3. METODE PENELITIAN 3.1 Alat dan Bahan Penelitian 3.1.1 Alat-alat Penelitian Peralatan yang digunakan dalam penelitian ini antara lain wadah kultur (erlenmayer 600 ml), aerator, selang, lampu TL, botol sprayer, pH meter, DO meter, termometer, haemocytometer 0,1 mm (BOECO, Hamburg, Germany), nampan, mikroskop (Olympus CX21, Jepang), bola hisap D&N, pipet volume 10 ml dan 1 ml pyrex lwaki, pipet tetes, elenmeyer 500 ml pyrex lwaki, autoklaf GEA, mikropipet Eppendorf Research Plus, gelas ukur 100 ml, beaker glass pyrex 250 ml, handtally counter, gayung, washing bottle, cover glass, cuvet, sentrifuge, oven RedLine RE53, timbangan analitik Radwag AS2201X, bak besar, refraktometer (Master Refractometer, Jepang), kalkulator, lux meter Sunche, spektrofotometer Spectroquant pharo 300, bunsen, sprayer, botol film, valcon, Laminary Air Flow (LAF), sendok media, blue tip, white tip, pinset, triangle,tabung reaksi, rak tabung reaksi, rotary evaporator (IKA® RV 10), colony counter, timbangan digital, spektofotometer, botol vial, GC-MS, petridish dan vaccum pump s VE115 Value. 3.1.2 Bahan Penelitian Bahan-bahan yang digunakan dalam penelitian ini meliputi Nannochloropsis sp. berasal dari Balai Besar Pengembangan Budidaya Air Payau (BBPBAP) Jepara, air laut salinitas 15 ppt, klorin, Na-Thiosulfat, alkohol 70%, tissue, kapas, Etil acetat, Bakteri Vibrio harveyi, vitamin, pupuk walne, kertas saring GF/C (diameter 90 mm), aquadest, metanol absolute, benang kasur, kertas koran, kertas label,air tawar, Media Thiosulfate Citrate Bile Salts Sucrose Agar (TCBS),
14
Embed
3. METODE PENELITIAN 3.1 Alat dan Bahan Penelitian 3.1.1 ...repository.ub.ac.id/11271/3/BAB III.pdf · larutan klorin 30 ppm, didiamkan selama 24 jam kemudian dinetralkan dengan larutan
This document is posted to help you gain knowledge. Please leave a comment to let me know what you think about it! Share it to your friends and learn new things together.
Transcript
3. METODE PENELITIAN
3.1 Alat dan Bahan Penelitian
3.1.1 Alat-alat Penelitian
Peralatan yang digunakan dalam penelitian ini antara lain wadah kultur
Metode kerja pada penelitian ini menggunakan gabungan 2 metode, yaitu
metode eksperimen dan deskriptif dengan pendekatan secara kuantitatif. Menurut
Wasis (2006), metode eksperimen merupakan metode penelitian yang menguji
hipotesis berbentuk hubungan sebab-akibat melalui pemanipulasian variabel
independen (misal treatment, stimulus, kondisi) dan menguji perubahan yang
diakibatkan oleh pemanipulasian. Efek dari manipulasi disebut variabel dependen.
Selama pemanipulasian perlakuan, peneliti melakukan kontrol terhadap variabel
luar (extraneous variables) agar perubahan yang terjadi benar-benar akibat
pemanipulasian, bukan disebabkan variabel lainnya.
Menurut Sugiyono (2015), analisis deskriptif yaitu dengan memberikan
ulasan atau interpretasi terhadap data yang diperoleh sehingga menjadi lebih jelas
dan bermakna dibandingkan dengan sekedar angka-angka. Langkah-langkahnya
adalah reduksi data, penyajian data dengan bagan dan teks, kemudian penarikan
kesimpulan. Sedangkan pendekatan kuantitatif dilakukan denan cata mencatat
dan menganalisa data hasil penelitian secara eksak dengan menggunakan
perhitungan statistik.
