3.2 Alat dan Bahaneprints.umm.ac.id/51779/27/BAB III.pdflaboratorium dilaksanakan mulai 7 Januari 2019 sampai dengan 4 Juni 2019. 3.2 Alat dan Bahan Alat yang digunakan di lahan pada

22

III. METODE PENELITIAN

3.1 Tempat dan Waktu Pelaksanaan

Penelitian di lapang dilaksanakan di Kebun Percobaan Universitas Merdeka

Pasuruan yang terletak di Kelurahan Purut Rejo, Kecamatan Purworejo Kota

Pasuruan. Penelitian di laboratorium dilaksanakan di laboratorium agroteknologi

Universitas Muhammadiyah Malang. Waktu penelitian di lapang mulai 1

September 2018 sampai dengan 2 Desember 2018. Sedangkan penelitian di

laboratorium dilaksanakan mulai 7 Januari 2019 sampai dengan 4 Juni 2019.

3.2 Alat dan Bahan

Alat yang digunakan di lahan pada penelitian ini berupa cangkul, gembor,

meteran, label, alat tulis, tali rafia, pisau dan alat dokumentasi. Sedangkan alat

yang digunakan di laboratorium adalah autoklaf, timbangan analitik, plastik, karet

gelang, tabung reaksi+rak, shaker,vortex, pipet ukur, pipet mikro, karet hisap,

alumunium foil, spatula, spektrofotometer, laminar air flow (LAF),

kompor+tabung gas, plastik wrap, erlenmeyer, cawan petri, toples, kain kasa,

kertas label, haemocytometer, Fotomikroskop, dan alat dokumentasi.

Bahan yang digunakan di lahan adalah keprasan pertama tanaman sorgum

(Sorghum bicolor L. Moench) 9 genotip, pupuk dasar, air, pupuk kimia dan

pestisida. Sedangkan bahan yang di gunakan di laboratorium adalah spirtus, media

PDA (Potato Dextrose Agar), media SDAY (Sabauraud Dextrose Agar dengan

2% Yeast extract), alkohol 70%, aquades, sampel tanah pada 9 genotip sorgum,

ulat hongkong (Tenebrio molitor), dan serangga yang diuji ulat grayak

Spodoptera sp instar 3 dan intar 4.

222

22

23

3.3 Prosedur Penelitian

Penelitian ini merupakan metode eksploratif dan metode deskriptif.

Perlakuan yang digunakan dalam penelitian menggunakan 9 genotip tanaman

sorgum yaitu genotip 1 (Pasuruan), genotip 2 (Lamongan 1), genotip 3

(Lamongan 2), genotip 4 (Tuban), genotip 5 (Sampang 1), genotip 6 (Sampang 2),

genotip 7 (Tulung agung 1), genotip 8 (Tulung agung 2) dan genotip 9 (Jombang).

Lahan pertanaman yang digunakan pada lokasi pengujian berbentuk bedengan

dengan jumlah bedengan sebanyak 27 ( 9 genotip x 3 ulangan). Tanaman ditanam

dengan jarak tanam antar bedengan 30 cm dan jarak antar tanaman 20 cm.

3.4 Tahapan Penelitian

3.4.1 Tahapan Penelitian di Lapang

1. Persiapan tanaman sorgum

Tanaman yang digunakan adalah keprasan pertama tanaman sorgum. Lahan

pertanaman yang digunakan pada lokasi pengujian berbentuk bedengan dengan

jumlah bedengan sebanyak 27 ( 9 genotip x 3 ulangan). Tanaman ditanam dengan

jarak tanam antar bedengan 30 cm dan jarak antar tanaman 20 cm.

2. Pengambilan sampel metode sampling sistematis

Gambar 7. Dena plot penelitian

U

24

Gambar 7. Dena plot penelitian. Keterangan : G1: Genotip Pasuruan, G2: Genotip

Lamongan 1, G3: Genotip Lamongan 2, G4: Genotip Tuban, G5:

Genotip Sampang 1, G6: Genotip Sampang 2, G7: Genotip Tulung

agung 1, G8 : Genotip Tulunga agung 2, G9 : Genotip Jombang, U1:

Ulangan 1, U2: Ulangan 2, U3: Ulangan 3. U: Utara.

Menurut Triyono (2003), Pengambilan sampel tanah dilakukan secara

berurutan dengan menggunakan metode samping sistematis. Berdasarkan gambar

7, Sampel tanah diambil 2 titik dalam satu genotip tanaman, sampel tanah yang

digunakan sebanyak 200 g.sebagai sampel uji, diambil dengan kedalaman tanah

10-15 cm diatas permukaan tanah di sekitar perakaran tanaman.

