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Purificacin de protenas

2. Purificacin de la enzima lactato deshidrogenasa de msculo esqueltico de bovino.PARTE I. EXTRACCIN Y PRECIPITACIN POR SALADO.Ciclo de Cori. LDH

Para qu purificar una protena?FitasaLipasaHexosa oxidasaVacuna Hepatitis BInsulinaGelatinaProtenas recombinantes varias

Suero fetal bovinoColorante de carneProtena liofilizada Caracterizacin de la actividad biolgica de la protena.Para estudios sobre la estructura-funcin Gua bsica para la purificacin de una protena

Fases para la purificacin de una protenaFase I. El objetivo inicial es la obtencin del homogeneizado o extracto crudo y su clarificacin o concentracin.

Fase II. El objetivo principal es remover una cantidad importante de contaminantes que pueden ser protenas, cidos nucleicos, toxinas y virus. Uno de los mtodos ms utilizados para eliminar protenas contaminantes es el de la precipitacin.

Fase III. El objetivo es obtener una protena pura o con mnimas trazas de contaminantes. Para alcanzar el objetivo se utilizan uno o la combinacin de varios mtodos cromatogrficos, como la cromatografa de exclusin molecular, intercambio inico, interaccin hidrofbica y de afinidad. SELECCIN DE LA FUENTE DE LA PROTENA. La eleccin de la procedencia de la protena debe basarse en criterios tales como:

la facilidad de obtener cantidades suficientes del tejido del que se asla la protena, la cantidad de la protena de inters en el tejido y cualquier propiedad peculiar de la protena escogida, que ayudar en su estabilizacin y su aislamiento. Mtodos para la ruptura mecnica de las clulasFASE I

Tamao de las protenas, propiedad utilizada para su separacin.El tamao de las protenas es medido usualmente en masa molecular, aunque algunas veces se menciona su longitud y dimetro (en ).El peso molecular es la masa de 1 mol de protena, usualmente se expresa en daltones. Un daltn es la masa atmica de un protn o neutrn.La masa se puede determinar con mtodos como: la electroforesis, la filtracin en gel y la espectrometra de masas. Los mtodos de separacin de protenas en los que se incluyen tanto forma como tamao son: la cromatografa en filtracin en gel (size exclusin chromatography y la electroforesis en gel de poliacrilamida.

CentrifugacinLa centrifugacin aprovecha la propiedades de tamao, forma y densidad de las protenas para separarlas de otras molculas que presentan caractersticas distintas.Como resultado, el efecto de la gravedad para cada protena es diferente. En principio, se pueden separar organelos de una solucin homognea de partculas, al exponer a la muestra a diferente fuerza gravitatoria.

FASE INo olvidar al homogeneizar en que compartimiento celular se encuentra la protena de inters

FASE IDiagrama de flujo para la obtencin de diferentes fracciones subcelulares

Centrifugacin diferencialFASE ICentrifugacin en gradiente

FASE ILa fuerza centrfuga relativa (RCF)se calcula con la siguiente ecuacin:

Donde RPM son las revoluciones por minuto de un rotor con una distancia r (expresada en mm). El radio usado es la distancia del centro del eje del rotor a la posicin intermedia del tubo.

FASE IDiagrama de flujo para la obtencin de diferentes fracciones subcelulares

Centrifugacin diferencialFASE IRemover contaminantes y/o concentrar la muestraPrecipitacin: cambio de pH, incremento en la temperatura, adicin de solventes, molculas cargadas, etc. Pero, el mtodo ms comnmente empleado es la precipitacin por salado con (NH4)2SO4.

FASE IISolubilidadEs la cantidad de soluto que puede disolverse en un solvente.La estructura 3-D de la protena afecta sus propiedades de solubilidad. Cada protena tiene una solubilidad caracterstica en un ambiente definido (amortiguador, tipo de solvente, pH, fuerza inica, temperatura, etc.) y si se cambian esas condiciones puede causar que las protenas pierdan sus propiedades de solubilidad y precipiten en solucin. FASE II

Salting in y salting outSalting in. Las protenas globulares aumentan su solubilidad al incrementar la concentraciones de iones. Pero cuando se eleva la concentracin de iones la protena disminuye su solubilidad y se agrega (salting out).

FASE IICmo vamos a purificar a la lactato deshidrogenasa de msculo de bovino?

Fase ICmo calcular la concentracin de sulfato de amonio a utilizar?

FASE IIExisten tablas que nos indican cuanto aadir de sulfato de amonio FASE II

Y tambin en internethttp://www.proteinchemist.com/cgi-bin/s2.plConocer:Sulfato de amonio slidoConocer el volumen de la solucinY la concentracin final de la sal

Eliminar la salUna vez que se obtiene el pp de una mezcla protena hay que eliminar la sal o medio utilizado para la precipitacin.La sal puede interferir en los posteriores pasos de purificacinLa sal puede alterar las propiedades biolgicas de la protenaBajar o eliminar la concentracin de salDilisisUtilizar la cromatografa filtracin en gel, para perder las molculas de bajo peso molecular (Sefadex-G25).Utilizar filtracin a travs de membranas de dimetro especifico.

Cromatografa de filtracin en gel o exclusin molecular Fase slida estacionaria consiste de un gel de tamao molecular determinado. Fase mvil. Acarreara a la mezcla de protenaCromatografa exclusin molecularProtenas de alto peso molecular salen primero de la columnaDespus las protenas de bajo peso molecular.

Determinar a cada fraccin: 1. Actividad y 2. concentracin de protena

Usos de la cromatografa de exclusin molecular

A. Definir los objetivos de la purificacin. Grado de pureza, cantidad y nivel de actividad requeridos.

B. Seleccionar la muestra biolgica de inicio. Depender de la localizacin de la protena tanto en tejidos como en compartimentos extracelulares o intracelulares.

C. Desarrollar una tcnica de anlisis. Para la determinacin rpida de la pureza, actividad o contenido total de protena. Un mtodo frecuentemente utilizado para evaluar la pureza es la separacin de la protena mediante electroforesis.

D. Minimizar la manipulacin de la muestra. Evitar los procedimientos largos, ya que se corre el riesgo de perder la actividad de la protena o reducir el rendimiento.

E. Remover al inicio del proceso los posibles contaminantes. Como por ejemplo las proteasas.

F. Reducir el uso de aditivos. El uso de muchos y diversos aditivos como sales y amortiguadores en cada paso, puede llevar a la prdida de la actividad de la enzima y aumentar los costos de la purificacin. Seleccionar y usar slo lo necesario.

G. Usar una tcnica diferente en cada paso. Para ello tomar en cuenta las caractersticas propias de la protena como tamao, carga, hidrofobicidad y especificidad por ligandos.H. Minimizar el nmero de pasos. En cada paso se pierde protena