35_12.pdf - Sociedade Brasileira de Nematologia

Nematologia Brasileira

volume 35 / números 1 e 2 / junho de 2011

Artigos

Reação de Cultivares de Mamona a Meloidogyne spp. e Efeito dos Exsudatos

Radiculares sobre Meloidogyne enterolobii e M. graminicola - Anderson V. Santos &

Cesar B. Gomes .............................................................................. 01-09

Efeito de Adubos Orgânicos sobre Meloidogyne javanica em Tomateiro - Janaína T.

Bernardo, Leandro G. de Freitas, Jaqueline K. Yamada, Vanessa S. Almeida, Rosangela

Dallemole-Giaretta & Silamar Ferraz ........................................... 10-19

Estudo Fitossanitário, Multiplicação e Taxonomia de Nematoides Encontrados em

Sementes de Gramíneas Forrageiras no Brasil - Luciany Favoreto, Jaime M. Santos,

Sergio A. Calzavara & Luciano A. Lara ........................................ 20-35

Técnicas Moleculares e Microscopia Eletrônica de Varredura no Esclarecimento

da Posição Taxonômica da População K5 de Pratylenchus sp. - Claudio M.G.

Oliveira, Rosana Bessi, Ricardo Harakava, Andressa C.Z. Machado & Roberto K. Kubo

............................................................................................................... 36-45

Comunicações

Hospedabilidade de Plantas Medicinais a Meloidogyne paranaensis - Ana Paula do

A. Mônaco, Rui G. Carneiro, Alexandra Scherer & Débora C. Santiago ......... 46-49

Assinalamentos de Meloidogyne enterolobii em Goiabeira e em Plantas Invasoras

no Estado de São Paulo, Brasil - Eduardo J. Almeida, Gleina C.S. Alves, Jaime M.

Santos & Antonio B.G. Martins ......................................................... 50-52

Nematologia Brasileira

volume 35 / issues 1 & 2 / March-June 2011 Articles

Reaction of castor bean cultivars to Meloidogyne spp. and effect of root exudates

on Meloidogyne enterolobii and M. graminicola.- Anderson V. Santos & Cesar B. Gomes

....................................................................... 01-09

Effect of organic amendments on Meloidogyne javanica in tomato - Janaína T.

Bernardo, Leandro G. de Freitas, Jaqueline K. Yamada, Vanessa S. Almeida, Rosangela

Dallemole-Giaretta & Silamar Ferraz ............ 10-19

Phytosanitary study, multiplication and taxonomy of nematodes associated with

seeds of forage grasses in Brazil - Luciany Favoreto, Jaime M. Santos, Sergio A. Calzavara

& Luciano A. Lara .......................................... 20-35

Molecular techniques and scanning electron microscopy for elucidating the

taxonomic status of K5 population of Pratylenchus sp. - Claudio M.G. Oliveira, Rosana

Bessi, Ricardo Harakava, Andressa C.Z. Machado & Roberto K. Kubo ................... 36-45

Communications

Host suitability of medicinal plants to Meloidogyne paranaensis - Ana Paula do A.

Mônaco, Rui G. Carneiro, Alexandra Scherer & Débora C. Santiago ......... 46-49

Records of Meloidogyne enterolobii on guava orchards and weeds in the State of

São Paulo, Brazil - Eduardo J. Almeida, Gleina C.S. Alves, Jaime M. Santos & Antonio B.G.

Martins ......................................................... 50-52

Nematologia BrasileiraPiracicaba (SP) Brasil

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Reação de Cultivares de Mamona a Meloidogyne spp. e Efeito dos Exsudatos Radiculares sobre Meloidogyne enterolobii e M. graminicola

Reação de Cultivares de Mamona a Meloidogyne spp. e Efeito dosExsudatos Radiculares sobre Meloidogyne enterolobii e M. graminicola*

Anderson V. Santos1** & Cesar B. Gomes2**

*Parte da Dissertação de Mestrado do primeiro autor, Universidade Federal de Pelotas (RS) Brasil.¹Universidade Federal de Pelotas, C. Postal 354, 96010-610 Pelotas (RS) Brasil.

²Embrapa Clima Temperado, C. Postal 403, 96001-970 Pelotas (RS) Brasil.**Autores para correspondência: [email protected], [email protected]

Recebido para publicação em 12 / 11 / 2010. Aceito em 20 / 04 / 2011Editado por Guilherme L. Asmus

Resumo - Santos, A.V. & C.B. Gomes. 2011. Reação de cultivares da mamona a Meloidogyne spp. e efeito dosexsudatos radiculares sobre Meloidogyne enterolobii e M. graminicola.

Avaliou-se a reação das cultivares de mamona BRS Energia, CPACT 40, AL Guarani, IAC 80, Sara, Lyra eNordestina a Meloidogyne incognita, M. javanica, M. arenaria, M. ethiopica, M. graminicola e M. enterolobii. Mudas dosdiferentes genótipos, mantidas em casa de vegetação, foram inoculadas com 5.000 ovos de cada espécie deMeloidogyne. Plantas de arroz ‘BR Irga-410’ foram usadas como testemunhas para M. graminicola e de tomate‘Rutgers’ para as demais espécies de Meloidogyne. Três meses após a inoculação, as raízes de cada planta foramavaliadas quanto ao número de galhas e fator de reprodução (FR = Pf / Pi) dos nematoides. Posteriormente,estudou-se o efeito in vitro dos exsudatos radiculares dos diferentes genótipos de mamona sobre a eclosão emotilidade de juvenis de segundo estádio (J2) de M. enterolobii e de M. graminicola. Verificou-se que todas ascultivares de mamona comportaram-se como imunes ou resistentes aos nematoides-das-galhas. Todos osexsudatos radiculares de mamona reduziram a motilidade dos J2 de M. enterolobii; entretanto, apenas aquelesprovenientes de ‘CPACT 40’, ‘Sara’, e ‘Nordestina’ afetaram negativamente os J2 de M. graminicola. Pequenoefeito nematostático foi observado sobre a eclosão dos J2 de M. graminicola com os exsudatos de ‘CPACT 40’,‘IAC 80’ e ‘Sara’. No entanto, verificou-se redução da eclosão dos J2 de M. enterolobii submetidos aos exsudatosda maioria dos genótipos. Estes resultados demonstraram que os exsudatos radiculares podem estar relacionadoscom a resistência da mamona às espécies de Meloidogyne avaliadas no estudo.Palavras-chaves: Ricinus communis, nematoide, Meloidogyne spp., resistência, exsudatos

Summary - Santos, A.V. & C.B. Gomes. 2011. Reaction of castor bean cultivars to Meloidogyne spp. and effectof root exudates on Meloidogyne enterolobii and M. graminicola.

The reaction of different castor bean cultivars (BRS Energia, AL Guarani, Sara, Nordestina, Lyra, CPACT40 and IAC 80) to Meloidogyne incognita, M. javanica, M. arenaria, M. ethiopica, M. graminicola and M. enterolobii wasevaluated at greenhouse conditions. Seedlings of different genotypes were inoculated with 5,000 eggs of eachnematode species per plant using six replications per treatment. Plants of rice ‘BR Irga-410’ were used as acontrol to M. graminicola and tomato ‘Rutgers’ to the other species. Three months after inoculation, the roots ofeach plant were evaluated by number of galls and by the nematode reproduction factor (RF = Pf / Pi).Subsequently, the effect in vitro of root exudates from each castor bean genotype was tested on the hatchingand motility of second stage juveniles (J2) of M. enterolobii and M. graminicola. All castor bean cultivars wererated as immune or resistant depending on the Meloidogyne species. All the root exudates of castor bean cultivarsreduced the J2 motility of M. enterolobii; on the other hand, only that exudates from ‘CPACT 40’, ‘Sara’ and‘Nordestina’ affected negatively the J2 of M. graminicola. Testing the root exudates of ‘CPACT 40’, ‘IAC 80’ and

ARTIGO

2 Vol. 35(1-2) - 2011

Anderson V. Santos & Cesar B. Gomes

IntroduçãoO gênero Meloidogyne constitui o grupo de

fitonematoides de maior importância econômica naagricultura, por causarem perdas significativas nas maisvariadas culturas e regiões do mundo (Sasser &Freckman, 1987). Plantas severamente atacadas poresses patógenos apresentam redução da parte aérea,decorrente do volume radicular reduzido e sistemavascular completamente desorganizado, devido àformação de galhas, comprometendo seriamente aabsorção e translocação de água e nutrientes pela plantahospedeira (Carneiro, 2000).

As medidas de controle mais utilizadas no manejode áreas infestadas por Meloidogyne spp., nas condiçõesbrasileiras, tem sido a rotação de culturas e o uso decultivares resistentes. No entanto, este grupo denematoides possui uma ampla gama de hospedeiros,o que dificulta a adoção dessas medidas (Ferraz &Freitas, 2004). Apesar da eficiência do controle químicoem determinados casos, a sua ação temporária acabafavorecendo a ressurgência do patógeno, que, naausência de inimigos naturais, pode atingir altos níveispopulacionais rapidamente. Além disso, muitosnematicidas foram retirados do mercado devido asua alta toxicidade ao homem e ao meio ambiente(Jatala, 1985). Práticas alternativas como a rotação deculturas com plantas antagonistas têm se mostradoeficazes na redução das populações do nematoide-das-galhas, na recuperação de áreas infestadas e nadiminuição do impacto negativo causado ao ambientequando comparado ao controle químico (Carneiro etal., 1998).

A mamona (Ricinus communis) é uma oleaginosa deconsiderável importância econômica e social, cujassementes são utilizadas para a extração de óleo deexcelentes propriedades industriais. Além de ser umaplanta rústica e com enorme capacidade adaptativaàs várias regiões do Brasil (Silva et al., 2005), resultadosde pesquisa têm evidenciado o potencial da mamonaem rotação de culturas para manejo de áreas infestadas

com fitonematoides, por ser considerada máhospedeira (McSorley et al., 1994; Park et al., 2004).

A mamona apresenta em sua composição químicaum alcaloide de elevada toxidade, a ricina (Bandeiraet al., 2004), o qual apresenta efeito nematicida (Richet al., 1989). Nos poucos trabalhos relacionados àresistência genética da mamona a nematoides, ficouevidente o antagonismo desta planta a nematoides dogênero Meloidogyne (Rao et al. 1984; McSorley, 1999;Dias-Arieira et al. 2008; Lima et al., 2009). Há, porém,relatos de suscetibilidade da cultura a M. javanica, M.incognita (Lordello, 1973), M. arenaria e a M. hapla(Whitehead, 1998). Além disso, não se conhece a reaçãode vários genótipos à maioria das espécies denematoides-das-galhas. Segundo Peacock (1959), aresistência da mamona a Meloidogyne spp. deve-se àrestrição do desenvolvimento ou reprodução dosnematoides no sistema radicular da planta. Além disso,no ambiente rizosférico pode ocorrer a ação desubstâncias, na forma de exsudatos radiculares,antagônicas aos fitonematoides (Ferraz & Freitas,2004). No entanto, muito pouco se sabe sobre osmecanismos envolvidos na resistência da mamona aestes patógenos.

Dessa forma, foi objetivo deste trabalho, avaliar areação de diferentes cultivares de mamona aosnematoides-das-galhas M. incognita, M. javanica, M.arenaria, M. ethiopica, M. graminicola e M. enterolobii Yang& Eisenback, 1983 (sin. M. mayaguensis Rammah &Hirschmann, 1988) em casa de vegetação; e estudar oefeito in vitro dos exsudatos radiculares dessas cultivaressobre a eclosão e motilidade de juvenis de segundoestádio (J2) de Meloidogyne spp.

Material e MétodosPlantas de mamona das cultivares BRS Energia,

CPACT 40, AL Guarani, IAC 80, Sara, Lyra eNordestina foram avaliadas em casa de vegetaçãoquanto à reação a seis espécies do nematoide das galhas(Meloidogyne spp.). Como inóculo dos nematoides,

‘Sara’, it was observed a weak nematostatic effect on the hatching of M. graminicola J2. However, reduction ofM. enterolobii hatching was observed for the majority of the castor bean exudates. These results showed that theroot exudates may be related to castor bean resistance to Meloidogyne spp.Key words: Ricinus communis, nematodes, Meloidogyne spp., resistance, exsudates.


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utilizaram-se populações puras de M. incognita (Est.I2), M. javanica (Est. J3), M. enterolobii (Est. M3), M.arenaria (Est. A2), M. ethiopica (Est. E3), as quais forammantidas e multiplicadas em tomateiro ‘Rutgers’, alémde uma população pura de M. graminicola (Est. VS1),mantida e multiplicada em plantas de arroz ‘BR IRGA410’, em casa de vegetação. As populações puras dasdiferentes espécies de Meloidogyne foram obtidas apartir de massas de ovos cujas fêmeas apresentaramo mesmo fenótipo esterástico quando submetidas àtécnica de eletroforese conforme metodologia descritapor Carneiro & Almeida (2001).

A partir de raízes infectadas com Meloidogyne sp.,procedeu-se à extração de ovos e J2 de cada espéciede nematoide-das-galhas utilizando-se a técnica deHussey & Barker (1973). Os J2 utilizados nos testes invitro foram obtidos pela incubação de parte dasuspensão dos ovos em funil de Baermannmodificado (Christie & Perry, 1951) a 25 ± 2 ºC. OsJ2 obtidos nas primeiras 24 horas foram descartados,e utilizaram-se apenas aqueles coletados com 48 horasde incubação, por se apresentarem mais ágeis.

Reação de cultivares de mamona aMeloidogyne spp. Inicialmente, procedeu-se àdesinfecção das sementes de mamona em hipocloritode sódio a 1 % (v / v) por um minuto, seguida dalavagem com água destilada esterilizada e semeaduraem bandejas de isopor previamente desinfestadas comhipoclorito 1,5 % (v / v) e contendo solo esterilizado.O mesmo procedimento foi realizado com assementes de arroz e tomate (testemunhas). Vinte diasapós a germinação, as plântulas dos diferentesgenótipos foram transplantadas para vasos contendosolo esterilizado, em casa de vegetação a temperaturade 25 ± 2º C.

Uma semana após o transplante, cada planta demamona foi inoculada separadamente com umasuspensão de 5.000 ovos de cada espécie deMeloidogyne. Como testemunhas suscetíveis para M.incognita, M. enterolobii, M. ethiopica, M. arenaria e M.javanica, plantas de tomateiro ‘Rutgers’ foraminoculadas com o mesmo nível de inóculo. Para M.graminicola, plantas de arroz ‘BR Irga-410’ inoculadascom o nematoide foram utilizadas como testemunhas.O experimento foi conduzido em delineamentointeiramente casualizado, com seis repetições para cada

tratamento (genótipo).Decorridos noventa dias da inoculação, as raízes de

cada planta foram separadas da parte aérea, lavadas eavaliadas quanto ao número de galhas. A seguir, as raízesforam processadas (Hussey & Barker, 1973) paraavaliação do número de ovos e determinação do fatorde reprodução (FR = população final / população inicial)de cada espécie de Meloidogyne nos diferentes genótipos.Foram consideradas resistentes as cultivares com FR <1,00, imunes com FR = 0,00 e suscetíveis com FR >1,00 (Oostenbrink, 1966). A seguir, os valores de númerode galhas (transformados em 1+x ) e de FR foramsubmetidos à ANOVA, sendo as médias dos tratamentoscomparadas entre si pelo teste de Scott-Knott a 5 % deprobabilidade, utilizando-se o programa SASM-AGRI(Canteri et al., 2001).

Efeito de exsudatos radiculares de mamonasobre a eclosão e motilidade de J2 de M.enterolobii e M. graminicola

Plântulas de mamona ‘BRS Energia’, ‘CPACT 40’,‘AL Guarani’, ‘IAC 80’, ‘Sara’ e ‘Nordestina’ foramutilizadas para extração dos exsudatos. Como inóculoutilizou-se populações puras de M. enterolobii e M.graminicola.

O procedimento para extração dos exsudatos foirealizado com base na metodologia de Campos et al.(2006) modificada. Plântulas dos diferentes genótiposde mamona (quatro dias), tomate e arroz (10 dias),cultivadas em tubetes plásticos (50 ml) contendo areiafina esterilizada, em casa de vegetação, foramremovidas, lavadas e transferidas para o interior deum tubo de extração, tomando-se o cuidado paranão injuriar as raízes. Para obtenção dos tubos deextração (Figura 1), ponteiras plásticas paramicropipetas de 1 a 5 ml, foram seccionadas a 2 cmde sua extremidade inferior, a qual foi coberta com10 mm2 de papel de filtro (Ø = 14µm) justaposto auma tela de náilon (Ø = 0,025 mm). A seguir, esteconjunto foi acoplado a um tubo tipo Eppendorf®

de 2 ml, e imediatamente vedado com fita adesivapara evitar o desprendimento desta conexão (Figura1). Logo após, cada tubo contendo a respectivaplântula, foi centrifugado a 1890 g por dez minutos,obtendo-se assim, os exsudatos radiculares, os quaisforam congelados a -20 oC, na ausência de luz, até asua utilização.

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A condução deste bioteste foi realizada em placasde ELISA esterilizadas, onde, em cada cavidade daplaca, inicialmente foi adicionada uma suspensão de20 µl de água destilada esterilizada contendo 30 ovosou J2 de M. graminicola ou M. enterolobii. A seguir,colocou-se em cada orifício, 80 µl da solução doexsudato radicular (80 %) de cada genótipo demamona, separadamente. Como testemunha absoluta,adicionou-se 100 µl de uma suspensão aquosacontendo 30 ovos ou J2 de cada espécie do nematoide,por cavidade da placa. Além disso, como testemunhapara M. graminicola e M. enterolobii, os ovos ou J2 foramsubmetidos aos exsudatos radiculares de arroz etomate, respectivamente, conforme metodologiautilizada para os exsudatos de mamona. Logo após,as placas foram vedadas com filme plástico, envoltaspor papel alumínio (simulando condições de solo) eincubadas a 25 ± 1º C. O ensaio seguiu o delineamentointeiramente casualizado com quatro repetições paracada tratamento.

Decorridos vinte e quatro horas da incubação,avaliou-se, sob microscópio estereoscópico, o efeitodos diferentes exsudatos radiculares de mamona sobrea motilidade dos J2 de M. enterolobii e M. graminicola.Para tanto, adicionou-se a cada cavidade contendo osJ2, uma alíquota de 10 µl de hidróxido de sódio 1 N(Chen & Dickson, 2000) e, após trinta segundos,

contou-se o número de J2 móveis e imóveis dosnematoides em cada repetição para posteriordeterminação da motilidade dos J2 de ambas asespécies.

A avaliação da eclosão foi realizada no décimosegundo dia de incubação dos ovos das duas espéciesde Meloidogyne submetidas aos diferentes tratamentos.Para tanto, procedeu-se à contagem do número deJ2 eclodidos e posterior determinação dapercentagem de juvenis eclodidos em cada repetição,sob microscópio estereoscópico.

A seguir, os valores de percentagem de motilidadee de eclosão dos J2 (transformados em arcsen

100/x ), foram submetidos à ANOVA, sendo asmédias dos diferentes tratamentos, comparadas entresi pelo teste de Duncan (P ≤ 0,05) utilizando-se oprograma SASM-AGRI (Canteri et al., 2001).

Resultados e DiscussãoReação da cultura da mamona a Meloidogyne

spp. De acordo com os resultados apresentados naTabela 1, observou-se que os genótipos de mamonaavaliados reagiram de forma resistente ou imune asdiferentes espécies de Meloidogyne testadas,diferenciando-se significativamente das testemunhas.Na avaliação da resistência da mamona a M. incognitae M. graminicola, verificou-se que todos os genótipos

Figura 1 - Esquema demonstrando as etapas na preparação de materiais para a extração dos exsudatos de raízes de mamona: bisturiutilizado na secção de uma ponteira de 5 ml (a e b); papel de filtro (c); tela de náilon (d); ajuste do papel de filtro e da tela em ummicrotubo (e); acoplamento da ponteira com papel e tela no microtubo (f); inserção do sistema radicular de plântula de mamona notubo de extração (g).


