2ciclo Celular y Biol Mol-2015

LA CELULA Unidad morfológica y funcional que constituye a los seres vivos

TEORIA CELULAR

Todos los organismos vivos están compuestos por una o mas células

Las reacciones químicas, procesos biosintéticos y reacciones liberadoras de energía ocurren dentro de la célula

Las células se originan de otras células

Las células contienen la información hereditaria de los organismos de la que son parte, y ésta pasa de una célula progenitora a una célula hija

Crecimiento y división celular

CICLO CELULAR

R. RestricciónG. GapS. Síntesis

El ciclo celular consiste en tres fases: interfase mitosis , y citocinesis . Antes de que una célula eucariótica pueda comenzar la mitosis y dividirse efectivamente, debe duplicar su DNA, sintetizar histonas y otras proteínas asociadas con el DNA de los cromosomas, producir una reserva adecuada de organelas para las dos células hijas y ensamblar las estructuras necesarias para que se lleven a cabo la mitosis y la citocinesis. Estos procesos preparatorios ocurren durante la interfase, en la cual, a su vez, se distinguen tres etapas: las fases Gl, S y G2.

VER FIG 10-3

PROCARIOTAS EUCARIOTAS

Monómeros de los Ácidos Nucleicos:

LOS NUCLEOTIDOS

UraciloH

Monómeros de los Acidos Nucleicos

LOS NUCLEOTIDOS

ESTRUCTURA DEL DNA

MODELO DE WATSON Y CRICK

Estructura del DNA: El Modelo de Watson y Crick

REPLICACION DEL DNA Y ENZIMAS INVOLUCRADAS

La replicación del DNA es el proceso por el cual el DNA es perpetuado. Es un

proceso semiconservativo, esto quiere decir que las moléculas finales contienen una hebra nueva, recién sintetizada, y la complementaria, hebra antigua, que sirvió como templado (molde).

El DNA es replicado por DNA polimerasas, esta utilizan una hebra como templado, sobre la cual realizan la síntesis de la hebra complementaria utilizando los desoxinucleótidos trifosfatos adecuados. La cadena de DNA naciente siempre crece en sentido 5’3’, es decir, el nucleótido que se agrega une su a-fosfato al grupo 3’-OH libre de la cadena en síntesis, este enlace ocurre entre las pentosas que componen los nucleótidos.

Estructuras formadas para la Replicación del DNA

·        OJO DE REPLICACION:

Es la estructura se forma al separase la doble hebra de DNA durante la replicación. En ella se pueden distinguir los llamados tenedores de

replicación, esto pueden ocurrir en una o ambas hebras y es donde esta ocurriendo la síntesis de DNA.

·        FRAGMENTOS DE OKAZAKI:

Estos son los Fragmentos de RNA-DNA que son resultados de la síntesis de DNA en la hebra discontinua. Estos son sintetizados en dirección 5’3’ pero discontinuamente, luego de la remoción de los

primers (RNA) son unidos por la DNA Ligasa.

Estructuras Formadas Para La Replicación Del DNA

REPLICACION DEL DNA Y ENZIMAS INVOLUCRADAS

La replicación del DNA es el proceso por el cual el DNA es perpetuado. Es un proceso semiconservativo,

Ver modelo Watson y Crick

Flujo de la información génica:

“Dogma” central de la biología (hipótesis central)

Transcripción

El RNA COMO MENSAJERO

Tipos de RNA

Mensajero (RNAm)

Transferencia (RNAt)

Ribosómico (RNAr)

Transcripción y maduración de mensajeros en eucariotas (splicing)

Ensamble de las subunidades del ribosoma

Estructura de RNA de transferencia

FLUJO DE INFORMACION GENETICA EN LA CELULA EUCARIOTICA

Flujo de la información desde DNA a Proteínas

Traducción: Síntesis de proteínas

Flujo de la información desde DNA a Proteínas

Descifrando el Código: Niremberg

Extractos celularesRNAs de fuentes diversasAA*

Polipeptidos

Extractos celularesMensajero sintético poliUAA* uno por reacción

Fenilalanina phe- phe- phe

Extractos celularesMensajero sintético (AG)nAGA GAG AGA GAGAA* uno por reacción

Arginina - Ac glutámico arg-glu-arg-glu

Extractos celularesMensajero sintético (AGC)nAGC AGC AGC AGC AGC AA* uno por reacción

