8/18/2019 3 Teknik Pemurnian Enzim, Enzim & Koenzim
1/34
Enzim & Koenzimserta
Teknik Permuniannya Amelia Rumi
8/18/2019 3 Teknik Pemurnian Enzim, Enzim & Koenzim
2/34
Pendahuluan
Senyawa organik bermolekul besar yg berfungsiuntuk mempercepat jalannya reaksimetabolisme di dalam tubuh tumbuhan tanpamempengaruhi keseimbangan reaksi
Enzim tidak ikut bereaksi, struktur enzim tidakberubah baik sebelum dan sesudah reaksi tetap
Enzim
biokatalisator
8/18/2019 3 Teknik Pemurnian Enzim, Enzim & Koenzim
3/34
Definisi Umum: Enzim
Dlm sistem biologi reaksi
kimia selalu memerlukan katalis.
Tanpa katalis sangat lama
shg diperlukan Enzim ygberfungsi sbg biokatalisator
protein yg berfungsi untuk
mempercepat reaksi dengan jalan
menurunkan tenaga aktivasi dantidak mengubah kesetimbangan
reaksi, serta bersifat sangat
spesifik.
8/18/2019 3 Teknik Pemurnian Enzim, Enzim & Koenzim
4/34
Katalis yg paling efisien mempercepat
reaksi 1020 x lbh cepat
8/18/2019 3 Teknik Pemurnian Enzim, Enzim & Koenzim
5/34
Bagian-bagian enzim
Kita mengenal istilah:
Holoenzim
Apoenzim/ apoprotein
Gugus prostetik
Koenzim
Kofaktor
8/18/2019 3 Teknik Pemurnian Enzim, Enzim & Koenzim
6/34
Bagian-bagian enzim (lanjutan)
Seperti halnya protein lain, enzim memiliki BMantara 12,000 – 1 juta kD
Beberapa enzim tidak membutuhkan molekul
kimiawi lain untuk aktifitasnya, beberapamembutuhkan kofaktor / koenzim
Kofaktor ion-ion anorganik yg dibutuhkanenzim untuk melakukan fungsinya
Koenzim molekul organik (komplek) yangdibutuhkan enziim untuk melakukan fungsinya
8/18/2019 3 Teknik Pemurnian Enzim, Enzim & Koenzim
7/34
Koenzim atau kofaktor yang terikat sangat
kuat bahkan terikat dengan ikatan kovalendengan enzim gugus prostetik
Enzim aktif lengkap dengan semua
komponennya holoenzim
Bagian yang terdiri dari protein saja pada
suatu enzim Apoenzim / apoprotein
Fungsi koenzim adalah sebagai karier
sementara dari gugus fungsional yg
berperan dalam reaksi ensimatis tersebut.
8/18/2019 3 Teknik Pemurnian Enzim, Enzim & Koenzim
8/34
Susunan enzim
Komponen utama enzim adalah protein
Tidak semua protein bertindak sebagai
enzim
8/18/2019 3 Teknik Pemurnian Enzim, Enzim & Koenzim
9/34
Enzim
Protein Enzim proteinsederhana
Protein +Bukan Protein
Protein = apoenzim
EnzimKonjugasi
Bukan protein =
Gugus prostetik
Organik =
Koenzim
Anorganik = kofaktor
8/18/2019 3 Teknik Pemurnian Enzim, Enzim & Koenzim
10/34
Contoh koenzim
1. NAD (koenzim 1)
2. NADP (koenzim 2)
3. Cytokrom: cytokrom a, a3, b, b6, c, dan f4. Plastoquinon, plastosianin, feredoksin
5. ATP: senyawa organik berenergi tinggi,
mengandung 3 gugus P dan adeninribose
8/18/2019 3 Teknik Pemurnian Enzim, Enzim & Koenzim
11/34
Sifat enzim
Enzim dibentuk dalam protoplasma sel
Enzim beraktifitas di dalam sel tempat
sintesisnya (disebut endoenzim) maupun ditempat yang lain diluar tempat sintesisnya
(disebut eksoenzim)
Sebagian besar enzim bersifat endoenzim
8/18/2019 3 Teknik Pemurnian Enzim, Enzim & Koenzim
12/34
1. Enzim bersifat koloid, luas permukaan besar, bersifathidrofil
2.