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testados foram imunes a estas espécies (Tabela 1). Comrelação a M. javanica, M. arenaria e M. enterolobii, osmesmos genótipos foram resistentes (0,01 < FR <0,12) e apresentaram um número muito pequeno degalhas nas raízes. Entretanto, na avaliação dasuscetibilidade da cultura a M. ethiopica, as cultivares‘CPACT 40’ e ‘Al Guarani’ foram resistentes (0,02 <FR < 0,05) e as demais, imunes ao nematoide, nãosendo possível visualizar a presença de galhas emnenhum dos genótipos testados.

Na literatura, a resistência de plantas de mamonaao nematoide das galhas refere-se, particularmente,às espécies M. incognita, M. arenaria e M. javanica.McSorley (1999), avaliando a reação da mamona aesses nematoides, verificou a imunidade das plantastestadas às três espécies de Meloidogyne. Dias-Arieira etal. (2009), estudando a resistência de diferentescultivares de mamona a Meloidogyne spp., observaramque todos os materiais testados foram resistentes aM. incognita, M. javanica e M. paranaensis, e as cultivares‘Al Guarani’ e ‘IAC 80’ apresentaram reação semelhanteaquela obtida neste estudo (Tabela 1). Entretanto,apesar dos autores verificarem número de galhassignificativamente inferiores à testemunha, no presenteestudo, não foi detectada a presença de galhas nasraízes dos genótipos de mamona inoculados com M.incognita e M. javanica.

Na avaliação dos genótipos a M. ethiopica, excetoas cultivares ‘CPACT 40’ e ‘AL Guarani’ (0,02 < FR <0,05), todas as demais foram imunes ao nematoide,

não tendo sido possível visualizar a presença de galhasem nenhum dos genótipos testados. Estes dados seassemelham aos resultados obtidos por Lima (2008)em uma pesquisa de seleção de plantas antagônicas aM. ethiopica, onde a autora verificou que a cultivar IAC80 foi imune ao nematoide, sendo considerada,portanto, uma excelente planta antagonista para usoem rotação de culturas. A imunidade das diferentescultivares de mamona a M. graminicola encontrada nestetrabalho, se assemelha aos estudos de Rao et al. (1984),os quais relataram a resistência da cultura a essenematoide. No Rio Grande do Sul, essa espécie foiidentificada em lavouras de arroz de vários municípios(Steffen, 2007; Gomes et al., 2009). Na literatura,culturas anuais como arroz, cebola, alface e berinjela(Siciliano, 1990; Gergon et al., 2001; Padgham et al.,2004), têm sido relatadas como hospedeiras de M.graminicola. Assim, o cultivo de mamona em áreasinfestadas por essa espécie pode ser uma boa opçãopara uso em rotação de culturas visando à supressãodo nematoide das áreas infestadas.

Apesar da resistência dos genótipos de mamona aM. enterolobii (FR = 0,03 a 0,12), foi possível observara formação de galhas em todos os materiais testados(Tabela 1). Entretanto, a presença de massas de ovosnas raízes foi detectada apenas na cultivar ‘CPACT40’, ao contrário do que ocorreu quando outrasespécies de Meloidogyne foram inoculadas no mesmogenótipo. De acordo com Carneiro et al. (2001), Menterolobii (sin. M. mayaguensis) é uma espécie de alta

Tabela 1 - Número de galhas (NG), fator de reprodução (FR) e reação de genótipos de mamona (RG) a Meloidogyne javanica, M.incognita, M. arenaria, M. graminicola, M. ethiopica e M. enterolobii, em casa de vegetação.

Médias seguidas pela mesma letra nas colunas não diferem entre si pelo teste de Duncan (P ≤ 0,05).1Valores originais transformados em 1+x2R = resistente (FR < 1,00), I= imune (FR = 0,00), S = suscetível (FR > 1,00).

Genótipos M. javanica M. incognita M. arenaria M. graminicola M. ethiopica M. enterolobiiNG1 FR RG2 NG1 FR RG2 NG1 FR RG2 NG¹ FR RG2 NG¹ FR RG2 NG¹ FR RG2

BRS Energia 0 a 0,01 a R 0 a 0,00 a I 0 a 0,03 a R 0 a 0,00 a I 0 a 0,00 a I 0,66 a 0,12 a RCPACT 40 0 a 0,10 a R 0 a 0,00 a I 0 a 0,13 a R 0 a 0,00 a I 0 a 0,02 a R 0,50 a 0,03 a RAL Guarani 0 a 0,03 a R 0 a 0,00 a I 0 a 0,03 a R 0 a 0,00 a I 0 a 0,05 a R 0,33 a 0,03 a RIAC80 0 a 0,04 a R 0 a 0,00 a I 2,33 a 0,12 a R 0 a 0,00 a I 0 a 0,00 a I 1,33 a 0,07 a RSara 0 a 0,25 a R 0 a 0,00 a I 0 a 0,03 a R 0 a 0,00 a I 0 a 0,00 a I 2,00 a 0,03 a RLyra 0 a 0,02 a R 0 a 0,00 a I 0 a 0,07 a R 0 a 0,00 a I 0 a 0,00 a I 0,66 a 0,06 a RNordestina 0 a 0,27 a R 0 a 0,00 a I 0 a 0,07 a R 0 a 0,00 a I 0 a 0,00 a I 1,33 a 0,04 a RArroz - - - - - - - - - 188 b 18,2 b S - - - - - -Tomateiro 1058 b 68,9 b S 316,1 b 16,4 b S 1451,5 b 26,8 b S - - 1339b 56,4b S 679,16 b 18,1 b SC.V.(%) 16,379 23,16 47,44 36,76 62,96 68,00 22,14 28,74 57,83 106,1 61,42 106,19

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virulência, com potencial de multiplicação superior aM. incognita em cultivares suscetíveis ou portadoresdo gene Mi em tomateiro, assim como também emoutras espécies resistentes a M. incognita, M. arenaria eM. javanica. No entanto, apesar da reação de resistência,o desenvolvimento de massas de ovos de M. enterolobiinas raízes do genótipo ‘CPACT 40’ pode estarrelacionado à maior agressividade desta espécie donematoide das galhas em relação às demais avaliadas.

Os resultados obtidos nesse estudo demonstram,portanto, o excelente potencial de utilização damamona na supressão das diferentes espécies donematoide das galhas visando a recuperação de áreasinfestadas. Essas evidências podem ser constatadas emtrabalhos realizados a campo em diferentes regiõesdo globo. Na Flórida, McSorley & Dickson (1995)observaram que a rotação de culturas com mamonafoi capaz de reduzir significativamente a densidadede M. incognita em apenas um ciclo de cultivo.Resultados semelhantes foram obtidos por Rao et al.(1998) em cultivo de berinjela associada com mamonae micorriza (Glomus fasciculatum) no controle de M.incognita. Da mesma forma, Rodrigues-Kábana et al.(1991), avaliando o efeito supressor da mamona emrotação de culturas, em uma área infestada por M.arenaria, observaram que as parcelas cultivadas apenascom amendoim apresentaram densidades donematoide vinte vezes maiores do que aquelascultivadas com mamona, logo no primeiro ano deavaliação.

Efeito de exsudatos radiculares da cultura damamona na eclosão e motilidade de J2 de M.enterolobii e M. graminicola. Os exsudatosprovenientes das cultivares avaliadas apresentaramefeito sobre as diferentes variáveis analisadas paraambas espécies do nematoide das galhas, sendo oefeito in vitro muito mais pronunciado sobre a eclosãoe motilidade dos J2 de M. enterolobii (Tabela 2). Todosexsudatos de mamona avaliados reduziramdrasticamente a motilidade dos J2 de M. enterolobii(96,35 a 100 %), quando comparados às testemunhaságua e exsudato de tomate (Tabela 2). Entretanto,somente os exsudatos das cvs. ‘CPACT 40’,‘Nordestina’ e ‘Sara’ afetaram negativamente amotilidade dos J2 de M. graminicola, quandocomparadas às testemunhas onde o nematoide foiexposto ao exsudato de arroz e água (P < 0,05). Deacordo com Ferraz & Freitas (2004), os exsudatos deplantas antagonistas a nematoides podemdesfavorecer a atração dos J2 nas raízes ou mesmona penetração do nematoide na planta, interferindoassim no ciclo de vida destes patógenos e na suainteração com a planta hospedeira.

Conforme os dados apresentados na Tabela 2,os exsudatos de mamona ‘Al Guarani’, ‘BRS Energia’,‘Cpact 40’, ‘Sara’ e ‘Nordestina’ proporcionaramredução na eclosão dos J2 de M. enterolobii, em relaçãoàs testemunhas, reduzindo em média, 40,22 % daeclosão do nematoide aos 12 dias de incubação. Noentanto, quando avaliada a influência dos exsudatos

Tabela 2 - Efeito de exsudatos radiculares de seis genótipos de mamona sobre a motilidade e eclosão de juvenis de segundo estádio(J2) de M. graminicola e M. enterolobii.

Médias seguidas pela mesma letra nas colunas, não diferem entre si pelo teste de Duncan (P ≤ 0,05).¹Valores de percentagem originais transformados em arc sen 100/x .2Testemunha para M. graminicola = exsudato radicular de plântulas de arroz; testemunha para M. enterolobii = exsudato radicular de plântulasde tomate.

Tratamentos M. graminicola M. enterolobiiMotilidade (%)¹ Eclosão aos 12 dias (%)¹ Motilidade (%)¹ Eclosão aos 12 dias (%)¹

Testemunha2 100,00 a 5,48 ab 50,67 b 42,40 aÁgua 100,00 a 15,12 a 99,07 a 39,61 aAL Guarani 100,00 a 5,02 b 0,00 c 24,51 bBRS Energia 100,00 a 2,27 c 0,00 c 28,93 bIAC 80 96,42 ab 2,43 c 0,75 c 35,88 aCPACT 40 95,38 bc 0,00 c 1,85 c 23,98 bSara 94,27 bc 1,04 c 0,00 c 26,19 bNordestina 91,00 c 5,11 b 0,00 c 18,95 bCV (%) 3,30 37,70 36,82 21,53


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radiculares sobre a eclosão dos juvenis de M.graminicola, aqueles tratamentos com mamona‘Nordestina’ e ‘Al Guarani’ não diferiram datestemunha “arroz”, muito embora nos tratamentosem que a redução da percentagem de eclosão dosnematoides tenha sido significativa, o efeitonematostático foi muito pequeno (4,72- 9,0 %) (Tabela2). Segundo Campos et al. (2006), exsudatos de plantasantagonistas ou más hospedeiras ao nematoide dasgalhas, além de afetar a mobilidade destes patógenos,podem também afetar a eclosão, interferindo nasdivisões celulares do nematoide dentro do ovo,retardando o ciclo do nematoide até o rompimentoda cutícula pelos J2, ou mesmo servindo como fatorde inibição da eclosão por algum composto comefeito nematostático (Ferraz & Freitas, 2004).

Apesar de não ter sido observada influêncianegativa do exsudato de arroz sobre a mobilidadedos J2 de M. graminicola submetidos a 24 horas deincubação (Tabela 2), a pequena redução da eclosãodetectada neste tratamento testemunha pode seratribuída à sensibilidade dessa espécie ao maior tempode exposição do nematoide ao exsudato (12 dias).Segundo Silveira & Freitas (2007), a idade da planta,as condições de estresse, o tipo de solo, assim como,a presença de microorganismos na rizosfera, podemalterar a exsudação radicular, tanto qualitativamentequanto quantitativamente. Além do mais, aconcentração dos exsudatos utilizadas nesse bioensaio(80 %) pode não ter sido a mais adequada, tomando-se por base a metodologia de Campos et al. (2006)para extração de exsudatos radiculares de Brachiariadecumbens L., o que demandaria ajustes e novos testespara comprovar tal hipótese.

Os resultados obtidos neste experimentodemonstram que os exsudatos de mamona interferemtanto na motilidade quanto na eclosão do nematoidedas galhas, apontando para uma possível influênciados exsudatos radiculares da mamona na reação deresistência e imunidade da mamona a M. enterolobii eM. graminicola (Tabela 1). Campos et al. (2006) avaliandoo efeito de exsudatos de plantas antagonistas aonematoide das galhas em outro patossistema,verificaram que a irrigação de substrato comexsudatos radiculares de B. decumbens resultou naredução da penetração e formação de fêmeas de M.

javanica em soja suscetível. Segundo Curtis (2008), osexsudatos radiculares são formados por compostoscomo enzimas, CO2, íons, aminoácidos, açúcares emetabólitos, capazes de alterar o comportamento dosnematoides do solo. Além disso, o ambiente rizosféricoé rico em outras substâncias como secreções,mucilagens, mucigel e lisados celulares, ambos capazesde interferir nas interações planta-microrganismos dosolo (Campbell & Greaves, 1990).

Hubbard et al. (2005) observaram que exsudatosextraídos da região da coifa de plantas de ervilhaforam capazes de diminuir a motilidade de M. incognitae Caenorhabdits elegans em condições de laboratório.Exsudatos radiculares extraídos de outras plantascomo o gergelim também inibiram a eclosão e apenetração de M. incognita em condições de laboratório(Tanda et al., 1989). Em experimento realizado porCastro et al. (1989), foram obtidos diferentescomponentes químicos de exsudatos radiculares depepino, sendo que cada uma das substâncias obtidasfoi capaz de atrair ou repelir Meloidogyne incognita emcondições de laboratório.

Com base nos resultados obtidos nessetrabalho, pode-se inferir que existem cultivares demamona resistentes a M. enterolobii, M. arenaria, M.javanica, M. ethiopica, M. incognita e M. graminicola, e quea cultura da mamona serve como alternativa nasupressão dos nematoides das galhas, podendo serutilizada em esquemas de rotação de culturas em áreasinfestadas por esses nematoides. Além disso, oconhecimento dos mecanismos de resistência, ofracionamento e a identificação de compostosaleloquímicos encontrados nos exsudatos da mamonapode contribuir no esclarecimento de como se dãoos processos e interações entre os nematoides e arizosfera dessas plantas, assim como, servir de basena inovação de produtos utilizados no controle defitonematoides a partir de sua manipulação genética ebiotecnológica, possibilitando a produção denematicidas com menor persistência no solo etoxicidade ao meio ambiente.

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Janaína T. Bernardo, Leandro G. de Freitas, Jaqueline K. Yamada, Vanessa S. Almeida, Rosangela Dallemole-Giaretta & Silamar Ferraz

Efeito de Adubos Orgânicos sobre Meloidogyne javanicaem Tomateiro

Janaína T. Bernardo*, Leandro G. de Freitas, Jaqueline K. Yamada, Vanessa S. Almeida, RosangelaDallemole-Giaretta & Silamar Ferraz

1Departamento de Fitopatologia, Universidade Federal de Viçosa (UFV), 36570-000 Viçosa (MG) Brasil.*Autora para correspondência: [email protected]

Recebido para publicação em 16 / 10 / 2010. Aceito em 09 / 05 / 2011Editado por Claudio Marcelo G. Oliveira

Resumo - Bernardo, J.T., L.G. Freitas, J.K.Yamada, V.S. Almeida, R. Dallemole-Giaretta & S. Ferraz. 2011.Efeito de adubos orgânicos sobre Meloidogyne javanica em tomateiro.

Diversas fontes de matéria orgânica possuem efeito nematicida comprovado; no entanto, algumas apresentamresultados inconsistentes no controle de fitonematoides, apesar de compensarem, ao menos em parte, asperdas causadas pelo parasitismo. Investigou-se neste trabalho o efeito de composto agrícola, turfa, palha decafé, esterco bovino, biofertilizante líquido e húmus de minhoca sobre Meloidogyne javanica em tomateiro, noverão; e palha de café, turfa e biofertilizante em dose completa e meia dose no outono-inverno. No experimentode verão, os materiais orgânicos testados permitiram aumento da infecção da planta pelo nematoide (P <0,05), exceto a palha de café, que reduziu o índice de galhas. O biofertilizante foi o único que não promoveucrescimento de planta na dose testada. No experimento de outono-inverno, a palha de café e a turfa reduziramo número de galhas e ovos por planta. A redução de ovos por planta com adição de palha de café e turfa foide 86 e 37 %, respectivamente, na mesma dose utilizada no verão. O biofertilizante reduziu a população denematoides somente na dose completa, sendo que na meia dose permitiu o aumento da infecção do nematoide,como no experimento do verão. A turfa causou redução significativa na dose completa, mas não diferiuestatisticamente da testemunha na meia dose. A palha de café na dose completa causou redução mais intensaque na meia dose.Palavras-chaves: Meloidogyne javanica, adubos orgânicos, ação nematicida, doses, tomateiro.

Summary - Bernardo, J.T., L.G. Freitas, J.K.Yamada, V.S. Almeida, R. Dallemole-Giaretta & S. Ferraz. 2011.Effect of organic amendments on Meloidogyne javanica in tomato.

There are several kinds of organic amendments that have proven to have nematicidal effect; however someof them are not consistent in the control of nematodes, although they increase crop productivity. Little isknown about the influence of doses of these materials in the control of nematodes. In this study, it wasinvestigated the effect of agriculture compost; peat, coffee pulp, cow manure, one liquid biofertilizer andearthworm humus on Meloidogyne javanica in tomato in the summer; and coffee pulp, peat and liquid biofertilizerat the recommended dose and half dose in the winter. The organic materials increased the nematode infectionin the summer experiment, except the coffee pulp, which reduced the gall index. The organic materials, ingeneral, increased the productivity of tomato, except the biofertilizer, the only organic matter that did notpromote plant growth. In the fall-winter experiment, coffee pulp and peat reduced the number of galls andeggs. The reduction of number of eggs with the use of coffee pulp and peat was about 86 and 37 %,respectively, for the same dose used in the summer. The biofertilizer only presented control in full dose, but, athalf dose, increased nematode infection as in the summer experiment. The peat reduced the nematode population

ARTIGO


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Efeito de Adubos Orgânicos sobre Meloidogyne javanica em Tomateiro

IntroduçãoAs espécies do gênero Meloidogyne Goeldi, também

conhecidas como nematoides-das-galhas, são parasitasde mais de 2.000 espécies de plantas e causam grandesperdas em olerícolas. Na cultura do tomate(Lycopersicon esculentum Mill.), Sasser (1989) estimou asperdas em torno de 20,5 %.

O aumento da consciência da sociedade sobre ouso de pesticidas na produção de alimentos temresultado em um crescente interesse nodesenvolvimento de métodos alternativos de controle(Kerry, 2007). Diversas são as fontes de matériaorgânica que possuem efeito nematicida comprovado,tais como resíduo do tratamento de esgoto, restosvegetais, serragens e esterco de origem animal (Kaplan& Noe, 1993; D’Addabbo, 1995). Em trabalhorealizado por Ribeiro et al. (1998), a aplicação de cascade café reduziu significativamente a população de M.javanica em alface (Lactuca sativa). Zambolim et al.(1996) já haviam constatado o efeito da palha de cafésobre essa espécie de nematoide. A casca de café érica em potássio, podendo ser utilizada comofertilizante agrícola, já que grande proporção dosnutrientes extraídos pela planta está contida na casca(Malavolta, 1993).

A turfa é composta por substâncias húmicas, comoácidos húmicos, ácidos fúlvicos e huminas, e desubstâncias não húmicas como lignina e proteína. Seuefeito sobre nematoides é desconhecido. Dias & Ferraz(2001) estudaram o efeito de ácidos húmicos e fúlvicossobre a eclosão de juvenis de Heterodera glycines eobservaram que a taxa de mortalidade foi maior que90 % nos tratamentos com ácidos húmicos e matériahúmica, mesmo nas soluções diluídas.

Atiyeh et al. (2000), estudando compostosorgânicos e húmus, demonstraram que compostosorgânicos são ricos em amônia, enquanto húmus deminhoca possui alto teor de nitratos, que são formasmais disponíveis para as plantas. Kimpinsk et al. (2003)avaliaram o efeito de composto agrícola e esterco

bovino sobre a produtividade de batata (Solanumtuberosum) em solos infestados com nematoides eencontraram aumento de produtividade médio de 27% após um período de sete anos, ainda que nessetrabalho o esterco bovino e o composto tivessemaumentado a população de nematoides no solo. Alveset al. (2007) acrescentaram esterco de curral aosubstrato e observaram o aumento da concentraçãode fenóis (mg / 100ml) nas raízes, fato que foi deletérioàs células gigantes e prejudicial ao desenvolvimentodo nematoide. O uso de três diferentes tipos debiofertilizante no crescimento de plantas emlaboratório sob estresse de alumínio tóxico resultouna mais alta biomassa e aumentou a absorção denutrientes pelas plantas (Marozsán et al. 2009).

