2018 Modul 4 Proteinreinigung und Radioaktivität Modul 4 Proteinreinigung und... · Stadienspezifisches Enzym Protein als Werkzeug, um neue Gene zu isolieren Laccasegen Regulator

Modul BA05:

Reinhard Fischer

Enzymreinigung

Radioaktivität

Wildtype

10 µmM P C

brlA abaA

!apsA

!hymA

brlA

abaA

wetA

yAwA

fluffy

Bisher: Entwicklungsmutanten A. nidulansForward Genetics

Entwicklungsmutanten von A. nidulansForward Genetics

asexual

sexual

Entwicklung in Aspergillus nidulansAktuell: Lichtregulation

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Heute: Fruchtkörperentwicklung in A. nidulans

100 µm

Stadienspezifisches Enzym: Laccase

Stadienspezifisches Enzym

Protein als Werkzeug, um neue Gene zu isolieren

Laccasegen

Regulator

Regulator

Regulierte Gene

Signale

Fruchtkörperent-wicklung

Hiwis

Hiwis für Modul BA04 gesucht

Homepage design Dekanat

Proteinreinigung (mit Tagg)

Affinitätschromatographie: Ni-Agarose etc.

Voraussetzungen: - Gen bekannt- Reinigung aus E. coli oder Organismus ist selbst transformierbar

Proteinreinigung (ohne Tagg)

Reinigung von Proteinen aus einem Organismus, um- Stoffwechselwege aufzuklären- ein Protein oder Enzym zu charakterisieren,

(Enzymkinetik, Substratspektrum, pH OptimumTemperaturoptimum, kinetische Parameter,Cofaktoranalyse)

- das Enzym biotechnologisch zu nutzen (Waschmittelindustrie, Getänkeindustrie, Medizin)- Antikörper herzustellen- Kristallstruktur zu bestimmen (Modelling)- das Gen zu isolieren

Zellaufschlussmethoden

Dounce Homogenisator

Kugelmühle, Zellmühle

French press

Cavitation

Säulenchromatographie

Säulenchromatographie

FPLC – SäulenchromatographieFast performance liquid chromatography

Säulenchromatographie

Gelfiltration (Molekularsieb) Adsorption

SäulenchromatographieIonenaustausch

Säulenchromatographie

Stadienspezifisches Enzym

Enzym als Werkzeug, um neue Gene zu isolieren

Laccasegen

Regulator

Regulator

Regulierte Gene

Signale

Fruchtkörperent-wicklung

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Nachweis von Laccase IIEnzymtest

Abs

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bei 5

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Zeit

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∆t

Enzymaktivität: µmol / minSpez. Enzymaktivität: µmol / min . mg protein

Zugabe Enzym

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Peptide Fingerprinting

Suche nach dem GenModul 3

Peptide Fingerprinting

Suche nach dem GenModul 3

Laccase Fusion mit GFP

PstI PstIATG Stop

ClaI

0.3 kb0.4 kb 2.3 kb

CpeA::GFP

GFP

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Stadienspezifisches Enzym

Enzym als Werkzeug, um Regulatorenzu isolieren

Laccasegen

Regulator

Regulator

Regulierte Gene

Signale

Fruchtkörperent-wicklung

4 Hiwis für Modul BA04 gesucht!

2. Radioaktivität

Isotope

Stabilität der Kerne

Zerfallsarten

Radioaktivität in der Biologie

Zerfallsschema für Tritium

Cl1735 + e- + Neutrino HWZ: 82 Tage

P1532 S

1632 + e- + Neutrino HWZ: 14 Tage

C6

14 N7

14 + e- + Neutrino HWZ: 5730 Jahre

S1635

Nachweis von RadioaktivitätFilm Szintillationszähler