-?6B

    -Promote "ompletion o$ partial e*tensionprodu"ts and annealing single stranded"omplementary produ"ts

  • 8/20/2019 4pcr

    25/48

    3! Taq DNA polymerase "on"entration :

    -ptimum 2!6 9 .!6 7

    -)n"rease en;!"on"

    de"rease spe"if"ity

    ! @gCl. "on"entration :

    -pt! 2!6-6!6m@,

    -in"rease in"rease PCR produ"t but de"reasespe"if"ity

    -@gE : - inFuen"es en;yme a"tiGity

    - in"rease Tm dsDNA % $orms soluble "omple*es&ith dNTPs to produ"e a"tual substrate that thepolymerase re"o+ni;e

    - Con"! @gE depends on "on"!"ompound that bindsthe ion su"h as dNTPs, Ppi, HDTA

  • 8/20/2019 4pcr

    26/48

    6! DNTPs "on"entration :

    -inbalan"ed dNTPs mi*tures  redu"e Taq fdelity

    -dNTPs redu"e $ree @gE inter$ering polymerase a"tiGity %

    de"reasing primer annealing

    6. Primers sequences:

    -should be: - no internal secondary structure

    -40 –75 G/C content-alanced distribution o! G/C " #/$ rich domains

    -%o com&lementary bet'een () end *no &rimer-dimers+

    -,&t.conc. 0. – 0.5 :

      - too lo' lo'er yields

      - too hih &romote mis&rimin " accumulation o! non s&eci!ic

    &roducts

  • 8/20/2019 4pcr

    27/48

    ! Template:

    -conc.should o&timi1ed

    -$oo little&rimers may not able to !ind taret

    -$oo much lead to increase mis&rimin

    -$em&late &urity in!luences outcome o! reaction.

    I!Jeneral &ork strategies to aGoid "ontamination

    -2aboratory bench " equi&ments

    -Cross contamination bet'een sam&les

    -Product !rom &re3ious PC am&li!ication

  • 8/20/2019 4pcr

    28/48

    Contoh apli!asi PCR

    1. "ete!si penya!it in#e!si

    2. "ete!si !ontaminasi agen in#e!sius

    $. "ete!si penya!it geneti! 

    %. "ete!si on!ogen

    . "ete!si polimorfsme 'alam populasi

    . nalisis e*olusi+. ,eperluan penyi'i!an

    -. ela!u!an mutagenesis

    /. ,eperluan riset lain

  • 8/20/2019 4pcr

    29/48

     APLIKASI BIOTEKNOLOGI dalam

     pengedalian dan pemberantasan

     penyakit •  +.eteksi dini

     < eteksi dengan immunoassay K

     < EO"/+$ "munohiridisasi$ "munositokimia

     < eteksi dengan pelacak *+ K

     < ;iridisasi *+

     < eteksi dengan PCR K < 5ualitatif 

     < 5uatitatif K Competitie PCRHOight PCR

    • B.pengemangan aksin

  • 8/20/2019 4pcr

    30/48

  • 8/20/2019 4pcr

    31/48

    0 " "0345EPT5P0R

  • 8/20/2019 4pcr

    32/48

  • 8/20/2019 4pcr

    33/48

    C5PET0T06E PCR 75R 894T0TT054 57C;"0 TRC5T0

  • 8/20/2019 4pcr

    34/48

    nalysis o# 35 #oo' y PCR

    (J@ produ"t 9 approGed by e*pert "ommittee

    (J@ produ"t 9 distinguished by labelling

    H*pl!: soybean introdu"tion o$ a glyphosate resistant

      - 6-enol-pyruGinyl shikimate-3phosphate synthase

  • 8/20/2019 4pcr

    35/48

    SUMBER NA

    • iisolasi dari organisma yang akan diuat

    pustaka genomiknya

    • itentukan metoda isolasi yang sesuai

    • isiapkan dalam kemurnian yang tinggi

    • /iap dilakukan fragmentasi dengan en3im

    endonuklease restriksi

  • 8/20/2019 4pcr

    36/48

    Te!ni! analisis polimorfsma erasis PCR

    (PCR 'engan primer spesif!