A efetividade de dada matéria orgânica parasupressão de nematoide depende de sua composiçãoquímica e das espécies de microorganismos quedesenvolve (Badra et al., 1979). Esses materiais têmtipicamente baixa relação C:N e alto conteúdo deproteína ou aminoácidos (Rodriguez-Kabana et al.,1987).

O objetivo deste trabalho foi avaliar o efeito dediferentes adubos orgânicos, em duas épocas, sobreM. javanica em tomateiro.

Material e MétodosDois experimentos foram realizados em condições

de casa de vegetação, o primeiro no verão e o segundoentre o outono e o inverno.

Experimento 1. O experimento foi realizado emcasa de vegetação do Departamento de Fitopatologiada Universidade Federal de Viçosa, no período dedezembro a fevereiro de 2009, com média detemperaturas máximas de 32,3 °C e média detemperaturas mínimas de 20,1°C, sendo a média geralde 26,2 °C. A temperatura média do solo foi de26,9 °C. O composto rural foi cedido peloLaboratório de Engenharia Sanitária e Ambiental daUniversidade Federal de Viçosa (LESA). Utilizou-se

at full dose, however it was not statistically different from the control treatment at half dose. The coffee pulpreduced statistically in higher extent at full dose than at half dose.Key words: Meloidogyne javanica, organic amendments, nematicidal activity, doses, tomato plant.

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na montagem da pilha de compostagem esterco decurral (50 %), folhas (25 %) e grama (25 %), os quaisforam misturados e umedecidos. De início ocorreu adegradação do material orgânico, durante o qual semanteve temperaturas não superiores a 65 °C. Foramfeitos reviramentos periódicos com o objetivo de aerara pilha. A aeração tem por finalidade suprir a demandade oxigênio requerida pela atividade microbiológicae atuar como agente de controle da temperatura(Pereira Neto, 2007). A temperatura foi verificada pormeio de uma sonda de temperatura. Os reviramentosforam feitos a cada três dias no primeiro mês e acada sete dias no segundo mês. O composto entãopermaneceu o terceiro mês sem reviramentos, comas temperaturas sempre abaixo de 40 °C. A queda detemperatura caracterizou a mudança da fase ativa paraa fase de maturação. Ao final dos 90 dias o compostoestava pronto para o uso.

O esterco bovino foi curtido por 120 dias antesde ser utilizado. A palha de café, composta de casca epergaminho, resíduos do preparo do café por via seca,foi utilizada seca e não lavada. O húmus de minhoca,a turfa e o biofertilizante foram provenientes deprodutos comerciais. O húmus de minhoca foioriginado do produto de nome “húmus aduboorgânico”, à disposição no comércio local. A turfautilizada é comercializada pela empresa TechnesAgrícola Ltda, de nome Turfa S.C.®. O produto écomposto exclusivamente de turfa extraída de jazidasdo estado de São Paulo. O biofertilizante é o produtode nome AminoagroMol® para aplicação via solo.

O experimento foi conduzido em delineamentointeiramente casualizado com nove repetições por

tratamento. Foram utilizados vasos plásticos de trêslitros, contendo substrato de solo de barranco(horizonte C) + areia de rio lavada 1:1 (v:v), nãoesterilizados. A composição química e densidade dosdiferentes adubos orgânicos testados são apresentadasna Tabela 1.

O solo utilizado na mistura apresentou as seguintescaracterísticas químicas: pH em H2O = 4,8; Al3+ = 0,2cmolc / dm3; Ca2+ = 1,2 cmolc / dm3; Mg2+ = 0,2cmolc / dm3; K = 197 mg / dm3 e P disponível =6,4 mg / dm3 de solo. O solo foi disposto, por 45dias, em camada fina de 1 cm de altura sobre lonaplástica em casa de vegetação para que secasse einativasse possíveis ovos ou juvenis de nematoides.Após esse período foi verificada a eficiência doprocesso pela retirada de amostras de solo, as quaisforam avaliadas pelo método de Jenkins (1964) econstatação da ausência de nematoides.

Os ovos de M. javanica foram inoculados nosubstrato do vaso de cada parcela experimental, naproporção de 5.000 ovos por vaso, em todos ostratamentos. Os tratamentos foram: 1 = compostorural, 2 = húmus, 3 = palha de café, 4 = esterco bovino,5 = biofertilizante e 6 = turfa e 7 = testemunha semmatéria orgânica. Os materiais orgânicos forampeneirados em peneira de 5 mm de malha parapadronização do tamanho das partículas, e aplicadono solo na proporção de 175 ml por vaso contendotrês litros de solo e areia (1:1). A dose em volume de175 ml / vaso foi estabelecida com base em estudosde recomendações para uso da palha de café na culturado cafeeiro (Santinato & Matiello, 2001; Moreira et al.2004), considerando-se que esse material apresenta o

Tabela 1 - Composição química e densidade da massa fresca dos diferentes adubos orgânicos1 testados para avaliação do efeito sobreMeloidogyne javanica em tomateiro.

1Análise realizada em julho de 2009 pelo Laboratório de Matéria Orgânica e Resíduos do Departamento de Solos da Universidade Federalde Viçosa.2Não verificado.3Densidade.

Tipos de matéria Matéria orgânica C:N N P K Ca M g Ñ3

orgânica total (mg/cm3)

Biofertilizante 40,2 % 2:1 11,5 % -2 1,1% _ _ 1,15Palha de café 86,9 % 55:1 0,78 % 0,13 % 0,24 % 0,40 % 0,13 % 0,23Turfa 80,3 % 47:1 0,85 % 0,04 % 0,01 % 0,66 % 0,20 % 0,38Húmus 72,3 % 104:1 0,31 % 0,44 % 0,31 % 0,91 % 0,22 % 0,51Esterco bovino 63,7% 38:1 0,78 % 0,38 % 0,17 % 0,99 % 0,37 % 0,42Composto rural 74,6% 17:1 1,62 % 0,43 % 0,73 % 1,64 % 0,37 % 0,65


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maior volume de massa fresca entre os adubosorgânicos utilizados. Evitou-se com isso a utilizaçãode uma subdose da palha de café. A umidade dosadubos orgânicos, medida aos 65 °C, foi de: 16,51 %(palha de café); 47,86 % (turfa); 42,35 % (húmus);26,58 % (esterco); 21,35 % (composto rural) e 92,5% (biofertilizante). Como cada material orgânicopossui uma densidade diferente, as doses padronizadasem volume corresponderam, em toneladas porhectare (t / ha) a: 33,3 de palha de café; 50 decomposto rural; 62,7 de turfa; 30 de esterco; e 62,7de húmus. A dose de biofertilizante foi estabelecidaem 15 l / ha, o que representa valor médio na faixarecomendada pelo fabricante, de 10 a 20 l / ha.

O nematoide e a matéria orgânica foramincorporados no solo 15 dias antes do transplantiodas mudas de tomate. A incorporação consistiu emmisturar bem cada tipo de matéria orgânica e osubstrato do vaso com o auxílio de uma pá de jardim.Com um lápis, foram feitos três buracos de 2 a 3 cmde profundidade, equidistantes cinco centímetros.Neles foram depositados os ovos do nematoide emsuspensão aquosa. As mudas de tomateiro, cultivarSanta Clara, foram transplantadas com 21 dias. Asplantas foram conduzidas em vasos por 75 dias. Trêstermômetros foram dispostos em três vasoslocalizados em diferentes pontos do delineamentoexperimental, para verificar a temperatura do solo;para medir a temperatura do ar, um termômetro demáxima e mínima foi fixado em ponto próximo aosvasos. O registro das temperaturas foi feito diariamentedurante o período do experimento. A rega foi feitacom regador manual, sempre que necessário,mantendo o solo constantemente úmido. As plantasforam estaqueadas aos 35 dias após o transplantiodas mudas. Na data da colheita, as plantas forammedidas na região compreendida entre o colo e agema apical, o que correspondeu à variável altura departe aérea de planta. Depois, as plantas foramcortadas no colo e pesadas para determinação damassa fresca de parte aérea. As raízes foram lavadasdelicadamente em balde com água para evitar a perdade ovos.

O nível de infecção do nematoide nas raízes foiestimado pelo índice de galhas, sendo a média dasnotas dadas por três pesquisadores de 0 a 10, sendo 0

= ausência de galhas, 1 = 10 % do sistema radicularcom galhas, 2 = 20 % do sistema radicular com galhas,assim por diante, até 10 = 100 % do sistema radicularcom galhas (Barker, 1978). A escala de Barker (1978)foi utilizada porque apresenta maior precisão,permitindo detectar diferenças menores entretratamentos. Os ovos e diferentes estádios dedesenvolvimento foram extraídos pelo método deHussey & Barker e modificado por Boneti & Ferraz(1981) e contados em câmara de Peters com o auxíliode esterescópio.

Foram avaliadas as seguintes variáveis: número deovos e diferentes estádios de M. javanica por sistemaradicular, número de ovos por grama de raiz, índicede galhas, altura de planta, massa fresca da parte aérea,e massa do sistema radicular.

Experimento 2. O experimento foi realizado noperíodo de abril a julho (outono–inverno) de 2009,com médias de temperaturas máximas de 30,6 °C emínimas de 15,1 °C, sendo a média geral de 22,9 °C.A temperatura média do solo foi de 22,8 °C. O soloutilizado foi o mesmo do experimento de verão. Osexperimentos foram conduzidos em delineamentointeiramente casualizado seguindo o esquema fatorial(2 x 3) + 1, sendo o primeiro fator a dose e o segundofator o tipo de matéria orgânica, e a testemunha. Asmatérias orgânicas utilizadas foram: biofertilizantecomercial AminoagroMOL®, turfa comercial TurfaS.C® e palha de café, cuja composição química edensidade são apresentadas na Tabela 1.

Os tratamentos foram 1 = biofertilizante, 2 = palhade café, 3 = turfa, 4 = testemunha sem matériaorgânica. Foram utilizadas oito repetições portratamento. As doses de matéria orgânica foramestabelecidas em dose completa e meia dose de massafresca (Tabela 2). A dose de turfa foi estabelecidasegundo recomendações do fabricante. Para obiofertilizante utilizou-se o dobro da dose máximarecomendada. A dose de palha de café foi estabelecidapor consulta à literatura (Santinato & Matiello, 2001;Moreira et al. 2004).

Misturou-se cada tipo de matéria orgânica comtrês litros de solo e areia (1:1) em saco depolipropileno, com agitação manual e posteriorcolocação em vasos de 3 l . Agitou-se poraproximadamente três minutos, retornando a mistura

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Tabela 2 - Doses de massa fresca dos diferentes adubos orgânicos, estabelecidas em dose completa e meia dose, para avaliação doefeito sobre Meloidogyne javanica em tomateiro.

Unidades: l = litro; µl = microlitro; t = tonelada; g = grama.

Matéria orgânica Meia dose Dose completapor hectare por vaso por hectare por vaso

Biofertilizante 20 l 30 µl 40 l 60 µlPalha de café 16 t 25 g 32 t / ha 50 gTurfa 31 t 50 g 62 t / ha 100 g

para o respectivo vaso. As plantas foram conduzidasem vasos por 60 dias.

O nível de infecção do nematoide nas raízes foiavaliado por contagem do número de galhas porsistema radicular e do número de ovos por planta.Também foram avaliadas a massa de sistema radicular,a altura de planta e a massa fresca da parte aérea.

ResultadosExperimento 1. Todos os materiais orgânicos

aumentaram o número de ovos de nematoidesproduzidos por planta, diferindo do tratamento datestemunha sem matéria orgânica, com exceção daturfa (P < 0,05) (Tabela 3).

Os melhores resultados nessa variável foramapresentados pela palha de café, húmus e o esterco,diferindo estatisticamente da turfa e da testemunha.Ao se considerar o número de ovos por grama deraiz, o biofertilizante foi o tratamento que maisestimulou a reprodução do nematoide. O tratamentocom turfa resultou no menor número de ovos porgrama de raiz, entretanto não diferiu do tratamentotestemunha. Já o tratamento com palha de café foi oque resultou em menor índice de galhas e foi o únicoque diferiu do tratamento testemunha (Tabela 3).

Observou-se aumento significativo de massa deraízes (Tabela 4) em todos os tratamentos testados,com exceção do biofertilizante.

A palha de café foi o tratamento que maisaumentou a massa fresca da parte aérea, diferindoestatisticamente da testemunha e dos outrostratamentos (Tabela 4). O húmus e o compostotambém aumentaram significativamente a massa frescada parte aérea; o aumento proporcionado pela adiçãode húmus (62 %) foi maior estatisticamente que oaumento proporcionado pela adição do composto(44 %). Já o esterco aumentou significativamente

menos (24 %) que os outros tratamentos. Obiofertilizante e a turfa não diferiram significativamenteda testemunha. A palha de café foi o único tratamentoque aumentou a altura da planta em relação àtestemunha (Tabela 4).

Experimento 2. Comparação com atestemunha. Na dose completa o biofertilizante, apalha de café e a turfa reduziram significativamente onúmero de ovos por planta (Tabela 5). Esse mesmopadrão foi observado para o número de ovos porgrama de raiz. Todos os tratamentos com adição dematéria orgânica apresentaram redução significativado número de galhas por grama de raiz. O númerode galhas por planta também foi reduzido em todosos tratamentos, entretanto, somente a palha de café eo biofertilizante diferiram da testemunhasignificativamente. A palha de café, o biofertilizante ea turfa reduziram respectivamente: 67,9; 59,7 e 15,5% (Tabela 6).

Na meia dose a palha de café e a turfa reduziramo número de ovos por planta e o número de ovospor grama de raiz (Tabela 6); entretanto apenas a palhade café apresentou diferença estatística em relação àtestemunha (Tabela 5). Em relação ao número degalhas por grama de raiz, a palha de café mostroureduções significativas para a meia dose e a dosecompleta, sendo de 44,9 e 76,5 %, respectivamente(Tabelas 5 e 6). Já na avaliação do número de galhaspor planta, a palha de café e a turfa não diferiramestatisticamente da testemunha (Tabela 5). Nãoobstante, o biofertilizante aumentou significativamenteos sintomas de infecção na planta pelo nematoide nameia dose (Tabela 5).

Todos os materiais orgânicos promoveramaumento significativo de massa fresca da parte aéreada planta (Tabela 7). Observa-se diferença estatísticados tratamentos com testemunha tanto na dose


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Tabela 3 - Média de número de ovos por planta e por grama de raiz e índice de galhas em tomateiros cultivados no verão em substratonão esterilizado, com diferentes tipos de matéria orgânica e infestados com 5.000 ovos de Meloidogyne javanica.

Para análise, os valores ovos por planta e ovos por grama de raiz foram transformados para log10x.1Médias seguidas pela mesma letra não diferem entre si pelo teste Duncan a 5 % de probabilidade. Médias de nove repetições.

Tratamento Ovos / planta Ovos / grama de raiz Índice de galhas

Composto 223.626 ab1 10.467 abc 7,9 aHúmus 288.836 a 11.318 abc 7,7 abPalha de café 305.109 a 11.664 abc 5,3 cEsterco 264.833 a 13.174 ab 6,1 bcBiofertilizante 182.174 ab 15.126 a 7,0 abTurfa 125.451 bc 6.450 c 7,8 abTestemunha 98.004,2 c 8.760,9 bc 7,3 ab

Tabela 4 - Média de massa de sistema radicular, de planta fresca e altura de tomateiros cultivados no verão em substrato nãoesterilizado, com diferentes tipos de adubos orgânicos e infestados com 5.000 ovos de M. javanica.

Para análise, os valores foram transformados para √(x).1Médias seguidas pela mesma letra não diferem entre si pelo teste DUNCAN, a 5 % de probabilidade. Médias de nove repetições.

Tratamento Massa de raízes (g) Massa fresca da parte aérea (g) Altura da parte aérea (cm)

Palha de café 28,8 a1 91,9 a 121,9 a1

Húmus 25,4 ab 79,2 b 96,4 bComposto 21,2 ab 70,2 c 108,7 abEsterco 21,5 ab 60,5 d 104,7 abTurfa 19,8 bc 57,2 de 96,3 bBiofertilizante 13,1 cd 49,0 e 93,4 bTestemunha 10,8 d 48,9 e 92,5 b

Tabela 5 - Média de galhas e ovos por planta, e por grama de raiz de tomateiros cultivados no outono-inverno em substratos nãoesterilizados, contendo diferentes fontes e doses de matéria orgânica, infestados com 5.000 ovos de Meloidogyne javanica; comparadoscom tomateiros conduzidos nas mesmas condições experimentais, porém sem adição de matéria orgânica (SMO - testemunha).

*Diferença significativa em relação à testemunha (SMO) pelo teste de Dunnett a 5 % de significância. DMS número de galhas por planta:89,0255. DMS número de ovos por planta: 40723,0420. DMS número de galhas por grama de raiz: 9,8948. DMS número de ovos por grama deraiz: 4992,1626. Médias de oito repetições.

Tratamento N°. de galhas N°. de ovos N°. de galhas N°. de ovos/ planta / planta / g raiz / g raiz

Sem matéria orgânica (SMO) 224,4 124.004,8 32,2 17.625,2Biofertilizante meia dose 349,1* 197.376,7* 43,7* 25.333,0*Biofertilizante dose completa 90,5* 39.529,2* 14,6* 6.226,1*Palha de café meia dose 195,6 ns 57.782,0* 17,8* 5.544,3*Palha de café dose completa 71,9* 16.614,1* 7,6* 1.719,7*Turfa meia dose 215,5 ns 84.833,2 ns 32,6 ns 13.127,0 nsTurfa dose completa 189,5 ns 77.864,9* 21,3* 9.558,7*

completa como na meia dose. Já o aumento de massade raízes não foi significativo para todos ostratamentos (Tabela 7). A palha de café na dosecompleta e na meia dose aumentou significativamentea massa de raízes. Entretanto, dose e meia dose debiofertilizante e turfa não diferiram estatisticamenteda testemunha.

Os materiais orgânicos não promoveramdiferença significativa de altura de parte aérea de planta.As médias de altura foram similares estatisticamente,

sendo a média geral igual a 94,58 cm.Comparação dos tratamentos entre si sem a

testemunha. Na dose completa a palha de caféapresentou o menor número de ovos por grama deraiz, diferindo significativamente dos outrostratamentos (Tabela 8). A turfa e o biofertilizante nãodiferiram estatisticamente entre si em número de ovospor grama de raiz. A palha de café e o biofertilizantereduziram significativamente mais o número de ovospor planta que a turfa (Tabela 8). Não houve diferença

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Tabela 6 - Porcentagem em relação à testemunha de redução ou aumento do número de galhas, galhas por grama de raiz, ovos porplanta e ovos por grama de raiz de tomateiros cultivados no outono-inverno em substratos não esterilizados, contendo diferentesfontes e doses de matéria orgânica, e infestados com 5.000 ovos de Meloidogyne javanica.

Tabela 7 - Médias de massa de raiz fresca e parte aérea fresca de tomateiros cultivados no outono-inverno em substratos nãoesterilizados, contendo diferentes fontes e doses de matéria orgânica e infestados com 5.000 ovos de Meloidogyne javanica; comparadoscom tomateiros conduzidos nas mesmas condições experimentais, porém sem adição de matéria orgânica (SMO-testemunha).

*Diferença significativa em relação à testemunha (SMO) pelo teste de Dunnett a 5% de significância. DMS de massa de raízes: 2,71. DMS demassa fresca de parte aérea: 10,7461. Médias de oito repetições.

