1 Αγαπητοί συνάδελφοι, Γράφω αυτό το κείμενο σε ένα τραίνο ταξιδεύοντας για Θεσσαλονίκη. Έξω από το τραίνο η χειμωνιάτικη με λίγη άνοιξη φύση αυτής της πολύτιμης γωνιάς του πλανήτη, μέσα ζωηρές συζητήσεις, χαρούμενη ατμόσφαιρα, σε πείσμα των καιρών, πριν από το τριήμερο της Αποκριάς. Καθυστέρησε αλήθεια αυτό το δελτίο για πολλούς λόγους αλλά τώρα επιτέλους έφθασε η ώρα να επικοινωνήσουμε. Και έχουμε να πούμε πολλά καλά και κακά να πούμε, όπως λέγαμε στη Μπερλίνα τα παλιά τα χρόνια (δεν ξέρω αν οι νεότεροι ξέρουν η έπαιξαν ποτέ Μπερλίνα...) Μπορούμε να μιλήσουμε για τα νεανικά μάτια που με ενδιαφέρον παρακολουθούν κάθε μήνα τις παρουσιάσεις των συναδέλφων, που αφορούν τα εργαστήρια. Τι γίνεται μέσα σε ένα εργαστήριο βιοχημικό, σε ενα ορμονολογικό, σε ενα ανοσολογικό. ρώτησαν τα παιδιά την επιτροπή νέων. Μαθαίνουμε για μεθόδους, για εξετάσεις, για νοσήματα... Γίνονται αυτά στα δικά μας εργαστήρια; Ας το κάνουμε, είπαμε. Ας παρουσιάσουμε την πραγματικότητα, την καθημερινότητα. Και η προσπάθεια πέτυχε και συνεχίζεται και σε ησυχία, με προσοχή ξετυλίγεται η ρουτίνα και ζωντανεύουν τα γραφεία μας και γεμίζουν οι καρεκλίτσες οι πλιαν. (κι αυτές μπορεί να μην τις καταλαβαίνουν οι νεότεροι). Ή να σας πω για τις ημερίδες ποιότητας, που οργανώνει σε διάφορες πόλεις της Ελλάδας το υπουργείο για να καλέσει τα εργαστήρια σε διαπίστευση ή τουλάχιστον σε εσωτερικό και εξωτερικό έλεγχο ποιότητας. Παρουσιάζονται οι απόψεις των εχόντων την εμπειρία ή των φορέων διαπίστευσης, πιστοποίησης, εξωτερικού ελέγχου ποιότητας. Αρκετοί συνάδελφοι συμμετέχουν ως εκπαιδευτές ή εκπαιδευόμενοι και η Εταιρεία μας παίζει σημαντικό ρόλο. Θα ήθελα να υπογραμμίσω και από τη θέση αυτή ότι υπάρχουν συνάδελφοι πρόθυμοι και έμπειροι να βοηθήσουν όσους ξεκινάνε τη διαδικασία. Ελπίζουμε να μπορέσουμε να οργανώσουμε σχετικό κομμάτι στην ιστοσελίδα μας. Κι έπειτα ετοιμάζουμε συνέδριο στο Βόλο αυτή τη φορά με τους ενθουσιώδεις συναδέλφους του Βιοχημικού του Αχιλλοπούλειου νοσοκομείου Βόλου αλλά και της υπόλοιπης Θεσσαλίας. Αντλεί κανείς θετική ενέργεια από την επαφή με τις άλλες πόλεις της Ελλάδας, αναπνέει πιο φρέσκο αέρα. Θα βρείτε πληροφορίες σε αυτό το δελτίο και βάλτε στο νου σας... 11-12 Οκτώβρη στο Βόλο για μια νέα συνάντηση, μια διαφορετική άποψη των πραγμάτων. Μη σκεφθείτε Και πού θα βρω χρήματα... Τρελλοί είναι αυτοί πάλι... Μας κουβαλάνε εποχή κρίσης στο Βόλο... Δέστε σαν μια νέα πρόκληση! Δέστε το σαν εκδρομή, σαν ευκαιρία να γνωρίσετε τι γίνεται σε μικρότερες πόλεις της Ελλάδας, με εξίσου ή και καλύτερα οργανωμένα εργαστήρια, πώς αντιμετωπίζουν τα πράγματα σήμερα ή και στο παρελθόν. Δώστε λοιπόν την ευκαιρία στους συναδέλφους μας της Θεσσαλίας να σας δείξουν, να σας φιλοξενήσουν, να γίνουν οι οικοδεσπότες της κλινικής χημείας για λίγες μέρες. Ετοιμάστε τις εργασίες σας. Κάτι έχετε να πείτε, κάτι έχετε παρατηρήσει, ανακοινώστε το. Θα προηγηθεί