3. Koleksi dan perbanyakkan isolat

Menurut (Trizelia, 2010) Isolat cendawan jamur entomopatogen yang

digunakan dalam penelitian ini diisolasi dari tanah disekitar perakaran tanaman

sorgum. Pengambilan tanah dilakukan dengan cara penggalian tanah pada

kedalaman 10 - 15 cm dengan menggunakan sekop tangan kecil. sampel tanah

dimasukkan kedalam kantong plastik dan dibawa ke laboratorium untuk diproses

lebih lanjut.

Eksplorasi jamur entomopatogen dilakukan dengan metode guna

mendapatkan spesies jamur entomopatogen. Metode dengan menggunakan umpan

serangga (Insect bait method) seperti dilakukan Hasyim & Azwana (2003).

Serangga umpan yang digunakan ialah larva Tenebrio monilitor Linn. (Ulat

hongkong) instar ketiga yang baru berganti kulit. Tanah yang digunakan untuk

memerangkap jamur entomopatogen diambil secara sampling sistematis. Tanah

yang digunakan dari rhizosfer tanaman sorgum pada kedalaman 10 - 15 cm.

25

3.4.2 Tahapan Penelitian di Laboratorium

A. Sterilisasi alat dan bahan

Menurut Ida indrawati dkk (2016) Alat dan bahan disteril menggunakan

autoklaf, untuk alat dengan suhu 121oC dan tekanan 1 atm selama ±20 menit,

untuk bahan medium dengan suhu 110oC dan tekanan 1 atm selama 10-15 menit.

B. Pembuatan media PDA (potato Dextrose Agar)

Menurut Aryal, 2018 menyatakan bahwa untuk pembuatan media pda

yaitu sesuai dengan tahapan yang pertama adalah menimbang pda instan sebanyak

39 gram. Kemudian memasukkan PDA instan ke dalam gelas kimia ukuran 1000

ml dan tambahkan aquades sampai mencapai volume 1000 ml. Setelah itu

masukkan gelas kimia ke dalam panci yang berisi air seperlunya dan dipanaskan

diatas kompor sambil diaduk hingga menjadi homogen (berwarna jernih atau

bening). Selanjutnya, media di masukkan pada erlenmeyer dengan menggunakan

kapas, dan diselimuti dengan alumunium foil atau kertas, dan tahapan terakhir

yaitu menstrerilkan media dengan menggunakan autoklaf bertekanan 1 atm,

dengan suhu 121oc selama 20 menit.

B. Pembuatan media SDAY (Sabauraud dextrose agar yeast extract)

Menurut Muhammad anton aston,i dkk (2015) menyatakan bahwa untuk

pembuatan media sday (sabauraud dextrose agar yeast extract) yaitu sesuai

dengan tahapan pertama adalah menimbang 40 gram dextrose, 20 gram pepton, 15

gram agar, 2,5 gram ragidan 2 kapsul kloram fenicol. Kemudian memasukkan

semua bahan ke dalam gelas kimia ukuran 1000 ml dan tambahkan aquades

sampai mencapai volume 1000 ml. Selanjutnya masukkan gelas kimia ke dalam

panci yang berisi air seperlunya dan dipanaskan diatas kompor sambil diaduk

hingga menjadi homogen (berwarna jernih atau bening). Setelah itu,, media di

26

masukkan pada erlenmeyer dengan menggunakan kapas, dan diselimuti dengan

alumunium foil atau kertas. Dan tahapan akhirnya adalah menstrerilkan media

dengan menggunakan autoklaf bertekanan 1 atm, dengan suhu 121oc selama 20

menit.

C. Isolasi mikroba dari rhizosfer tanaman sorgum

Menurut untuk isolasi mikroba dari rhizosfer tanaman sorgum yaitu sesuai

dengan tahapan pertama adalah menimbang 1 gram tanah dan memasukkan ke

dalam erlenmeyer berisi 100 ml air steril kemudain mengocok sampai terbentuk

suspensi yang homogen. Selanjutnya mendiamkan dan mengambil 1 ml bagian

yang jernih dan memasukkan ke dalam tabung reaksi berisi 9 ml air steril.

Kemudian melakukan hal tersebut berulang – ulang sampai pengenceran 103.

Setelah itu, untuk mengisolasi jamur, pada pengenceran 103 (1:1000) mengambil

100 µml dan menuangkan ke dalam cawan petri steril yang telah berisi asam

asetat tiga tetes dan pada tahap selanjutnya medium pda dengan suhu 45 – 50°c

menuangkannya ke dalam cawan petri tersebut. Kemudian tahapan akhirnya yaitu

meratakan sampel di dalam cawan petri agar tercampur rata dan menginkubasikan

selama 24 – 96 jam.

