3

Sebagai hasil dari penemuan bahwa fl avonoids secara langsung atau tidak langsung terhubung ke kesehatan, fl metabolisme avonoid dan molekul yang menarik yang merupakan produk alami pada tanaman, telah menarik perhatian baik industri dan peneliti yang terlibat dalam ilmu tanaman, nutrisi, bio / kimia, bioteknologi kimia, farmasi, obat-obatan, dll Selanjutnya, dalam beberapa tahun terakhir, fl avonoids menjadi berita utama di industri farmasi, yang terus-menerus mencari cara baru untuk memproduksi obat fi sien aman dan ef. Kultur sel mikroba dapat bertindak sebagai pekerja keras bio-pabrik dengan menawarkan mesin metabolisme mereka untuk tujuan mengoptimalkan kondisi dan meningkatkan produktivitas suatu fl avonoid selektif. Selain itu, metodologi rekayasa metabolik digunakan untuk memperkuat apa yang alam melakukan yang terbaik dengan memperbaiki kekurangan dan mati-ujung jalur metabolisme. Teknik biosintesis kombinasi menyebabkan penemuan cara baru menghasilkan tumbuhan alami dan bahkan tidak alami fl avonoids, sementara, di samping itu, rekayasa metabolik yang disediakan industri dengan kesempatan untuk berinvestasi dalam biologi sintetis untuk mengatasi dibatasi diversifikasi dan produktivitas masalah yang ada saat ini di protokol kimia sintetik. Dalam ulasan ini, disajikan update pada pendekatan dirasionalisasi untuk produksi avonoids fl alam atau tidak wajar melalui bioteknologi, menganalisis signifikansi biosintesis kombinasi dari senyawa pertanian / farmasi yang diproduksi dalam organisme heterolog. Juga disebutkan adalah strategi dan prestasi yang sejauh ini berkembang pesat di bidang biologi sintetik, dengan penekanan pada teknik metabolik menargetkan optimalisasi seluler mikroorganisme dan tanaman yang menghasilkan avonoids fl, sementara menekankan kemajuan dalam fluks kontrol dinamis dan optimasi. Akhirnya, keterlibatan jumlah meningkat pesat dari genom berkumpul yang berkontribusi terhadap gene- atau jalur-pertambangan untuk mengidentifikasi gen (s) bertanggung jawab untuk memproduksi spesies-spesifik metabolit sekunder juga dianggap disini.Kata kunci: biosintesis fl avonoid, avonoids fl wajar, rekayasa metabolik, regulasi yang dinamis, kontrol metabolik, metabolit sekunder, biosintesis kombinasi

PENDAHULUAN  Flavonoid diketahui diproduksi oleh semua tanaman terestrial. Mereka terdiri dari kelompok besar senyawa alami yang berasal dari metabolisme fenilpropanoid, yang telah berkembang pada tanaman untuk menghasilkan sejumlah besar saling terkait fl avonoid struktural tulisan (Gambar 1). Berbagai ulasan telah muncul yang menggambarkan secara rinci rute metabolik serta kelompok besar dan kecil yang fl avonoids jatuh ke (Winkel-Shirley, 2001; Andersen dan Markham, 2006; Ververidis et al, 2007;.. Gholami et al, 2014) . Dalam metabolisme fenilpropanoid, metabolit cabang untuk membentuk kelompok tertentu fi c seperti yang disajikan pada Gambar 1 (yaitu, fl avonoids, stilbenoids, lignin, dll). Nama "fenilpropanoid" berasal dari kelompok fenil aromatik dan ekor threecarbon dari fenilalanin awal, yang kemudian bioconverted pertama asam sinamat, dan kemudian ke p-coumaricAsam (Gambar 2). Penambahan kelompok koenzim A kepada mereka asam hydroxycinnamic mengaktifkan molekul-molekul untuk subse- quent enzimatik dekarboksilasi dan kondensasi dengan tiga diaktifkan molekul malonil-CoA. Reaksi ini dikatalisis oleh sintase poliketida III (Chalcone Synthase, CHS) untuk CRE chalcones makan, molekul prekursor sebenarnya dari backbone.These avonoid fl kemudian dikonversi ke fl avanones melalui penggunaan Chalcone Isomerase (CHI) (Andersen dan

Markham 2006). Pada langkah selanjutnya, diversifikasi dihasilkan oleh aksi berurutan "dekorasi" enzim pada backbone avonoid fl. Flavonoid tampaknya berfungsi agen regulasi internal (Stafford, 1991), sedangkan dalam tahap evolusi kemudian, mereka funtioned sebagai tapis terhadap sinar ultraviolet (Stapleton dan Walbot, 1994). Fl seperti avonoid memproduksi organisme, baik dengan

kompleksitas seluler yang lebih rendah atau lebih tinggi, berevolusi untuk bertahan hidup di lingkungan yang bermusuhan, baik dari segi biotik dan abiotik stres (Demain dan Fang, 2000). Selain itu, di bawah tekanan seleksi alam, mereka metabolit, terlepas dari peran penting mereka dalam fungsi fisiologis lainnya, juga merupakan bagian penting dari mekanisme perlindungan, baik dengan langsung morti fi ca- tion atau penghambatan fungsi tertentu dari organisme menyerang (Bennett dan Wallsgrove, 1994). Produk tanaman alami seperti yang berasal dari chorismate dan jalur shikimate metabolisme primer, menunjukkan keragaman kimia mengesankan disebabkan oleh evolusi tumbuhan (Demain dan Fang, 2000). Memanfaatkan mekanisme molekuler sintesis dan bene fi sifat resmi mereka untuk kesehatan manusia (Ververidis et al., 2007), kita akan mampu merancang dan membuat alat nological biotech- yang akan membentuk posisi kami di medan pertanian dan gizi serta sebagai industri vertikal pharmaceu-, bersamaan mempromosikan kesehatan dan perlindungan konsumen. Namun, ekstraksi molekul-molekul dari sumber tanaman tidak menghasilkan jumlah yang cukup besar untuk memenuhi permintaan pasar yang meningkat. Isolasi atau pemurnian dariproduk alami menggunakan proses ekstraksi konvensional, terutama mengenai mereka ditujukan untuk penggunaan komersial, tampaknya terbatas karena tingkat konsentrasi yang rendah ini icals phytochem- pada tanaman, sebagai lawan biomassa tanaman yang tinggi. Selain itu, proses ini memakan waktu, mahal, boros dalam hal sumber daya alam dan, kadang-kadang, tidak aman lingkungan karena penggunaan pelarut selama isolasi dan puri prosedur fi kasi. Hal ini telah menjadi jelas bagi masyarakat, sehingga menarik perhatian para ilmuwan, bahwa kebutuhan industri menuntut platform ekstraksi alternatif, fi pengurangan signifikan dari biaya yang berkaitan dengan isolasi dan puri fi kasi praktek dan peningkatan substansial dari tingkat ketersediaan. Kemajuan terbaru di bidang bioteknologi mikroba memiliki secara signifikan mendukung ekspresi cara path- metabolik sebagian atau seluruh, allowingthebiosynthesisofhighvalueend-products.Inthis proyek, kami meninjau rekayasa metabolik saat pendekatan untuk mencapai konsentrasi dieksploitasi dari fl alam avonoid pound com- dalam mikroorganisme, dengan aplikasi potensial dalam industri. Kami juga memperkenalkan beberapa upaya penelitian yang bertujuan untuk menghasilkan fl wajar analog avonoid (non-native disintesis oleh tanaman) dengan menggunakan pendekatan dalam vivo.