Dapat bereaksi dengan senyawa asam maupun basa,kation maupun anion
3. Enzim sangat peka terhadap faktor-faktor yangmenyebabkan denaturasi protein misalnya suhu, pH dll
4. Enzim dapat dipacu maupun dihambat aktifitasnya
5. Enzim merupakan biokatalisator yang dalam jumlahsedikit memacu laju reaksi tanpa merubahkeseimbangan reaksi
6. Enzim tidak ikut terlibat dalam reaksi, struktur enzim
tetap baik sebelum maupun setelah reaksiberlangsung
7. Enzim bermolekul besar
8. Enzim bersifat khas/spesifik
8/18/2019 3 Teknik Pemurnian Enzim, Enzim & Koenzim
13/34
Suhu: optimum 300C, minimum 0 0C, maksimum 400C
Logam, memacu aktifitas enzim: Mg, Mn, Co, Fe
Logam berat, menghambat aktivitas enzim: Pb, Cu, Zn,Cd, Ag
pH, tergantung pada jenis enzimnya (pepsin aktifkondisi masam, amilase kondisi netral, tripsin kondisibasa)
Konsentrasi substrat, substrat yang banyak mula-mulamemacu aktifitas enzim, tetapi kemudian menghambatkarena: penumpukan produk (feed back effect )
Konsentrasi enzim, peningkatan konsentrasi enzim
memacu aktifitasnya Air, memacu aktifitas enzim
Vitamin, memacu aktifitas enzim
8/18/2019 3 Teknik Pemurnian Enzim, Enzim & Koenzim
14/34
Kerja enzim dapat dihambat secara reversible atau irreversible
Irreversible pembentukan atau pemecahan ikatan kovalendalam enzim
Reversible suatu senyawa dapat terikat dan kemudian dpt
lepas kembali
Reversible inhibitor ini dpt dibagi :
compet i t ive
non-compet i t ive
Penghambatan aktifitas enzim ada dua tipe:
1. Kompetitif: zat penghambat mempunyai struktur yang miripdengan substrat sehingga dapat bergabung dengan sisi aktifenzim. Terjadi kompetisi antara substrat dengan inhibitor
untuk bergabung dengan sisi aktif enzim (misal feed backeffect )
2. Non kompetitif: zat penghambat menyebabkan struktur enzimrusak sehingga sisi aktifnya tidak cocok lagi dengan substrat
8/18/2019 3 Teknik Pemurnian Enzim, Enzim & Koenzim
15/34
8/18/2019 3 Teknik Pemurnian Enzim, Enzim & Koenzim
16/34
8/18/2019 3 Teknik Pemurnian Enzim, Enzim & Koenzim
17/34
Bagaimana enzim bekerja
Reaksi tanpa enzim:
Lambat
Membutuhkan suhu yang tinggi Tekanan yang tinggi
Reaksi enzimatis
Enzim memberikan suatu lingkungan yg spesifik
di dalam sisi aktifnya, sehingga reaksi secara
energetik dapat lebih mudah terjadi
8/18/2019 3 Teknik Pemurnian Enzim, Enzim & Koenzim
18/34
Substrat terikat interaksi nonkovalen
E + S ↔ ES
Kekuatan enzim dlm mengkatalisis suatu reaksi
kemampuan enzim membawa substrat bersama-sama
pd orientasi yang tepat untuk terjadinya suatu reaksi
Substrat terikat pd sisi aktif yaitu lekukan pd protein
yg berisi asam amino yg penting untuk tjdnya suatu
reaksi kimia
8/18/2019 3 Teknik Pemurnian Enzim, Enzim & Koenzim
19/34
8/18/2019 3 Teknik Pemurnian Enzim, Enzim & Koenzim
20/34
Gambar sisi aktif enzim dan asam amino yang
terlibat
8/18/2019 3 Teknik Pemurnian Enzim, Enzim & Koenzim
21/34
Sisi aktif mempunyai 2 bagian yg penting: Bagian yang mengenal substrat dan kemudian
mengikatnya
Bagian yang mengkatalisis reaksi, setelah
substrat diikat oleh enzim
8/18/2019 3 Teknik Pemurnian Enzim, Enzim & Koenzim
22/34
Teori untuk menjelaskan kerja enzim:
Lock and Key analogy
Enzim memiliki struktur sisi spesifik yang cocok dengansubstrat.
Mampu menerangkan spesifitas ensim ttp tidak dapatmenerangkan stabilitas fase transisi ensim
Induced Fit theory
mempertimbangkan fleksibilitas protein, sehinggapengikatan suatu substrat pada enzim menyebabkan
sisi aktif mengubah konformasinya sehingga cocok dgnsubstratnya. dpt menerangkan fase transisi ESkomplek
8/18/2019 3 Teknik Pemurnian Enzim, Enzim & Koenzim
23/34
Lock and key model
Induced Fit model
8/18/2019 3 Teknik Pemurnian Enzim, Enzim & Koenzim
24/34
Faktor-faktor yg mempengaruhi kerja
enzim
pH setiap enzim mempunyai pH optimum utk
bekerja.
contoh : pepsin pH 2, amylase pH 7.0
Temperatur setiap kenaikan suhu 10˚C(sampai 40˚C), kecepatan reaksi naik 2 x lipatnya
dan reaksi terhambat dan berhenti pada 60˚C.