D. Isolasi sampel ulat

Larva Tenebrio monilitor Linn. (ulat hongkong) yang terinfeksi jamur

permukaannya disterilkan dengan alkohol 70% selama tiga menit. Kemudian

dibilas air steril sebanyak tiga kali dan dikering anginkan diatas kertas saring

steril. Lalu serangga tersebut diletakkan dalam cawan petri (diameter 9 cm)

berisi tissue lembab steril dan diinkubasikan untuk merangsang tumbuhnya jamur.

Jamur yang keluar dari tubuh larva Tenebrio monilitor Linn. (ulat hongkong)

27

diambil dengan jarum inokulasi, dibiakan pada PDA (potato Dextrose Agar)

dan diinkubasikan selama tujuh hari pada suhu 23-25°C.

D. Pemurnian

Menurut Adiz adryan Ed-har et al, (2017), Pemurnian (purification) bertujuan

agar diperoleh biakan murni yang diinginkan tanpa ada kontaminan dari mikroba

lain. Pemilihan koloni mikroba yang dimurnikan berdasarkan perbedaan

kenampakan morfologi koloni, baik dari segi warna, elevasi, tekstur permukaan,

garis garis radial, lingkaran konsentris maupun tetes eksudat sehingga diperoleh

isolat murni. pada pemurnian isolat fungi menggunakan metode titik dalam proses

pemindahan ke dalam media SDAY (Sabauraud dextrose agar yeast extract).

D. Identifikasi morfologi secara makroskopis dan mikroskopis

Secara mikroskopis, koloni yang tumbuh diidentifikasi berdasarkan Nelson dkk

(1994), Morfologi diidentifikasi berdasarkan karakterisasi dari hifa, konidia, dan

pertumbuhan koloni. Mengamati karakterisasi bentuk makronidia dan mikronidia

dengan cara bagian tubuh jamur diambil sedikit dan diletakkan di atas kaca

preparat yang telah ditambahkan sedikit air lalu diaduk dengan jarum inokulasi.

Kaca preparat ditutup dengan cover glass dan diamati dengan mikroskop. Secara

makroskopis, koloni yang tumbuh diidentifikasi secara visualisasi langsung

berdasarkan karakterisasi warna koloni dan kepadatan koloni.

E. Penyiapan suspensi jamur

Menurut Dwi astuti, M.E et al, (2006), pembuatan suspensi konidia dilakukan

dengan cara mengambil koloni jamur dari isolat murni kemudian dicampur

dengan aquades steril, diaduk dan disaring hingga membentuk suspensi. Suspensi

28

yang telah terbentuk dihitung kerapatan konidianya menggunakan

haemositometer dan diamati di bawah mikroskop pada perbesaran 400 kali

F. Perhitungan jumlah spora jamur

Menurut laratorium balai besar perbenihan dan proteksi tanaman perkebunan

surabaya (2009), Isolat jamur dipanen dari dalam cawan petri dengan cara

menambahkan 10 ml akuades kemudian memasukkanya ke dalam beaker glass

setelah itu mengaduk hasil panen sampai homogen lalu mengambilnya

menggunakan pipet tetes. Selanjutnya metode perhitungan jumlah spora yaitu:

1. Menyiapkan haemocytometer tipe Neubauer Improve, letakkan pada meja

benda mikroskop, Tutup dengan gelas penutup seperti pada gambar 8.

Gambar 8. Penutupan Haemacytometer dengan menggunakan gelas penutup.

2. Mengamati dengan perbesaran 100x, untuk mendapatkan bidang hitung

pada haemacytometer.

3. Melakukan pengambilan contoh bahan uji sesuai IK No. B.3

4. Menimbang 1 (satu) gram contoh bahan uji dengan menggunakan

aluminium foil dan masukkan ke dalam erlenmeyer 100 ml.

5. Menambahkan akuades hingga volume mencapai 100 ml.

6. Mencampurkan larutan sampai homogen dengan menggunakan magnetic

stirrer ( 15 menit)

7. Mengambil suspensi spora sebanyak 0,2 ml menggunakan jarum suntik

8. Meneteskan suspensi spora secara perlahan pada bidang hitung dengan

jarum suntik hingga memenuhi kanal seperti pada gambar 9.

29

Gambar 9. Penetesan suspensi pada bidang hitung

9. Mendiamkan satu menit agar posisi stabil

10. Mengulangi pengamatan untuk memperoleh fokus pada spora dan bidang

hitung.

11. Menghitung jumlah spora yang terdapat pada kotak hitung (a+b+c+d+e)

dengan perbesaran 400x dengan menggunakan hand counter. Lakukan

pengecekan penghitungan untuk tiap kotak hitung seperti pada gambar 10.