KERAGAMAN FLAVONOID sebagai metabolit sekunder yang PERTANIAN DAN / ATAU FARMASI PENTINGNYABeberapa karakteristik membedakan avonoids fl dan metabolit sekunder lainnya dari zat-zat dari metabolisme primer. Lebih khusus lagi: (i) ada kecenderungan untuk akumulasi dalam jaringan tertentu atau organ, contoh menjadi avonols fl dalam kulit anggur (ii) Theirdistributionislimitedtocertaintax- unit onomic, sebagaimana dibuktikan oleh iso fl avonoid biosintesis dalam spesies (Muetal, 2014.). keluarga Fabaceae tanaman (Reynaud et al., 2005). (iii) Mereka perkembangan diatur, seperti yang dibuat jelas dengan kultur

jaringan yang mampu menghasilkan metabolit sekunder, meskipun sel tanaman memiliki informasi genetik yang diperlukan (Wink, 2003) .Akhirnya, (iv) aktivitas theyarelikelytopossessbiological misalnya, dalam organism- interaksi organisme atau diferensiasi organisme (Haslam, 1995). Kemajuan dalam metabolomik memberikan kesempatan untuk mengidentifikasi secara akurat beragam bahan kimia yang diproduksi oleh organisme. Keragaman tersebut, yang merupakan hasil dari proses yang sedang berlangsung lutionary evo-, ada tidak hanya antara spesies yang berbeda atau genera, tetapi juga dalam diri individu yang sama, meskipun tidak pada tingkat yang sama. Kemajuan biologi struktural dan molekuler telah mengungkapkan bahwa mutasi dan duplikasi gen adalah prosesbertanggung jawab atas kation modi fi terus menerus dari enzim yang terlibat dalam biosintesis avonoid fl (Noel et al., 2005). Mekanisme tersebut dapat menghasilkan produksi berbagai senyawa, karena aksi enzim dan kompleks enzim pada struktur dasar jalur metabolik. Enzim yang terlibat dalam fl avonoid jalur biosintesis tampaknya telah berevolusi dengan cara ini, sehingga menyebabkan katalis yang dapat menyebabkan baik ke wilayah-spesifik kondensasi atau glikosilasi, acy- lation, prenilasi, sulfation, metilasi atau isomerisasi. Dalam hal itu, tampak bahwa avonoid memproduksi organisme fl mampu mensintesis molekul inti, seperti fl avanone narin- Genin. Molekul ini kemudian diproses kemungkinan hilir oleh beberapa kelas enzim (misalnya, hydroxylases, isomerase, dll,) untuk membentuk produk akhir fl avonoid, seperti tyol eriodic- atau dihydroxykaempferol [untuk jalur lihat Gambar 2 dari ulasan ini dan Gambar 3 di Ververidis et al. (2007)]. Selain itu, fitur umum dari banyak organisme menggunakan enzim yang dapat memanfaatkan aktivitas mereka pada berbagai jenis substrat. Sebagai contoh, enzim fl avonol sintase mengkatalisis oksidasi fl avanonol ke fl avonol baik menggunakan dihydrokaempferol atau dihydroquercetin sebagai substrat, dan memproduksi kaempferol atau quercetin masing-masing. Campuran seperti disentesis lites metabo mengakibatkan pembentukan perisai kimia yang digunakan baik

untuk mempertahankan atau untuk beradaptasi (Dixon dan Paiva, 1995; Harborne dan Williams, 2000). Pertanyaan yang timbul adalah mengapa ada kimia seperti diver- sity. Dalam upaya untuk menjawab pertanyaan ini, kita akan menjelaskan beberapa prinsip biologi evolusi. Seleksi alam adalah satu-satunya penjelasan untuk adaptasi dan dapat bertindak pada populasi hanya jika ada variasi di antara para anggotanya dan jika variasi tersebut adalah acak terhadap arah adaptasi (Jenke- Kodama et al., 2008). Dengan definisi, tingkat keragaman genetik populasi sebanding dengan potensi dari penduduk yang sama untuk beradaptasi dengan perubahan lingkungan. Namun, dengan sengaja memperpanjang arti keragaman genetik, dapat dianggap sama dengan keragaman kimia. Menurut prinsip ini, Doing pop ditandai dengan signifikan fi heterogenitas genetik tidak bisa konsekuen juga ditandai dengan heterogenitas kimia. Heterogenitas ini mungkin hasil dari keberadaan ber num besar alel gen yang melakukan reaksi kimia inti yang sama (misalnya, C-3 hidroksilasi avanones fl). Setelah ini, enzymevariantsmayacceptdifferent yang berbeda (mirip) substratesandper- membentuk reaksi kimia yang sama untuk produksi produk akhir yang berbeda. Orang-orang lebih mungkin untuk dipertahankan dalam lingkungan yang berubah, karena saham genetik yang kaya lebih mungkin mengandung gen yang mendukung adaptasi individu dalam kondisi lingkungan yang baru. Ide ini juga setuju dengan asumsi Firn, yang menyatakan bahwa itu adalah properti

langka bagi setiap molekul untuk memiliki aktivitas biologis yang kuat. Dengan demikian, organisme harus menghasilkan sebanyak variabilitas kimia mungkin agar toincreasetheprobabilityto fi ndamoleculethat fungsi fi tsintoacertain (Firn dan Jones, 2000). Ini juga memberikan potensi untuk menghasilkan banyak struktur yang berbeda dengan meminimalkan sumber daya genetik. Jika, misalnya, satu set tujuh gen yang diperlukan untuk produksi kaempferol dari fenilalanin, variasi alel yang diperoleh evolusi yang hydroxylates C-3? posisi B fl avonoid cincin (yaitu, fl avonoid 3 hidroksilase;?? F3 H), akan memimpin fl avonol sindrom thase (FLS) untuk produksi dua fl avonols bukan satu; kaempferol dan quercetin (Trantas et al., 2009). Demikian pula, ekspresi synthase resveratrol (RS) pada buah anggur yang timbul dari chalcone synthase (CHS) duplikasi (Rausher, 2006), adalah responsiblefortheproductionofresveratrol thatbelongstoanew kelas non fl avonoid fenilpropanoid senyawa. Oleh karena itu, tampak bahwa RS dan CHS bertanggung jawab atas diversifikasi metabolisme fenilpropanoid yang mengarah ke produksi benoids stil-, avonoids fl dan keturunan mereka masing-masing (Ververidis et al., 2007). Mengingat sejumlah besar organisme dan dengan demikian jumlah peru- besar interaksi yang ada, jumlah metabolit sekunder mengambil bagian dalam mekanisme penyesuaian diharapkan sangat tinggi. Oleh karena itu jelas bahwa alam adalah sumber yang unik dari masukan dalam upaya fi nd dan menciptakan produk-produk obat baru yang potensial.Flavonoid KOMBINATORIAL BIOSINTESIS PERTANIAN / PHARMACEUTICAL PENTINGNYA  Selama beberapa dekade terakhir, ketersediaan yang tidak memadai bahan sumber dari mana phytochemical yang diekstrak, serta kompleksitas produksi produk ini melaluiconventionalchemicalsynthesis, resultedinthegradualreduction dari Pharma-makanan-dan minat industri Agro dalam mengembangkan aplikasi alam berbasis produk komersial. Hal ini sering com- secara komersial layak untuk mensintesis molekul kimia bioaktif, awalnya diproduksi dari tanaman dengan beberapa ity complex- struktural menggabungkan biaya produksi rendah dan menuntut kemurnian. Meskipun sintesis kimia memungkinkan desain ditargetkan senyawa baru dengan fungsi ditingkatkan atau bahkan baru, teknik rekayasa metabolik tampaknya mendapatkan dasar (Otero dan Nielsen, 2010). Karena produk tumbuhan alami biasanya tidak memiliki nilai gizi tetapi ketika dimasukkan dalam diet dapat meningkatkan sistem kekebalan tubuh atau melindungi tubuh manusia dari radikal bebas atau bahkan mencegah atau menekan karsinogenesis, permintaan dipasarkan akan terus puncak. Selain itu, karena keragaman kimia terbatas dan kompleksitas struktural perpustakaan sintetis kimia, serta karena sukses besar obat produk yang diturunkan alami di pasar dalam beberapa tahun terakhir, skrining sumber daya yang belum dimanfaatkan biologi untuk produk alami yang baru diharapkan untuk dilanjutkan dalam waktu (Marienhagen dan Bott, 2013). Banyak jalur biosintesis untuk produk tumbuhan alami telah dijelaskan melalui kemajuan dalam ing DNA sequenc-, dalam kombinasi dengan teknologi baru DNA rekombinan. Selain itu, teknologi inovatif telah muncul mengandalkan bakteri, ragi atau tanaman biotransformations berbasis sel menargetkan in vivo biosintesis untuk produksi skala besar produk alami dalam kondisi yang terkendali, dalam upaya untuk gener- makan produk alami baru, dan untuk produksi produk alami yang langka dan mahal (Mora-Pale et al., 2014). Strategi produksi pro tersebut sangat spesifik, yang dikendalikan sepenuhnya dan tidak memberikan kontribusi terhadap pencemaran lingkungan. Terlebih