    (PCR 'engan primer semispesif! (rep

  • 8/20/2019 4pcr

    37/48

  • 8/20/2019 4pcr

    38/48

    Single-Step PCR for

    Detection of Brucella spp. 

    From Blood and Milk ofInfected Animals

    ournal of Clinical 6ikroiology$ec 044&$p %1-27%141

  • 8/20/2019 4pcr

    39/48

    Latar Belakang

    • Brucellosis diseakan oleh akteri gram negatif

    yang termasuk genus Brucella• B. melitensis penyea utama rucellosis

    pada kaming dan manusia di 6exico

    • /etelah periode akut patogen iniersemunyi di cairan tuuh mahluk yang telah

    terinfeksi darah dan susu

    • eteksi secara serologi dan mikroiologi

    kurang sensitif dan spesifik perludikemangkan metode aru PCR

    !

  • 8/20/2019 4pcr

    40/48

    u!uan 

    6emuktikan kemampuan$tingkat kesensitifandan tingkat kespesifikan dari /ingle7/tep PCR 

    untuk mendeteksi darah$ susu pada kaming

    dan manusia yang terinfeksi Brucella spp.

    6emandingkan hasil /ingle7/tep PCR dengan

    uQi serelogi dan analisa mikroiologi untuk

    mendeteksi darah$ susu pada kaming dan

    manusia yang terinfeksi Brucella spp.

  • 8/20/2019 4pcr

    41/48

    Cara "er!a

    • Persiapan sampel

    /ampel positif  strain Brucella spp.

    kaming yang terinfeksi

    pasien rucellosis

    /ampel negatif  strain akteri yangmemiliki huungan dengan Brucellaspp.ekstrak *+ dari manusia$ kaming dan

    sapi yang elum pernah diaksin$dinyatakaneas Brucella spp. setelah melakukan uQiserologi dan analisa mikroiologi

  • 8/20/2019 4pcr

    42/48

    • UQi /erologi

    4 ml darah (kaming$sapi$manusia yang terinfeksi)

    iagi dalam % ali!uot

    % ml tidak ditamah dengan antikoagulan

    ilakukan uQi fiksasi

  • 8/20/2019 4pcr

    43/48

    •  +nalisa 6ikroiologi

    % ml darah yang mengandung antikoagulandikultur dalam medium Rui37Castaneda Biphasic$

    posisi ertikal pada suhu %2C

    arah yang ada dalam ali!uot ditanam pada

    agar standrad untuk pertumuhanBrucella spp.selama% minggu

    Oapisan lemak agian atas susu ditanam pada

    agar untuk pertumuhan Brucella spp. yang

    mengandung antiiotik diinkuasi pada suhu

    %2C dalam kondisi aeroik

  • 8/20/2019 4pcr

    44/48

  • 8/20/2019 4pcr

    45/48

    @ael. /pesies dan ioar yang digunakan 

    Aamar. Peta amplifikasi gen omp 2 dengan primer

  • 8/20/2019 4pcr

    46/48

    Aamar. Peta amplifikasi gen omp 2  dengan primer

    PM$PR dan *+ Brucella

    @ael. ;asil deteksi Brucella sp dengan eragai

  • 8/20/2019 4pcr

    47/48

    @ael. ;asil deteksi Brucella sp dengan eragai

    metode

  • 8/20/2019 4pcr

    48/48

    "esimpulan

    • 6etode /ingle7/tep PCR mempunyai

    kesensitifan dan kespesifikan yang tinggi

    • 6etode /ingle7/tep PCR leih sensitif dan

    spesifik diandingkan dengan uQi serologi

    dan analisa mikroiologi untuk mendeteksi

    darah $susu pada kaming dan manusia

    yang terinfeksi Brucella spp