Tratamento Massa de raízes frescas (g) Massa fresca da parte aérea (g)

Sem matéria orgânica (SMO) 6,9 40,0Biofertilizante meia dose 8,0 ns 51,9*Biofertilizante dose completa 6,2 ns 53,1*Palha de café meia dose 10,8* 62,0*Palha de café dose completa 10,3* 69,2*Turfa meia dose 6,5 ns 51,4*Turfa dose completa 8,4 ns 60,2*

Tabela 8 - Média de galhas e ovos por planta; e por grama de raiz de tomateiros cultivados no outono-inverno em substratos nãoesterilizados, contendo diferentes fontes e doses de matéria orgânica, infestados com 5.000 ovos de Meloidogyne javanica.

Dose Biofertilizante Palha de café Turfa

Redução ou aumento de galhas por planta0,5 +55,6 % -12,8 % -4,0 %1 -59,7 % -67,9 % -15,5 %

Redução ou aumento de ovos por planta0,5 +59,2 % -53,4 % -31,6 %1 -68,1 % -86,6 % -37,2 %

Redução ou aumento de galhas / g0,5 +35,3 % -44,9 % +0,9 %1 -54,8 % -76,5 % -26,9 %

Redução ou aumento de ovos / g0,5 +43,7 % -68,5 % -25,5 %1 -64,7 % -88,9 % -45,8 %

Dose Biofertilizante Palha de café Turfa

Número de galhas por planta0,5 349,1 A 195,6 B 215,5 B1 90,5 B 71,9 B 189,5 A

Número de ovos por planta0,5 197.376,7 A 57.782,0 B 84.833,2 B1 39.529,2 B 16.614,1 B 77.864,9 A

Número de galhas por grama de raiz0,5 43,7 A 17,8 C 32,6 B1 14,6 AB 7,6 B 21,3 AB

Número de ovos por grama de raiz0,5 25.333,0 A 5.544,3 C 13.127,0 B1 6.226,1 A 1.719,7 B 9.558,7 A

1Médias seguidas pela mesma letra na linha não diferem entre si pelo teste de Duncan a 5 % de probabilidade. Médias de oito repetições.

estatística entre a palha de café e o biofertilizante, aindaque a palha de café tenha apresentado percentualmentemaior redução. O tratamento palha de café reduziu

86,6 %, o biofertilizante reduziu 68,1 % e a turfa em37,2 % o número de ovos por planta em relação àtestemunha (Tabela 6). Resultado semelhante pode ser


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observado para o número de galhas por planta (Tabela8). Os tratamentos não diferiram significativamenteentre si em número de galhas por grama de raiz.

Na meia dose a palha de café apresentou, comona dose completa, o menor número de ovos porgrama de raiz, diferindo significativamente dos outrostratamentos (Tabela 8). A turfa, em relação aobiofertilizante, apresentou estatisticamente menornúmero de ovos por grama de raiz. Resultadosemelhante pode ser observado para o número degalhas por grama de raiz. O biofertilizante foi otratamento que resultou em maior número de ovos egalhas por planta, diferindo significativamente dosoutros tratamentos. A palha de café e a turfa nãoapresentaram diferença estatística entre si.

Em média, a adição dos materiais orgânicostestados na dose completa reduziu significativamentemais (P < 0,05) o número de galhas por planta, onúmero de galhas por grama de raiz e o número deovos por grama de raiz, do que na meia dose. Naavaliação de ovos por planta, estatisticamente não fezdiferença usar meia dose ou dose completa.

O sistema radicular apresentou maiordesenvolvimento no tratamento palha de café, o qualdiferiu estatisticamente dos outros dois tratamentos.Do mesmo modo, a palha de café também aumentousignificativamente a massa fresca de parte aérea,diferindo dos outros tratamentos (Tabela 9). Obiofertilizante e a turfa não diferiram estatisticamenteentre si no desenvolvimento de raízes e parte aérea.Não fez diferença utilizar dose completa ou meia doseem cada tipo de material orgânico, quanto à massa deraízes ou massa fresca de parte aérea (Tabela 9).

A massa fresca da parte aérea média dostratamentos foi s ignif icat ivamente maisincrementada na dose completa (60,97 g) que nameia dose (55,12 g).

DiscussãoNo experimento de verão, os adubos orgânicos,

de maneira geral, promoveram o desenvolvimentoradicular. Isso gerou, provavelmente, maior área paraa penetração de juvenis entre o primeiro e o segundociclo de vida e possivelmente entre o segundo e oterceiro ciclo do nematoide de galha. Emtemperaturas altas de verão (média de 26,2°C) essenematoide pode completar três ciclos de vida em 75dias de experimento (Milne & Du Plessis, 1964).Como o biofertilizante não promoveu odesenvolvimento do sistema radicular, esse tratamentoapresentou um alto número de ovos por grama deraiz, sem, portanto, diferir da maioria dos adubosorgânicos. Sistemas radiculares de tamanho grandepodem apresentar alto número de ovos por planta,porque têm maior superfície de penetração para osjuvenis. No entanto, esses ovos têm uma grande áreapara estarem distribuídos e o número de ovos porgrama de raiz é reduzido. Já num sistema radicularpouco desenvolvido, a pressão do parasitismo é maior.Por isso apresenta o número de ovos por grama deraiz maior.

O índice de galhas equivale à variável número degalhas por grama de raiz. Isso se deve ao critério depercentagem de infecção do índice de galhas. Paradar nota a cada sistema radicular, o pesquisadorconsidera o tamanho do sistema radicular e aconcentração e distribuição das galhas, resultando emavaliação similar ao número de galhas por grama deraiz. Kimpinski et al. (2003) explicaram que o aumentoda população de nematoide com a adição decomposto ou esterco pode ser devido ao aumentodo sistema radicular. Os autores obtiveram resultadossemelhantes testando composto e esterco bovino parao controle de nematoide. Em experimento comduração sete anos, os autores encontraram, na média

Tabela 9 - Médias de massa de raízes e massa fresca da parte aérea de tomateiros cultivados no outono - inverno em substratos nãoesterilizados, contendo diferentes fontes e doses de matéria orgânica, sendo não observado o efeito de dose para cada materialorgânico, e infestados com 5.000 ovos de Meloidogyne javanica.

1Médias seguidas pela mesma letra na coluna não diferem entre si pelo teste Duncan a 5 % de probabilidade. Médias de 16 repetições.

Tratamento Massa de raízes Massa de fresca de parte aérea

Palha de café 10,58 A 65,62 ATurfa 7,49 B 55,78 BBiofertilizante 7,06 B 52,75 B

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de sete estações de plantio de batata, o aumento dosníveis das populações de fitonematoides no solo, masainda assim, observaram aumento de produção dasplantas. Esse aumento médio foi de 27 % para a batatatratada com composto ou esterco bovino. Os autoresconcluíram que o efeito de qualquer material orgânicosobre a população de fitonematoides é variável. Aindaque os materiais orgânicos aumentem a produtividadee forneçam nutrientes para as culturas, o efeito sobreos nematoides pode variar com as espécies denematoide, tipos de matéria orgânica e seussubprodutos e tempo após a aplicação (McSorley &Gallaher, 1996, 1997). McSorley & Gallaher (1996,1997) sugeriram que a escolha da cultivar de milhofoi mais importante que a aplicação de resíduos dejardim para o manejo de nematoide-das-galhas nessacultura.

A casca de café tem efeito nematicida conhecido,devido a este material liberar NH4

+ e furfural duranteo processo de decomposição no solo, ambas assubstâncias tóxicas ao nematoide-das-galha(Zambolim et al., 1996), entretanto, não se observoucontrole do nematoide por esse material nesse teste(Tabela 3). O aumento de número de ovos, observadono presente trabalho com a adição de palha de café,provavelmente deve-se à tripla interação plantaadubada / nematoide / alta temperatura ocorrida noperíodo de verão, quando as altas temperaturasfavoreceram a eclosão dos juvenis de segundo estádioe de penetração nas raízes, assim como encurtou ociclo de vida do nematoide. Acredita-se que as maiorestemperaturas do verão em relação ao outono -inverno tenham favorecido mais o nematoide do quea decomposição da casca de café, que é um materialnaturalmente de decomposição lenta devido à altarelação C:N de 55:1. No experimento de outono -inverno a palha de café controlou o nematoide tantoem meia dose quanto na dose completa, sendo maioro controle, ou a diferença significativa com atestemunha, na dose completa. Esse resultado está deacordo com trabalho realizado por Ribeiro et al.(1998), no qual a aplicação da casca de café reduziusignificativamente a população de M. javanica em alface.O biofertilizante aumentou a infecção na meia dose

em todos as variáveis avaliadas, mas na dose completacontrolou o nematoide, o que pode ser evidenciadopor todas as variáveis avaliadas. A eficácia de controlena dose completa mostra que existe um limiar de dosepara o controle com esse tipo de material orgânico.Ainda que tenha uma baixa relação C:N, o efeitonematicida só é percebido quando usado em maioresdoses. O efeito de limiar de dose para o controle dematéria orgânica foi verificado por Tronconi (1986)utilizando palha de café para controle de M. exiguaem mudas de cafeeiro. Parece que para cada matériaorgânica existe uma dose mínima para o controle denematoides, e que essa pode variar com as condiçõesedafoclimáticas. O controle promovido pela turfa nadose completa, tanto na redução de ovos quanto degalhas, demonstra que este é um material orgânicocom atividade nematicida, ainda que tenha uma altarelação C:N. A dose completa de 62 t / ha, quandoaplicada no outono-inverno foi suficiente para ocontrole do nematoide (Tabela 5), mas no verão nãofoi suficiente (Tabela 3), comportando-se como a meiadose do inverno, que resultou em controle dos ovos,mas não das galhas (Tabela 5).

A palha de café, a turfa e o biofertilizante sãomateriais orgânicos com potencial nematicida epossuem uma dose mínima para o controle para M.javanica em tomateiro. São necessários mais estudospara o estabelecimento de doses mínimas de controlepara esses materiais orgânicos. As doses de controleno inverno não são as mesmas para o período deverão. Para o período de verão, as doses dessesmateriais orgânicos devem ser maiores do que aquelestestados no presente trabalho, tendo em vista queapresentam efeito nematicida no inverno. O uso debiofertilizante, em baixas doses, em solo infestado comovos de M. javanica, aumenta a reprodução donematoide em tomateiro.

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20 Vol. 35(1-2) - 2011

Luciany Favoreto, Jaime M. Santos, Sergio A. Calzavara & Luciano A. Lara

Estudo Fitossanitário, Multiplicação e Taxonomia de NematoidesEncontrados em Sementes de Gramíneas Forrageiras no Brasil*

Luciany Favoreto1**, Jaime M. Santos1, Sergio A. Calzavara1 & Luciano A. Lara2

*Parte da Tese da primeira autora, para obtenção do título de Doutorado em Agronomia.1Departamento de Fitossanidade, Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias – Universidade Estadual Paulista (FCAV-

UNESP), 14884-900 Jaboticabal (SP) Brasil.2Departamento Técnico, Sementes Matsuda, 17160-000, Álvares Machado (SP). Brasil.

**Autora para correspondência: [email protected]

Recebido para publicação em 18 / 08 / 2009. Aceito em 10 / 05 / 2011Editado por Claudio Marcelo G. Oliveira

Resumo - Favoreto, L., J.M. Santos, S.A. Calzavara & L.A. Lara. 2011. Estudo fitossanitário, multiplicação etaxonomia de nematoides encontrados em sementes de gramíneas forrageiras no Brasil.

A presença de patógenos nas sementes tem implicações quarentenárias que dificultam as exportações. Foiobjetivo dessa pesquisa quantificar a população de nematoides e de fungos em amostras de sementes degramíneas forrageiras procedentes dos principais Estados produtores do Brasil; estudar a multiplicação in vitroe a taxonomia dos nematoides encontrados. Amostras de 237 lotes de sementes de diferentes gramíneasforrageiras, procedentes dos Estados de São Paulo, Minas Gerais, Mato Grosso do Sul, Mato Grosso, Bahiae Goiás foram coletadas e enviadas para análise nos laboratórios de Nematologia e de Fitopatologia daFCAV–UNESP, Campus de Jaboticabal, pela empresa Comércio e Indústria Matsuda Imp. Exp. Ltda. Osnematoides foram extraídos de alíquotas de 10 g de sementes das amostras. Para detecção dos fungos, utilizou-se o método do papel-filtro. As identificações foram realizadas com auxílio de um microscópio fotônico eestereoscópio. Na multiplicação in vitro, foram utilizadas populações partenogenéticas de Aphelenchoides sexlineatus,Aphelenchus sp. e Ditylenchus montanus. Culturas de um isolado de Fusarium sp. e de Didymella brioniae foramutilizadas como substrato para a multiplicação dos nematoides em placas de Petri, onde 10 fêmeas foraminoculadas e mantidas incubadas em B.O.D. a 25 ± 1 °C no escuro. Após 30 dias, efetuou-se a extração dosnematoides pela técnica do funil de Baermann. As populações nas suspensões obtidas foram estimadas aomicroscópio com auxílio da câmara de contagem de Peters. Com os dados obtidos, foi estimado o fator dereprodução dos nematoides. Para o estudo taxonômico dos fitonematoides, as características morfológicas deespécimes foram fotomicrografadas e eletromicrografadas. Os resultados indicam uma ampla distribuiçãodos nematoides e fungos em sementes de forrageiras nas regiões produtoras do Brasil. Foram identificadas asseguintes espécies de nematoides: Aphelenchoides besseyi, A. bicaudatus, A. fragariae, A. sexlineatus, Ditylenchus myceliophagus,D. dipsaci, D. montanus e Aphelenchus sp. Os fungos detectados foram Fusarium sp., Helminthosporium sp. e Phoma sp.Palavras-chaves: nematoides, Aphelenchoides spp., Ditylenchus spp., fungos, fitoparasitas.

Summary - Favoreto, L., J.M. Santos, S.A. Calzavara & L.A. Lara. 2011. Phytosanitary study, multiplicationand taxonomy of nematodes associated with seeds of forage grasses in Brazil.

Pathogens in seeds imply quarantine constraints for exportation. This research aimed to quantify nematodesand fungus populations in seed samples of forage grasses from the main Brazilian producing states, and tomultiply the nematodes in vitro, as well to study the taxonomy of the nematodes detected. Seed samples of 237lots of different forage grasses from São Paulo, Minas Gerais, Mato Grosso do Sul, Mato Grosso, Bahia, andGoiás States were collected and shipped for analyses in the Nematology and Plant Pathology Laboratories at

ARTIGO


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Estudo Fitossanitário, Multiplicação e Taxonomia de Nematoides Encontrados em Sementes de Gramíneas Forrageiras no Brasil

IntroduçãoNos últimos 30 anos, houve expressivo aumento da

área cultivada com pastagens no Brasil, que passou de154,1 para 177,7 milhões de hectares (Silva & NascimentoJr., 2006). A produção de sementes de gramíneasforrageiras representa expressiva fonte de divisas para oBrasil (Soares, 2003). Estima-se que mais de 100.000 tsão produzidas e comercializadas anualmente somenteno mercado interno (Oliveira, 1994). As espécies deBrachiaria são as mais comercializadas, chegando a 60 %do mercado (Souza, 2001) e predominantementeconstituídas por Brachiaria decumbens e B. brizantha(Verzignassi & Fernandes, 2001). Em relação ao mercadointernacional, exporta-se para mais de 20 países,principalmente da América Latina (Santos & Santos Filho,1999).

Cerca de 180 espécies de Aphelenchoides já foramdescritas (Nickle & Hooper, 1991); em Ditylenchus sãoreconhecidas 81 espécies válidas. Outras 82 espéciesforam removidas do gênero por razões de ordemtaxionômica (Sturhan & Brzeski, 1991). Essa enormediversidade em ambos os grupos dificulta a taxonomiadesses nematoides em relação aos demais. SegundoShahina (1996), a identificação de espécies deAphelenchoides não é fácil, pois algumas referências sãode difícil acesso e existem descrições inadequadas deespécies. Além disso, Ditylenchus spp. e Aphelenchoidesspp. são os fitonematoides que apresentam a maiorvariação de nichos ecológicos no filo Nematoda(Nickle & Hooper, 1991).

Na ausência de plantas hospedeiras, cultivadas ouinvasoras, nematoides do gênero Aphelenchoides podemsobreviver no solo alimentando-se de fungos saprófitosou fitopatogênicos (Pederson & Quesenberry, 1998).Fortuner & Williams (1975) incluíram Panicummaximum, Setaria italica, Cyperus sp. e Digitaria sanguinalisna lista de hospedeiros de Aphelenchoides besseyi.

Além de A. besseyi, outras espécies de Aphelenchoidestêm sido relatadas associadas às gramíneas forrageiras(Favoreto et al., 2003; 2004; Favoreto & Santos, 2004).Sharma et al. (2001) citam a ocorrência de A. subtenuisem 96,9 % e Ditylenchus terricolus em 92,2 % das 64amostras coletadas na rizosfera de Brachiaria brizantha‘Marandu’, no Estado do Acre.

Favoreto (2004) observou que os nematoides emsementes secas usualmente estão inativos. Quandoextraídos, demandam algum tempo em suspensãoaquosa para exibirem atividade. Além disso,nematoides mortos ou inativos não são extraídos pelométodo de funil de Baermann e suas variações. Porconseguinte, o método de extração de nematoidesdas sementes de B. brizantha pela flutuação emcentrífuga (Coolen & D’Herde, 1972) é mais eficazpara recuperação de nematoides que o funil deBaermann com e sem hidratação e/ou trituraçãoprévia das sementes. A mesma autora concluiu que apopulação de Aphelenchoides spp. que infecta assementes de gramíneas forrageiras é maior que apopulação de Ditylenchus spp., que apenas infestam assementes. Deste modo, o processo de beneficiamento

FCAV–UNESP – Jaboticabal( SP) by Comércio e Indústria Matsuda Imp., Exp. Ltd. Nematodes were extractedfrom 10 g of seeds. To detect the fungus, the Blotter-test was applied. The identifications were done by usinga photonic microscope and a stereomicroscope. For the study of in vitro multiplication of the nematodes, thefollowing parthenogenetic species were selected: Aphelenchoides sexlineatus, Aphelenchus sp. and Ditylenchus montanus.Cultures of the fungi Fusarium sp. and Didymella brioniae were used as substrate to multiply the nematodes inPetri dishes. Each plate was inoculated with 10 mature females, then incubated in B.O.D. at 25 ±1 oC, in thedark. Thirty days after inoculation, the nematodes were extracted. The populations obtained in the suspensionswere estimated in the microscope using Peters counting chamber, and the reproduction factor estimated. Forthe taxonomic study of the nematodes, morphological characters of specimens were recorded under the lightand scanning electron microscopes. The results indicated a large distribution of nematodes and fungus in seedsof forage grasses in Brazil. The nematodes identified in the present study were: Aphelenchoides besseyi, A. bicaudatus,A. fragariae, A. sexlineatus, Ditylenchus myceliophagus, D. dipsaci, D. montanus, and Aphelenchus sp. In addition, speciesof the fungi Fusarium, Helminthosporium and Phoma were recovered.Key words: nematodes, Aphelenchoides spp., Ditylenchus spp., fungus, phytoparasite.

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usualmente empregado reduz mais a população deDitylenchus spp. nas sementes beneficiadas que as deAphelenchoides spp. Ainda, os nematoides encontradosem sementes de gramíneas forrageiras também estãopresentes em todos os tecidos da planta. Assim,podem ser disseminados por restos vegetais.

No Brasil, os estudos nematológicos em sementesde gramíneas forrageiras são incipientes, razão pelaqual esta pesquisa foi conduzida, com os objetivos dequantificar a população de nematoides e fungos emamostras de sementes vindas dos principais Estadosprodutores do Brasil, estudar a multiplicação in vitro ea taxonomia dos nematoides encontrados nassementes.

Material e MétodosEstudo fitossanitário. Amostras compostas de

237 lotes de sementes de diferentes gramíneasforrageiras, procedentes dos Estados de São Paulo,Minas Gerais, Mato Grasso do Sul, Mato Grasso, Bahiae Goiás, foram analisadas quanto à ocorrência denematoides e fungos (Tabela 1). Tais amostras foramcoletadas e enviadas ao laboratório de Nematologiada FCAV-UNESP pelos técnicos da empresaComércio e Indústria Matsuda Imp., Exp. Ltda., comsede no município de Álvares Machado (SP). Osnematoides foram extraídos das sementes pela técnicade Coolen & D’Herde (1972) de alíquotas de 10 g desementes. A população total de nematoidesfitoparasitos nas suspensões aquosas de cada amostra,obtidas ao final, foi estimada com o auxílio de ummicroscópio fotônico e da câmara de contagem dePeters (Southey, 1970).