lagi, pemulihan produk yang dihasilkan jauh lebih mudah daripada ekstraksi produk alami atau sintesis kimia konvensional, karena produk samping yang lebih sedikit dan kurang limbah yang dihasilkan. Untuk tujuan ini, industri bioteknologi fl ourished. Signifikan kerja fi kan telah dilakukan untuk menghasilkan berbagai macam produk alami, analog mereka, serta kelas yang berbeda intermediet berguna seperti isoprenoidnya, fl avonoids, stilbenes, polisakarida dan teins glikoprotein, dan alkohol (Abdullah et al., 2008). Zat-zat ini memiliki aplikasi potensial sebagai obat-obatan, bahan kimia mendefinisikan dan bahan bakar bio (Otero dan Nielsen, 2010; van Summeren-Wesenhagen dan Marienhagen, 2013). Sincethemid-tahun 1980-an, ology advancesingeneticengineeringmethod- menyebabkan perkembangan dari pendekatan alternatif, digambarkan sebagai biosintesis kombinasi, untuk menghasilkan molekul baru dari produk alami. Alasan untuk ini adalah bahwa tanaman merupakan sumber yang sangat kaya produk bioaktif yang memiliki potensi yang sangat besar untuk penemuan obat. Biosintesis kombinasi terdiri dari serangkaian metode yang membentuk kombinasi enzim-substrat baru in vivo yang mengarah pada tesis biosyn- senyawa baru, alam atau bahkan tidak alami, yang dapat digunakan dalam program penemuan obat (Chemler et al., 2007). Teknik-teknik yang terlibat dalam biosintesis kombinasi dapat dirangkum ke dalam kategori berikut (Pollier et al, 2011; Cress et al, 2013..): (I) bio-transformasi, di mana senyawa alami atau non yang dimodifikasi oleh berbagai jenis biocatalysts (sel utuh, ekstrak sel, atau enzim puri fi kasi); (ii) memberi makan bermutasi (rekombinan) biocatalysts dengan prekursor non-alami

senyawa, yang terakhir mengarah ke mutasynthesis, metodologi semi-sintetik (Chemler et al, 2007;. Bhan et al, 2014.); (iii) com- metabolisme binatorial in hibrida yang berevolusi dari penyeberangan dalam aksesi yang berbeda, kultivar, atau genotipe spesies tumbuhan, atau bahkan interspeci fi c seksual atau somatik tion hybridiza-; (iv) aktivasi metabolisme diam melalui aktivasi faktor transkripsi yang relevan; dan (v) biologi sintetis atau kompilasi kombinasi gen dalam heterolog (tanaman) host. Pada bagian ini, kita membahas beberapa contoh negara-of-the-art metode biosintesis kombinasi yang dihasilkan fl avonoid molekul dari mikroba host. Dalam hal itu, sebuah aplikasi penting dari rekayasa metabolik adalah hasil produksi senyawa alami diversi fi kasi. Strategi biosintesis kombinasi dikembangkan oleh Naesby dan rekan kerja nya yang bekerja modi eYACs fi kasi (ragi dinyatakan Arti fi cial Kromosom) untuk ekspresi gen tanaman dalam ragi (Saccharomyces cerevisiae) (Naesby et al., 2009). Penggunaan vektor ini memungkinkan ekspresi gabungan dari sejumlah besar gen dari berbagai sumber berniat untuk berfungsi dalam kombinasi acak yang mengarah ke biosintesis berbagai avonols fl. Pendekatan kombinasi ini menghasilkan penciptaan 5-7 langkah variabel majelis jalur, masing-masing mengubah fenilalanin dan / atau tirosin metabolit ragi ke avonoids fl, biasanya hanya producedbyplants.Whenrandomlypickedcloneswereanalyzed, sekitar setengah dari mereka memamerkan produksi fl a- vanone naringenin, dan sepertiga dari mereka menghasilkan fl avonol kaempferol dalam berbagai jumlah. Biosintesis kombinasi adalah metode yang menetapkan baru kombinasi enzim-substrat in vivo. Strategi inovatif yang menggabungkan enzim yang tampaknya tidak berfungsi bersama-sama di alam, dapat langsung transgenik host untuk tion produksi heterolog produk alam yang langka yang tidak menumpuk pada tanaman (Fukushima et al., 2013). Akibatnya, penerapan metodologi biologi thetic sindrom dapat menyebabkan pengembangan obat

baru melalui biosintesis kombinasi dari Ditanam produk alami yang berasal (Cress et al, 2013;. Gholami et al, 2014.). Potensi tersebut telah dibuktikan oleh produksi senyawa avonoid beragam fl dari mikroba ketika diberi makan dengan berbagai alami dan tidak alami (misalnya, halogen) turunan asam sinamat, yang berpotensi penting untuk industri farmasi (Chemler et al., 2007). Alasan lain mengapa avonoids fl menjadi menarik adalah karena mereka telah terbukti untuk bertindak sebagai pencegah mikroba dan agen anti-infeksi pada tanaman (Trantas et al., 2009). Fowler dan rekan-rekan kerjanya, saat bekerja mencoba untuk meningkatkan efektivitas avonoid fl terhadap beberapa infeksi dengan memungkinkan pengangkutan molekul beracun ke dalam spesies yang menginfeksi, menunjukkan bahwa sintesis kombinasi dari avanones fl non-alami bisa iDEN- tifikasi agen anti-mikroba novel dengan aktivitas terhadap bakteri dan jamur, tetapi dengan toksisitas minimal untuk sel manusia (Fowler et al., 2011). Selain itu, telah menunjukkan bahwa dengan cara com- binatorial mutasynthesis fl avonoids analog dari asam akrilik dapat diproduksi dalam jumlah besar dan sangat murni menggunakan mendasi platform produksi rekombinan (Chemler et al., 2007). Dalam karya itu, Chemler dan rekan-rekan kerjanya mampu biosynthesize baru fl avanones dan dihidro fl avonols dari sejumlah acrylicacids.Thisonceagainindicatedthatthe aromatik fl avonoidnetworkmenunjukkan substrat yang luas spesifik kota. Mutasynthesis melibatkan sintesis kimia substrat non-alami yang mirip dengan struktur substrat alami. Setelah perpustakaan analog non-alami dibuat, konversi enzimatik dari analog non-alami dilakukan oleh bermutasi (rekombinan) biocatalysts untuk mengisolasi senyawa non-alami baru. Hasil kemudian dapat dinilai untuk menjelaskan mekanisme katalisis enzimatik dan menentukan substrat spesifik persyaratan fi kota (Bhan et al., 2014). Ini disebut pendekatan semi-sintetik, atau kombinasi dari sintesis kimia dan biosintesis, juga telah digunakan untuk produksi iso non-alami fl avonoids. Derivatif fitokimia memiliki potensi untuk digunakan dalam tics therapeu- manusia, sebagai mikroba mengkatalisis reaksi-reaksi baru telah diisolasi dari usus manusia dan seharusnya memiliki bene fi dampak kesehatan resmi pada host manusia mereka (Cress et al., 2013).