σεμινάριο συνεχιζόμενης εκπαιδευσης για την παιδιατρική κλινική χημεία αρχές καλοκαιριού, με πολύ ενδιαφέροντα θέματα, καινούργια και ειδικά, που ενδιαφέρουν όμως όλους, όσους έχουν να κάνουν με παιδιατρικούς ασθενείς. Αυτά ήταν τα καλά νέα. Ελπίζω να μη με παρεξηγείτε και να θεωρείτε ότι όλα τα βλέπω θετικά και σαν κάτι παλαιο... σας παροτρύνω να συμμετέχετε σε όλα, και όλα θα λυθούν και όλα θα λάμψουν, και θα βρούμε τη θέση μας σε αυτή τη χώρα, όπου και την ιδιότητά μας ως επαγγελματιών υγείας ακούγεται ότι αμφισβητούν. Υπάρχουν και τα κακά, αλλά μάλλον τα ξέρετε όλοι. Τα βλέπετε κάθε μέρα. Στη χώρα αυτή, όπου ο Πλάτων δίδαξε την πλήρη διαύγεια «εν αυγή καθαρά», στη χώρα αυτή επικρατεί η αμφιβολία για την αλήθεια. Ηλίου φαεινότερη είναι η θέση μας, και έτσι αντιμετωπίζεται σε όλο τον κόσμο... Όμως... Σε αυτό το δελτίο μπορείτε να διαβάσετε για αυτούς που έτυχαν της υψηλότερης διάκρισης στον κόσμο στην επιστήμη της χημείας, που φέτος σχετίζεται με τη βιοχημεία, και πιο συγκεκριμένα με τους υποδοχείς, που συνδέονται με πρωτεΐνες G. Μπορείτε να διαβάσετε και για το NOBEL ιατρικής, που αφορά στα βλαστοκύτταρα και τον επαναπρογραμματισμό τους. Σε αυτό το δελτίο μπορείτε να διαβάσετε και τις εργασίες αυτών που βραβεύθηκαν στο συνέδριό μας. Μελετείστε με ενδιαφέρον τις εργασίες τους. Για να ανέβει το φρόνημά μας. Τις παρουσίασαν αλλά και τις έγραψαν για μας. Όσο για τους άλλους, τους μεγάλους, που μας κάνουν παρέα στα δελτία, αν δεν σας πείθω εγώ να αντιμετωπίσετε τους καιρούς με συμμετοχή, με δουλειά, με μελέτη, μπορεί να τα καταφέρουν αυτοί... Με φιλικούς χαιρετισμούς Κατερίνα Ψαρρά Επιστολή εκδότηNEWSLETTER 2013 Μάρτιος Τεύχος 8 ΕΛΛΗΝΙΚΗ ΕΤΑΙΡΙΑ ΚΛΙΝΙΚΗΣ ΧΗΜΕΙΑΣ- ΚΛΙΝΙΚΗΣ ΒΙΟΧΗΜΕΙΑΣ Αλωπεκής 47, 10676 Αθήνα τηλ. επικ. 2103645751, fax 2103645392 Σε αυτό το τεύχος: ΑΝΑΠΤΥΞΗ ΚΑΙ ΑΞΙΟΛΟΓΗΣΗ ΜΕΘΟΔΟΥ HPLC- MS/MS ΓΙΑ ΔΙΑΓΝΩΣΗ ΦΑΙΝΥΛΟΚΕΤΟΝΟΥΡΙΑΣ ΕΚΦΡΑΣΗ ΤΩΝ ΜΕΛΩΝ ΤΗΣ ΥΠΕΡΟΙΚΟΓΕΝΕΙΑΣ ΤΟΥ TNF-α ΣΕ ΜΥΕΣ ΜΕ ΑΝΕΠΑΡΚΕΙΑ CRH ΚΑΤΑ ΤΗ ΔΙΑΡΚΕΙΑ ΔΕΡΜΑΤΙΚΗΣ ΤΡΑΥΜΑΤΙΚΗΣ ΜΕΛΕΤΕΣ ΥΠΟΔΟΧΕΩΝ ΠΟΥ ΣΥΝΔΕΟΝΤΑΙ ΜΕ ΠΡΩΤΕΪΝΕΣ G ΩΡΙΜΑ ΚΥΤΤΑΡΑ ΜΠΟΡΟΥΝ ΝΑ ΕΠΑΝΑΠΡΟΓΡΑΜΜΑΤΙΣΤΟΥΝ ΓΙΑ ΝΑ ΓΙΝΟΥΝ ΠΟΛΥΔΥΝΑΜΑ ΓΙΑ ΝΑ ΘΥΜΗΘΗΤΕ... ΤΟ ΠΑΡΑΠΟΝΟ, ΤΟΥ ΟΔ. ΕΛΥΤΗ Ε Π Ι Τ Ρ Ο Π Η Σ Υ Ν Τ Α Ξ Η Σ • Μ. Βικεντίου • Μ. Γαροφαλάκη • Α. Γρηγοράτου • Ε. Κώνστα • Κ. Κωνσταντινάκου • Β. Λόη
28
Embed
2013 Μάρτιος NEWSLETTER Τεύχος 8στον κόσμο στην επιστήμη της χημείας, που φέτος σχετίζεται με τη βιοχημεία,
This document is posted to help you gain knowledge. Please leave a comment to let me know what you think about it! Share it to your friends and learn new things together.
Transcript
1
Αγαπητοί συνάδελφοι,
Γράφω αυτό το κείμενο σε ένα τραίνο ταξιδεύοντας για
Θεσσαλονίκη. Έξω από το τραίνο η χειμωνιάτικη με λίγη άνοιξη
φύση αυτής της πολύτιμης γωνιάς του πλανήτη, μέσα ζωηρές συζητήσεις, χαρούμενη
ατμόσφαιρα, σε πείσμα των καιρών, πριν από το τριήμερο της Αποκριάς.