Para detecção dos fungos, utilizou-se o métododo papel de filtro (Blotter-test), conforme descritopela International Seed Testing Association (ISTA,1976). Foram utilizadas placas de Petri de plástico com15 cm de diâmetro, onde foram colocadas três folhasde papel de filtro esterilizadas e umedecidas com águadestilada. Foram adotadas 10 repetições compostaspor 10 sementes equidistantes por placa, totalizando100 sementes analisadas por lote. As placas foramfechadas para manutenção da umidade e mantidasem câmara incubadora com alternância de ciclos deluz e escuro de 12 horas e temperaturas de 20 a 21°C, onde permaneceram por 10 dias. Foram utilizadas

lâmpadas de 40 watts a 40 cm acima das placas. Asidentificações dos fungos foram realizadas com basenas características morfológicas, com auxílio de ummicroscópio fotônico e um estereoscópio, utilizandoa chave de classificação de Barnett & Hunter (1998).

Multiplicação dos nematoides in vitro. Parafacilitar os estudos de taxonomia, procedeu-se àmultiplicação in vitro das espécies partenogenéticas,Aphelenchoides sexlineatus, Aphelenchus sp. e Ditylenchusmontanus, no laboratório de Nematologia da FCAV-UNESP. Culturas de um isolado de Fusarium sp. obtidode inhame (Colocasia esculenta) e de Didymella brioniaeobtido de melão (Cucumis melo) foram utilizadas paraa multiplicação dos nematoides em placas de Petri.Dez fêmeas de cada espécie foram axenizadasseparadamente em solução de ampicilina a 0,1 % einoculadas em culturas dos fungos com cinco dias decrescimento em B.D.A. A seguir foram incubados emB.O.D. a 25 ± 1 °C, no escuro. Aos 30 dias após ainoculação, efetuou-se a extração dos nematoides pelatécnica do funil de Baermann. As populações nassuspensões obtidas foram estimadas sob estereoscópiocom auxílio da câmara de contagem de Peters (Southey,1970). Com os dados obtidos foi estimado o fatorde reprodução dos nematoides segundo Oostenbrink(1966).

Estudo taxonômico dos nematoides. Preparodos nematoides para estudo ao microscópiofotônico. Os espécimes obtidos foram retirados dassuspensões sob estereoscópio, com auxílio de aparatopreparado com um pelo suíno, semelhante a umestilete, e transferidos para frascos de vidro de 10 ml,contendo cerca de 5 ml de água filtrada. Esses frascosforam tampados e agitados manualmente por cercade 2 minutos. Então foram colocados em banho-maria a 55 °C por 5 minutos. Em seguida, foramadicionados 4 ml de formalina a 8 % em cada frasco,os quais foram armazenados, no escuro, até o preparoe montagem de lâminas semipermanentes epermanentes.

As montagens temporárias foram preparadastransferindo-se 10 a 15 espécimes vivos de uma dadapopulação, para uma gota de água filtrada colocadano centro de uma lâmina de vidro sob estereoscópio.Os espécimes foram relaxados em chama de umalamparina a álcool e, em seguida, arranjados lado a


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Tabela 1 - 'Gramíneas forrageiras e respectivos lotes de sementes amostrados quanto às ocorrências de nematoides e fungos.

Forrageiras Quantidade de lotes analisados Quantidades de lotes analisadospor município

Brachiaria brizantha 77 3-Rio Verde-GO1-São Desidério-BA68-Tupaciguara-MG

4-Chapada Gaúcha-MGBrachiaria decumbens 65 4-Chapada Gaúcha-MG

1-Costa Machado-SP2-Jardinopólis-SP

5-Restinga-SP2-Santo Anastácio-SP2-São Desidério-BA47-Tupaciguara-MG

2- Unai-MGBrachiaria dictyoneura 20 12-Costa Machado-SP

1-Rancharia-SP3-Ribeirão dos Indios-SP

3-Santo Anastácio-SP1-Tupaciguara-MG

Brachiaria humidicola 7 Aguas Claras-MSCanarana-MT

João Pinheiro-MGCanarana-MT

João Pinheiro-MGSandovalina-SP

João Pinheiro-MGBrachiaria ruziziensis 5 2-Posse-GO

3-São Desidério-BAPanicum maximum cv. Mombaça 4 1-Santo Anastácio-SP

3-Auriflama-SPPanicum maximum cv. Massai 2 Paranapuã-SPPaspalum atratum (capim Pojuca) 1 Santo Anastácio-SPSetaria anceps cv. Kazungula 2 2-Ivinhema-MSPanicum maximum cv. Tanzânia 2 2-Auriflama-SPBrachiaria brizantha cv. MG-4 35 2-Chapada Gaúcha-MG

2-Santo Anastácio-SP10-São Desidério-BA21-Tupaciguara-MG

Brachiaria brizantha cv. MG-5 8 1-Costa Machado-SP3-São Desidério-BA4-Tupaciguara-MG

Panicum maximum cv. Áries 6 2-Santo Anastácio-SP2-Costa Machado-SP

2-Rinopólis-SPPanicum maximum(Capim Aruana) 2 1-Tupaciguara-MG

1-Costa Machado-SPPennisetum glaucum (Milheto) 1 SEM REGISTRO

lado no fundo e no centro da gota. Então, depositou-se uma lamínula de 21 x 22 mm e efetuou-se a lutagemcom esmalte de unha incolor (Tihohod, 1989). Asobservações e fotomicrografias foram efetuadas até3 h após a montagem. Foram examinados e

documentados fêmeas e machos. As montagenssemipermanentes foram preparadas transferindo-sealguns espécimes fixados para uma gota da soluçãofixadora no centro de lâminas de vidro, seguidas dadeposição da lamínula e lutagem, como no caso

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anterior. As montagens permanentes foram efetuadaspelo método da infiltração dos espécimes comglicerina, segundo Seinhorst (1959).

Os espécimes foram examinados efotomicrografados em um sistema de aquisição deimagens constituído por uma câmera digital SonyHiper HAD® (Sony Electronics Inc., 1 Sony Drive,EUA), montada sobre um microscópio OlympusBX50® (Olympus do Brasil, São Paulo, SP) e acopladaa um microcomputador. As imagens foramdigitalizadas e gravadas em computador para seremposteriormente medidas. Pelo menos 10 fêmeas decada população foram documentadas. Asmensurações nas imagens digitalizadas foram feitasutilizando-se do programa Image Pro-Plus da MediaCybernetics® (Silver Spring, MD, EUA).

Preparação dos nematoides para amicroscopia eletrônica de varredura. Cerca de1.000 espécimes de cada grupo, recém-extraídos,foram transferidos como descrito no item anteriorpara os frascos contendo 3/4 de seus volumespreenchidos com água filtrada. A seguir, os frascosforam agitados manualmente por cerca de 5 minutose deixados em repouso, em refrigerador, a 5 °C, porcerca de 1 hora. Subsequentemente, o volume de águade cada frasco foi reduzido a 0,5 ml com uma seringahipodérmica, e os frascos novamente deixados emgeladeira por 20 minutos. A seguir, o volume de cadafrasco foi preenchido com a solução fixadoraconstituída de glutaraldeído a 3 % e formaldeído a 2% (preparado a partir de paraformaldeído), emsolução-tampão de fosfato de sódio a 0,05 M e pH7,4 e resfriada a 1 °C. Os frascos foram mantidos emgeladeira para que os nematoides se mantivessemrelaxados durante todo o processo de fixação. Apóso período mínimo de 72 h, o processo de preparoteve prosseguimento. Os nematoides em suspensãoforam transferidos com pipeta Pasteur, para câmaraspreparadas com cápsulas de polietileno utilizadas eminclusão de amostras para microscopia eletrônica detransmissão e tela de silk-screen com poros de 25 mm,conforme descrito por Eisenback (1991). Finalmente,os nematoides foram observados eeletromicrografados em microscópio eletrônicoJEOL JSM 5410, operado em 15 kV. Foramdocumentados a morfologia da região labial, em vista

lateral e de topo, os campos laterais, a genitália externae a cauda de fêmeas e de machos.

Identificação de espécies de fitonematoidesem sementes de gramíneas forrageiras. Os dadosobtidos aos microscópios fotônico e eletrônico devarredura foram submetidos às chaves de identificaçãoobtidas na literatura. Para espécies de Aphelenchoides,foram utilizadas as chaves publicadas por váriosautores (Sanwal, 1961; Baujard, 1989; Tacconi &Ambrogioni, 1993; Shahina, 1996). Para identificaçãode espécies de Ditylenchus, foram utilizadas as chavespropostas por Fortuner (1982), Hooper & Southey(1978) e Brzeski (1991).

Resultados e DiscussãoEstudo fitossanitário. Observou-se que as

sementes são meio potencial de disseminação tantode nematoides quanto de fungos (Tabela 2). Nassementes habitualmente colhidas no cacho, tais comoas de milheto e Brachiaria ruziziensis, recuperou-sepequena quantidade ou nenhum nematoide nasamostras. As demais sementes continham expressivasquantidades de nematoides. Em todos os lotes desementes de forrageiras foram detectadas espécies deFusarium, Helminthosporium e Phoma. Algumas espéciesfitoparasitas dos fungos encontrados nesselevantamento são também patógenos de outrasculturas e, por isso, possuem implicações de naturezaquarentenária, o que dificulta a comercializaçãointernacional de sementes forrageiras.

A infecção das sementes por essesmicroorganismos dá-se predominantemente no solo,onde são contaminadas por diversos nematoides efungos, incluindo parasitos facultativos que têm vidasaprofítica no solo, tais como espécies dos nematoidesAphelenchoides, Ditylenchus e dos fungos Fusarium,Helminthosporium, Alternaria, Phoma, Phomopsis,Rhizoctonia, Pythium e Cylindrocladium, dentre outros(Ferreira, 1989; Favoreto, 2008). Os fungosencontrados nas sementes apresentam rápidocrescimento micelial e esporulação, o que pode facilitara contaminação de sementes sadias durante o períodode transporte, de beneficiamento e/ouarmazenamento (Meneses & Oliveira, 1993).

Multiplicação dos nematoides in vitro. NaTabela 3, observa-se que todas as espécies de


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Tabela 2 - Principais fungos e nematoides encontrados em diferentes lotes de sementes de gramíneas forrageiras, oriundas dos estadosde São Paulo, Minas Gerais, Mato Grosso, Mato Grosso do Sul, Bahia e Goiás.

1Infecção média em 100 sementes.

nematoides se multiplicaram em culturas de Fusariumsp. e Didymella brioniae. Porém, existem diferenças entreos fatores de reprodução dos nematoides. As maioresmédias de multiplicação foram alcançadas pela espéciede Aphelenchus quando em cultura de Fusarium sp.,seguida de Aphelenchoides sexlineatus e Ditylenchus montanus.Porém, quando em cultura de D. brioniae, observou-se que A. sexlineatus foi a que mais se multiplicou,seguida de Aphelenchus sp. e de D. montanus. A grandevariabilidade morfológica em ambos os gêneros e aescassez de espécimes adultos nas amostras analisadastorna a taxonomia desses nematoides muito difícil emrelação aos demais. Além disso, conforme mençãode Tenente et al. (1994), os estudos sobre a biologiadestes fitonematoides demandam um grande númerode indivíduos, notadamente quando envolveinoculação.

Esses nematoides não são parasitos obrigatóriosde plantas, podendo atuar como ectoparasitos ouendoparasitos, dependendo do hospedeiro. Na

ausência de plantas hospedeiras, cultivadas ouinvasoras, podem sobreviver no solo alimentando-sede fungos saprófitos ou fitopatogênicos (Pederson& Quesenberry, 1998). A multiplicação de nematoidesin vitro facilita os estudos de taxonomia, a produçãode inóculo para diferentes propósitos, assim comoestudos moleculares e da biologia desses organismos.Estudos sobre a multiplicação de espécies deAphelenchoides e Ditylenchus em diferentes meios deculturas já foram relatados por diversos pesquisadores(Tenente et al., 1994; Ruess et al., 2000). Segundo Ruesset al. (2000), espécies de Aphelenchoides são consideradasgeneralistas, polífagas, alimentando-se de ampla gamade diferentes gêneros de fungos. Ainda, alguns fungospossuem maiores valores nutricionais do que outros,podendo suportar maiores populações de nematoides.Os resultados observados neste trabalho indicaramque ambos os fungos podem ser bons hospedeiros.

Estudo taxonômico dos nematoides. Foramidentificadas quatro espécies de Aphelenchoides a partir

Forrageiras Média da percentagem de sementes Média do número de nematoides infectadas com fungos1 em 10 g de sementes

Fusarium sp. Helminthosporium sp. Phoma sp. Ditylenchus spp. Aphelenchoides spp.

Brachiaria brizantha 61,5 27 13 128 496B. decumbens 55 22 8 96 288B. dictyoneura 37 5,5 17 148 48B. humidicola 45 34 11,5 6,9 184B. ruziziensis 77 74 27 1,6 6,4Panicum maximum cv. Mombaça 72,5 30 4 32 200Panicum maximum cv. Massai 59 18 26,5 132 252Paspalum atratum (capim Pojuca) 62 14 16 176 832Setaria anceps cv. Kazungula 45,5 1,5 2,5 0 128Panicum maximum cv. Tanzânia 47,5 8 14,5 68 1332Brachiaria brizantha cv. MG-4 68 24 9 112 272Brachiaria brizantha cv. MG-5 70 59 23 34,7 133,3Panicum maximum cv. Áries 26 17 13 216 1316Panicum maximum (capim Aruana) 12 11,5 4,5 212 552Pennisetum glaucum (Milheto) 45 11 1 0 0

Tabela 3 - Reprodução dos nematoides Aphelenchoides sexlineatus (Aph), Ditylenchus montanus (Dity) e Aphelenchus sp. (Aphec)recuperados das culturas de Fusarium sp. (F) e Didymella brioniae (D), avaliada com base no fator de reprodução [FR = população final(Pf) / população inicial (Pi)] após 30 dias.

Médias de cinco repetições.

Culturas Pi P f FRAph Dity Aphec Aph Dity Aphec Aph Dity Aphec

F 10 10 10 13.920 8.832 38.384 1.392,0 883,2 3.838,4D 10 10 10 10.656 3.144 6.304 1.065,6 314,4 630,4

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das sementes de gramíneas estudadas: A. besseyi, A.bicaudatus, A. fragariae e A. sexlineatus. Uma vez que assuspensões de nematoides foram misturadas, não foipossível determinar a distribuição geográfica dasespécies. Os espécimes da primeira espécie foramidentificados com base nas seguintes características: ocomprimento do estilete de 15 µm (Figura 1A), campo

lateral com quatro linhas (Figuras 1B e 2B), saco pós-uterino estreito sem a presença de espermatozoides(Figura 1C) e cauda mucronada exibindo três (Figura1D) e quatro mucros (Figuras 2C e D). Esses caracteres,de acordo com as chaves obtidas da literatura (Sanwal,1961; Baujard, 1989; Tacconi & Ambrogioni, 1993;Shahina, 1996), indicam que se trata de A. besseyi. Além

Figura 1 - Fotomicrografias de Aphelenchoides besseyi extraídos de sementes de Brachiaria brizantha. A) Fêmea, parte anterior do corpo;B) Fêmea, campo lateral com quatro linhas; C) saco pós-uterino; D) Fêmea, cauda mucronada com três mucros. Barra de escala paratodas as figuras = 20 µm.


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de A. besseyi, outra espécie do grupo encontrada exibiao comprimento do estilete de 10 µm (Figura 3A),ovário longo exibindo ovo (Figuras 3B e C), campolateral com duas linhas (Figura 3D), saco pós-uterinoestreito não contendo espermatozoides (Figura 3E) ecauda bifurcada (Figura 3F). Esses caracteres, deacordo com Tacconi & Ambrogioni (1993) e Shahina(1996), indicam que se trata de A. bicaudatus.

Outra espécie de Aphelenchoides encontrada exibiao comprimento do estilete de 10 µm e região labialmais larga que o primeiro anel do corpo (Figura 4A),duas linhas no campo lateral (Figura 4B), saco pós-uterino longo quando comparado a A. besseyi e A.bicaudatus (Figura 4C), e cauda mucronada exibindoum mucro na fêmea (Figuras 4D) e no macho (Figura4E). Esses caracteres, de acordo com Baujard (1989)e Shahina (1996), indicam que se trata de A. fragariae.

Encontrou-se uma espécie partenogenética,exibindo o comprimento do estilete de 9 µm, regiãolabial ligeiramente mais larga que o primeiro anel docorpo (Figuras 5A, 6A e B), saco pós-uterino longo eestreito (Figura 5B), cauda mucronada (Figura 5C),porém exibindo mucros com crescimento fora dospadrões de espinho e estrela (Figuras 6E e F). Este

tipo de formação nos mucros, segundo Shahina(1996), caracteriza o grupo 4 de caudas mucronadase campo lateral com seis linhas (Figuras 6G e H). Essascaracterísticas morfológicas, segundo o mesmo autor,referem-se A. sexlineatus.

Aphelenchoides besseyi é um patógeno da cultura dearroz, agente causal da doença referida como PontaBranca, de ampla distribuição mundial (McGawley& Overstreet, 1998). Por esse motivo, a presença dessenematoide em sementes de gramíneas forrageiras temsérias implicações no comércio internacional desementes de forrageiras, uma vez que paísescompradores de tais sementes consideram essenematoide como praga quarentenária. Aphelenchoidesbicaudatus é um nematoide micofago, porém pode serencontrado na rizosfera de importantes culturas, taiscomo milho, algodão, cana de açúcar, arroz e tomate,sem no entanto causar prejuízo (Siddiqui, 1976).Aphelenchoides fragariae é conhecido como nematoide-das-folhas e botões florais, sendo o morangueiro seuhospedeiro-tipo, porém pode se alimentar emultiplicar em culturas de diversos fungos (Cares etal., 2008). A espécie partenogenética, A. sexlineatus, nãohavia sido anteriormente relatada no Brasil. Muito

Figura 2 - Eletromicrografia de varredura de Aphelenchoides besseyi extraídos de sementes de Brachiaria brizantha. A) Fêmea, regiãolabial, B) Fêmea, quatro linhas no campo lateral; C e D) Fêmea, cauda com quatro mucros.

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Figura 3 - Fotomicrografia de Aphelenchoides bicaudatus extraídos de sementes de Brachiaria brizantha. A) Fêmea, extremidadeanterior; B) ovário longo; C) ovo; D) fêmea, campo lateral exibindo duas linhas; E) saco pós-uterino; F) cauda bimucronada (v =vulva, a = ânus). Barra de escala para todas as figuras = 20 µm.


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Figura 4 - Fotomicrografia de Aphelenchoides fragariae extraídos de sementes de Brachiaria brizantha . A) Fêmea, extremidade anterior;B) fêmea, duas linhas no campo lateral; C) saco pós-uterino (v = vulva); D) cauda mucronada da fêmea (a = ânus); E) caudamucronada do macho. Barra de escala para todas as figuras = 20 µm.

Figura 5 - Fotomicrografia de Aphelenchoides sexlineatus (partenogenética) extraídos de sementes de Brachiaria brizantha. A) Extremidadeanterior; B) saco pós-uterino; C) Cauda mucronada (v = vulva, a = ânus). Barra de escala para todas as figuras = 20 µm.

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Figura 6 - Eletromicrografia de varredura de Aphelenchoides sexlineatus (partenogenética) extraídos sementes de Brachiaria brizantha.A,B) Região labial; C) cauda mucronada (v = vulva); D) vulva; E,F) mucro; G,H) seis linhas no campo lateral.

pouco se sabe desta espécie, que também parece sermicófaga, conseguindo se reproduzir muito bem nasduas espécies de fungos testadas neste trabalho.