3.3 Kerangka Operasional Penelitian
Adapun kerangka operasional pada penelitian ini (Gambar 9), yaitu
sebagai berikut :
20
Gambar 9. Kerangka Operasional Penelitian
3.4 Prosedur Penelitian
3.4.1 kultivikasi Nannochloropsis sp.
a. Sterilisasi Alat dan Bahan
Sterilisasi merupakan suatu proses membunuh mikroorganisme yang tidak
diinginkan baik pada alat-alat, bahan, atau media yang digunakan. Sterilisasi yang
digunakan dalam penelitian ini meliputi sterilisasi panas basah dan sterilisasi
kimia. Sterilisasi panas basah menggunakan autoklaf, sedangkan sterilisasi kimia
menggunakan bahan meliputi klorin 30 ppm selama 24 jam dan diberi Na
Thiosulfat 15 ppm untuk menghilangkan bau klorinnya (Suminto, 2009).
Peralatan yang terbuat dari kaca meliputi pipet volume dan pipet tetes
disterilisasi dengan menggunakan autoklaf. Peralatan yang akan disterilkan dicuci
menggunakan sabun, kemudian dibilas dengan air tawar, dan ditunggu sampai
kering. Selanjutnya peralatan tersebut dibungkus dengan menggunakan kertas
Analisis Data
21
rius. Namun sebelum dibungkus, pipet volume dan pipet tetes harus diberi kapas
dan diikat menggunakan benang kasur. Setelah itu, ditata peralatan yang akan
disterilkan di dalam autoklaf, kemudian ditutup. Prinsip kerja autoklaf adalah
sterilisasi panas basah dengan tekanan 1 atm pada suhu 1210C selama 30 menit.
Peralatan lainnya yaitu toples kaca, erlenmeyer, beaker glass, dan gelas ukur yang
digunakan untuk kultur disterilisasi cara direndam air tawar dan ditambahkan
larutan klorin 30 ppm, didiamkan selama 24 jam kemudian dinetralkan dengan
larutan Na Thiosulfat 15 ppm.
Media kultur berupa air laut 15 ppt ditambah dengan pupuk walne kemudian
disterilisasikan di autoclaf. Selanjutnya dilakukan penambahan vitamin sebelum
penataan wadah kultur dengan dosis masing-masing yaitu 1 mL/L. Wadah yang
telah diisi media steril sebanyak 1,5 liter kemudian diletakkan di atas rak kultur.
b. Penyiapan Inokulan
Bibit Nannochloropsis sp. diperoleh dari kultur murni BBPBAP Jepara.
Selanjutnya dikultur pada toples dengan volume 1,5 liter dengan media air laut
sebanyak 2 buah. Penyediaan inokulan Nannochloropsis sp. dilakukan selama 4
hari untuk mencapai fase eksponensial. Selama penyiapan inokulan tersebut suhu
ruang dijaga pada 28oC dengan intensitas cahaya 4.500 lux.
Stok Nannochloropsis sp. yang ditebar, sebelumnya dihitung kepadatan
awalnya untuk mengetahui seberapa banyak bibit Nannochloropsis sp. yang
dibutuhkan untuk ditebar pada media. Selanjutnya apabila telah diketahui
kepadatannya, ditentukan bibit Nannochloropsis sp. yang dibutuhkan dengan
metode pengenceran. Menurut Cresswel (2014), pengenceran dapat digunakan
untuk menghitung jumlah bibit plankton yang dikehendaki untuk budidaya maupun
untuk diberikan sebagai makanan larva. Jumlah bibit yang dikehendaki dihitung
menggunakan rumus sebagai berikut:
22
Keterangan:
V1 : volume bibit untuk penebaran awal (ml) N1 : jumlah bibit yang akan ditebar (sel/ml) V2 : volume budidaya yang dikehendaki (ml) N2 : jumlah bibit yang dikehendaki (sel/ml) c. Pelaksanaan Kultur Nannochloropsis sp.
Pelaksanaan kultur Nannochloropsis sp. dengan menempatkan wadah yang
telah diisi media sebanyak 1,5 liter di atas rak kultur. Intensitas cahaya diatur
dengan lampu TL 4.500 lux. Selanjutnya diaerasi, bibit Nannochloropsis sp. yang
ditebar memilki kepadatan awal 5 x105 sel/ml dengan pengenceran (Nass,2013).
Pengamatan pertumbuhan Nannochloropsis sp. dilakukan setiap hari selama
masa kultur hingga fase eksponensial hingga mencapai 5 hari waktu pengkulturan.
Selanjutnya dilakukan pemanenan untuk dilakukan proses ekstraksi.