Καθυστέρησε αλήθεια αυτό το δελτίο για πολλούς λόγους αλλά τώρα επιτέλους έφθασε η ώρα
να επικοινωνήσουμε. Και έχουμε να πούμε πολλά καλά και κακά να πούμε, όπως λέγαμε στη
Μπερλίνα τα παλιά τα χρόνια (δεν ξέρω αν οι νεότεροι ξέρουν η έπαιξαν ποτέ Μπερλίνα...)
Μπορούμε να μιλήσουμε για τα νεανικά μάτια που με ενδιαφέρον παρακολουθούν κάθε μήνα
τις παρουσιάσεις των συναδέλφων, που αφορούν τα εργαστήρια. Τι γίνεται μέσα σε ένα
εργαστήριο βιοχημικό, σε ενα ορμονολογικό, σε ενα ανοσολογικό. ρώτησαν τα παιδιά την
επιτροπή νέων. Μαθαίνουμε για μεθόδους, για εξετάσεις, για νοσήματα... Γίνονται αυτά στα
δικά μας εργαστήρια; Ας το κάνουμε, είπαμε. Ας παρουσιάσουμε την πραγματικότητα, την
καθημερινότητα. Και η προσπάθεια πέτυχε και συνεχίζεται και σε ησυχία, με προσοχή
ξετυλίγεται η ρουτίνα και ζωντανεύουν τα γραφεία μας και γεμίζουν οι καρεκλίτσες οι πλιαν. (κι
αυτές μπορεί να μην τις καταλαβαίνουν οι νεότεροι).
Ή να σας πω για τις ημερίδες ποιότητας, που οργανώνει σε διάφορες πόλεις της Ελλάδας το
υπουργείο για να καλέσει τα εργαστήρια σε διαπίστευση ή τουλάχιστον σε εσωτερικό και
εξωτερικό έλεγχο ποιότητας. Παρουσιάζονται οι απόψεις των εχόντων την εμπειρία ή των
ΜΕΤΑΒΟΛΙΚΕΣ ΠΑΘΗΣΕΙΣ Ο µεταβολισµός περιλαµβάνει το σύνολο των βιοχηµικών αντιδράσεων που λαµβάνουν χώρα σε έναν ζώντα οργανισµό. Τα ένζυµα
διαδραµατίζουν καθοριστικό ρόλο σε όλες τις µεταβολικές οδούς και για το λόγο αυτό, οποιαδήποτε αλλαγή στη λειτουργία τους λόγω
κάποιας µετάλλαξης στο αντίστοιχο γονίδιο, µπορεί να δηµιουργήσει σοβαρές επιπτώσεις στο µεταβολισµό και κατ’ επέκταση στην υγεία.
Μία γενετική ανωµαλία σε κάποιο ένζυµο ή πρωτεϊνικό µεταφορέα που εµπλέκεται στο µεταβολισµό των πρωτεϊνών, των υδατανθράκων, των
λιπιδίων καθώς και των παράπλευρων συστηµάτων που εµπλέκονται µε αυτόν, ορίζεται ως ενδογενές σφάλµα του µεταβολισµού [1]. Στην
πλειονότητά τους οι µεταβολικές παθήσεις είναι κληρονοµικές µε αυτοσωµικό υπολειπόµενο χαρακτήρα και καθεµία από αυτές παρουσιάζει
διαφορετικούς φαινότυπους ανάλογα µε την ηλικία έναρξης, την κλινική σοβαρότητα και τον τρόπο µεταβίβασης της πάθησης από γενιά σε
γενιά [2].
Η συχνότητα εµφάνισης των µεταβολικών παθήσεων ποικίλει ανάλογα µε την εθνοτική σύνθεση του πληθυσµού. Στην Ευρώπη, η συχνότητα
εµφάνισης µεταβολικών παθήσεων είναι κατά µέσο όρο 1 στις 5.000 γεννήσεις. Οι µεταβολικές παθήσεις εµφανίζονται συνήθως αµέσως µετά
τη γέννηση ή κατά τη διάρκεια τις βρεφικής περιόδου και εξελίσσονται ταχέως, ενώ σε ένα µικρό ποσοστό αυτών τα συµπτώµατα
εµφανίζονται στην παιδική ηλικία [3].
