3. METODE PENELITIAN 3.1 Tempat dan Waktu Pelaksanaanrepository.ub.ac.id/4505/4/BAB III.pdf · Malang.Bahan kimia yang digunakan antara lain akuades, alkohol 70%, D-glukosa, L-Asparagin,

31

3. METODE PENELITIAN

3.1 Tempat dan Waktu Pelaksanaan

Penelitian ini dilakukan di Laboratorium Keamanan Hasil Perikanan,

Laboratorium Parasit dan Penyakit IkanUniversitas Brawijaya Malang, Jawa

Timur. Sedangkan identifikasi 16S rRNA dilakukan di Laboratorium Genetika dan

Molekuler Fakultas Sains dan Teknologi Universitas Islam Negeri Maulana Malik

Ibrahim Malang, Jawa Timur. Penelitian dilakukan mulai bulan November 2016

sampai bulan Maret 2017. Pengambilan sampel dilakukan di Pantai Aingsareh

Madura, Pantai Sendang Biru Malang dan Pantai Bajul Mati Malang.

3.2 Alat dan Bahan

3.2.1 Peralatan Penelitian

Peralatan yang digunakan dalam penelitian ini adalah autoklaf, Vortex,

Laminar Air Flow, Inkubator, timbangan digital, timbangan analitik, Mikroskop, pH

meter, mikropipet, Sedangkan alat yang digunakan untuk proses identifikasi 16S

rRNA adalah Spektrofotometer,dry bath, NanoDrop, Polymerase Chain Reaction,

mesin sekuensing ABIPRISM®310 Genetic Analyzer, perangkat elektroforesis

dan visualisasi dengan Gel-Doc XR 1000.

Perangkat gelas dan non gelas yang digunakan dalam penelitian ini

adalah beaker glass 100 ml dan 250 ml, tabung reaksi, labu erlenmeyer 100 ml,

250 ml, 500 ml, labu ukur, pipet ukur, pipet tetes, cawan petri diameter 20 cm,

kuvet, blue tip, tube sentrifuge 5 ml, botol ukuran 20 ml, ose, bunsen, pematik

dan rak tabung reaksi.

32

3.2.2 Bahan Penelitian

Sampel yang digunakan untuk mendapatkan isolat diambil dari batang dan

daun mangrove Sonneratia alba di tiga daerah pantai yang berbeda, yaitu Pantai

Aingsareh Madura, Pantai Sendang Biru Malang dan Pantai Bajul Mati

Malang.Bahan kimia yang digunakan antara lain akuades, alkohol 70%, D-

glukosa, L-Asparagin, Na2HPO4, KH2HPO4, MgSO4.7H2O, NaCl,CaCl2,

Bromothymol blue, NaOH dan HCl. Bahan-bahan tersebut didapatkan dari toko

laboratorium Makmur Sejati dan Panadia, Malang. Untuk media yang digunakan

meliputi yeast extract, pepton, sodium kloridadan bacto agar yang dibeli dari PT.

Satya Abadi Vigined, Tangerang Selatan. Untuk identifikasi menggunakan

deteksi 16S rRNA, primer yang digunakan adalah primer universal yang terdiri

dari rancangan primer gen forward27F (5’-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3’) dan

primer reverse1492R (5’-TACGGCTACCTTGTTACGA-3’), Master Mix Go Tag

Green, buffer tag, MgSO4, dNTP, ddH2O, marker DNA 1000 bp, TE buffer, gel

agarosa, TBE, dan SYBR safe.

3.3 Metodologi Penelitian

Metode penelitian yang digunakan adalah deskriptif eksploratif dimana

dibagi menjadi dua tahapan penelitian. Tahapan pertama adalah skrining bakteri

penghasil L-asparaginase yang menghasilkan aktivitas enzim L-asparaginase

dilihat dari pengamatan kualitatif dengan membandingakan luas perubahan

warna media pertumbuhan bewarna kuning pekat menjadi warna biru yang

menandakan adanya aktivitas hidrolisis enzim L-asparaginase. Tahapan kedua

adalah Identifikasi bakteri yang memiliki aktivias hidrolisis enzim L-asparaginase

yang paling tinggi dengan metode identifkiasi 16S rRNA diperkuat dengan

pewarnaan gram. Hasil penelitian dipaparkan secara deskriptif berdasarkan

33

tahapan-tahapan penelitian yang dilakukan. Sedangkan hasil pengujian

identifikasi bakteri 16S rRNA dipaparkan secara kuantitatif.