Parameter yang diukur pada media pemeliharaan meliputi suhu, DO, pH
dilakukan satu kali sehari setiap 24 jam pada pukul 11.00 WIB.
d. Pertumbuhan Nannochloropsis sp.
Perhitungan kepadatan Nannochloropsis sp. dilakukan setiap hari dari awal
kultur hingga akhir percobaan. Perhitungan kepadatan Nannochloropsis sp.
dilakukan menggunakan metode penghitungan konsentrasi sel menggunakan 0,1
mm deep Neubauer haemocytometer dan alat bantu mikroskop dengan
menggunakan rumus perhitungan menurut Cresswel (2010) yaitu:
Jumlah (sel/ml) = x 104
23
Apabila kepadatannya tinggi maka menggunakan perhitungan yaitu
sebagai berikut:
- Laju Pertumbuhan Spesifik
Perhitungan laju spesifik dari pertumbuhan saat awal kultur hingga puncak
konsentrasi maksimum. Laju pertumbuhan spesifik dihitung dengan menggunakan
rumus Ak et al. (2008) yaitu:
µ =
keterangan:
µ : laju pertumbuhan per unit konsentrasi sel (hari-1) x1 dan x2 : konsentrasi sel pada waktu ke-1 (tl) dan waktu ke-2 (t2), berturut-turut.
- Doubling Time
Doubling time (dt) ialah waktu penggandaan dari sel Nannochloropsis sp.
Waktu penggandaan sel (dt) merupakan rata-rata waktu generasi sel membelah.
Doubling Time dihitung dari laju pertumbuhan dengan menggunakan rumus
menurut Ak et al. (2008) sebagai berikut:
3.4.2 Ekstraksi Ekstraseluler Nannochloropsis sp.
Pembuatan ekstrak ekstraseluler Nannochloropsis sp. dilakukan melalui 2
tahap yaitu sentrifugasi dan evaporasi untuk mendapatkan ekstrak murni dari
ekskresi Nannochloropsis sp. Proses ekstraksi yang pertama dilakukan adalah
sentrifugasi dengan pemisahan cairan luar tubuh Nannochloropsis sp.
menggunakan pelarut ethyl acetat. Nannochloropsis sp. dipanen pada fase
Jumlah (sel/ml) =
24
eksponensial sebanyak 1,5 liter kemudian dimasukkan kedalam 6 valcon
sebanyak 10 ml setiap valcon kemudian disentrifugasi dengan kecepatan 3.000
rpm selama 10 menit. Hasil sentrifugasi dari Nannochloropsis sp. diambil larutan
yang berada pada bagian atas biomassa yang mengendap di bawah sebagai
supernatan. Supernatan dituang sebanyak 5ml pada setiap valcon yang telah
diberi ethyl acetat sebanyak 5 ml. Perbandingan pemberian ethyl acetat dengan
larutan supernatan Nannochloropsis sp. adalah 1:1 yaitu 5 ml ethyl acetat dan 5
ml spernatan. Selanjutnya valcon ditutup kemudian disentrifugasi dengan
kecepatan 3.000 rpm selama 10 menit. Setelah disentrifugasi larutan yang berada
diatas larutan supernatan diambil dan ditampung pada Erlenmeyer steril sebagai
larutan sampel supernatan Nannochloropsis sp. Proses sentrifugasi untuk setiap
sampel Nannochloropsis sp. dilakukan tiga kali ulangan. Setelah seluruh sampel
terkumpul kemudian diuapkan menggunakan rotary evaporator dengan kecepatan
80 rpm selama ± 3,5 jam dengan suhu 320C. Larutan hasil penguapan kemudian
dipindahkan ke dalam botol sampel sebagai sampel hasil ekstraksi ekstraseluler
Nannochloropsis sp.. Sampel ekstrak selanjutnya disimpan dalam lemari
pendingin dengan suhu -200C hingga pemakaian.
Pelarut yang digunakan dalam penelitian ini adalah etil asetat. Etil asetat
merupakan pelarut yang baik digunakan untuk ekstraksi karena dapat dengan
mudah diuapkan, tidak higroskopis, dan memiliki toksisitas rendah. Etil asetat
bersifat semi polar sehingga mampu menarik senyawa aglikon maupun glikon.