Ο µεταβολικός έλεγχος για την ανίχνευση και τη διάγνωση µίας ή περισσοτέρων διαταραχών είναι πολύ σηµαντικός, ώστε να είναι δυνατή η
θεραπευτική τους αντιµετώπιση. Αναµφισβήτητα, η καταλληλότερη στιγµή για τη διάγνωση κάποιας µεταβολικής πάθησης είναι οι πρώτες
µέρες µετά τη γέννηση [2,4]. Για το λόγο αυτό, κατά τη διάρκεια των τελευταίων 50 ετών εφαρµόζονται παγκοσµίως προγράµµατα νεογνικού
προληπτικού ελέγχου. Η εισαγωγή του νεογνικού ελέγχου έχει συντελέσει στην έγκαιρη διάγνωση και αντιµετώπιση κληρονοµικών και
µεταβολικών ασθενειών και έχει συµβάλλει σηµαντικά στη µείωση της θνησιµότητας καθώς και της νοσηρότητας των νεογνών [5]. Μερικές
από τις παθήσεις που περιλαµβάνονται στα ευρωπαϊκά προγράµµατα ελέγχου είναι η φαινυλοκετονουρία, ο συγγενής υποθυρεοειδισµός, η
συγγενής υπερπλασία επινεφριδίων, η οµοκυστεϊνουρία, η ασθένεια µε χαρακτηριστική οσµή σφενδάµου στα ούρα, η γαλακτοζαιµία, η
ανεπάρκεια αφυδρογονάσης των µεσαίας αλυσίδας ακυλο-CoA, η ανεπάρκεια της παλµιτοϋλο-µεταφοράσης της καρνιτίνης Ι και Ι κ.ά. Η
εισαγωγή της φασµατοµετρίας µαζών στην κλινική ανάλυση επέτρεψε να συµπεριληφθούν στο νεογνικό έλεγχο ασθένειες που σχετίζονται µε
το µεταβολισµό των λιπαρών οξέων και τις οργανικές οξυαιµίες, καθώς επίσης και να αυξήθεί αξιοσηµείωτα ο αριθµό των αµινο-οξυαιµιών
που δύνανται να διαγνωσθούν. Ο αριθµός των παθήσεων που συµπεριλαµβάνονται στο πρόγραµµα νεογνικού ελέγχου ποικίλει από χώρα σε
χώρα και εξαρτάται τόσο από την οικονοµική δυνατότητα κάθε χώρας για πρόληψη όσο και από τα κριτήρια που θέτουν οι πραγµατογνώµονες
των κρατών. Στην Ελλάδα, το εθνικό πρόγραµµα νεογνικού ελέγχου ξεκίνησε το 1974 και σήµερα πραγµατοποιείται από το Ινστιτούτο
Υγείας του Παιδιού. Αρχικά το πρόγραµµα περιελάµβανε τον έλεγχο φαινυλοκετονουρίας. Από το 1983, µε τη συνεισφορά του Εργαστηρίου
Ανοσοδιαγνωστικών Προϊόντων του Ι./Ρ.-Ρ.Π. του Ε.ΚΕ.Φ.Ε. «∆ηµόκριτος», που προσέφερε επισηµασµένη µε ραδιο-ιώδιο (125Ι)
θυρεοειδοτρόπο ορµόνη (TSH) και ανοσοκατακρηµνιστικό αντιδραστήριο για 100.000 µετρήσεις το χρόνο, εντάχθηκε στο πρόγραµµα ο
έλεγχος του συγγενούς υποθυρεοειδισµού. Σήµερα, ελέγχονται επιπλέον, η συγγενής υπερπλασία των επινεφριδίων και η γαλακτοζαιµία.
Ωστόσο στο πρόγραµµα δεν εντάσσονται παθήσεις που απαιτούν τη χρήση φασµατοµετρίας µαζών και για το λόγο αυτό, ο αριθµός των
ελεγχοµένων παθήσεων είναι µικρός σε σύγκριση µε τον αριθµό των παθήσεων που περιλαµβάνονται στα προγράµµατα νεογνικού ελέγχου
άλλων ευρωπαϊκών χωρών.
Στα πλαίσια αυτής της εργασίας, αναπτύχθηκε απλή και σύντοµη µέθοδος υγρής χρωµατογραφίας-φασµατοµετρίας µαζών (HPLC/MS-MS) σε
αποξηραµένές κηλίδες αίµατος µε στόχο τη διάγνωση της φαινυλοκετονουρίας και της ανεπάρκειας της αφυδρογονάσης των µεσαίας
αλυσίδας ακυλοσυνενζύµων Α.
ΦΑΙΝΥΛΟΚΕΤΟΝΟΥΡΙΑ Η φαινυλοκετονουρία (PKU), µία µορφή υπερφαινυλαλανιναιµίας (HPA) είναι αυτοσωµική υπολειπόµενη κληρονοµική διαταραχή του
µεταβολισµού των αµινοξέων, µε συχνότητα εµφάνισης 1 στις 10.000 κατά µέσο όρο, και οφείλεται σε ανεπάρκεια του ηπατικού ενζύµου
υδροξυλάση της φαινυλαλανίνης (PΑΗ). Το ένζυµο αυτό, υπό φυσιολογικές συνθήκες καταλύει την οξείδωση της φαινυλαλανίνης (Phe) σε
τυροσίνη (Tyr). Έτσι, απώλεια ή ανεπάρκεια αυτού του ενζύµου οδηγεί σε αυξηµένα επίπεδα της Phe στο αίµα και τα βιολογικά υγρά ενός
οργανισµού και σε ανικανότητα σύνθεσης Tyr [6] (Σχήµα 1). Η πιο συνηθισµένη αιτία για την έλλειψη της δραστικότητας της PAH είναι µία
γενετική ανωµαλία στο γονίδιο που είναι υπεύθυνο για το ένζυµο PAH [7]. Γενετικές αναλύσεις που πραγµατοποιήθηκαν µέσω τεχνικών
ανασυνδυασµού DNA έδειξαν πως η γενετική περιοχή για την PKU βρίσκεται στο χρωµόσωµα 12q23.2. Το γονίδιο του PAH περιέχει 13
εξόνια συνολικού µήκους 90.000 βάσεων DNA. Η κλασσική µορφή της ασθένειας δεν οφείλεται σε απώλεια ολόκληρου του γονιδίου αλλά σε
µεταλλάξεις στην αλληλουχία του που οδηγούν σε υποκαταστάσεις αµινοξέων ή σε πρόωρη διακοπή της µετάφρασης του γονιδίου. Οι
πλειοψηφία των ασθενών που πάσχουν από PKU έχουν µία ή περισσότερες µεταλλάξεις στο συγκεκριµένο γονίδιο [8]. Μία δευτερεύουσα
αιτία για την εµφάνιση της PKU είναι κάποια διαταραχή στην αναγέννηση ή τη βιοσύνθεση της τετραϋδροβιοπτερίνης (BH4) που αποτελεί
συµπαράγοντα της PAH. Κατά την οξείδωση της Phe σε Tyr η BH4 µετατρέπεται σε κινονοειδή διϋδροβιοπτερίνη (qBH2). Προκειµένου να
συνεχισθεί η δράση του PAH, η ΒΗ4 πρέπει να αναγεννηθεί µέσω της αναγωγάσης της διϋδροπτεριδίνης (Σχήµα 1). Η ανεπάρκεια του
συγκεκριµένου ενζύµου οδηγεί σε ανεπάρκεια της PAH.