Entre as espécies de Ditylenchus encontradas, umaexibia o comprimento médio do estilete de 7,1 µm(Figura 7A). O bulbo mediano é fusiforme comparedes do lúmen espessas (Figura 7B), sobreposiçãoligeiramente dorsal do esôfago sobre o intestino(Figura 7C), campo lateral com seis linhas (Figuras7D), saco pós-uterino medindo cerca da metade dadistância entre a vulva e o ânus (Figura 7E) e, cauda

com término variando de subagudo a ligeiramentearredondado (Figuras 7F e G). Esses caracteres, deacordo com Hooper & Southey (1978) e Fortuner(1982) indicam que se trata de Ditylenchus myceliophagus.Além de D. myceliophagus, outra população do grupotambém foi encontrada exibindo o comprimentomédio do estilete de 10 µm. Observou-se que a regiãolabial exibe três anéis, também dividida em seis setores,sendo os lábios laterais menores que os submedianos(Figuras 8A). A cauda é pontiaguda (Figuras 8B e C)e o campo lateral exibe apenas quatro linhas (Figura


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Figura 7 - Fotomicrografia de Ditylenchus myceliophagus extraídos de sementes de Brachiaria brizantha. A) Fêmea, região anterior; B)Fêmea, bulbo mediano fusiforme; C) fêmea, ligeira sobreposição dorsal do esôfago sobre o intestino; D) fêmea, seis linhas no campolateral; E) saco pós-uterino (v = vulva, a = ânus); F) cauda da fêmea; G) cauda do macho. Barra da escala = 10 µm para todas asfiguras.

8D). Esses caracteres indicam que se trata de Ditylenchusdipsaci (Hooper & Southey, 1978; Fortuner, 1982). Foiencontrada uma espécie partenogenética, tambémneste grupo, que exibia o comprimento médio doestilete de 12 µm (Figura 9A). Ao MEV, observou-seque a placa labial aproximadamente quadrada, divididaem seis setores, disco labial circular e proeminente,lábios submedianos fundidos com ligeira constriçãodos lados ventral e dorsal, e lábios laterais visivelmentemenores que os submedianos (Figuras 10A e B). Acauda exibe término agudo (Figuras 9B, 10C e D),saco pós-uterino curto quando comparado àsdemais espécies do grupo mencionado (Figura 9C), eo campo lateral exibindo seis linhas (Figuras 10G eH). Esses caracteres, indicam tratar-se de Ditylenchusmontanus (Hooper & Southey, 1978; Fortuner, 1982).

Ditylenchus myceliophagus já havia sido relatada emsementes de gramíneas forrageiras (Favoreto, 2004) efoi encontrada novamente em diversas amostras destapesquisa. Ditylenchus dipsaci é o agente etiológico dadoença referida como amarelão-do-alho (Alliumsativum). Viglierchio (1971) observou que estenematoide reproduziu-se muito bem em fungos desolo tais como Verticillium sp. e Cladosporium sp., emcondições de laboratório. Goodey et al. (1965)relataram que este nematoide pode estar associado amais de 400 espécies de plantas. Pouco se conhecesobre Ditylenchus montanus, espécie esta não relatadaanteriormente no Brasil. Este nematoide exibiu elevadofator de reprodução nas culturas de Fusarium sp. e deD. brioniae no presente estudo.

Foi observado também em sementes de gramíneas

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Figura 8 - Eletromicrografia de varredura de Ditylenchus dipsaci extraídos sementes de Brachiaria brizantha. A) Fêmea, região labial;B) cauda do macho; C) cauda da fêmea; D) fêmea, quatro linhas no campo lateral.

Figura 9 - Fotomicrografia de Ditylenchus montanus (partenogenética) extraídos de sementes de Brachiaria brizantha. A) Fêmea, parteanterior; B) cauda da fêmea; C) saco pós-uterino (v = vulva). Barra da escala = 10 µm para todas as figuras.


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Figura 10 - Eletromicrografia de varredura de Ditylenchus montanus (partenogenética) extraídos sementes de Brachiaria brizantha. A,B)Região labial; C,D) cauda pontiaguda; E,F) vulva; G,H) seis linhas no campo lateral.

forrageiras uma espécie partenogenética de Aphelenchusque ainda não foi identificada. Ao MEV, observa-seque a placa labial é arredondada, dividida em seissetores, disco labial circular e pouco proeminente(Figuras 11A e B). A cauda terminando com a larguraaproximadamente igual à largura do corpo (Figuras11C e D) e dez linhas no campo lateral (Figura 11F).Não existe registro de nematoide com taiscaracterísticas no Brasil, sendo que esse grupo é muitopouco estudado no mundo. Por conseguinte, estudosadicionais precisam ser realizados para que se possaconhecer melhor sobre a biologia, interações com as

forrageiras e métodos para a desinfestação de grandesquantidades de sementes, facilitando a exportaçãodestes produtos.

AgradecimentosÀ Empresa Sementes Matsuda Ltda., pelo suporte

na condução dos experimentos; à Dra. Renata C.V.Tenente, à Dra. Sue Hockland, ao Dr. Vilmar Gonzagae ao Dr. Juvenil E. Cares, pela ajuda na confirmaçãode algumas espécies de nematoides; à Dra. Rita deCássia Panizzi e à MSc. Delineide Pereira Gomes, pelaidentificação dos fungos; ao Conselho Nacional de

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Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq),pela concessão da bolsa de estudo.

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Figura 11 - Eletromicrografia de varredura de Aphelenchus sp. (partenogenética) extraídos de sementes de Brachiaria brizantha. A,B)Região labial; C,D) cauda (v = vulva); E) vulva; F) linhas do campo lateral.


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Claudio M.G. Oliveira, Rosana Bessi, Ricardo Harakava, Andressa C.Z. Machado & Roberto K. Kubo

Técnicas Moleculares e Microscopia Eletrônica de Varredura no Esclarecimentoda Posição Taxonômica da População K5 de Pratylenchus sp.

Claudio M.G. Oliveira1*, Rosana Bessi2, Ricardo Harakava3,Andressa C.Z. Machado4 & Roberto K. Kubo1

1Instituto Biológico, C. Postal 70, 13001-970 Campinas (SP) Brasil.2Departamento de Fitopatologia e Nematologia, Escola Superior de Agricultura “Luiz de Queiroz” – Universidade de São

Paulo (ESALQ-USP), C. Postal 9, 13418-900 Piracicaba (SP) Brasil.3Instituto Biológico, 04014-002 São Paulo (SP) Brasil.

4Instituto Agronômico do Paraná - IAPAR, Rodovia Celso Garcia Cid - BR 445 km 375, C. Postal 481, 86047-902Londrina (PR) Brasil.

*Autor para correspondência: [email protected]

Recebido para publicação em 02 / 03 / 2011. Aceito em 15 / 06 / 2011Editado por Rosângela D.L. Oliveira

Resumo - Oliveira, C.M.G., R. Bessi, R. Harakava, A.C.Z. Machado & R.K. Kubo. 2011. Técnicas molecularese microscopia eletrônica de varredura no esclarecimento da posição taxonômica da população K5 de Pratylenchussp.

O nematoide-das-lesões radiculares do cafeeiro, Pratylenchus coffeae, é considerado um patógeno importantee limitante à produção dessa cultura em muitos países. Entretanto, vários autores têm questionado a posiçãotaxonômica desse grupo de nematoides e sugerido a existência de raças ou espécies no grupamento taxonômicoatualmente chamado P. coffeae. Dessa forma, o principal objetivo do presente estudo foi caracterizar trêspopulações de Pratylenchus (K5, IB04P e IB13P), coletadas em cafeeiros e citros no estado de São Paulo, pormeio do sequenciamento de fragmentos da expansão D2/D3 do 28S rDNA, e realizar estudos morfológicosutilizando-se microscopia eletrônica de varredura. Além disso, a diagnose das populações de Pratylenchus sp.foi efetuada pela aplicação da tecnologia do código de barras do DNA, com o objetivo de demonstrar autilidade da técnica para a diagnose das três populações de Pratylenchus estudadas. Com base nos estudostaxonômicos morfológicos dessas populações foram observadas as seguintes características: região labial comdois anéis distintos, ponta da cauda da fêmea truncada ou hemisférica, espermateca oval, funcional e presençade machos. De acordo com as análises moleculares, concluiu-se que as populações K5 e IB04P, através dacomparação das sequências com outras presentes no banco de dados GenBank, tratam-se de P. jaehni, uma vezque apresentaram alto grau de homologia baseando-se nas sequências da expansão D2/D3 do 28S rDNA(respectivamente 99 e 98 %) com um isolado dessa espécie. Da mesma forma, a identificação da populaçãoIB13P foi confirmada como P. jaehni (homologia de 99 %), justificando e validando a aplicação da tecnologiado código de barras do DNA na identificação de espécies de Pratylenchus.Palavras-chaves: nematoide das lesões radiculares, código de barras do DNA, sequenciamento, identificação.

Summary - Oliveira, C.M.G., R. Bessi, R. Harakava, A.C.Z. Machado & R.K. Kubo. 2011. Molecular techniquesand scanning electron microscopy for elucidating the taxonomic status of K5 population of Pratylenchus sp.

The coffee root-lesion nematode, Pratylenchus coffeae, is an important pathogen of this crop on severalcountries. However, a number of authors have questioned the taxonomic status of this group, suggesting theexistence of different races or species in the taxonomic group currently named as P. coffeae. Thus, the mainobjective of the present study was to characterize three Pratylenchus populations (K5, IB04P, and IB13P),collected on coffee and citrus in São Paulo state, through sequencing of D2 and D3 expansion fragments of

ARTIGO


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Técnicas Moleculares e Microscopia Eletrônica de Varredura no Esclarecimento da Posição Taxonômica da População K5 de Pratylenchus sp.

IntroduçãoO nematoide-das-lesões radiculares do cafeeiro

(Coffea spp.), Pratylenchus coffeae, é considerado umpatógeno limitante à cultura do café em países comoBarbados, Brasil, Congo, Costa Rica, El Salvador,Guatemala, Índia, Jamaica, Madagascar, Malásia eFilipinas (Schieber & Grullon, 1969, Gonçalves et al.,1978, Campos et al., 1990, Kumar & Samuel, 1990).

No Brasil, o primeiro relato de sua associação como cafeeiro foi feito por Monteiro & Lordello (1974),em Marília (SP). Há alguns anos, P. coffeae foiencontrado em Barra da Guabiraba (PE), causandosevera nematose em cafeeiro (Moura et al., 2002). Osautores relataram que as plantas de café infectadasapresentavam extenso escurecimento do córtexradicular e muitas lesões na região do colo, que atingiamaté 10 cm para cima ao longo do caule. Kubo et al.(2003), em experimentos de casa de vegetação,demonstraram diferenças na agressividade em duaspopulações de P. coffeae, uma de Marília (denominadaK5) e outra do Rio de Janeiro (denominada M2) emplântulas de cafeeiro cv. Mundo Novo. Nesse trabalho,ambas as populações reduziram a fotossíntese dasplântulas, mas a população K5 causou maiorescurecimento das raízes, clorose foliar e redução dasraízes e parte aérea.

Em levantamento no Estado de São Paulo, Kuboet al. (2004) observaram que P. brachyurus é maisfrequente nos cafezais, mas geralmente em baixasdensidades populacionais, enquanto que P. coffeae,apesar de menos disseminada que a anterior, ocorreem altas densidades e causa danos mais pronunciados.

O “status” taxonômico de P. coffeae tem sidoquestionado nos últimos anos, devido à diversidade

morfológica e principalmente genética relatada entrediferentes populações do nematoide (Duncan et al.,1999, Wilcken et al., 2008), bem como em relação àresposta hospedeira de algumas espécies vegetais aesse nematoide (Oliveira et al., 1995; Silva & Inomoto,2002).

Inserra et al. (1990) sugeriram a possibilidade daexistência de raças ou espécies no grupamentotaxonômico atualmente chamado P. coffeae, uma vezque esse nematoide era encontrado frequentementeparasitando espécies nativas, mas com baixa incidêncianos pomares de citros da Flórida. Essa suspeita foiconfirmada quando as espécies de P. loosi e P.pseudocoffeae foram propostas para designação depopulações de P. coffeae coletadas em diversas espéciesde plantas nativas na Flórida (Inserra et al., 1996; 1998).Além disso, o exame de uma população de P. coffeaeextraída de café de localidade próxima à ilha de Java,Indonésia, localidade-tipo da espécie, revelou que ospadrões labiais dessa população são semelhantes aosencontrados em P. gutierrezi (Inserra et al., 1998),descrito a partir de cafeeiros na Costa Rica (Goldenet al., 1992).

Com o objetivo de esclarecer essa questão, Duncanet al. (1999) realizaram estudos morfométricos emoleculares, por meio de RAPD e sequenciamentoda expansão D2/D3 do DNA ribossômico, visandocaracterizar as espécies de nematoides-das-lesões queocorrem em citros na Flórida e as populações de P.coffeae de várias localidades, inclusive algumas brasileiras[C1, C2 e C7 (citros), M1 (Colocasia esculenta), M2

(Aglaonema) e K5 (C. arabica)]. Os resultados permitiramque as 33 populações avaliadas fossem separadas empelo menos sete grupos. As populações brasileiras

the 28S rDNA, and study morphological characteristics using scanning electron microscopy (SEM). Additionally,there was used the DNA barcode technology, with the aim of demonstrating the utility of this technique forthe diagnosis of the Pratylenchus populations studied here. Based on morphological taxonomic studies, thefollowing characteristics were observed: labial region with two distinct annuli, female tail terminus truncate orhemispherical, oval and functional spermatheca, and the presence of males. According with the molecularanalyses, it was concluded that both K5 and IB04P populations are P. jaehni, since they showed high homologylevel based on D2-D3 expansion fragments (respectively 99 and 98 %) with an isolate of this species depositedin the GenBank. Similarly, the identification of IB13P population was confirmed as P. jaehni (99 % of homology),justifying and validating the application of DNA barcode technology in the identification of Pratylenchus species.Key words: root-lesion nematodes, DNA barcode, sequencing, identification.

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foram classificadas dentro do grupo V e, apesar damorfometria do grupo estar de acordo com odescrito originalmente para P. coffeae, essas populaçõesdiferiram das demais pelo menor tamanho do estilete(< 15,5 µm). Ademais, o sequenciamento da expansãoD2/D3 da região 28S rDNA de algumas populaçõesbrasileiras produziu sequências distintas das demaispopulações estudadas. Os autores sugeriram que aspopulações brasileiras, devido ao fato de seremmorfologica e molecularmente distintas das outraspopulações tidas como P. coffeae de outras localidades,muito provavelmente são espécies não descritas oucomplexos de espécies. Inserra et al. (2001) elevarama população de P. coffeae extraída de Citrus aurantiumno estado de São Paulo, denominada C1 no estudode Duncan et al. (1999), ao nível de espécie, como P.jaehni.

De acordo com Campos (2002), três outraspopulações de Pratylenchus coletadas em citros em SãoPaulo (a, b e c), juntamente com K5, foramconsideradas morfologicamente iguais a P. jaehni.Entretanto, a população K5 não consegue semultiplicar em Citrus limonia, provavelmente se tratandode uma raça que seria diferente de C1, P. jaehni (Silva& Inomoto, 2002). Posteriormente, Wilcken et al.(2008), realizaram estudo semelhante ao de Duncanet al. (1999), com as populações C1 (P. jaehni), C2,PcB1, PcB2 e PcB3 (provenientes de bananeira), K5 eM2, além de um teste em casa de vegetação para avaliara suscetibilidade de C. arabica ‘Catuaí’ às populaçõesK5 e M2. Os resultados do teste em casa de vegetação,juntamente com as análises morfométricas emoleculares (RAPD) apontaram para o fato de queC2 é P. jaehni, enquanto K5 seria uma espécie diferentede P. coffeae ou de P. jaehni, provavelmente ainda nãodescrita.

Em função do exposto, fica evidente a necessidadeda realização de estudos morfológicos e molecularesque esclareçam a variabilidade genética entrepopulações de P. coffeae associadas a cafeeiros, comênfase na definição do “status” taxonômico dapopulação K5 de P. coffeae.

Dessa forma, o principal objetivo do presenteestudo foi caracterizar geneticamente populações dePratylenchus spp. coletadas em cafeeiros e citros noestado de São Paulo, inclusive a população K5,

juntamente com a espécie P. jaehni, por meio dosequenciamento da expansão D2/D3 da região 28Sdo DNA ribossômico (rDNA). Além disso,realizaram-se estudos morfológicos da população K5utilizando-se microscopia eletrônica de varredura.

Material e MétodosColeta de amostras. Baseando-se no

levantamento realizado por Kubo et al. (2004), foramcoletadas amostras nematológicas, compostas de soloda rizosfera e de raízes de café (Coffea arabica), daspopulações IB04P e K5, classificadas inicialmentecomo P. coffeae, coletadas, respectivamente, emValinhos e Marília, estado de São Paulo. Para apopulação K5, por tratar-se do mesmo local de coleta(Fazenda Santa Teresinha, Marília, SP), foi mantida amesma designação proposta por Duncan et al. (1999).Foi ainda incluída uma população de P. jaehni de citros(IB13P), coletada em Conchal (SP). As etapas deprocessamento, extração, contagem, montagem delâminas e identificação dos nematoides emmicroscópio de luz foram realizadas no Laboratóriode Nematologia do Instituto Biológico (IB) emCampinas (SP). Para extração dos nematoides do soloe raízes foram utilizados os métodos de Jenkins (1964)e Coolen & D’Herde (1972), respectivamente.

Uma parte dos nematoides extraídos foiutilizada nas análises moleculares, por meio da coletaseletiva de espécimes vivos sob microscópioestereoscópico, armazenados em tubos demicrocentrífuga contendo solução salina (NaCl 1 M)e congelados a -20 ºC. A outra parte foi mantida emcondições de casa de vegetação, em raízes de sorgo.

Observação da população de K5 Pratylenchussp. por meio de microscopia eletrônica devarredura (MEV). Os estudos utilizando-se MEVforam realizados no Núcleo de Apoio à Pesquisa -Microscopia Eletrônica Aplicada à pesquisaAgropecuária, ESALQ / USP, Piracicaba (SP). Osespécimes utilizados no presente estudo foramrecuperados de raízes de sorgo pelo método do funilde Baermann modificado para recipiente raso(Hooper, 1986).

Fêmeas adultas ainda vivas foram transferidas umaa uma dos recipientes originais para outros menores,que foram preenchidos com solução fixadora de


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glutaraldeído 3 % em tampão fosfato de sódio 0,1M em pH 7,2 a 4 °C.

As fêmeas fixadas foram transferidas para cápsulas“beem” de polietileno, adaptadas segundometodologia descrita por Eisenback (1991).Procedeu-se à pós-fixação em tetróxido de ósmio1 % por duas horas à temperatura ambiente, seguidada desidratação em série de concentrações crescentesde etanol (30, 50, 70, 80, 90, 95 e 100 %). As amostrascompletamente desidratadas foram secas ao pontocrítico, utilizando-se CO2 como fluido de transição.Após a secagem, as amostras foram armazenadas emrecipiente hermeticamente fechado, contendo sílica-gel.

A montagem dos nematoides foi realizada sobre“stub” contendo fita adesiva de carbono e um fio decabelo e/ou cobre, como suporte para se obter umângulo de inclinação. Os espécimes foram cobertoscom fina camada de ouro e examinados aomicroscópio LEO 435 VP, operando a 20 kV.

Extração do DNA. Para a extração do DNAgenômico foi utilizado o método da proteinase-K(WLB: Worm Lysis Buffer), segundo Williams et al.(1994). Separadamente, um único indivíduo do gêneroPratylenchus foi selecionado, seccionado em três partes(com auxílio de uma agulha) em uma gota de 15 mlWLB e colocados em tubos de microcentrífuga, sendoincubados a -20 ºC por 15 min. Posteriormente, ostubos foram incubados a 60 ºC por 1 hora, 95 ºCpor 15 min. e resfriados a 4 ºC.