Sebuah UPDATE LANCAR PADA METABOLIK ENGINEERING DATA TERAPAN UNTUK farmakologi dan industri penting FLAVONOID-PENEKANAN PADA NOVEL DAN METABOLIT BIOAKTIF wajar  Pada bagian sebelumnya, telah disebutkan bahwa kombinasi yang biosintesis torial telah digunakan untuk menghasilkan berbagai bentuk alami atau tidak wajar dari avonoids fl di berbagai host mikroba. Tanaman yang juga dapat digunakan sebagai tuan rumah telah dinilai kurang menguntungkan dibandingkan dengan sistem mikroba, karena tence exis- masalah teknis yang terkait dengan mereka (Mora-Pale et al., 2013). Biosintesis produk alami dalam mikroba host atau tanaman menggunakan sumber energi yang berasal dari metabolisme primer. Metabolisme Shikimate feed asam amino pendahulu jalur propanoid phenyl- (Gambar 1). Sukses fluks pengalihan dari metabolisme utama untuk jalur sekunder heterolog tergantung pada banyak faktor (strain tuan rumah, media nutrisi, kondisi pertumbuhan dll). Dua pendekatan utama yang diterapkan untuk produksi avonoids fl di heterolog host. Dalam prekursor melengkapi pendekatan, jalur heterolog diberi makan dengan baik lalanine pheny- atau tirosin yang kemudian diubah menjadi ing berkoresponden fl avonoid (Gambar 1). Meskipun melengkapi budaya mikroba dengan prekursor mahal mungkin layak untuk percobaan skala kecil, itu sangat menghambat

industri aplikasi- tanggung. Terbarukan, sederhana dan murah sumber karbon, seperti glukosa dan gliserol, secara khusus diinginkan untuk produksi farmasi atau bahan kimia industri atau protein. Dalam pendekatan kedua, insinyur berusaha untuk menghasilkan produk pemikiran fermentasi dengan kebutuhan rendah masukan energi. Untuk mencapai hal ini, modifikasi genetik fi kasi dari strain host diperlukan dalam rangka untuk itu untuk menjadi overproducer asam amino aromatik, sehingga menyelesaikan masalah ketersediaan prekursor awal rendah. Selama proses tasi fermen-, asam amino aromatik yang tersedia ditujukan untuk jalur avonoid fl dan disediakan oleh metabolisme primer, mungkin tidak cukup untuk memberi makan secara substansial dengan cara path- heterolog. Pemanfaatan overproducers asam amino aromatik akan menunjukkan kinerja ekonomi yang optimal mengenai hasil pemikiran fermentasi dari biosintesis avonoid fl ditargetkan. Saat ini, platform biologis yang paling dimanfaatkan metaboli- callyengineeredfortheheterologousproductionof fl avonoidsare mikroba bioindustri Escherichia coli dan ragi pemulawww.frontiersin.org Januari 2015 | Volume 6 | Pasal 7 | 5Trantas et al. Rekayasa metabolik avonoids flS.cerevisiae.Thestrongestargumentforutilizingmicroorganisms untuk rekayasa metabolik produk tumbuhan alami adalah tingkat tinggi tractability genetik mereka (Cress et al., 2013). Selain itu, banyak set data dan alat biologi molekuler tersedia untuk manipulasi lancar genetik, karakterisasi, modeling, dan skala-up. Ini fleksibilitas genetik mengurangi badan-inadequa- eksperimental sehingga membatasi faktor yang tidak diketahui, dan memungkinkan untuk lebih cepat, eksperimentasi lebih dapat diprediksi dan pengumpulan data. Untuk fungsional mengungkapkan satu set gen untuk pemulihan dari jalur heterolog, seorang peneliti harus berurusan dengan serangkaian parameter misalnya, pemilihan tuan rumah, pemilihan sumber gen, sistem ekspresi, kekuatan promotor, jumlah copy plasmid / gen, aerasi, suhu, pH, atau suplemen gizi. Optimalisasi tersebut parameter-parameter akan menghasilkan kondisi fermentasi ditingkatkan sehingga karbon aliran akan optimal (Mora-Pale et al., 2013), sehingga meningkatkan hasil dari senyawa target pada himpunan parameter yang digunakan. Tions Thismulti-factorialapproachgivesspaceforvariouscombina- yang pada akhirnya akan menghasilkan berbagai fi nal titer. Data dari percobaan independen untuk biosintesis dari fl a- vanone pinocembrin menunjukkan fi nal fl avanone titer mulai dari 40to429mg / L (Tabel 1) .InTable 1, reporteddataconcerningthe tingkat heterologousproductionlevelsfromvarious fl avonoidgroupscan befound.Particulareffortismadetocomparethesetiterswiththe dari mereka tanaman yang dihasilkan fl avonoids. Sebagaimana dibahas dalam bagian terdahulu, protokol biosintesis kombinasi baru-baru ini memberikan kita kesempatan untuk menghasilkan fl wajar molekul avonoid (tidak diproduksi dari tanaman atau organisme lain).Flavanon flavanon mewakili sekelompok senyawa dengan sangat Menariknya ing sifat farmakologi (Ververidis et al., 2007). Mereka adalah yang pertama disintesis senyawa fl avonoid, dari mana semua avonoids fl lainnya dihasilkan (Gambar 2). Ada banyak contoh dibangun strain mikroba yang menerima molekul prekursor yang relevan dan bio-mengubahnya menjadi fl avanone sesuai. Misalnya p-sinamat asam, fenilalanin, dan tirosin diubah menjadi pinocembrin, naringenin dan eriodictyol di titer 429mg / L (E. coli, Leonard et al., 2007), 8.9mg / L (S. cerevisiae, Trantas et al. 2009), dan 107mg / L (E. coli, Zhu et al., 2014) masing-masing, (Tabel 1). Dalam semua kasus di atas, ekspresi