3
Σχήµα 1: Οξείδωση της Phe σε Tyr µέσω της υδροξυλάσης της Phe και αναγέννηση του απαραίτητου για την αντίδραση συµπαράγοντα BH4
Υπό φυσιολογικές συνθήκες, όταν η πρόσληψη της Phe από την τροφή είναι ικανοποιητική, ο ανθρώπινος οργανισµός µπορεί εύκολα να
συνθέσει επαρκή ποσότητα Tyr. Το ένζυµο (PAH) καταλύει την οξείδωση της Phe στη θέση 4 του αρωµατικού της δακτυλίου µετατρέποντάς
την σε Tyr, χρησιµοποιώντας µοριακό οξυγόνο και BH4. Η Tyr µέσω διαδοχικών ενζυµικών αντιδράσεων καταβολίζεται σε φουµαρικό, το
οποίο εισέρχεται στον κύκλο του κιτρικού οξέος και µετατρέπεται σε CO2 και H2O καθώς και σε ακετοακετυλο-CoA (κετονοσώµατα). Η
οξείδωση της Phe είναι η κύρια πορεία για τη βιοσύνθεση της τυροσίνης, η οποία αποτελεί πρόδροµη ένωση της ντοπαµίνης και των
κατεχολαµινών, νορεπινεφρίνης και επινεφρίνης (Σχήµα 2) και εµµέσως της µελανίνης και της θυροξίνης.
Page 3 Τεύχος 8
Σχήµα 2: Κύρια πορεία αποικοδόµησης της Phe. Μεταβολισµός της Tyr σε CO2 και H2O ή ακετοακετυλο-CoA. Μετατροπή της Tyr σε
ντοπαµίνη, νορεπινεφρίνη και επινεφρίνη
Η ανεπάρκεια του ενζύµου PAH οδηγεί σε ανεπάρκεια τόσο της σύνθεσης της Tyr όσο και της παραγωγής των κατεχολαµινών και των
ορµονών που εξαρτώνται από αυτήν, καθώς επίσης και σε αύξηση των επιπέδων της Phe στο αίµα, η οποία είναι τοξική για τον εγκέφαλο.
Όταν η κύρια πορεία παρεµποδιστεί ακολουθείται µία δευτερεύουσα πορεία, η τρανσαµίνωση της Phe (Σχήµα 3). Πιο συγκεκριµένα, όταν η
PAH δεν λειτουργεί τότε η Phe δεν µπορεί να µετατραπεί σε Tyr και τρανσαµινώνεται µε αποτέλεσµα την παραγωγή φαινυλοκετονών, όπως
φαινυλοπυροσταφυλικό, φαινυλοξικό, φαινυλογαλακτικό όπως επίσης και σε ο-υδροξυφαινυλοξικό. Αποτέλεσµα των παραπάνω είναι η
πρόκληση µη αντιστρεπτών βλαβών στο κεντρικό νευρικό σύστηµα.
4
Σχήµα 3: Τρανσαµίνωση της Phe
Στην περίπτωση που η PKU δεν διαγνωστεί ώστε να αντιµετωπιστεί εγκαίρως, οι πάσχοντες µπορεί να εµφανίσουν στους πρώτους 5-6 µήνες
της ζωής τους διανοητική καθυστέρηση, χαρακτηριστική οσµή των ούρων (µούχλα) λόγω της παρουσίας φαινυλοπυροσταφυλικού και άλλων
φαινυλοκετονών και εξανθήµατα που προσοµοιάζουν µε έκζεµα. Στη συνέχεια του βίου τους συµπτώµατα όπως η ανεπαρκής νοητική
ανάπτυξη συνδυαζόµενη µε µικροκεφαλία, η διανοητική και ψυχοκοινωνική καθυστέρηση, τα κινητικά προβλήµατα, η απώλεια µελανίνης
από τα µαλλιά ή το δέρµα και αυξηµένα αντανακλαστικά των µυών καθίστανται περισσότερο έκδηλα [9-11].