Serina ser-ser-ser

El Código genético

Esquema general

Iniciación

La subunidad ribosómica más pequeña se une al extremo 5' de una molécula de mRNA. La primera molécula de tRNA, que lleva el aminoácido modificado fMet, se

acopla con el codón iniciador AUG de la molécula de mRNA. La subunidad ribosómica más grande se ubica en su lugar, el complejo tRNA-fMet ocupa el sitio P

(peptídico). El sitio A (aminoacil) está vacante. El complejo de iniciación está completo ahora

Traducción:

Síntesis de proteínas

Elongación

Un segundo tRNA, con su aminoácido unido, se coloca en el sitio A y su anticodón se acopla con el mRNA. Se forma un enlace peptídico entre los dos aminoácidos reunidos en el ribosoma. Al mismo tiempo, se rompe el enlace entre el primer aminoácido y su tRNA. El ribosoma se mueve a lo largo de la cadena de mRNA en una dirección 5' a 3', y el segundo tRNA, con el dipéptido unido, se mueve desde el sitio A al sitio P, a medida que el primer tRNA se desprende del ribosoma. Un tercer aminoacil-tRNA se coloca en el sitio A y se forma otro enlace peptídico. La cadena peptídica naciente siempre está unida al tRNA que se está moviendo del sitio A al sitio P y el tRNA entrante que lleva el siguiente aminoácido siempre ocupa el sitio A. Este paso se repite una y otra vez

hasta que se completa el polipéptido

Terminación

Cuando el ribosoma alcanza un codón de terminación (en este ejemplo UGA), el polipéptido se escinde del último tRNA y el tRNA se desprende del sitio P. El sitio A es ocupado por un factor de liberación que produce la disociación de las dos subunidades del ribosoma

TRANSCRIPCION EN PROCARIOTAS y SU REGULACION

Los grupos de genes que codifican esas moléculas suelen transcribirse en una única cadena de mRNA. Estos mRNA se conocen con el nombre de mRNA POLICISTRONICOS

REGULACIÓN DE LA TRANSCRIPCIÓN

Lac+: aprox 3000 molec. de β -gal/celLac-: aprox 1molec. de β-gal/cel

Trp-: RNAm Trp maximoTrp+: RNAm Trp minimo

Un medio principal de regulación genética en las bacterias es el sistema OPERON que comprende al promotor , a los genes

estructurales y al operador .

En los sistemas inducibles, como el operón lac, la molécula del represor es activa, hasta que se combina con el inductor (en este caso, alolactosa).

En los sistemas inducibles, como el operón lac, la molécula del represor es activa, hasta que se combina con el inductor (en este caso, alolactosa).

Control positivo del Operón Lac.

SISTEMA CAP-AMPcCAP (Proteina activadora de los genes catabolicos) + AMPc

El complejo se une a la región promotora la transcripción es máxima

En presencia de Glucosa E. coli no usa lactosa como fuente de C.

Cuando los niveles de Glu disminuyen, aumentan los niveles de AMPc que forman mas complejos CAP-AMPc que se unen a la region promotora activando la transcripcion y comienza a degradarse lactosa.

En los sistemas represibles, como el operón trp, el represor se activa sólo cuando se combina con el correpresor . Fig 15-8

FUENTES DE VARIABILIDAD EN ORGANISMOS

FUENTES DE VARIABILIDAD: MUTACIONES

FUENTES DE VARIABILIDAD: MUTACIONES

Deleción: es la pérdida de uno o varios nucleótidos del DNA. Ejemplo: CGTACGTA por CTACGTA.

Inserción:es la adición de uno o varios nucleótidos en la molécula del DNA. Si la inserción es de un nucleótido donde no altera el amino ácido a ser codificado, la mutación pasa desapercibida. Ejemplo: CGTACGTA por CGGGTACGTA, en este caso se afectará la proteína. Inversión: es el cambio de posición de varios nucleótidos en la molécula. Se altera la información genética. Ejemplo: CGTACGTA por CGCATGTA.