8/18/2019 3 Teknik Pemurnian Enzim, Enzim & Koenzim
25/34
Pengaruh suhu terhadap reaksi enzimatis
8/18/2019 3 Teknik Pemurnian Enzim, Enzim & Koenzim
26/34
Pengaruh pH terhadap reaksi enzimatis
8/18/2019 3 Teknik Pemurnian Enzim, Enzim & Koenzim
27/34
8/18/2019 3 Teknik Pemurnian Enzim, Enzim & Koenzim
28/34
Teknik Pemurnian
Enzim
8/18/2019 3 Teknik Pemurnian Enzim, Enzim & Koenzim
29/34
Pemurnian Awal Larutan Enzim
Setelah dinding sel dipecahkan, maka enzim
intraselluler yg diinginkan berada dalam larutan yg
mengandung enzim2 lain, protein, as. Nukleat,
metabolit, senyawa-senyawa yg diperlukan utk media,dll.
Bila enzimnya merupakan ekstraselluler , maka enzim
ini harus dipisahkan dari sel penghasilnya & senyawa2
lain yg terdapat dlm media.
Utk maksud tsb, dpt dilakukan pemisahan secara
bertahap melalui bbrpa cara, seperti :klarifikasi,
presipitasi, sentrifugasi, filtrasi.
8/18/2019 3 Teknik Pemurnian Enzim, Enzim & Koenzim
30/34
Berbagai Metode PemecahanDinding Sel
- Pemecahan dgn
gelembung
netrasonik
(sonikator)
- Agitasi mekanis dgntekanan (Pompa
penekan “French
pressure”)
Pemecahan Sel
Mekanis Non mekanis
Bentuk cair Bentuk padat Manipulasilingkungan
Kimiawi &
Enzimatis
- Homogenasi
(dgn
“homoginer”)
dan
penggilingan
dgn
mortar/blender
- Penghancuran
dgn “Hammer
Kill”
- Freeze-thaw
Kejutan
osmotik
- Peggunaan
vakum
desikasi
Penambahan
detergen ionik/
non ionik,
lisozim
8/18/2019 3 Teknik Pemurnian Enzim, Enzim & Koenzim
31/34
Klarifikasi & Presipitasi
Proses pemisahan partikel non enzim yg tercampur dgn
enzim dgn cara pengendapan
Partikel non enzim berasal dari penambahan buffer, air, atau
cairan fisiologis pd proses pemecahan dinding sel, ataumolekul2 kompleks yg berikatan dgn enzim
Dapat dilakukan dgn penambahan senyawa yg dpt
menggumpalkan spt : amonium fosfat, as. Askorbat, garam2
kalsium, serat seluloasa, sistein, tanah diatom, gelatin, as.
fosfat, garam na-fosfat, na-sulfat dan na-sitrat, atau senyawapenggumpal dalam pemurnian air (polielektrolit spt poliamin)
menggumpalkan struktur koloid cairan
8/18/2019 3 Teknik Pemurnian Enzim, Enzim & Koenzim
32/34
Klarifikasi & presipitasi.......
Dapat ditambahkan bahan pengawet pada tingkat yg
aman untuk dikonsumsi, misal: fenol, amonium kuartener
dan florida.
Konsentrasi senyawa penggumpal harus tepat, agarenzim tdk ikut menggumpal.
8/18/2019 3 Teknik Pemurnian Enzim, Enzim & Koenzim
33/34
Sentrifugasi Cara ini dipilih untuk memisahkan larutan dari molekul yang lebih
besar dalam skala laboratorium.
Dalam skala besar, sentrifugasi tidak memuaskan diantaranya
karena: kapasitasnya kecil, diperlukan kecepatan sangat tinggi
(ultrasentrifuge), dan lain-lain.
Pemisahan akan lebih mudah tercapai bila diameter partikel
besar; perbedaan massa jenis partikel dan larutan yg besar; dan
viskositas larutan yang rendah.
Selain itu kecepatan sudut yang tinggi, radius putaran yangbesar, dan lapisan cairan yang tipis juga mempercepat proses.
8/18/2019 3 Teknik Pemurnian Enzim, Enzim & Koenzim
34/34
Filtrasi Penyaring yang biasa digunakan untuk industri merupakan : filter
press atau dengan “rotary drum filter”
Filter terdiri dari kain saring yang terletak diantara dua piringan
berombak. Piringan tersebut akan menekan cairan didalam kain
saring dan keluar melalui pori-pori kain saring. Rotary drum filter juga menggunakan tekanan dan perputaran tong
akan membantu mengurangi akumulasi endapan pada penyaring.
Pada skala pilot plant dan industri kecil corong Buchner berukuran
besar dapat digunakan, dan dikombinasikan dengan bantuan
vakum. Resiko penggunaan vakum : terbentuknya busa dan penurunan
aktivitas enzim.
Alat lain : filtrasi bertekanan (filter press)