Reação de PCR. Foi utilizado o kit de PCR“pureTaq” Read-To-Go Bead (Amersham PharmaciaBiotech). Em um tubo de microcentrífuga de 0,5 mlfoi adicionada uma esfera do kit de PCR, que numvolume final de 25 ml de reação contém os seguintesreagentes necessários para a reação de PCR: 2,5 UpureTaq, 200 mM de cada dNTP, 10 mM Tris-HCl,50 mM KCl e 1,5 mM MgCl2, quando dissolvida em17,5 ml de água mili-Q. Em seguida, foi adicionado5 ml de DNA genômico, 1ml de cada par de primers(D2A: 5’ – ACAAGTACCGTGAGGGAAAGTTG– 3’ e D3B: 5’ – TCGGAAGGAACCAGCTACTA– 3’). Esta mistura foi levada ao termociclador.

As condições de amplificação foram: desnaturaçãoinicial de 95 ºC por 3 min. e 35 ciclos de 95 ºC por 1min., 68 ºC por 1 min., 72 ºC por 1 min. e uma

extensão final de 72 ºC por 7 min. (Al-Banna et al. ,2004).

Após a amplificação do DNA, 5 ml do produtoda PCR foi utilizado para eletroforese em tampão1X TAE (Sambrook et al., 1989) em gel de agarose a0,8 % com 0,003 % de brometo de etídio (0,02 mg /ml). O resultado da amplificação foi comparado como marcador molecular 100 Base-Pair Ladder(Amershan). O gel foi visualizado num transiluminadorde luz UV e fotografado.

Sequenciamento do DNA. Os sequenciamentosrealizados no presente trabalho foram feitos noLaboratório de Bioquímica Fitopatológica do InstitutoBiológico, em São Paulo (SP). O sequenciamentodireto dos fragmentos amplificados da expansão D2/D3 foi feito por meio de PCR utilizando o kit BigDye Terminator (Perkin Elmer, Norwalk, CT, EUA).Os fragmentos foram purificados por meio do kitWizard® PCR Preps DNA Purification System(Promega). Para cada reação, foi preparada umamistura contendo 2 ml de TRR mix (terminator readyreaction mix), 3,2 mM do primer para o sentido anversoou para o sentido reverso, 3,0 ml do produtopreviamente amplificado contendo aproximadamente400 ng de DNA e 2,0 ml de água. A amplificaçãopara sequenciamento foi realizada de acordo com oprotocolo do fabricante (PE Applied Biosystems,Norwalk, CT, EUA). Foi feita nova purificação doproduto amplificado por precipitação comisopropanol em microtubos. Após a desnaturação dasamostras a 95 ºC por 3 min., foi realizada eletroforeseem aparelho ABI Prism 377 DNA SequencerÔ (PEApplied Biosystem, Norwalk, CT, EUA).

Diagnose das populações de Pratylenchus sp.pela aplicação da tecnologia do código de barrasdo DNA. Utilizou-se no presente estudometodologia da diagnose das populações dePratylenchus sp. pela aplicação da tecnologia do códigode barras do DNA, de acordo com Oliveira et al.(2009), com o objetivo de demonstrar a utilidade datécnica para a diagnose das três populações dePratylenchus (K5, IB04P e IB13P).

O DNA genômico foi extraído de um únicoespécime de Pratylenchus spp. Através do uso de PCR,amplificou-se a expansão D2/D3 do 28S rDNA daspopulações de Pratylenchus sp, conforme descrito

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anteriormente. Os fragmentos de DNA amplificadosde cada população foram purificados e sequenciadosdiretamente em ambas as direções.

As sequências obtidas foram alinhadas ecomparadas com auxílio do programa BioEdit SequenceAlignment Editor (Hall, 1999) com a finalidade deidentificar polimorfismo nas sequências nucleotídicase análise do eletroferograma de cada sequência. Aseguir, as sequências consenso de Pratylenchus sp. foramcomparadas às sequências de outras espécies denematoides depositadas no banco de dados(GenBank, http://www.ncbi.nlm.nih.gov) para aidentificação de homologia utilizando-se o programaBLASTN 2.2.19+ (Zhang et al., 2000).

Análises filogenéticas. Para essa etapa, foiutilizado inicialmente o programa CLUTALX v. 1.81(Thompson et al., 1997), para criação dosalinhamentos múltiplos entre as diferentes sequênciasdos fragmentos da expansão D2/D3 da região 28SrDNA das diferentes populações analisadas. Após oalinhamento, foi feita uma edição manual através doprograma GeneDoc (Nicholas et al., 1997), onde ascolunas filogeneticamente não informativas foramexcluídas das análises. As análises filogenéticas foramfeitas através do programa TREE-PUZZLE(Strimmer & Von Haeseler, 1996).

Resultados e DiscussãoEstudos taxonômicos. Com base nos estudos

morfológicos das populações em microscopia de luz,observou-se que as populações IB04P, IB13P e K5apresentaram as seguintes características: região labialcom dois anéis distintos, ponta da cauda da fêmeatruncada ou hemisférica, espermateca oval e funcional,e presença de machos.

De acordo com Loof (1991), o número de anéislabiais, a estrutura do campo lateral e o tamanho daespermateca são características confiáveis naidentificação das espécies de Pratylenchus. As duasprimeiras características podem ser examinadas commaior facilidade por MEV do que por microscopiade luz. Os espécimes da população K5 examinadosem MEV apresentaram dois anéis labiais, o últimodeles separado do resto do corpo por profundaincisura transversal, formando nítida constrição, regiãolabial com os lábios laterais fundidos aos submedianos

e ao disco labial (Figuras 1A e 1B). O término caudalfoi identificado como cônico-truncado e liso (Figura1C), mas espécimes com a ponta da cauda hemisféricatambém foram encontrados (Figura 1D). O campolateral apresenta quatro incisuras (Figura 1E), sendoque as bandas externas do campo lateral são areoladas.

Estudos moleculares - análise filogenética dePratylenchus spp. Com o objetivo de se estudar aheterogeneidade e agrupamentos entre espécies dogênero Pratylenchus, foram incluídas no presente estudofilogenético as sequências da expansão D2/D3 daregião 28S de várias espécies de Pratylenchusdepositadas no GenBank, juntamente com as trêspopulações de Pratylenchus spp.

O alinhamento das 43 sequências (incluindoRadopholus similis, utilizado como outgroup) da expansãoD2/D3 apresentou-se no tamanho deaproximadamente 285 pares de bases. A partir doalinhamento das sequências de Pratylenchus spp.,produziu-se uma árvore filogenética (Figura 2).

Analisando-se a árvore filogenética, observa-se queK5 e IB04P formaram um grupo com as populaçõesde P. jaehni [IB13P e outras duas populações de P.jaehni (C1 e C2) de Duncan et al., 1999].

Cabe ressaltar que as duas populações inicialmenteclassificadas como P. coffeae provenientes de cafezaisdo estado de São Paulo (K5 e IB04P) não seagruparam com as populações P. coffeae incluídas notrabalho de Duncan et al. (1999) e Subbotin et al. (2008).

Código de barras do DNA. O uso de um códigode barras do DNA para identificação de organismosfoi proposto em duas conferências realizadas nolaboratório de Cold Spring Harbor, Estados Unidos(EUA), em 2003 (Powers, 2004). O princípio do usode um código de barras genético seria o de que, emum pequeno trecho do genoma do organismo,específico para cada espécie, geralmente o DNAmitocondrial ou DNA ribossômico, existiria variaçãosuficiente para separar as espécies que habitam oplaneta atualmente, inclusive os nematoides parasitosde plantas (Powers, 2004).

Recentemente, por meio da aplicação da tecnologiado código de barras do DNA, Oliveira et al. (2009)relataram que, inadvertidamente, tubérculos de batataprovenientes do Canadá apresentavam-se com onematoide P. penetrans. Nesse material, devido às


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Figura 1 - Fotomicrografias de fêmeas adultas de Pratylenchus jaehni (população K5) ao microscópio eletrônico de varredura. A e B:região labial e início do campo lateral. C e D: cauda. E: campo lateral.Barra: A e B = 2 µm; C, D e E = 5 µm.

condições de transporte e armazenagem, os poucosnematoides presentes na amostra apresentavam-secom a morfologia alterada devido à anidrobiose, semcondições para a segura identificação específica. Pararesolver tal questão, lançou-se mão de uma técnicabastante segura, mas que ainda não se encontra emuso rotineiro em laboratórios de diagnose denematoides no Brasil, o chamado código de barrasdo DNA (DNA barcode), por meio dosequenciamento de um pequeno trecho do genomado organismo, específico para cada espécie.

Nesse sentido, utilizou-se metodologia semelhanteno presente estudo com o objetivo de demonstrar autilidade da técnica do código de barras do DNApara a diagnose de três populações de Pratylenchus sp.(K5, IB04P e IB13P).

Para nematoides do gênero Pratylenchus, a regiãogenômica mais estudada é a D2/D3, situada no DNAribossômico. Essa região apresenta-se atualmente commaior número de sequências depositadas no GenBanke, de acordo com Subbotin et al. (2008), é a mais

adequada para identificação molecular de Pratylenchusspp. Portanto, procedeu-se ao estudo dessa região como objetivo de elucidar a identificação das espécies dePratylenchus coletadas em cafezais paulistas em análise,além de IB13P proveniente de plantas cítricas.

As sequências da expansão D2/D3 obtidas foramindividualmente confrontadas aos dados existentes nobanco de dados GenBank, para a identificação dehomologia com sequências de outras espécies denematoides.

De acordo com essas análises, concluiu-se que aspopulações K5 e IB04P, pela comparação dassequências da expansão D2-D3, são P. jaehni, uma vezque apresentaram alto grau de homologia(respectivamente 99 e 98 %) com o isolado C2 (códigode acesso no GenBank : AF170427.1). Da mesmaforma, a identificação da população IB13P foiconfirmada como P. jaehni (homologia de 99 %).

Variabilidade genética em relação à região ITS-1do rDNA tem sido relatada frequentemente parapopulações de nematoides, como Belonolaimus

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longicaudatus (Cherry et al., 1997), Globodera pallida (Bloket al., 1998, Grenier et al., 2001), Naccobus aberrans(Reid et al., 2003), Radopholus similis (Elbadri et al., 2002),Xiphinema americanum (Vrain et al., 1992), X. elongatum(Chen et al., 2004) e X. krugi (Oliveira et al., 2006).

Variabilidade genética intrapopulacional tambémfoi encontrada quando se analisou a expansão D2/D3 de espécies de Pratylenchus. Tal variabilidade, pelomenos no caso de P. coffeae, tem sido relatada emtrabalhos prévios (Duncan et al., 1999, Waeyenbergeet al., 2000). Recentemente, Subbotin et al. (2008)relataram que existe diversidade genética de até 3,6 %entre as sequências da expansão D2/D3 de váriaspopulações de P. coffeae, até 5,9 % para P. zeae e 6,5 %entre populações de P. thornei. Ademais, há evidênciasde que várias espécies correlatas a P. coffeae são, naverdade, complexos de espécies (Duncan et al., 1999).

O conceito de complexo de espécies se relaciona aum grande número de espécies ligadas na naturezapor frequentes e ocasionais hibridizações entre elas(Grant, 1957). Além do conceito de complexos deespécies, o termo espécies crípticas, que são aquelasmorfologicamente semelhantes, mas geneticamentedistintas, também tem sido utilizado nesse caso (VanOppen et al., 2001).

Duncan et al. (1999) estudaram a expansão D2/D3 de diferentes populações de P. coffeae, incluindopopulações brasileiras, e observaram grandevariabilidade em relação a populações da AméricaCentral, Indonésia e Estados Unidos (Duncan et al.,1999). No citado trabalho, os autores chegaram aconcluir que as populações brasileiras [C1, C2 e C7

(citros), M1 (Colocasia esculenta), M2 (Aglaonema) e K5 (C.arabica)], isoladas de café e citros no estado de São

Figura 2 - Árvore filogenética mostrando as relações entre as populações de Pratylenchus estudadas no presente trabalho, emcomparação com Pratylenchus spp. da literatura (código de acesso no GenBank entre parênteses), baseada nas seqüências da expansãoD2/D3 da região 28S do rDNA. Radopholus similis foi utilizado como outgroup.

Radopholus similis (U47558.1)

P. gutierrezi K1 (AF170440)

Pratylenchus sp. (Gl161209937)

P. thornei (EU130880.1)

P. mediterraneus (AJ545022.1)

P. brachyurus (Gl1870249)

P. pseudocoffeae (AF170444)

P. agilis (Gl161209881)

P. hexincisus (DQ498833.1)

P. dunensis (AM231943.1)

P. penetrans (Gl161209896)

P. arlingtoni (AF307328.1)

P. penetrans (EU130863.1)

IB04P (JN162389)

P. jaehni C1 (AF170426)

IB13P (JN162388)

K5 (JN162387)

P. jaehni C2 (AF170427)

P. scribneri (DQ498830.1)P. hippeastri (FN554882.1)

P. loosi N1 (Af170437)

P. pratensis (AM231935.1)

P. coffeae B1 (AF170433)

P. coffeae C4 (AF170428)

P. coffeae Y3 (AF170432)

P. coffeae B2 (AF170434)

P. coffeae M3 (AF17046)



P. coffeae M1 (AF170435)

P. coffeae C6 (AF170429)

P. coffeae CA80 (Gl161209883)

P. coffeae K6 (AF170443)

P. crenatus (U47549.1)

P. crenatus (Gl161209892)

P. vulnus (Gl161209922)

P. zeae (Gl161209934)

P. brzeskii (AM231928.1)

P. minyus (U47548.1)

P. neglectus (Gl161209894)

P. brachyurus (Gl161209882)

P. teres (AF303951.1)0.1

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96

91

100

97

79

52

73

100

100


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Paulo, seriam um complexo de uma ou mais espéciesnão descritas, uma vez que foram separadas em pelomenos sete grupos distintos morfometricamente.Entretanto, a população K5, incluída no presenteestudo, não foi incluída nas análises moleculares daexpansão D2/D3 realizadas por Duncan et al. (1999),como as demais. Com efeito, Inserra et al. (2001)consideraram a população de P. coffeae extraída de C.aurantium no estado de São Paulo, denominada C1,incluída no estudo de Duncan et al. (1999), ao nível deespécie, P. jaehni. Além disso, outras duas espécies, P.loosi e P. pseudocoffeae, haviam sido recentementepropostas para designar populações de P. coffeaecoletadas em diversas espécies de plantas nativas naFlórida (Inserra et al., 1996, 1998).

Em função do maior número de trabalhos queutilizaram a expansão D2/D3 de diferentes espéciesde Pratylenchus, foi possível realizar uma comparaçãodireta das sequências obtidas no presente trabalho comoutras do banco de dados GenBank, pelo alinhamentosmúltiplos e aplicação da tecnologia do código de barrasdo DNA.

Após análise dos eletroferogramas das sequênciase estudos moleculares (código de barras do DNA eanálise filogenética) e morfológicos (microscopiaeletrônica de varredura), concluiu-se que, no casoespecífico da população K5, a hipótese de que se tratade uma espécie ainda não descrita foi descartada. Essapopulação se alinhou filogeneticamente à P. jaehni,apresentando identidade genética de 99 % pela análisedo código de barras. Esses resultados contradizemrelatos anteriores (Duncan et al., 1999; Wilcken et al.,2008). No entanto, Campos (2002) considerou K5morfologicamente igual a P. jaehni, porém, K5 não semultiplica em C. limonia, provavelmente se tratandode uma raça que seria diferente da população-tipo deP. jaehni que parasita citros, segundo Silva & Inomoto(2002).

Comparando-se os valores morfométricosobtidos nos trabalhos de Duncan et al. (1999), Campos(2002) e Wilcken et al. (2008), observa-se sobreposiçãode alguns valores entre P. jaehni e K5, levando àconclusão de que a separação desses dois nematoidesbaseada somente em um pequeno número decaracterísticas morfométricas não é totalmenteconfiável. No presente trabalho, o sequenciamento da

expansão D2/D3 do rDNA da população K5indicou claramente sua semelhança com P. jaehni e suaseparação das demais espécies de Pratylenchus incluídasnas análises.

De maneira geral, com base nas análises daexpansão D2/D3, as populações IB04P e K5,classificadas inicialmente como P. coffeae, provenientesde cafezais do Estado de São Paulo não se alinharamfilogeneticamente às outras populações de P. coffeaeprocedentes dos estudos realizados por Duncan et al.(1999) e Subbotin et al. (2008). Por outro lado, essaspopulações e a população IB13P de P. jaehniformaram um grupo filogenético com outras duaspopulações de P. jaehni (C1 e C2), caracterizando econfirmando suas identidades.

AgradecimentosAo Consórcio Pesquisa Café e à Fundação de

Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo(FAPESP) pelo apoio financeiro. Ao ConselhoNacional de Desenvolvimento Científico eTecnológico (CNPq) pela concessão da bolsa deprodutividade em pesquisa aos autores C.M.G.Oliveira e R. Harakava.

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46 Vol. 35(1-2) - 2011

Ana Paula do A. Mônaco, Rui G. Carneiro, Alexandra Scherer & Débora C. Santiago

Hospedabilidade de Plantas Medicinais a Meloidogyne paranaensis*

Ana Paula do A. Mônaco1**, Rui G. Carneiro2, Alexandra Scherer2 & Débora C. Santiago1

*Parte da Tese da primeira autora, para obtenção do título de Doutora em Agronomia (Fitopatologia) pela UniversidadeEstadual de Londrina (PR).

1Universidade Estadual de Londrina, Rodovia Celso Garcia Cid - BR 445 km 380, C. Postal 6001, 86051-990 Londrina(PR) Brasil.

2Instituto Agronômico do Paraná – IAPAR, Rodovia Celso Garcia Cid - BR 445 km 375, C. Postal 481, 86047-902Londrina (PR) Brasil.

**Autora para correspondência: [email protected]

Recebido em 31 / 01 / 2011. Aceito em 9 / 06 / 2011Editado por Mário Inomoto

Resumo - Mônaco A.P.A., R.G. Carneiro, A. Scherer & D.C. Santiago. 2011. Hospedabilidade de plantasmedicinais a Meloidogyne paranaensis.

Estima-se que, do total de medicamentos consumidos atualmente, cerca de 40 % são de origem natural.No Brasil, este segmento responde por cerca de sete por cento do mercado farmacêutico, envolvendo cercade 400 milhões de dólares por ano e gerando em torno de 100 mil empregos diretos e indiretos. Osfitonematoides podem comprometer qualitativa e quantitativamente as substâncias ativas das plantas medicinais.No presente estudo, considerando o valor terapêutico e o econômico dessas plantas, quatorze espécies deplantas medicinais foram avaliadas quanto à resistência a Meloidogyne paranaensis. Três experimentos foramconduzidos em delineamentos inteiramente casualizados, com dez repetições. Plântulas foram individualmenteinoculadas com suspensão de 5000 ovos e juvenis de segundo estádio (J2) e mantidas por 60 dias em casa-de-vegetação. Após esse período, procedeu-se à extração e contagem de ovos e J2 dos sistemas radiculares, e osfatores de reprodução (FR) foram estimados. Comportaram-se como suscetíveis ao nematoide estudado:alfavaca-cheirosa, orégano, boldo, tomate e poejo; como resistentes dente-de-leão, camomila verdadeira, erva-cidreira, hissopo, lípia, folha-da-fortuna e bálsamo; como imunes estragão e guiné.Palavras-chaves: reprodução, resistência, suscetibilidade, nematoide-das-galhas.

Summary - Mônaco A.P.A., R.G. Carneiro, A. Scherer & D.C. Santiago, 2011. Host suitability of medicinalplants to Meloidogyne paranaensis.

Around 40 % of the medications consumed currently are of natural origin. In Brazil, 7% of the pharmaceuticalmarket share (ca. 400 million dollars per year) and 100,000 direct and indirect jobs are strictly related to theproduction and commerce of medications based on medicinal plants. Taking into account the therapeutic andeconomic value of the medicinal plants, fourteen species were evaluated for resistance to Meloidogyne paranaensis.Three experiments were conducted in a completely randomized design with ten replications. Seedlings wereindividually inoculated with a suspension of 5,000 eggs and second stage juveniles (J2) and maintained for 60days in a greenhouse. Thus, eggs and J2 were extracted from the roots and counted, thereafter and thereproduction factors (RF) were estimated. Sweet basil, oregano, boldo, tomato and pennyroyal were rated assusceptible to M. paranaensis; dandelion, camomile true, lemon balm, hyssop, lípia, leaf-of-fortune and balsamas resistant; tarragon and guiné as immune.Key words: reproduction, resistance, susceptibility, root-knot nematodes.