Η θεραπευτική αντιµετώπιση των νεογνών µε ανεπάρκεια του PAH περιλαµβάνει αυστηρό περιορισµό της κατανάλωσης πρωτεϊνών και
µείωση του επιπέδου πρόσληψης της Phe σε εκείνο που απαιτείται για την πρωτεϊνική σύνθεση. Λόγω της περιορισµένης πρόσληψης των
φυσικών πρωτεϊνών είναι απαραίτητη η χορήγηση στους ασθενείς ενός µίγµατος αµινοξέων που εµπεριέχει όλα τα απαραίτητα αµινοξέα και
την Tyr για την κάλυψη των απαιτήσεων του οργανισµού σε άζωτo [11,12].
ΑΝΕΠΑΡΚΕΙΑ ΤΗΣ ΑΦΥ∆ΡΟΓΟΝΑΣΗΣ ΤΩΝ ΜΕΣΑΙΑΣ ΑΛΥΣΙ∆ΑΣ ΑΚΥΛΟ-ΣΥΝΕΝΖΥΜΩΝ A
Η ανεπάρκεια της αφυδρογονάσης των µεσαίας αλυσίδας ακυλο-CoA (MCADD), είναι µία αυτοσωµική υπολειπόµενη πάθηση µε συχνότητα
εµφάνισης 1 στις 10.000 - 15.000 και σχετίζεται µε το µεταβολισµό των λιπαρών οξέων. Η αφυδρογονάση των µεσαίας αλυσίδας ακυλο-CoA
(MCAD), το οποίο είναι το πρώτο ένζυµο της β-οξείδωσης, καταλύει την οξείδωση των µεσαίας αλυσίδας ακυλο-CoA (6-12 άτοµα άνθρακα)
σε trans-∆2- ενοϋλο-CoA µε ταυτόχρονη αναγωγή του FAD σε FADH2 (Σχήµα 4).
Σχήµα 4: Πρώτο στάδιο της β-οξείδωσης. Αφυδρογόνωση των ακυλο-παραγώγων στον C2 µε ταυτόχρονο σχηµατισµό διπλού δεσµού
Ανεπάρκεια ή αδράνεια της MCAD οδηγεί σε αύξηση των επιπέδων των µεσαίας αλυσίδας ακυλο-CoA και των παραγόµενων παραπροϊόντων
τους, ακυλοκαρνιτινών και ακυλογλυκινών στο αίµα και τα ούρα, αντίστοιχα [13].
Το γονίδιο ACADM το όποιο κωδικοποιεί την πρωτεΐνη MCAD βρίσκεται στο χρωµόσωµα 1p31. Περισσότερες από 30 µεταλλάξεις έχουν
ταυτοποιηθεί σε αυτό το γονίδιο, στην πλειοψηφία τους παρανοηµατικές. Η πιο συχνή µετάλλαξη είναι η A985G. Αποτέλεσµα αυτής της
σηµειακής µετάλλαξης είναι η υποκατάσταση της λυσίνης από γλουταµινικό οξύ στη θέση 329 της πρόδροµης πρωτεΐνης, η οποία αντιστοιχεί
στη θέση 304 της ώριµης πρωτεΐνης. ∆ύο αντίγραφα αυτής της συνήθους µετάλλαξης έχουν βρεθεί σε 80% των ατόµων που πάσχουν από
MCADD στην Ευρώπη [13, 14]. Η MCADD είναι η πλέον συνήθης κληρονοµική διαταραχή του µεταβολισµού των λιπαρών οξέων.
Υπο φυσιολογικές συνθήκες, τα µεσαίας αλυσίδας λιπαρά οξέα (εξανοϋλο-, οκτανοϋλο-, δεκανοϋλο- λιπαρά οξέα) απορροφώνται από τον
εντερικό αυλό άµεσα και µέσω της πυλαίας φλέβας εισέρχονται στην κυκλοφορία του αίµατος και µεταφέρονται στο ήπαρ όπου οξειδώνονται
[15]. Τα µεσαίας και µικρής αλυσίδας λιπαρά οξέα δεν ενεργοποιούνται στο κυτοσόλιο (όπως συµβαίνει µε τα µακράς αλυσίδας λιπαρά οξέα)
αλλά στη µιτοχονδριακή µήτρα όπου µετατρέπονται σε ακυλο-CoA µέσω των αντίστοιχων ακυλο-CoA συνθετασών προκειµένου να
οξειδωθούν [16]. Για την είσοδο των µεσαίας αλυσίδας λιπαρών οξέων στη µιτοχονδριακή µήτρα δεν απαιτείται η σύνδεσή τους µε καρνιτίνη
αλλά πραγµατοποιείται µέσω παθητικής διάχυσης. Υπό φυσιολογικές συνθήκες, τα µεσαίας αλυσίδας ακυλο-CoA οξειδώνονται προς ακετυλο-
CoA, το οποίο εισέρχεται στον κύκλο του Krebs και στην αναπνευστική αλυσίδα για παραγωγή ενέργειας (Σχήµα 5).