Penelitian eksploratif bersifat menjelajah, artinya penelitian yang dilakukan

apabila pengetahuan tentang gejala yang diteliti masih sangat kurang atau tidak

ada sama sekali. Penelitian eksploratif seringkali berupa studi kasus dari suatu

kelompok atau golongan tertentu yang masih kurang diketahui orang

(Surakhmad, 1994).

3.4 Prosedur Penelitian

3.4.1 Pengambilan Sampel dari Mangrove Sonneratia alba (Prihanto et al.,

2011)

Sampel yang digunakan pada penelitian ini adalah batang dan daun

Mangrove Sonneratia alba yang diambil dari tiga daerah yang berbeda,

diantaranya pantai Aingsareh Madura, pantai Sendang Biru Malang Selatan dan

pantai Bajul Mati Malang Selatan.Gambar 12. menunjukkan peta wilayah

pengambilan sampel mangrove Sonneratia alba.

34

Gambar 12.Peta wilayah pengambilan sampel mangrove

Keterangan : 1. Pantai Aingsareh, Sampang Madura (7°13'5.57"S, 113°19'8.89"E) 2. Pantai Sendang Biru, Malang Selatan (8°25'52.18"S, 112°41'9.52"E)

3. Pantai Bajul Mati, Malang Selatan (8°25'52.9"S 112°38'08.0"E)

Bagian tumbuhan mangrove (batang dan daun) dipotong dengan

menggunakan cutter steril. Setiap bagian dipisahkan dalam wadah plastik steril

untuk menghindari hilangnya sifat keaslian batang dan daun dari mangrove itu

sendiri. Setelah itu dimasukkan ke dalam cool box 4oC untuk pengkondisian suhu

dimaksudkan agar mikroorganisme asli endofit mangrove tidak mengalami

kematian ketika dibawa dari pantai menuju laboratorium. Selanjutnya sampel

dibawa menuju Laboratorium tidak boleh lebih dari 12 jam untuk segera mungkin

dilakukan penanganan.

3.4.2 Tahap Persiapan Media (Pelczar dan Chan, 2005)

Media yang digunakan pada kultur massal adalah Luria Bertani Agar (LBA),

media ditimbang dan dilarutkan di dalam erlenmeyer dengan menggunakan

aquades. Setelah itu erlenmeyer yang berisi media ditutup dengan kapas untuk

mencegah media kontak dengan lingkungan dan direbus selama 15-20 menit

agar homogen, kemudian disterilisasi menggunakan autoklaf dengan suhu 121oC

tekanan 0,15 Mpa untuk mematikan semua bakteri yang tidak dikehendaki pada

media. Untuk mengoptimalkan pertumbuhan bakteri, medium yang digunakan

harus mengandung komponen-komponen yang dibutuhkan oleh bakteri tersebut.

Kebutuhan bakteri termasuk air, karbon, energi, nitrogen, mineral dan faktor

pertumbuhan seperti vitamin dan beberapa asam amino (Fardiaz, 1992). Adapun

komposisi media LBA dapat dilihat pada Tabel 2.

35

Tabel 2. Komposisi Media Luria Bertani Agar (LBA)

Bahan Kimia Komposisi Media

Yeast extract 5 gr/L Pepton 10 gr/L NaCl 10 gr/L Agar 15 gr/L

Aquades 1 L

Sumber : Luria Bertani Agar Himedia (2017)