gen terlibat diinduksi dan mengakibatkan berbeda tetapi rel- atively rendah titer. Namun, Leonard et al. (2007) serta Zhu et al. (2014), rekayasa host heterolog mereka dengan meningkatkan metabolisme mary primer untuk menghasilkan peningkatan kadar malonil-CoA. Dalam serupa set-up, E. coli direkayasa untuk memberikan genangan malonil-CoAneededtoproduce7-O-methylaromadendrinfrom asam p-coumaric pada konsentrasi 2.7mg / L (Malla et al., 2012). Memperluas strategi mereka, Zhu et al. (2014) lebih lanjut dimanfaatkan versi terpotong dari F3? H yang menyatu dengan CPR a. Ini diperlukan karena P450 diklasifikasikan F3? Hs perlu ditambah dengan donor elektron sitokrom P450 reduktase (CPR), karena bakteri tidak memiliki sistem transportasi endogen untuk mendukung aktivitas katalitik penuh P450 enzim (Sevrioukova et al., 1999). Namun, kasus yang paling menarik adalah orang-orang di mana tidak ada asam amino prekursor dilengkapi dan sistem-host sistem pendokumentasian mampu memanfaatkan energi glukosa untuk produksipinocembrin dan naringenin, pada konsentrasi 40mg / L (Wu et al., 2013) dan 108.9mg / L (Koopman et al., 2012), masing-masing (Tabel 1). Dalam kasus pertama, Wu dan rekan-rekan kerjanya mengevaluasi penggunaan pengkodean gen untuk enzim tanggapan-sensitif untuk meningkatkan thepoolofintra-sel fenilalanin. Inthelatter kasus, Koopman dan rekan kerja yang digunakan bermutasi S. cerevisiae strain, yang menghambat metabolit aliran menuju cabang kecil metabolisme primer. Avanones fl yang lebih kompleks seperti sakuranetin atau ponciretin diproduksi di 42,5 atau 40.1mg / L, masing-masing sebesar E. coli strain, ketika jalur inti naringenin yang terkait dengan O-methyltransferase (Gambar 2) dari beras atau kedelai (Kim et al., 2013b).

Flavon DAN flavonol  Flavon dan avonols fl merupakan dua kelompok yang berbeda dari avonoids fl. Namun, keduanya dihasilkan oleh setara (C2-C3) desaturasi reaksi di fl avonoid γ-pyrone di C fl avonoid cincin dari fl avanone atau fl avanonol, masing-masing. Enzim FNS I (Gambar 2) dan FLS (Gambar 3) mengkatalisis dation oxi- dari substrat masing-masing dengan memperkenalkan ikatan ganda C2-C3 (Martens et al., 2003). Flavanonoles (juga disebut dihidro fl avonols) adalah produk avonoid fl berasal dari hidroksilasi avanones fl pada posisi C3 (Gambar 3). Fl avone aglikon apigenin dan chrysin telah diproduksi di E. coli pada 13 dan 9.4mg / L, masing-masing (Miyahisa et al., 2006). Namun, hanya apigenin glukosida diukur pada 4.67mg / L (Choi et al., 2012) (Tabel 1). Baru-baru ini, hypolaetin, avone fl lain, dihasilkan dari luteolin pada 88mg / L, dengan penggunaan monooxygenase heterolog kloning dari bakteri Saccharothrix espanaensis (Lee et al., 2014). Flavonol merupakan salah satu kelompok yang paling menarik dari avonoids fl. Mereka adalah dua langkah biokimia jauh dari fl a- vanones (Gambar 3). Mengenai biosintesis mereka, enzim ing hydroxylat- (Lee et al., 2014) bertindak pada avanone fl sebelum fl avonol bertindak synthase pada dihasilkan dihidro fl avonol (Holton et al., 1993). Selain itu, jenis FLS enzim yang memiliki aktivitas bi-fungsional yang menarik telah diklon dari Ginkgo biloba (Xu et al., 2012) andCitrus unshiu (Lukacin et al., 2003), yang selain dari kegiatan konvensional mereka dapat bertindak pada fl a- vanone naringenin dan mengubahnya langsung ke kaempferol seperti yang ditunjukkan dalam kasus E. coli. Berikut langkah-langkah yang sama dengan yang dijelaskan di atas, berbagai bentuk avonols fl telah dihasilkan dari molekul prekursor eksogen dilengkapi. Kaempferol dan quercetin merupakan perwakilan terkenal dari kelompok ini, baik yang dihasilkan dalam E. coli

pada konsentrasi 0,3 dan 0.05mg / L, masing-masing (Tabel 1), dimulai dengan asam p-coumaric sebagai prekursor (Leonard et al., 2006 ). Ketika cara path- penuh untuk produksi kaempferol dari fenilalanin, bersama dengan gen yang menyebabkan peningkatan internal malonyl- CoA renang diperkenalkan pada E. coli, 15.1mg / L dari fl avonol yang disentesis (Miyahisa et al. 2006). Ketika pendekatan yang sama diikuti di S. cerevisiae, sejumlah 1.3mg / L dari kaempferol dihasilkan dari fenilalanin (Trantas et al., 2009). Tak satu pun dari senyawa ini atau avonols fl lainnya telah secara langsung dihasilkan dari sumber karbon utama makan (misalnya, glukosa) tanpa suplementasi eksogen prekursor apapun.Selain itu, berbagai bentuk avonols fl telah dihasilkan oleh theactionofvariousdecoratingenzymes.Acommonbiotransfor- mation adalah lampiran gula dengan gugus hidroksil dari tulang punggung avonoid fl melalui aksi glikosil-transferase (Gambar 3). Setelah metode ini, E. coli strain yang mampu memproduksi astragalin di 109.3mg / L dari naringenin (Malla et al., 2013) atau 13.56mg / L dari kaempferol (Dia et al., 2008) dan 23.78mg / L dari 3 O-xylosyl quercetin dari quercetin (Pandey et al., 2013), (Tabel 1). Upaya lain yang sejenis untuk mendapatkan transferases glycosyl- dari berbagai sumber termasuk biotransformasi apigenin, chrysin, luteolin, kaempferol, quercetin dan untuk mereka 3-O-, 7-O, atau 4? -O-Glukosida (Dia et al., 2008;. Choi et al, 2012). Pemanfaatan dari rhamnose fl avonol Glycosyltransferase pada kaempferol dan quercetin memadai untuk produksi thecorresponding 3-O-rhamnosides atconcentrations of150and 200mg / L, masing-masing (Kim et al., 2012b).ISOFLAVONONES Iso avonoids fl sebagian besar dikenal berkat interaksinya dengan reseptor estrogen manusia dan hewan (Cress et al., 2013). Ini bukan kelas uni-variate senyawa melainkan terdiri dari lebih dari satu subclass (misalnya, avones iso fl, iso fl avanes) yang dimodifikasi dalam langkah-langkah selanjutnya (Dixon dan Steele, 1999); lebih dari 1600 iso fl avonoidderivativeshavebeenidenti fi edtodate (Pandeyetal., 2014). Seperti kelas-kelas lain, E. coli dan S. cerevisiae adalah host yang paling umum untuk produksi heterolog dari iso fl avonoids. Reaksi utama dalam biosintesis iso fl avonoids adalah spesifik gerakan fi c daerah- dari fl avonoid B-cincin dari C-2 ke C-3positionbytheactionoftheP450enzymeiso fl avonesynthase (IFS, Gambar 3) (Pandey et al., 2011).Yang pertama mencoba untuk mengubah avanone fl ke corre- sponding iso fl avanone dalam mikroba dicapai dengan Akashi et al. (1999), yang menyatakan gen IFS dari licorice dalam sel ragi untuk mengubah naringenin menjadi genistein. Dalam pekerjaan mereka, kebutuhan untuk CPR yang ditutupi oleh endogen tases ragi pengurangan. Dalam pendekatan alternatif, Kim et al. (2009) berhasil menghasilkan genistein dalam E. coli. Dalam hal ini, IFS dari semanggi merah direkayasa untuk sekering di-frame dengan CPR kloning dari beras. Protein yang dihasilkan mudah bisa mengubah naringenin menjadi Tein genis- sampai dengan 15.1mg / L (Tabel 1). Ketika Leonard et al. (2009) menyatakan IFS chimeric direkayasa di E. coli, mereka memungkinkan kuat produksi genistein dan daidzein dari naringenin mented suplementasi dan liquiritigenin pada konsentrasi 10 dan 18mg / g, masing-masing. IFS yang direkayasa dibangun sebagai perpaduan dari IFS kloning dari Glycine max dengan CPR kloning dari Catharanthus roseus, dari mana membran yang mencakup daerah hidrofobik telah dihapus dan urutan pemimpin mamalia ditambahkan. Dalam pendekatan yang berbeda, pelaksanaan co-budidaya E. coli dan S. cerevisiae strategi, di mana naringenin yang dihasilkan oleh E.