Corrida del marco de lectura ("frameshift"): aquí se inserta o se pierde uno o varios nucleótidos, como resultado toda la información del gen se pierde ya que se sustituyen unos amino ácidos por otros. Ejemplo: CGT ACG TAC GTA por CGA CGT ACG TAC cada tres representan nucleótidos codifican para un amino ácido, sin embargo observamos que los codones son diferentes.

Traslocación: esta mutación ocurre cuando segmentos de nucleótidos se separan y se unen en otro lugar del cromosoma.

FUENTES DE VARIABILIDAD EN BACTERIAS

CONJUGACION

El factor F (de fertilidad) de E. coli es un plásmido presente en las células F+ dadoras y puede ser transferido a las células F- receptoras; estas células pueden transformarse en F+ y transferir, a su vez, el factor F.

FUENTES DE VARIABILIDAD EN BACTERIAS

CONJUGACION

Cuando el factor F se integra al cromosoma de una célula de E. coli (transformándolas en una célula Hfr) (Alta frecuencia de recombinación) parte del cromosoma o (en raras ocasiones) todo el cromosoma puede ser transferido a otra célula de E. coli por conjugación. En el momento de la transferencia, el cromosoma se replica por el mecanismo de círculo rodante y una copia de DNA de cadena simple entra a la célula receptora linealmente, de modo que los genes bacterianos penetran uno tras otro, en una secuencia fija. Luego se sintetiza la cadena complementaria

AUXOTROFIA en bacterias como sistema para determinar conjugacion

FUENTES DE VARIABILIDAD EN BACTERIAS

TRANSDUCCION. Los virus como vectores

Los virus pueden servir como vectores de material genético, transportando genes de una célula a otra, proceso conocido como transducción . La transducción general ocurre cuando el DNA hospedador, fragmentado en el curso de la infección viral, se incorpora a nuevas partículas virales que llevan estos fragmentos a una nueva célula hospedadora. La transducción especializada ocurre cuando un profago, al liberarse del cromosoma hospedador, lleva con él, como parte del cromosoma viral, genes del hospedador que luego son transportados a una nueva célula hospedadora.

- El DNA viral puede entrar a la célula y comenzar una infección (ciclo lítico); o

- el DNA viral puede incorporarse al cromosoma bacteriano, replicarse con él y ser transferido a las células hijas (ciclo lisogénico).

Las bacterias que albergan a estos virus se conocen como lisogénicas porque, de cuando en cuando, los profagos se activan y establecen un nuevo ciclo lítico.

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Clonado del DNA

Manipulación del DNAEstudio de una secuencia específica de DNA que suele encontrarse

en un conjunto heterogéneo de secuencias.

Aislamiento, amplificación, secuenciación y expresión de un fragmento de DNA específico

Esta tecnología se denomina: Tecnología del DNA recombinante, clonación génica o ingeniería genética

Ningún campo de la biología ha permanecido igual tras esta revolución tecnológica

Propiedad básica del DNA que permite su manipulación:

El acoplamiento de cadenas por complementariedad. La extraordinaria especificidad del reconocimiento entre secuencias de bases complementarias constituye un poderoso instrumento para la identificación, aislamiento, clonación,... De fragmentos de DNA complementarios a uno dado

Herramienta básica:

Endonucleasas (enzimas) de restricción -> Enzimas de bacterias que reconocen secuencias de DNA específicas y lo cortan por el esqueleto azúcar-fosfato.