3.4.3 Tahap Persiapan Sampel dan Pengenceran (Prihanto et al., 2011)

Kultivasi Bakteri endofit mangrove (daun dan batang) diawali dengan pre-

treatment sampel. Batang dan daun mangrove dikondisikan aseptis

permukaannya, bertujuan untuk menghilangkan mikroba kontaminan dari

permukaan batang dan daun. Pengkondisian aseptis dilakukan dengan membilas

aquades. Kemudian sampel direndam dengan etanol 75% selama 1 menit,

sodium hipoklorit 2% selama 3 menit dan etanol lagi 75% selama 30 detik,

setelah itu dicuci kembali dengan akuades untuk membersihkan sisa-sisa

disinfektan (Prihanto et al., 2011). Selanjutnya sampel dihaluskan menggunakan

mortar alu, sebelumnya mortar alu juga disterilisasi. Hal ini dimaksudkan agar

mikroba yang tumbuh nantinya memang asli dari mikroba endofit mangrove. 1

gram sampel dimasukkan dalam 9 ml NaFis dan divortex. Setelah itu dilakukan

pengenceran 1 ml sampel serial hingga 10-6 tiap sampel dan dilakukan

penanaman pada4 pengenceran terakhir. Pengenceran bertujuan untuk

mengurangi kepadatan mikroba (Pelczar dan Chan, 2006).

3.4.4 Tahap Kultur Bakteri (Pelczar dan Chan, 2006)

Pada proses kultur bakteri menggunakan metode sebar (spread plate

method). Sampel yang telah diencerkan ke dalam NaFis diambil sebanyak 1 ml

dengan menggunakan mikropipet kemudian dipindahkan ke cawan petri yang

berisi media LBA sebanyak 15 ml. Setelah itu diinkubasi pada suhu 37oC selama

24 jam.

36

3.4.5 Tahap Isolasi Bakteri (Pelczar dan Chan, 2005)

Setelah diinkubasi selama 24 jam, bakteri yang telah tumbuh dilakukan

tahap identifikasi awal meliputi bentuk dan warna koloni dan dipilih 1 jenis bakteri

dominan dari masing-masing sampel kemudian dilakukan isolasi bakteri dengan

cara metode streak 3 kuadran. Isolasi bakteri bertujuan untuk mendapatkan

koloni murni sehingga memudahkan untuk tahap identifikasi selanjutnya, setelah

itu diinkubasi pada suhu 37oC.

3.4.6 Tahap Skrining Bakteri Penghasil Enzim L-asparaginase(Mahajan et

al., 2013)

Proses skrining bakteri endofit mangrove penghasil L-Asparaginase

dilakukan dengan cara, setiap koloni yang tumbuh berbeda pada kultur

sebelumnya diambil 1 ose dan digores ke setiap cawan petri steril yang

mengandung media selektif L-asparaginase ( 2 g D-glucose, 5 g L-asparagin, 6 g

Na2HPO4, 3 g KH2HPO4, 0.02 g MgSO4.7H2O, 0.5 NaCl, 0.02 CaCl2, 15 g Agar,

dan 0.007 Bromothymol blue dalam 1000 ml akuades), diinkubasi selama 24 jam

pada suhu 37oC. Apabila media pertumbuhan mikroorganisme kurang optimal

maka dapat ditambahkan larutan HCl untuk pengkondisian pH media sekitar 5,5.

Asumsi yang digunakan adalah bahwa setiap isolat murni yang tumbuh dapat

menghasilkan amonia dengan ditandai berubahnya warna media L-asparaginase

dari kuning menjadi biru (Sinha et al., 2013).

3.4.7 Pembuatan Stok Kultur (Sianturi, 2008)

Pembuatan stok kultur dilakukan dengan cara mengambil 1 ose dari setiap

isolat mikroorganisme yang tumbuh pada kultur murni dan dipindahkan ke dalam

media agar miring secara aseptis. Komposisi media yang digunakan untuk stok

kultur sama dengan media yang digunakan dalam isolasi kultur murni yairu LBA.

37

Kultur diinkubasi selama 24 jam pada suhu 37oC, kemudian disimpan dalam suhu

4oC dalam refrigerator. Peremajaan stok kultur dilakukan sekali dalam 2 minggu.

3.4.8 Identifikasi Molekuler Bakteri 16S rRNA

Tahapan kerja secara umum dalam analisis sekuen 16S rRNA adalah

isolasi DNA plasmid, amplifikasi gen dengan teknik PCR, konfirmasi hasil

amplifikasi gen, purifikasi amplikon gen, sekuensing DNA amplikon gen dan

analisa kekerabatan.