COMUNICAÇÃO


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Hospedabilidade de Plantas Medicinais a Meloidogyne paranaensis

ConteúdoNo Brasil, o uso de plantas medicinais é uma

tradição que tem suas origens na cultura indígena. Porcentenas de anos têm sido utilizadas para tratar doençase amenizar dores e incômodos; nos dias atuais, essasplantas ou as substâncias voláteis delas extraídas vemsendo usadas como flavorizantes, aromatizantes eterapêuticos nas indústrias alimentícia, farmacêutica ecosmética (Jorge, 2006). A utilização da fitoterapiaestá em expansão em todo o mundo. Estima-se que,do total de medicamentos consumidos hoje, cerca de40 % são de origem natural. Os fitoterápicosmovimentam anualmente cerca de 22 bilhões dedólares, com crescimento de 12 % ao ano. No Brasil,este segmento responde por cerca de 7 % domercado farmacêutico, envolvendo cerca de 400milhões de dólares por ano e gerando em torno de100 mil empregos diretos e indiretos (Carlini &Rodrigues, 2005). O estado do Paraná é o maiorprodutor brasileiro de plantas medicinais, sendoresponsável pelo abastecimento de 90 % da demandanacional destes produtos, com faturamento anual deR$ 25 milhões. Há cerca de trinta propriedadesparanaenses que cultivam exclusivamente ervasmedicinais, geralmente em sistema orgânico deprodução (Emater, 1998; 2010).

As plantas medicinais podem ser atacadas porfitonematoides, o que pode comprometer qualitativae quantitativamente suas propriedades farmacológicase sua produção. Dentre os fitonematoides constatadosparasitando plantas medicinais, destacam-se os dogênero Meloidogyne (Correa et al.,1991). Considerandoos valores econômico e terapêutico das plantasmedicinais e os danos que lhes são causados porMeloidogyne spp., além da ocorrência generalizada deMeloidogyne paranaensis no estado do Paraná empropriedades outrora cultivadas com café, conduziu-se o presente trabalho em casa de vegetação, com oobjetivo de determinar a reação de 14 espécies deplantas medicinais quanto à reação a M. paranaensis.

Três experimentos foram conduzidos emdelineamento inteiramente casualizado e com dezrepetições. Durante o período de condução doprimeiro experimento (15 / 10 a 15 / 12 / 2008), amédia das temperaturas mínimas foi de 18,15 °C e

das máximas de 29,63 °C, sendo a média de 23,40°C. No período do segundo experimento (28 / 11 a28 / 01 / 2009), a média das temperaturas mínimasfoi de 18,83 °C e das máximas de 29,34 °C, sendo amédia de 23,71 °C. No terceiro experimento (09 /01 a 09 / 03 / 09), a média das temperaturas mínimasfoi de 19,99 °C e das máximas de 29,64 °C, sendo amédia de 24,15 °C.

Sementes certificadas adquiridas das empresas IslaSementes Ltda. e Feltrim Sementes e estacas foramcolocadas para germinar em substrato de areia e terra(2:1, v:v) contido em vasos plásticos com capacidadepara 500 cm3. O substrato foi desinfestado porautoclavagem por duas horas em temperatura de 120°C. Plântulas assim obtidas foram transplantadas paraoutros vasos de mesmo volume contendo o mesmosubstrato já descrito, mantendo-se uma planta porvaso.

Para a identificação das espécies das plantasmedicinais (poejo, boldo, bálsamo, folha-da-fortuna,lípia, dente-de-leão e guiné), coletadas em canteirosno Instituto Agronômico do Paraná (IAPAR),procedeu-se à herborização das mesmas segundorecomendações do Instituto de Botânica (1989).Exsicatas foram coletadas e depositadas no herbárioda Universidade Estadual de Londrina (UEL). Osnúmeros dos depósitos no herbário foram 48474(guiné), 48473 (lípia), 48475 (boldo), 48890 (bálsamo),48891 (poejo), 48892 (folha-da- fortuna) e 48893(dente-de-leão). Não foram coletadas exsicatas dasdemais plantas (alfavaca-cheirosa, hissopo, erva-cidreira, estragão, orégano, tomate), por seremutilizadas sementes certificadas.

O inóculo inicial do nematoide partiu depopulação obtida de raízes de cafeeiro infectado comM. paranaensis. A população pura do nematoide foiobtida utilizando-se hospedeiros diferenciadorespropostos por Taylor & Sasser (1978), conjugado àtécnica de eletroforese para isoenzimas descrita porCarneiro & Almeida (2001). Essa população foimantida em casa de vegetação do IAPAR, em plantasde cafeeiro. Os inóculos utilizados nos experimentosforam preparados a partir raízes de tomateirosinoculados com a população pura e mantidos em casade vegetação por 60 dias. O método de Bonetti &

48 Vol. 35(1-2) - 2011

Ana Paula do A. Mônaco, Rui G. Carneiro, Alexandra Scherer & Débora C. Santiago

Ferraz (1981) foi utilizado para a obtenção dosinóculos. As plantas foram inoculadas entre cinco e15 dias após o transplante, dependendo da taxa decrescimento de cada espécie, com suspensão de 5 mlde suspensão contendo 1000 ovos + J2 / ml em trêsorifícios de aproximadamente 2 cm de profundidadelocalizados ao redor das plântulas. Plantas de tomateiro(Lycopersicon esculentum) ‘Rutgers’ foram utilizadas comotestemunhas da viabilidade dos inóculos.

As avaliações foram realizadas 60 dias após ainoculação. Os sistemas radiculares das plantas foramcoletados, separados da parte aérea, lavadoscuidadosamente e processados pela técnica de Boneti& Ferraz (1981) para extração dos ovos. Aquantificação dos ovos foi feita em câmara de Peterssob microscópio óptico. Com os valores obtidosforam estimados os fatores de reprodução em cadaparcela (FR = nº. de ovos e J2 extraídos / nº. deovos e J2 inoculados). Foram consideradas resistentesas espécies vegetais com FR < 1, suscetíveis as comFR ≥ 1 e imunes as com FR = 0 (Oostenbrink, 1966).Para as análises estatísticas, optou-se pelatransformação dos dados em raiz de (x +1). Asmédias foram comparadas pelo teste Tukey a 5 % de

probabilidade, após serem submetidas à análise devariância.

Os resultados obtidos estão apresentados na Tabela1. A viabilidade dos inóculos foi confirmada pelonúmero de ovos produzidos em tomateiro. Noprimeiro experimento (Tabela 1), alfavaca-cheirosa foisuscetível, enquanto estragão foi imune e as demaisforam resistentes. Dente-de-leão, camomila verdadeirae erva-cidreira apresentaram valores de FR baixos,indicando elevado nível de resistência. Alfavaca-cheirosa produziu maior quantidade de ovos que asdemais plantas testadas.

No segundo experimento (Tabela 1), boldo eorégano foram suscetíveis, com FR muito alta emboldo. A produção de ovos em orégano foisignificativamente menor que a observada em boldo.Guiné foi imune a M. paranaensis e as demais medicinaisdeste experimento foram resistentes. No terceiroexperimento, poejo foi suscetível e bálsamo foiresistente. Portanto, comportaram-se como suscetíveisao nematoide: alfavaca cheirosa, orégano, boldo epoejo; como resistentes, dente-de-leão, camomilaverdadeira, erva-cidreira, hissopo, lípia, folha-da-fortuna e bálsamo; como imunes, estragão e guiné.

Tabela 1 - Número de ovos, fator de reprodução (FR) e reação (S = suscetível, R = resistente, I = imune) de plantas medicinais aMeloidogyne paranaensis, após 60 dias da inoculação em casa de vegetação.

Cada valor é a média de dez repetições. Médias seguidas de mesma letra na coluna e no mesmo experimento não diferem entre si pelo testeTukey 5 %.

Espécie Nome vulgar Nº. de ovos1 FR Reação

Experimento 1Lycopersicon esculentum Tomate 56280 a 11,26 SOcimum basilicum Alfavaca-cheirosa 10020 b 2,00 SHyssopus officinalis Hissopo 3044 c 0,61 RMelissa officinalis Erva-cidreira 1028 c 0,21 RMatricaria recutita Camomila verdadeira 680 c 0,14 RTaraxacum officinale Dente-de-leão 57 c 0,01 RArtemísia dracunculus Estragão 0 c 0,00 I

Experimento 2Lycopersicon esculentum Tomate 197228 a 39,45 SPlectranthus barbatus Boldo 124900 b 24,98 SOriganum vulgare Orégano 12625 c 2,53 SKalanchoe pinnata Folha-da-fortuna 340 d 0,07 RLippia alba Lípia 266 d 0,05 RPetiveria alliacea Guiné 0d 0 I

Experimento 3Lycopersicon esculentum Tomate 48120 a 9,62 SMentha pulegium Poejo 21685 b 4,33 SSedum praealtum Bálsamo 3828 c 0,76 R


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Hospedabilidade de Plantas Medicinais a Meloidogyne paranaensis

Embora haja muitos trabalhos publicados sobrea reação de plantas medicinais a espécies de Meloidogyne(Cesnik, 1957; Cesnik, 1958; Costa Manso et al., 1985;Goswawi & Vijayalakshwi, 1986; Lordello et al., 1986;Haseeb & Pandey, 1987; Izquierdo et al., 1987; Patelet al., 1989; Moura et al., 1990; Mesquita et al., 1993;Araujo et al., 1994; Macedo Filho et al. (1994), Souzaet al., 1995; Maciel & Ferraz, 1996; Karl et al., 1997;Dias et al., 1998; Prodócimo & Lozano, 1998; Souzaet al., 1998; Park et al., 2004; Moreira et al., 2008; Coutoet al., 2008), apenas Mônaco et al. (2008) estudaram ainteração entre plantas medicinais e M. paranaensis.Nenhuma das plantas daninhas avaliadas por essesautores foram estudadas no presente trabalho.

É improvável que as populações baixasobservadas nas plantas imunes e resistentes a M.paranaensis sejam resultado da falta de sítios dealimentação, uma vez que as raízes estavam em ótimoestado de conservação, sem sinais de perda de matériapor necroses ou podridões.

Os resultados obtidos indicaram que estragão,dente-de-leão, camomila verdadeira, erva-cidreira,hissopo, guiné, lípia, folha-da-fortuna e bálsamopodem ser cultivados em áreas infestadas por M.paranaensis. Alfavaca-cheirosa, boldo e poejo foramsuscetíveis e possivelmente terão o desenvolvimentovegetativo prejudicado pelo nematoide, além deaumentar a população de M. paranensis no solo,proporcionalmente aos valores do FR.

.Literatura CitadaBONETI, J.I.S. & S. FERRAZ. 1981. Modificação do

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50 Vol. 35(1-2) - 2011

Eduardo J. Almeida, Gleina C.S. Alves, Jaime M. Santos & Antonio B.G. Martins

Assinalamentos de Meloidogyne enterolobii em Goiabeira e em PlantasInvasoras no Estado de São Paulo, Brasil

Eduardo J. Almeida1*, Gleina C.S. Alves2, Jaime M. Santos1 & Antonio B.G. Martins3

1Departamento de Fitossanidade da Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias – Universidade Estadual Paulista,14883–090 Jaboticabal (SP) Brasil.

2Departamento de Fitossanidade, Universidade Federal de Goiás, 74001-970 Goiânia (GO) Brasil.3Departamento de Produção Vegetal, Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias – Universidade Estadual Paulista,

14883–090 Jaboticabal (SP) Brasil.*Autor para correspondência: [email protected]

Recebido para publicação em 05 / 01 / 2011. Aceito em 05/ 07 / 2011Editado por Luiz Carlos C.B. Ferraz

Resumo - Almeida, E.J., G.C.S. Alves, J.M. Santos & A.B.G. Martins. 2011. Assinalamentos de Meloidogyneenterolobii em goiabeira e em plantas invasoras no estado de São Paulo, Brasil.

Como subsídios adicionais ao conhecimento sobre a distribuição geográfica de Meloidogyne enterolobii noBrasil, são apresentados os assinalamentos da espécie em pomares paulistas de goiabeira registrados no âmbitodo Laboratório de Nematologia da FCAV-UNESP, Jaboticabal (SP), com indicação dos municípios de origeme níveis de infestação nas raízes. Também são relatadas algumas espécies de plantas invasoras ocorrentes nospomares atacados que se revelaram novas hospedeiras do nematoide e outras que se mostraram muitodesfavoráveis ou possivelmente imunes.Palavras-chaves: Psidium guajava, nematoide-das-galhas, plantas daninhas.

Abstract - Almeida, E.J., G.C.S. Alves, J.M. Santos & A.B.G. Martins. 2011. Records of Meloidogyne enterolobii onguava orchards and weeds in the State of São Paulo, Brazil.

Information regarding to the geographical distribution of Meloidogyne enterolobii in guava orchards situated inthe State of São Paulo, Brazil, are included, with indication of the municipalities from where the nematode wasrecorded and data of average number of nematodes per 10 g roots. In addition, some weed species rated asnew hosts of the guava root-knot nematode are listed.Key words: Psidium guajava, root-knot nematodes, weeds.

COMUNICAÇÃO

ConteúdoA goiabeira (Psidium guajava) é uma importante

frutífera no Brasil, cujo cultivo tem sido fortementelimitado pelo parasitismo do nematoide Meloidogyneenterolobii (sin. M. mayaguensis). O histórico deocorrências dessa espécie, causando sérios danos e,comumente, perdas totais em pomares brasileiros,principalmente nos últimos vinte anos, já foi sumariadoem recente publicação (Silva & Oliveira, 2010). Alémde atacar a goiabeira em praticamente todas as regiõesprodutoras do País, esse nematoide de galhas tem sidoassinalado também parasitando várias outras culturas,

a exemplo de acerola, alface, fumo, pimentão, quiabo,soja e tomate.

Relativamente ao estado de São Paulo, algunsregistros de meloidoginose em goiabeira devidos aM. enterolobii já foram publicados (Almeida et al., 2006;Becaro et al., 2009), mas como resumos, contendoescassos informes a respeito das interações. Objetivou-se, portanto, detalhar aqui tais assinalamentos, bemcomo completá-los com referências a novas plantasinvasoras hospedeiras do nematoide.

Os relatos descritos a seguir foram formalmenteregistrados no Laboratório de Nematologia do


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Assinalamentos de Meloidogyne enterolobii em Goiabeira e em Plantas Invasoras no Estado de São Paulo, Brasil

Departamento de Fitossanidade da FCAV-UNESP,Jaboticabal (SP). Embora amostras relativas à goiabeirativessem sido enviadas ao laboratório desde 1999,como, por exemplo, do município de FernandoPrestes, com verificação de Meloidogyne no solo darizosfera ou em raízes de plantas fortementedepauperadas, não foi possível estabelecer a identidadeda(s) espécie(s) presente(s); isso se deveuprincipalmente às más condições das raízesprocessadas, as quais exibiam severo descorticamento.Foi apenas a partir de 2002 que houve situações nasquais se suspeitou de que o agente causal envolvidopudesse ser efetivamente M. enterolobii. Durante aqueleano, de duas amostras, oriundas das localidadespaulistas de Pontes Gestal e Taquaritingarespectivamente, obtiveram-se altas populações deuma espécie de Meloidogyne cuja identificação específicanão pode ser definida com precisão. Considerando-se que os métodos então utilizados permitiam aidentificação segura das espécies mais comuns deMeloidogyne, tal dificuldade pode ser indicativa de queas citadas populações na verdade se tratassem de M.enterolobii, pois esta era ainda pouco conhecida e haviasido relatada pela primeira vez no País apenas umano antes (Carneiro et al., 2001), em pomares dosestados de Pernambuco e Bahia.

Nos registros referentes ao ano de 2003, a análisede amostra datada de 3 de março, proveniente degoiabal do município de Vista Alegre do Alto (SP),levou à identificação de M. enterolobii pela primeiravez no Estado. Para confirmação da identificação daespécie, recorreu-se ao estudo do fenótipo enzimáticode alfa-esterase e estudo morfológico mediante aanálise da configuração perineal de fêmeas. Assim,apesar das suspeitas de ocorrência em amostrasprocessadas em anos anteriores, deve-se considerar2003 como o ano do primeiro registro comprovadodo nematoide no Estado de São Paulo. Na sequência,em 2004, totalizaram 13 amostras positivas; no anoseguinte, houve cinco casos; em 2006, seis; em 2007,17; em 2008, 31; e em 2009, oito. Atualmente, são 14os municípios paulistas com pomares de goiabeiraatacados por M. enterolobii registrados no laboratóriode Nematologia da FCAV-UNESP. São eles:Fernando Prestes, Vista Alegre do Alto, Taquaritinga,

Pontes Gestal, Monte Alto, Pirangi, Monte AzulPaulista, Jaboticabal, Franca, Matão, Itápolis, Taiaçu,Tapinas e Taquaral.

Em adição a esses registros, sabe-se que M.enterolobii foi também encontrado em goiabais paulistasnos municípios de Matão, Santa Adélia e NovoHorizonte (Becaro et al., 2009).

O alto grau de polifagia dessa espécie se aplicatambém às plantas invasoras. As análises realizadas emJaboticabal, com base em amostras de solo e raízesde plantas daninhas encontradas vegetandoespontaneamente em pomares de goiabeira infestados,possibilitaram definir algumas delas como hospedeirasde M. enterolobii. As espécies, com respectivos númerosmédios de ovos + juvenis J2 obtidos de 10 g de raízes,foram as seguintes: picão-preto (Bidens pilosa) - 2600,0;capim-colchão (Digitaria horizontalis) - 25,0; caruru(Amaranthus retroflexus) - 42,0; erva-de-santa-luzia(Chamaesyce hirta) - 15,0; maria-pretinha (Solanumamericanum) - 933,3; sojinha (Cleome affii) - 9,2; e buva(Coniza canadensis) - 32,0. Essas plantas daninhasapresentavam galhas radiculares de tamanho variável,nem sempre bem evidentes. Desses hospedeirosalternativos do nematoide para o Brasil ora relatados,há de se observar que, em alguns casos, como dosgêneros Amaranthus e Chamaesyce, outras espécies jáhaviam sido antes definidas como hospedeiras.Podem ser citados os exemplos de Amaranthus hybridus(caruru-branco) e Chamaesyce prostata (beldroega-pequena), consideradas hospedeiras a partir deamostras coletadas em São João da Barra, estado doRio de Janeiro (Souza et al., 2006). No caso de Solanumamericanum, aqui chamada maria-pretinha e maria-gorda por Souza et al. (2006), é bem provável que setrate da mesma espécie vegetal. Quanto ao picão-preto(B. pilosa), já havia sido relatado como hospedeiro noestado do Paraná (Carneiro et al., 2006), sendo onematoide também encontrado nas raízes de plantasnaturalmente ocorrentes em goiabal infestado.

Ainda no presente estudo, as análises envolvendoamostras de trapoeraba (Commelina benghalensis), falsa-serralha (Emilia fosbergii) e picão-branco (Galinsogaparviflora) coletadas em goiabais paulistas muitoinfestados, não evidenciaram ocorrência de galhas nasraízes e tampouco delas foram recuperados

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Eduardo J. Almeida, Gleina C.S. Alves, Jaime M. Santos & Antonio B.G. Martins

exemplares de M. enterolobii em qualquer estágio dedesenvolvimento. Isso é sugestivo de que essas plantasinvasoras possam não ser hospedeiras do nematoide,embora se necessite de estudo mais conclusivo arespeito. Carneiro et al. (2006), em condiçõessemelhantes, consideraram que trapoeraba, serralha(Sonchus oleraceus) e cravo-de-defunto (Tagetes minuta)também não eram hospedeiras. Outras espéciesdaninhas hospedeiras foram igualmente determinadasno estado de Pernambuco (Castro et al., 2007), o quecomprova ser essencial a inclusão do controle dessasplantas na elaboração de estratégias de manejo de M.enterolobii em pomares de goiabeira.

AgradecimentosÀ Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de

São Paulo (FAPESP) pelo auxílio à pesquisa concedidoa este trabalho.

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35_12.pdf - Sociedade Brasileira de Nematologia

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