coli berubah menjadi genistein oleh sel S. cerevisiae membawa gen IFS, menyebabkan produksi up untuk 6mg / L genistein (Katsuyama et al., 2007b). Tingkat konversi pendahulu produk nal fi mungkin tinggi ketika mengacu pada reaksi mono-enzimatik. Namun, hal ini tidak selalu berlaku untuk kasus reaksi multi-enzim. Trantas et al. (2009) mencoba untuk merekonstruksi jalur biosintesis seluruh untuk biosintesis genistein dalam S. cerevisiae dengan intro ducing tujuh gen di bawah promotor GAL. Ketika sistem produksi disediakan dengan fenilalanin, sel ragi berubah dengan jalur penuh diproduksi 0.1mg / L genistein. Ketikasistem yang sama disediakan dengan asam p-coumaric atau naringenin, 0,14 atau 7.7mg / L genistein yang diproduksi (Tabel 1), indicat- ing rate limiting langkah atau pengalihan metabolisme fluks terhadap genistein dari langkah-langkah metabolisme hulu. Selain itu, varian glikosilasi dari iso avonoids fl telah berhasil diproduksi melalui pemanfaatan transferases glycosyl- berbeda kloning dari berbagai sumber, dalam rangka mengembangkan kegiatan biologis baru. Akibatnya, genistein, daidzein, atau mononetin untuk- telah berhasil berubah menjadi daidzin, genistin, atau ononinin dalam sel S. cerevisiae melalui pemanfaatan sebuah glikosil-transferase dari Pueraria lobata (Li et al., 2014) atau E . coli melalui pemanfaatan sebuah glikosil-transferase derivative ing dari Bacillus licheniformis (Pandey et al., 2014), atau dari Glycyrrhiza echinata (Nagashima et al., 2004) (Gambar 3, Tabel 1). Sophoricoside, 4? glukosida genistein diproduksi di E. coli ketika glikosil-transferase dari Bacopa monniera dimanfaatkan (Ruby et al., 2014). Baru-baru ini, 3 -? Hydroxydaidzein diproduksi di 75mg / L dari daidzein dengan monooxygenase heterolog kloning dari bakteri S. espanaensis (Lee et al, 2014.). Equol merupakan contoh lain yang menarik dari avonoids iso fl (iso fl avan subclass). Ini menunjukkan lahan milik biologis yang melebihi orang-orang dari prekursor daidzein dan dapat digunakan sebagai obat atau agen nutraceutical untuk sejumlah gangguan hormon-dependent karena kemiripannya dengan estradiol hormon manusia (Setchell dan Clerici, 2010b). Sementara banyak kepentingan dalam equol berpusat efek estrogenik, ada banyak sifat biologis lainnya dengan potensi untuk menjadi nilai dalam mengobati penyakit di banyak bidang klinis, termasuk kanker, penyakit jantung, osteoporosis, serta gejala menopause (Setchell et al., 2002). Anggota lain yang menarik dari iso fl avan kelompok adalah 5-hidroksi-equol, juga pameran-ing peningkatan aktivitas antioksidan dibandingkan dengan prekursor genistein yang (Schroder et al., 2013). Kedua iso mereka fl Avans tidak dapat disentesis di alam tetapi ditemui sebagai daidzein atau produk sampingan genistein setelah aksi usus mikro fl ora (Setchell dan Clerici, 2010a). Baru-baru ini, gen yang bertanggung jawab untuk metabolisme mereka diidentifikasi dari Slackia iso fl avoniconvertens dan fungsional dinyatakan dalam E. coli (Schroder et al., 2013).

FLAVONOID wajar

  Meskipun avonoids fl telah dipelajari secara ekstensif, sejauh ini kami hanya membahas senyawa alami yang dapat ditemukan di alam. Namun, seperti yang disebutkan di atas, organisme tuan rumah memiliki kemampuan untuk bioconvert molekul yang tidak biasa mereka makan eksternalitas akhirnya, untuk menghasilkan non-pribumi, sehingga disebut, avonoids fl wajar. Meskipun tanaman tidak menghasilkan senyawa ini sama sekali, mereka tampak sangat menjanjikan untuk industri farmasi berkat sifat mereka.

Dalam beberapa kasus, menarik avonoids fl wajar dapat diproduksi yang mungkin menunjukkan banyak sifat farmakologi, contoh menjadi kasus avonols fl (Forbes et al., 2014), bichalcones (Gurung et al., 2010) atau fl avonoidal alkaloid (Nguyen et al., 2012). Pendekatan tersebut membuka jalan ke pengembangan strategi baru yang dapat menyebabkan novel senyawa bioaktif biosynthesisof wajar. Di antara upaya pertama untuk menghasilkan avonoids fl wajar, Chemler et al. (2007) berhasil mengubah berbagai cin- analog asam Namic dan akrilik ke avonoids fl sesuai dihiasi atau avonols fl (Gambar 4) melalui penggunaan rekayasaS. cerevisiae strain yang berisi satu set fl gen inti avonoid. Mereka mengandalkan substrat spesifisitas luas gen digunakan yang mampu biotransform molekul prekursor yang disediakan melalui kegiatan enzimatik berurutan, memproduksi avanones fl wajar pada titer dari 2.81 ke 15.82mg / L (Tabel 2). Pendekatan serupa digunakan oleh Katsuyama et al. (2007a), yang berhasil memproduksi array 36 avonoids fl wajar (16 di antaranya baru dalam daftar pustaka) yang termasuk ke dalam kelas avanones fl (45-102mg / L), fl avones (26-46mg / L), dan avonols fl (0.5-33mg / L). Katsuyama et al. (2007a) menggunakan rekombinan E. coli bantalan gen yang dipilih dari jalur fenilpropanoid untuk mengarahkan pembangunan analog tumbuhan alami dan tidak alami baru sesuai avonoids fl dan poliketida ketika diberi makan dengan berbagai molekul prekursor. Analog ini dari avones fl dan avonols fl yang disentesis dari asam masing-masing alam atau tidak wajar karboksilat, yang menjabat sebagai prekursor untuk aksi pasca-poliketida enzim modi fi kasi, seperti fl avones synthase I (FNSI) dan fl avanone 3-hidroksilase / fl avonol synthase (F3H / FLS), masing-masing (Gambar 2, 3). Pembangunan strain bakteri untuk sintesis wajar glikosida avonoid fl memiliki sifat yang menarik adalah mungkin melalui pendekatan yang dirancang secara rasional. Strategi ini melibatkan desain molekul baru dengan spesifik fungsional-ity, berdasarkan kemampuan untuk memprediksi bagaimana struktur molekul akan mempengaruhi perilaku melalui model fisik. Kasus yang menarik adalah penggunaan kombinasi transferases glikosil untuk melampirkan lebih dari satu kelompok glikosil dalam kelompok hidroksil dari tulang punggung avonoid fl (diglycosides). Sesuai dengan ide ini, spesifik UGTs diekspresikan dalam E. coli untuk hasil produksi dari 67mg / L dari quercetin 3-O-glukosida-7-O-rhamnoside dan 67.4mg / L dari quercetin 3,7-O-bisrhamnoside (Kim et al., 2013a) (Gambar 4, Tabel 2). Pemilihan nukleotida spesifik glikosil-transferase (UGT) dan ekspresinya ke dalam sel E. coli membuat biosintesis tidak wajar glikosilasi quercetin analog, quercetin 3-O-6-deoxytalose (Yoon et al., 2012) dimungkinkan. Selain itu, sebuah coli galur E. direkayasa untuk menghasilkan 7-O-xylosyl naringenin ketika diberi makan dengan naringenin (Simkhada et al., 2009). Strain ini dibangun melalui sion overexpres- gen yang diperlukan untuk biosintesis UDP-xylose serta asthe7-O-glycosyltransferasegene.Followingasimilarapproach, Kim et al. (2012a) berhasil menghasilkan 380mg / L dari quercetin 3-ON-asetilglukosamin ketika direkayasa E. coli galur adalah fedwithquercetin.Methyltransferaseshavealsobeenusedforthe produksi bentuk alkohol dari avonoids fl. The co-budidaya strain membawa gen FLS dan strain membawa 3-OMT berhasil mengubah dihydrokaempferol ditambah atau dihydroquercetin ke kaempferol dan quercetin masing-masing (Kim et al., 2010). Novel metil-transferase untuk metilasi posisi tambahan dari fl avonol backbone juga telah Engineered neered; 3,7-O-dimethylquercetin dan 3,7-O-dimethylkaempferol diproduksi di E. coli pada konsentrasi 19,16 dan 22mg / L (Joe et al., 2010).