3.4.8.1 Isolasi DNA

IsolasiDNA dilakukan dengan menggunakan prosedur dari Kit IsolasiDNA

(Wizard Genomic DNA Purification Kit from Promega) dengan langkah berikut;

diambil 0,5 gr sampel, masukkan dalam tube 2 ml yang berisi 1,5 ml buffer

celllysis solution dan di mix (sampai tercampur). Inkubasi pada suhu ruang

selama 10 menit kemudian centrifuge 2,000 xg selama 10 menit. Supernatan

dibuang dengan tetap memperhatikan pelet agar tidak ikut terbuang, pelet

ditambahkan1 ml nucleic lysis dan divortek. Tambahkan 0,3 ml protein

precipitation solution, kemudian divortek selama 20 detik, centrifuge 2,000 x g

selama 10 menit. Supernatan diambil dan dimasukkan tube 1,5 ml baru yang

berisi1 ml isopropanol kemudian divortex dan dicentrifuge 2,000xg selama 1

menit. Supernatan dibuang (pellet tidak boleh terbuang), ditambahkan 1 ml

ethanol 70% Centrifuge 2,000 x g selama 1 menit, Supernatan dibuang pelet

dikeringkan dengan vakum untuk memastikan ethanol benar-benar hilang. Hasil

pelet dilarutkan dengan menambahkan 75 µl DNA rehydration solution,

diinkubasi pada suhu 650C selama 1 jam, selanjutnya disimpan pada suhu -20⁰ C

hingga digunakan.

a. Pengukuran Kemurnian DNA

38

Pengukuran kemurnian dan konsentrasi DNA yang telah diisolasi

menggunakan mesin UV spektrofotometer Biorad. Pengukuran kemurnian dan

konsentrasi DNA dilakukan dengan mengambil sampel DNA sebanyak 5 μl

kemudian ditambah dengan 995 μl Tris-EDTA (TE) buffer dan diletakkan pada

alat vorteks hingga larutan homogen. Selanjutnya larutan dimasukkan dalam

kuvet dan diukur absorbansinya pada panjang gelombang 260 nm dan 280 nm.

Pita ganda DNA dapat menyerap cahaya UV pada 260 nm, sedangkan

kontaminan protein atau fenol akan menyerap cahaya UV pada 260 nm.

Sehingga kemurnian DNA dapat diukur dengan menghitung nilai absorbansi 260

nm dibagi dengan nilai absorbansi 280 nm, dan nilai kemurnian DNA berkisar

1,8-2,0. Sebelum dilakukan absorbansi pada larutan tersebut, dilakukan

peneraan dengan menggunakan TE buffer sebagai larutan blanko. Penentuan

tingkat kemurnian DNA dilakukan dengan rumus berikut ini.

Keterangan : A260 = Nilai absorbansi pada panjang gelombang 260 A280 = Nilai absorbansi pada panjang gelombang 280

Perhitungan kemurnian DNA pada perbandingan memiliki kisaran nilai

1,8-2,0. DNAyang memiliki kisaran nilai kemurnian >2 menunjukkan bahwa

terjadi kontaminasi protein sedang kisaran nilai <1,8 menunjukkan keberadaan

kontaminasi RNA (Fatchiyahet al., 2011).

3.4.8.2 Amplifikasi Gen dengan Teknik Polymerase Chain Reaction (PCR)

Amplifikasi genotyping gen dilakukan dengan teknik Polymerase Chain

Reaction atau PCR dengan menggunakan mesin thermalcycler. amplifikasi 16S

Kemurnian DNA =

39

rRNA bakteri digunakan pasangan primer universal bakteria 27F (memutar pada

posisi 8 ke 27 dalam rRNA koordinat Escherichia coli) dan 1492R (umumnya

memutar pada posisi 1492 ke 1507). Sepasang primer ini merupakan primer

yang sering digunakan secara umum untuk amplifikasi bakteri (Frank et al.,

2008). Adapun urutan basa nukleotida primer tersebut sebagai berikut :

Primer forward 27F : 5’-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3’

Primer reverse 1492R : 5’-TACGGCTACCTTGTTACGA-3’

Komposisi PCR dengan volume total 20 μl/tube terdiri atas 6 μl ddH2O, 10

μl PCRkitGoTaq® Green Master Mix (10 x buffer taqpolymerase, dNTP, MgCl2,

primer, Taq DNA polymerase, ddH2O), primer forward 1 μl, primer reverse 1 μl

dan 2 μl DNA sampel hasil isolasi. Penentuan suhu amplifikasi mengacu

padaCorrea (2012), secara berurutan proses amplifikasi dikondisikan pada suhu

pre-denaturasi 950C selama 5 menit 1 kali siklus dan denaturasi dengan 30 kali

siklus pada suhu 950C30 detik, 55oC selama 30 detik, dan 720C selama 30

detik,dilanjutkandengan 1 siklus ekstensi pada suhu 720C selama 10 menit dan

suhu 40C selama 5 menit.