Στην περίπτωση ανεπάρκειας της MCAD, τα µεσαίας αλυσίδας λιπαρά οξέα που έχουν εισέλθει στη µιτοχονδριακή µήτρα και έχουν
ενεργοποιηθεί αλλά και αυτά που προέκυψαν από ατελή οξείδωση των µακράς αλυσίδας λιπαρών οξέων δεν µπορούν να οξειδωθούν λόγω της
ανεπάρκειας αυτού του ενζύµου, που είναι το πρώτο από τα 4 ένζυµα της β-οξείδωσης. Προκειµένου να απελευθερωθεί το συζευγµένο µε τα
λιπαρά οξέα CoA και να συµµετέχει σε άλλες απαραίτητες αντιδράσεις έτσι ώστε να παραχθεί ενέργεια, τα µεσαίας αλυσίδας ακυλο-CoA
συνδέονται µε την καρνιτίνη, συσσωρεύονται µε την µορφή εξανοϋλο-, οκτανοϋλο-, δεκανοϋλο καρνιτίνης (C6, C8 και C10, αντίστοιχα) και
εξέρχονται του κυττάρου. Για το λόγο αυτό, στην πάθηση αυτή παρατηρείται αύξηση των επιπέδων των µεσαίας αλυσίδας ακυλοκαρνιτινών
στο αίµα.
ΕΛΛΗΝΙΚΗ ΕΤΑΙΡΙΑ ΚΛΙΝΙΚΗΣ ΧΗΜΕΙΑΣ-
ΚΛΙΝΙΚΗΣ ΒΙΟΧΗΜΕΙΑΣ
Αλωπεκής 47, 10676 Αθήνα
τηλ. επικ. 2103645751, fax 2103645392
5
Σχήµα 5. Μεταβολισµός των µεσαίας αλυσίδας λιπαρών οξέων σε περίπτωση ανεπάρκειας MCAD.
Συνήθως, τα πρώτα συµπτώµατα της MCADD εµφανίζονται νωρίς κατά την παιδική ηλικία, ενώ σε µικρότερο ποσοστό γίνονται αντιληπτά
κατά την εφηβεία. Έχει αναφερθεί ότι οι πάσχοντες από MCADD µπορεί να είναι φυσιολογικοί χωρίς κανένα σύµπτωµα όσο τρέφονται συχνά
ενώ είναι πιθανό να νοσήσουν ξαφνικά µετά από περιόδους νηστείας ή µόλυνσης. Τα κυριότερα από τα συµπτώµατα που παρατηρούνται σε
ασθενείς µε MCADD είναι υποκετονική υπογλυκαιµία, ενώ άλλα χαρακτηριστικά συµπτώµατα είναι υπογλυκαιµικές και µεταβολικές κρίσεις,
τάση για έµµετο, εγκεφαλοπάθεια, λήθαργος, κώµα ή ακόµα και θάνατος [13].
Η σύγχρονη θεραπευτική αντιµετώπιση της MCADD περιλαµβάνει αποφυγή νηστείας, δίαιτα πλούσια σε υδατάνθρακες και περιορισµένη σε
λίπη. Επίσης, απαραίτητη προϋπόθεση είναι η κατανάλωση τακτικών γευµάτων κατά τη διάρκεια της ηµέρας ενώ πρέπει να αποφεύγεται η
νηστεία κατά τη διάρκεια της νύχτας. Παρόλα αυτά, πρέπει να διευκρινιστεί ότι οποιαδήποτε θεραπεία δεν προλαµβάνει 100% τις
νευρολογικές διαταραχές. Ο περιορισµός στην κατανάλωση λίπους είναι αναγκαίος και κυρίως όταν ταυτόχρονα υπάρχει κάποια µόλυνση.
Επίσης, σε καταστάσεις που τα επίπεδα της καρνιτίνης στο αίµα είναι χαµηλά, η χορήγηση σκευασµάτων L-καρνιτίνης είναι αρκετά ωφέλιµη
[17].
ΜΕΘΟ∆ΟΙ ΓΙΑ ΤΗ ∆ΙΑΓΝΩΣΗ PKU και MCADD
Αρχικά, η διάγνωση της PKU επραγµατοποιείτο µέσω του προσδιορισµού των επιπέδων του φαινυλοπυροσταφυλικού οξέος στα ούρα [18].
Ωστόσο, σύντοµα αντικαταστάθηκε από µία ηµι-ποσοτική µέθοδο προσδιορισµού φαινυλαλανίνης µέσω βακτηριακής αναστολής, η οποία
ήταν η πρώτη µέθοδος που εφαρµόστηκε ευρέως για το νεογνικό έλεγχο της PKU σε δείγµατα αίµατος που βρίσκονταν υπό µορφή
αποξηραµένης κηλίδας (Guthrie test) [19]. Στη συνέχεια, αναπτύχθηκαν φθορισµοµετρικές όσο και ενζυµικές µέθοδοι, οι οποίες βασίζονταν
στον προσδιορισµό της φαινυλαλανίνης. Οι µέθοδοι αυτές, εµφάνιζαν σχετικά υψηλά ποσοστά ψευδώς θετικών αποτελεσµάτων [20-22] και
ήταν αρκετά χρονοβόρες. Επιπλέον, αναπτύχθηκαν χρωµατογραφικές µέθοδοι για την ταυτόχρονη ανίχνευση φαινυλαλανίνης και τυροσίνης
[23-25]. Ο προσδιορισµός των συγκεντρώσεων των δύο αυτών αµινοξέων καθώς και η χρήση του λόγου Phe προς Tyr ως επιπλέον δείκτη για
τη διάγνωση της PKU, περιόρισε σηµαντικά τα ψευδώς θετικά αποτελέσµατα που εµφανίζονταν όταν η διάγνωση βασιζόταν µόνο στον
προσδιορισµό των επιπέδων φαινυλαλανίνης. Οι περισσότερες από τις χρωµατογραφικές µεθόδους απαιτούν παραγωγοποίηση των αµινοξέων,
πριν ή µετά το διαχωρισµό τους στη στήλη, χρησιµοποιώντας διάφορα αντιδραστήρια ανάλογα µε το είδος της ανίχνευσης, µε αποτέλεσµα να
αθίσταται κοπιώδης η προετοιµασία του δείγµατος.