•Tipo I y III: cortan el DNA en puntos distintos al de reconocimiento (al azar)

•Tipo II: cortan justo en los puntos que reconocen, que son repeticiones invertidas o palíndromes

5´-GGATCC- 3´

3´-CCTAGG- 5´

Herramienta básica enzimas de restricción

Las enzimas de restricción tipo II:

Proporcionan una forma de cortar el DNA de cualquier origen en secuencias específicas, produciendo por tanto una población heterogénea de fragmentos de extremos idénticos

CORTE Y LIGADURA DE FRAGMENTOS DE DNA

Las endonucleasas de restricción

Clonación y secuenciación del DNA

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EcoRI: E. Coli

BamHI: Bacillus amyloliquefaciens

Dos tipos de cortes:

•Corte plano:

extremos romos

•Corte escalonado:

extremos pegajosos o cohesivos

CORTE Y LIGADURA DE FRAGMENTOS DE DNA

http://www.arrakis.es/~ibrabida/iggifanim.html

Clonación del DNA

•DNA foráneo (secuencia que se desea clonar)

•Vector de clonación (vehículo)

•Organismo huésped (E. Coli)

•Selección de vectores

Vector

híbrido

Clonación y secuenciación del DNA

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Vectores híbridos (quimera)

Fragmentos de distintas procedencias que se unen in vitro tras cortarse con la misma enzima de restricción. Ligasa sella zona híbrida

Vectores de clonación

Inserción de los fragmentos de ADN. Esta inserción se realiza en vectores de clonado, que son los agentes transportadores capaces de introducirlos en las células

hospedadoras. Los vectores de clonación son pequeñas moléculas de ADN, que tienen capacidad para autorreplicarse dentro

de las células hospedadoras.

Plásmidos. Son moléculas de ADN circular, con un tamaño menor que el del cromosoma. Se replican con

independencia del cromosoma bacteriano ya que tienen su propio origen de replicación.

Huésped: E. coli

Inserción del vector híbrido en el huésped:

•Plásmido: transformación (solución diluida cloruro de calcio) y replicación autónoma

•Fago (transducción, inserción en DNA huésped)

•Cósmido (transducción como fago y replicación como plásmido)

Selección de vectores híbridos•Plásmido: resistencia a antibióticos

Además del origen de replicación, los vectores de clonación (plásmidos) deben llevar otros genes denominados marcadores, que sirven para identificar las células que contienen el vector de clonación. Se suelen utilizar como marcadores, genes de

resistencia a antibióticos y genes de bioluminiscencia. Genes de resistencia a antibióticos. Sirven para identificar bacterias que contienen el vector de clonación, porque estas bacterias serán resistentes al antibiótico del gen

marcador.

Genes de luminiscencia.. En este caso, la célula que contenga el gen que se quiere clonar, tendrá la propiedad de emitir luz, ya que el marcador que se le incorpora

determina que se exprese esa característica. Este sistema se emplea cuando la célula hospedadora es una célula eucariota.

CLONADO

Se necesitan Endonucleasas de restricción

Ligasa

Vector de clonado

Bacterias a ser transformadas

Sistema de selección

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•Electroporación: se usa corriente eléctrica para introducir DNA (para bacterias y protoplastos)

•Liposomas: DNA se encapsula en liposomas (vesículas de membrana artificial, para cel animales ppalmente)

•Biolística : disparo de proyectiles de tungsteno u oro recubiertos por DNA (para bacterias y cel vegetales9

•Plásmidos (Ti de Agrobacterium tumefaciens y A rhizogenes para plantas)

Métodos transformación

Clonación del DNA

•DNA foráneo (secuencia que se desea clonar)

•Vector de clonación (vehículo)

•Organismo huésped (E. Coli)

•Selección de vectores

Vector

híbrido

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Clonación y secuenciación del DNA

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Separación fragmentos

Reptación de los fragmentos a través del gel de agarosa

Clonación y secuenciación del DNA

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DNA teñido con bromuro de etidio emite fluorescencia con luz UV

ELECTROFORESIS

Clonación y secuenciación del DNA

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Sondeo de una secuencia de DNA en un conjunto heterogéneos de fragmentosSe precisa de una sonda marcada (radioactividad, colorantes fluorescentes,...), cDNA suele usarse como sonda

•Transferencia en Southern (Southern blotting)

•Transferencia Northern (Northern blotting): se hibrida con RNA

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Transferencia en Southern

(esquema resumen)

Clonación y secuenciación del DNA

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La reacción en cadena de la polimerasa (PCR)

Reaccion en cadena de la polimerasa PCR

Clonación y secuenciación del DNA

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http://www.dnalc.org/ddnalc/resources/animations.html

Animaciones de técnicas de la genética