3.4.8.3 Konfirmasi Hasil Amplifikasi Gen

Hasil PCR semua sampel DNA yang telah diamplifikasi dikonfirmasi

dengan menggunakan elektroforesis horizontal gel agarosa 1,5%. Gel agarosa

1,5% dilakukan dengan cara berikut, bubuk agarosa ditimbang sebanyak 0,6

gram kemudian dilarutkan di dalam 40 ml TBE buffer dan dipanaskan hingga

terbentuk larutan yang transparan (bening). Larutan agarosa didiamkan hingga

hangat kemudian dituangkan ke dalam cetakan elektroforesis yang telah

ditambah dengan 0,5 μl etidium bromida. Sisir dipasang pada ujung bak

elektroforesis dan didiamkan hingga larutan agarosa mengeras (gel). Sisir

diambil pada gel agarosa yang telah terbentuk kemudian dipindahkan pada bak

40

elektroforesis ditambah dengan TBE buffer hingga seluruh permukaan gel

tertutup larutan buffer. Sebanyak 2 μl sampel DNA dicampur dengan 1 μl loading

dye dicampur kemudian dimasukkan ke dalam sumuran secara perlahan.

Selanjutnya, dilakukan proses elektroforesis (running) dengan tegangan 65 Volt

selama 1,5 jam. Hasil elektroforesis divisualisasi dengan menggunakan UV

transiluminator dan didokumentasikan dengan kamera polaroid.

3.4.8.4 Purifikasi Amplikon Gen

Sampel amplikon hasil PCR gen yang sebagian telah digunakan untuk

konfirmasi elektroforesis dimasukkan dalam tube dengan volume maksimum 1,5

ml. Sampel tersebut ditambah dengan sodium asetat (Merck) sebanyak 0,1 %

dari total volume sampel amplikon dalam tube yang akan dipurifikasi. Berikutnya

ditambahkan ethanol absolut dingin sebanyak dua kali volume larutan sodium

asetat dan sampel amplikon. Kemudian dilakukan spin down dengan

menggunakan alat sentrifugasi dan disimpan pada suhu -200C selama 60 menit.

Selanjutnya dilakukan sentrifugasi dengan kecepatan 13.000 rpm pada suhu 4

0C selama 15 menit. Supernatan dibuang dan ditambahkan 200 µl etanol 70%

dingin dan disentrifugasi lagi dengan kecepatan 13.000 rpm pada suhu 40C

selama 15 menit. Pelet hasil sentrifugasi ini kemudian dikeringkan dengan

menggunakan inkubator pada suhu 370C. Pelet yang telah kering ditambah

dengan ddH2O sebanyak 15 µl.

3.4.8.5 Sequencing (Pengurutan Sekuen) DNA Amplikon Gen

Sequencing atau pengurutan sekuen DNA dilakukan untuk mengetahui

sekuen DNA yang mengalami polimorfisme. Sequencing dilakukan dengan

menggunakan sampel DNA dari hasil PCR yang telah dipurifikasi. Pada

konfirmasi amplifikasi DNA dengan elektroforesis gel agarosa, pita yang paling

tebal dipilih sebagai sampel untuk sequencing. Pita yang paling tebal dipilih

41

dengan asumsi bahwa DNA telah dikenali oleh primer yang spesifik dan

teramplifikasi dengan panjang sekuen yang sesuai. Komposisi sequencing terdiri

dari amplikon gen sampel yang telah dipurifikasi 2 µl, ddH2O 10 µl, Big Dye

terminator 8 µl (menggunakan ABIPRISM®BigDye®terminator v3.1cycle

sequencing kits), larutan penyangga 5 µl (buffer dengan EDTA (Applied

Biosystem), dan primer dengan konsentrasi 20 pmol sebanyak 2 µl sehingga

jumlah keseluruhan 25 μl. Selanjutnya dilakukan PCR sequencing dengan

optimasi suhu sesuai petunjuk reagen kit sequencing, sampel hasil PCR

sequencing dilakukan purifikasi ulang sebelum dilanjutkan ke mesin sequencing,

hasil purifikasi berupa amplikon kedua ini ditambah dengan larutan buffer khusus

yaitu Hi-DiTM Formamide (Genetic Analysis Grade-Applied Biosystem) dan

disequencing menggunakan ABIPRISM®310 Genetic Analyzer di Laboratorium

Genetika, Jurusan Biologi, Fakultas Sains dan Teknologi, Universitas Islam

Negeri Maulana Malik Ibrahim Malang.