PERATURAN JALUR DINAMIS DAN METABOLIK KONTROL

  Rekayasa metabolik tradisional sebagian besar difokuskan pada over-ekspresi tingkat-membatasi langkah (Tai dan Stephanopoulos, 2013), penghapusan jalur bersaing (Stephanopoulos, 2012),mengelola ATP; (. Singh et al, 2011) (Singh et al, 2011. Lan dan Liao, 2012) dan menyeimbangkan redoks dan prekursor metabolit. Sementara pendekatan ini telah terbukti efektif dalam produktivitas seluler upaya untuk memperbaiki dan hasil, strain rekayasa sering tidak mampu secara dinamis mengendalikan ekspresi gen dan rentan terhadap gangguan lingkungan. Seperti heterolo- jalur gous menjadi lebih besar dan lebih rumit, menjadi semakin sulit untuk mengoptimalkan mereka dengan kendali peraturan statis (Holtz dan Keasling, 2010). Umumnya, optimasi melalui kontrol statis hanya berlaku dalam lingkungan tertentu dan setiap gangguan yang jauh dari kondisi pengoperasian yang ditetapkan kemungkinan akan mengakibatkan ketidakstabilan fenotipe atau produktivitas optimal. Bertentangan dengan kontrol statis, sistem biologis asli biasanya menggunakan jaringan peraturan yang dinamis untuk mengontrol metabolisme fluks dalam menanggapi perubahan lingkungan (Xu et al., 2013a). Sebagai contoh, salah satu strategi yang koheren yang terjadi dalam sistem biologis yang paling adalah regulasi ekspresi gen melalui negatif / positif umpan balik (Afroz dan Beisel, 2013). Dimediasi oleh regulator scriptional transponder, yang antara metabolisme akan bertindak sebagai molekul sinyal yang akan mendorong atau menekan ekspresi enzim yang bertanggung jawab untuk sintesis atau konsumsi. Alam telah mengembangkan strategi ini untuk memungkinkan cara path- metabolisme dikontrol secara dinamis sehingga sumber daya selular dapatmenjadi secara efisien digunakan, terlepas dari perubahan lingkungan. Dalam prakteknya, strategi ini dapat diterapkan untuk jalur tion optimalisasi ketika akumulasi intermediet beracun merugikan sel growth.Successfulapplicationofthisoptimizationstrategywould membutuhkan pembangunan promotor hibrida yang transkripsi secara internasional responsif terhadap molekul menengah kecil (Xu et al., 2014b). Sebagai contoh, Liao et al telah merancang dan menerapkan sirkuit ulatory reg- yang bisa merasakan glikolitik jalur ciri metabolit asetil-fosfat untuk mengontrol jalur biosintesis likopen (Farmer dan Liao, 2000) dan menghasilkan ekspresi gen osilasi (Fung et al., 2005) serta mencapai arti fi komunikasi sel-sel resmi (Bulter et al., 2004). Dhal et al. memiliki dipekerjakan promotor stres-respon untuk meningkatkan produksi farnesyl pirofosfat (Dahl et al., 2013) dan Zhang et al. telah dibangun promotor responsif lemak asil-CoA untuk secara dinamis mengontrol ekspresi gen yang terlibat dalam sintesis biodiesel (Zhang et al., 2012) di E. coli. Baru-baru ini, Xu et al. (2014a, b) telah melaporkan genetically- dikodekan saklar metabolisme yang memungkinkan regulasi dinamis dari kedua sumber jalur malonil-CoA dan malonyl- CoA wastafel jalur (Gambar 5). Rekayasa hybrid promoter- interaksi regulator transkripsi menyebabkan pembangunan dua sensor malonil-CoA yang menunjukkan menentang transkripsi kegiatan nasional. Balancing yang tepat dari aktivitas transkripsi

dari malonil-CoA-up mengatur promotor dan malonil-CoA- turun mengatur promotor mengakibatkan terintegrasi beralih malonil-CoA render pola ekspresi gen bi-stabil.

Ketika beralih malonil-CoA ini sintetik dilaksanakan untuk mengontrol produksi asam lemak, strain rekayasa bisa lebih menyeimbangkan tradeoff antara pertumbuhan sel dan pembentukan produk dan didemonstrasikan produksi unggul FA pro fi le. Skema kontrol dalam penelitian ini adalah laporan pertama untuk menggunakan kedua ON dan OFF fungsi tion untuk mengatur metabolisme sel. Berbeda dengan laporan oleh Zhang et al. (2012) dan Xu et al. (2014a, b) hanya menggunakan sebuah "ON" berfungsi untuk mengontrol ekspresi asam lemak etil ester (wajahku) down aliran jalur (lemak asil-CoA dan sintesis etanol), di mana wajahku jalur hulu (asam lemak sintesis) adalah meninggalkan uncon- dikendalikan. Karena malonil-CoA merupakan prekursor penting yang terlibat dalambiofuel biosintesis avonoids fl, poliketida dan asam lemak berbasis (. Xuetal, 2011,2013b;. Felnagleetal, 2012), thesynthetic beralih malonil-CoA harus memfasilitasi pembangunan strain untuk produksi hasil yang tinggi dari senyawa malonil-CoA yang diturunkan.