Gambar 10. Kotak hitung Haemacytometer

12. Alur perhitungan spora seperti tercantum pada gambar 11 dibawah ini

30

Gambar 11. Perhitungan spora

13. Spora yang terletak pada garis batas kotak hitung hanya dihitung pada sisi

kiri dan atas kotak hitung tersebut, sedangkan proses perhitungannya

seperti pada gambar 12 berikut ini:

Gambar 12. Batas kotak hitung spora

14. Mengulangi langkah k pada bidang hitung 2 seperti pada gambar 13.

Gambar 13. Kanal pada bidang hitung

15. Menersihkan Haemacytometer sesuai IK No. B. 7.

16. Mengulangi langkah a dan b, kemudian kocok suspensi spora dengan

menggunakan magnetic stirer selama 3 menit.

31

17. Mengulangi langkah f hingga m sebanyak 2 kali.

18. Setelah diketahui banyaknya spora pada kotak perhitungan, hitung jumlah

spora/ml dengan rumus sebagai berikut:

G. Perhitungan persentase mortalitas kematian ulat

Persentase mortalitas ulat sampel menggunakan analisis perhitungan

Schneider-Orelli's formula, untuk perhiungan mortalitas kematian ulat sampel

sumber: http://www.ehabsoft.com/ldpline/onlinecontrol.htm#SchineiderOreli.

Corrected % = ( Mortality % in treated plot - Mortality % in control plot

100 - Mortality % in control plot

) * 100

F. Aplikasi jamur entomopatogen terhadap ulat grayak

1. Ulat grayak di letakkan pada toples yang steril

2. Menyemprotkan 0,5 ml suspensi jamur entomopatogen pada daun sawi atau

makanan ulat grayak

3. Ulat grayak diamati 12 jam sekali setiap hari.

3.5 Pengamatan

Mengetahui gejala ulat grayak yang terinfeksi jamur entomopatogen

dan mengidentifikasi ulat grayak yang terinfeksi jamur entomopatogen dengan

parameter pengamatan:

...................(1)

......................... (2)

32

a. Persentase pola makan ulat sampel setelah aplikasi mikroba jamur

entomopatogen metode pemancingan ulat dan pengenceran.

Berdasarkan gambar 14, pengamatan persentase pola makan ulat dilihat

12 jam setiap hari setelah ulat diberi daun yang berukuran panjangnya 5 cm

dan lebarnya 5 cm yang sudah diaplikasikan jamur entomopatogen untuk

sebagai makanan ulat sampel yang diuji, cara melakukan perhitungan pola

makan ulat dilakukan secara visual. Ciri-ciri ulat yang diuji atau terinfeksi

jamur entomopatogen yaitu terjadinya perubahan tingkah laku dan penurunan

pola makan.

Gambar. 14 Persentase daun sebagai makanan ulat yang diuji

b. Rata-rata waktu kematian ulat metode pemancingan ulat dan pengenceran

Pengamatan rata-rata waktu kematian ulat dilihat 12 jam setiap hari, ulat

diberi daun yang sudah diaplikasikan jamur entomopatogen untuk sebagai

makanan ulat sampel yang diuji. cara melakukan perhitungan pola makan ulat

dilakukan secara visual. Ciri-ciri ulat yang diuji atau terinfeksi jamur

entomopatogen yaitu terjadinya perubahan warna kulit ulat kehitaman dan

tidak bergerak sama sekali.

c. Persentase mortalitas ulat metode pemancingan ulat dan pengenceran

33

Perhitungan persentase mortalitas menggunakan rumus analisis perhitungan

Schneider-Orelli's formula. Data diperoleh dari pengamatan waktu rata-rata

kematian ulat sampel yang diuji setelah diaplikasikan jamur entomopatogen.

d. Perubahan warna ulat metode pemancingan ulat dan pengenceran

Pengamatan perubahan warna ulat sampel diuji dilihat 12 jam setiap hari

setelah ulat diberi daun yang sudah diaplikasikan jamur entomopatogen untuk

sebagai makanan ulat sampel yang diuji. cara melakukan perhitungan pola

makan ulat dilakukan secara visual. Ciri-ciri ulat yang diuji atau terinfeksi

jamur entomopatogen yaitu terjadinya perubahan warna kulit ulat menjadi

hitam.

3.6 Analisis Data

Data yang diperoleh pengamatan di Laboratorium diperoleh berdasarkan

Persentase mortalitas ulat sampel menggunakan analisis perhitungan Schneider-

Orelli's formula. Data karakterisasi morfologi isolat jamur disajikan dalam bentuk

deskriptif serta dibandingkan dengan literatur. Data disajikan dalam bentuk tabel

dan gambar.