3.4.8.6 Pembacaan Sekuen Hasil Sekuensing

Pembacaan sekuen hasil sekuensing bakteri yang diujikan dapat dilihat

dengan bantuan software Squence Scanner. Adapun langkah-langnya adalah

sebagai berikut :

1. Buka file yang berekstensi .abl dengan Squence Scanner.

2. Periksa seluruh grafik dengan menggulung (scroll) sampai ujung.

3. Hasil sekuensing disimpan dalam bentuk format FASTA.

3.4.8.7 Penggabungan Hasil Sekuensing Forward dan Reverse

Hasil sekuensing tersebut selanjutnya diolah menggunakan software

BioEdit. Analisis contigmerupakan penggabungan dua sekuen yang digunakan

untuk merakit kembali serangkain bagian DNA dalam satu bentuk tunggal tanpa

celah. Software yang digunakan untuk menggabungkan hasil sekuensing forward

42

dan reverseyaitu menggunakan Bioedit. Adapun langkah-langkah dalam

penggabungan sekuen dengan analisis contig Bioedit menurut Rukmana (2015),

adalah sebagai berikut :

1. Dibuka program BioEdit.

2. Dibuka “New Alignment” pada program Bioedit.

3. Diklik menu : File Import Sequence alignment file. Pilih kedua file yang

akan dianalisis contig.

4. Disimpan dengan nama baru dalam format FASTA.

5. Dipilih salah satu sekuen dengan mengklik nama sekuen tersebut.

6. Dilakukan “Reverse complementer” melalui menu: Sequence nucleid acid

reverse complement.

7. Dilakukan “Pairwise Alignment” melalui menu : Sequence pairwise

alignment Alignment two sequence (allow ends to slide).

8. Ditampilkan sekuen consesus dari hasil contig dengan menu : Alignment

Create consensus sequence.

9. Diklik sekuen consensus kemudian dipilih menu : EditCopy Sequence to

clipboard (FASTA format).

10. Dibuka file teks baru dari menu : File New text. Paste sekuen consensus.

11. Dirubah ke dalam format FASTA dengan menambahkan tanda “lebih besar

dari” (>), diikuti dengan nama sekuen dan sekuen DNA pada baris kedua.

3.4.8.8 Pencarian Database Spesies lain dengan Gen Bank

Menurut Witarto (2002), perangkat yang dapat digunakan untuk pencarian

database dan paling berhasil hingga saat ini adalah BLAST (Basic Local

Alignment Search Tool). Kegunaan dari pencarian ini yaitu ketika mendapatkan

suatu sekuen DNA yang belum diketahui fungsinya, maka dengan

membandingkan dengan yang ada dalam database bisa diperkirakan fungsinya.

43

Pencarian database menurut Rukmana (2015), dapat dilakukan dengan langkah-

langkah berikut :

1. Diketikhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov(website Gen Bank Amerika Serikat).

2. Diklik “BLAST” pada home NCBI.

3. Dipilih Nucleotida blast.

4. Dimasukkan urutan DNA hasil sekuensing dalam program tersebut dengan

cara memblok data sekuen (dalam format FASTA) dan dicopypaste pada form

yang tersedia.