Metabolomik DAN NGS DIBANTU Bioinformatika UNTUK JALUR PERTAMBANGAN Interaksi setan antara evolusi dan alam, dilengkapi semua organisme dengan mesin genetik yang tepat untuk biosynthe- aksesoris ukuran metabolisme sekunder, untuk menahan perangkap siklus hidup mereka. Meskipun bagian dari mesin ini telah diidentifikasi, berbagai bagian tetap ditemukan. Seperti dianalisis lier telinga, semua metabolit sekunder ini berevolusi dari biosyntheticpathsandfollowedvarioustailoring saling berhubungan, condensingand

dekorasi intervensi enzimatik, yang bertanggung jawab untuk kategorisasi mereka akhirnya menjadi phenylpropanoids, fl avonoids, alkaloid, terpenoid, dll sebagian besar jalur biosintesis, enzim inti ada untuk menempatkan reaksi biokimia utama melalui untuk produksi produk akhir. Enzim inti dari jalur biosintesis avonoid fl bertanggung jawab atas tion produksi dari basal fl avonoid kerangka. Namun, ada sejumlah enzim menjahit lainnya untuk dekorasi inti skele- ton dengan pola kimia tambahan yang berbeda dalam pola oksidasi, asilasi, metilasi, atau glikosilasi. Mereka yang dicapai dengan memanfaatkan Oxido-reduktase dan asil atau glikosil-transferase tersedia menciptakan fl berbeda avonoid kelas-seperti yang dijelaskan di atas, terdiri dari meluap-luap senyawa avonoid fl. Teknologi yang sedang berkembang di medan dari Metabolomik dan Genomics menawarkan bantuan besar dalam upaya untuk aktivitas enzim baru atau jalur metabolik bahkan baru. Di satu sisi, peningkatan aparat spektrometri massa memungkinkan pengguna mengidentifikasi entitas ical chem-, dan bahkan ekstrapolasi asli tions konsentrasi intraseluler. Teknik-teknik tersebut ditambah dengan proses untuk pemantauan transformasi metabolik telah memungkinkan metabolomik untuk berkembang dalam konteks fungsi enzim atau penemuan jalur dalam model atau non-Model organisme (Prosser et al., 2014). Di sisi lain, munculnya teknologi Next-Generation Sequencing (NGS) telah merevolusi genomik fungsional. Genom mikroba Seluruh sekarang dapat diurutkan, facil- itating penemuan kelompok gen biosintesis. Fitur lestari dari inti avonoid fl dan dekorasi enzim, yang bertindak antar sedemikian rupa untuk membuat metabolons avonoid fl (Winkel, 2004;. Crosby et al, 2011), dapat digunakan sebagai query dalam program komputer yang membandingkan primer biologis urutan informa - (. Altschul et al, 1990) tion untuk fi nd cocok. Hal ini akan membantu

kita untuk homolog tambang fl avonoid jalur pada spesies lain atau individu pada umumnya. Teknologi NGS berkembang pesat (Hui, 2014) mengakibatkan pemuatan database publik dengan besarjumlah data sekuens organisme melebihi petunjuk anno- sultasi. Memiliki gigabases data di tangan mereka dikombinasikan dengan metabolisme fi pro ling, genomik fungsional dan pendekatan biologi sistem, para ilmuwan secara rutin dapat memeriksa di-silico dan memperoleh pengetahuan yang mendalam dalam usaha mereka untuk lebih memahami fl avonoid jalur biosintesis. Hal ini dapat meningkatkan potensi bio-engineering melalui identifikasi gen yang diduga cod- ing untuk enzim dengan aktivitas perbaikan atau novel yang terlibat dalam jalur avonoid fl. Sejalan dengan hal ini penalaran, kami juga harus mencatat bahwa Transkriptome sequencing dalam dan metabolisme fi pro ling telah memungkinkan identifikasi varian gen antosianin biosintesis di Camellia chekiangoleosa (Wang et al., 2014) dan avonoids fl dan terpenoid biosintesis di Isatis indigotica (Chen et al ., 2013). Setiap kali kurangnya informasi genomik atau alat genetik yang masih terbelakang menampilkan dirinya, eksplorasi mekanisme ular molec- pembentukan avonoid fl menghadapi kesulitan- kesulitan. Transkriptome sequencing dapat menjadi pendekatan yang efisien untuk obtain- ing informasi genomik fungsional, yang dapat berkontribusi untuk jalur pertambangan. Selanjutnya, data yang dihasilkan NGS akan berfungsi sebagai platform informasi untuk ekspresi gen, genomik, dan genomik fungsional. E fi sien analisis data pipa yang diperlukan untuk semua aplikasi ini agar mereka yang akan didirikan sebagai kegiatan tine ROU-, dan studi lebih diperlukan bertujuan untuk mengatasi ketahanan teknik ini (Morozova dan Marra, 2008). Penjelasan otomatis harus seakurat mungkin untuk menghindari kesalahan sistematis yang dihasilkan oleh salah menilai pemanggilan gen (Bakke et al., 2009). Dengan kata lain, meskipun sequencing telah menjadi mudah, penjelasan genom telah menjadi ing lebih challeng-: (a) teknologi NGS menghasilkan panjang dibaca pendek yang mengakibatkan hilangnya kedekatan, (b) urutan "eksotis" genom tanpa pra-ada user-centric Data penjelasan membuat gene- prediksi memanggil metode sulit untuk melatih, mengoptimalkan dan con Figur (Yandell dan Ence, 2012). Meskipun penjelasan genom bukan prosedur point-and-klik, "do-it-yourself" proyek layak menggunakan

alat masa kini. Hal ini juga memungkinkan penemuan baru berbagai keragaman enzimatik, kelas urutan yang sama sekali baru dan fungsi baru (Pollier et al., 2011).KESIMPULAN Flavonoid merupakan kelompok yang beragam tanaman sekunder metabo lites dengan senyawa menarik yang menampilkan aktivitas antioksidan yang luar biasa. Banyak senyawa ini digunakan sebagai obat-obatan maceutical atau sebagai suplemen nutraceutical. Rekayasa Flavonoid telah sangat berkembang selama beberapa tahun terakhir. Kemajuan teknis dalam penemuan gen, genomik fungsional dan implementasi skala besar kombinasi yang berbeda biosyn- thesistechniquesinplantsallpromiseabrightgreenfutureforthe penemuan dan eksploitasi tanaman produk turunan. Selain itu, alat-alat algoritmik, seperti paket perangkat lunak OptForce, sudah tersedia untuk membantu para peneliti melakukan intervensi genetik yang ditargetkan untuk meningkatkan karbon fluks melalui malonyl- CoA (Bhan et al., 2013). Ini memang membatasi langkah prekursor untuk overekspresi berbagai jalur heterolog seperti avanones fl dan poliketida pada bakteri. Kelompok Koffas 'telah mengembangkan sebuah sensor yang memanipulasi dua jalur selular yang mengatur

produksi malonil-CoA (Xu et al., 2014a) secara real time. Dengan memanfaatkan teknik pengaturan dinamis berbasis sensor pada tingkat sel, peneliti mampu memaksimalkan produksi malonil-CoA dan meminimalkan kerusakan pada sel. Teknik ini telah diterapkan untuk biosintesis asam lemak dan tampaknya sangat menjanjikan untuk avonoids fl, karena, dengan meningkatkan ketersediaan malonil-CoA dalam E. coli, titer produk tumbuhan alami dapat ditingkatkan juga. Alternatif atau pendekatan paralel akan mengidentifikasi dan memanfaatkan mikroorganisme yang kelebihan fenilalanin atau tirosin untuk meminimalkan masukan dari sumber karbon selama prosedur fermentasi.

PENGAKUAN  Pekerjaan ini didanai oleh program "THALES-TEI CRETE, MIS 380.210" dalam kerangka NSRF (National Kerangka Acuan Strategis).