5. Diklik “RUN BLAST” dan ditunggu hasilnya.

3.4.8.8 Filogenik Sekuen DNA (Dereeper et al., 2010)

Pembuatan pohon filogenik dilakukan dengan membuka phylogeny.fr yang

dapat diakses secara online pada laman http://www.phylogeny.fr/(Dereeper et

al.,2010). Langkah-langkahnya adalah sebagai berikut :

1. File hasil dari “RUN BLAST” pada BLAST dibuka.

2. Diklik bakteri yang sama sebanyak 4 jendela Description.

3. Klik Download FASTA (aligned sequence) continue.

4. Dicari format fasta bakteri padahttp://www.ncbi.nlm.nih.govNucleotide

ketik nama bakteri pada kolom searchenter klik bakteri FASTA

Download. (Ketentuan : 3 bakteri yang mempunyai genus yang sama

dengan baktero hasil BLAST tetapi spesiesnya berbeda, kemudian 2 bakteri

yang mmpunyai genus yang berbeda dengan bakteri hasil BLAST tetapi

spesiesnya sama dan 1 bakteri yang paling berbeda baik genus maupun

spesies. Jadikan satu file dalam fasta BLAST sebelumnya).

5. Dibuka laman http://www.phylogeny.fr/.

6. Ditekan one Click buka file fasta dari BLAST.

7. Ditekan submit.

44

8. Tunggu hingga hasilnya keluar.

9. Dilihat hasil filogenetik.

3.4.9 Konfirmasi Gram dan Morfologi (Volk dan Wheeler, 1993)

Identifikasi bakteri dengan pewarnaan gram langkah pertama yaitu

objectglass dibersihkan dengan akuades kemudian difiksasi untuk

menghilangkan kontaminan. Langkah selanjutnya diambil sedikit isolat bakteri

kemudian ambil 1 ose NaFis steril 0.9% dan dihomogenkan di atas objek glass

bertujuan untuk menguraikan koloni agar tidak terlalu padat dan terlihat bentuk

selnya setelah dilakukan pewarnaan gram, kemudian difiksasi sampai kering

yang bertujuan untuk menguapkan NaFis pada objectglass. Kemudian ditetesi

kristal violet yang berfungsi sebagai pewarna primer dan didiamkan selama 1

menit kemudian dibilas dengan akuades yang bertujuan untuk membilas sisa

kristal violet yang tidak menempel pada bakteri, lalu ditetesi iodin didiamkan

selama 1 menit yang bertujuan untuk memperkuat warna ungu yangberasal dari

kristal violet dan dibilas dengan akuades yang bertujuan untuk membersihkan

sisa iodin yang tidak menenmpel, selanjutnya ditetesi dengan alkohol yang

berfungsi untuk pemucat warna dan didiamkan tidak boleh lebih dari 7 detik.

Kemudian dibilas dengan akuades dan terakhir ditetesi safranin sebagai pewarna

sekunder, ketika ditetesi alkohol, bakteri gram negatif akan melunturkan kristal

violet dan mengikat safranin dan didiamkan 30 detik kemudian dibilas dengan

akuades selanjutnya gram yang telah terwarnai diamati di bawah mikroskop

dengan pembesaran 40x dan 100x.

Sel bakteri yang telah terwarnai diamati di bawah mikroskop binokuler

dengan perbesaran 100x dan dilihat bentuk dinding selnya serta warna gramnya.

Dilihat bentuk selnya apakah berbentuk basil, spiral atau coccus. Untuk

45

pewarnaan gram bakteri dinyatakan gram positif apabila berwarna ungu atau

biru, dikatakan gram negatif apabila berwarna merah.

Zat pewarna violet dan iodin membentuk senyawa yang kompleks.

Beberapa marga bakteri melepaskan zat pewarna dengan mudah apabila dicuci.

Pada bakteri lain, zat pewarna tetap bertahan walau dicuci dengan alkohol 95%.

Bakteri yang tidak dapat menahan zat pewarna setelah dicuci dengan alkohol

95% disebut gram negatif yang ditandai dengan warna merah. Sedangkan

bakteri yang dapat menahan zat pewarna disebut Gram positif ditandai dengan

warna biru atau ungu.

46

3.5 Diagram Alir Penelitian

Gambar 13.Diagram Alir Isolasi dan Identifikasi Bakteri penghasil L- asparaginase

Endofit Mangrove

Kultivasi Bakteri pada media LBA

Skrining Bakteri penghasil enzim L-asparaginase pada media L-asparaginase

L-Asparaginase positif

Isolat terpilih

L-asparaginase negatif

Pewarnaan gram Identifikasi molekuler 16S rRNA

Nama Spesies

Analisa Kekerabatan

(Pohon Filogenik)

Identitas spesies

Isolasi Bakteri pada media LBA