Τα τελευταία χρόνια, η εισαγωγή της φασµατοµετρίας µαζών συνέβαλε στην αύξηση της ευαισθησίας καθώς και στη µείωση του χρόνου
ανάλυσης συγκριτικά µε τις προϋπάρχουσες µεθόδους. Η πλειοψηφία των MS µεθόδων απαιτούν παραγωγοποίηση πριν την ανάλυση των
δειγµάτων [26-28]. Ωστόσο, τα προβλήµατα που µπορεί να παρουσιαστούν κατά την παραγωγοποίηση των δειγµάτων, οδήγησαν στην
ανάπτυξη µεθόδου MS για την ανάλυση αµινοξέων χωρίς τη χρήση αντιδραστηρίων παραγωγοποίησης [29]. Στην µέθοδο αυτή, ο
υπολογισµός των συγκεντρώσεων των αµινοξέων πραγµατοποιείται βάσει του σήµατος του πρώτου θυγατρικού ιόντος, ώστε να αποφευχθούν
ψευδώς θετικά αποτελέσµατα λόγω της πιθανής ύπαρξης ισοβαρών ουσιών ή ιόντων µε το ίδιο m/z στο δείγµα. Το σήµα στην περίπτωση αυτή
είναι εν γένει σηµαντικά χαµηλότερο ως προς το σήµα του προδρόµου ιόντος, µε αποτέλεσµα η µέθοδος να έχει µειωµένη ευαισθησία.
Τεύχος 8
6
Συλλογή δειγµάτων
Αποξηραµένες κηλίδες αίµατος ενηλίκων εθελοντών σε απορροφητικό χαρτί χορηγήθηκαν
ανώνυµα από το ιατρείο του Ε.Κ.Ε.Φ.Ε. «∆ηµόκριτος» για προκαταρκτική αξιολόγηση της
µεθόδου. Αποξηραµένες κηλίδες αίµατος νεογνών σε απορροφητικό χαρτί χορηγήθηκαν από το
Μαιευτήριο Λητώ, µε τη σύµφωνη γραπτή γνώµη των γονέων και έγκριση από την επιστηµονική
επιτροπή του µαιευτηρίου. Η λήψη των δειγµάτων έγινε από την πτέρνα των νεογνών µέχρι και 72
ώρες µετά τη γέννησή τους. Οι κηλίδες ξηράνθηκαν επί 4 ώρες σε θερµοκρασία δωµατίου και στη
συνέχεια φυλάχθηκαν σε ξηραντήρα στους - 20 οC, έως την ανάλυση τους.
Παρασκευή προτύπων δειγµάτων και δειγµάτων ελέγχου
Με φυγοκέντρηση ολικού αίµατος από εθελοντή ενήλικα, παρελήφθησαν τα ερυθροκύτταρα, τα
οποία εν συνεχεία εκπλύθηκαν µε φυσιολογικό ορό.
Τα πρότυπα δείγµατα και τα δείγµατα ελέγχου παρασκευάστηκαν µε ανάµειξη ερυθροκυττάρων µε
κατάλληλες ποσότητες ανθρώπινου ορού που περιείχε γνωστές συγκεντρώσεις των προς µέτρηση
ουσίων, ώστε να αντιστοιχούν σε αίµα µε αιµατοκρίτη 50-55%. Κηλίδες αίµατος των προτύπων δειγµάτων εναποτέθηκαν σε ειδικό
απορροφητικό χαρτί, ξηράνθηκαν και φυλάχθηκαν όπως και τα δείγµατα.
∆ιαδικασία ανάλυσης
∆ισκία αποξηραµένων σταγόνων αίµατος σε χαρτί, διαµέτρου 6,4 mm τοποθετήθηκαν στα πλακίδια µικροτιτλοδότησης 96 φρεατίων. Σε κάθε
φρεάτιο προστέθηκαν 400 µL µεθανόλης και τα δείγµατα ανακινήθηκαν σε οριζόντιο αναδευτήρα επί 20 min στις 250 rpm και στη συνέχεια
τοποθετήθηκαν επί 20 min σε συσκευή υπερήχων. Κατόπιν, από κάθε φρεάτιο ελήφθησαν 300 µL του υπερκειµένου και εξατµίσθηκαν υπό
συνεχή ροή N2. Ακολούθησε ανασύσταση του ξηρού υπολείµµατος µε 50 µL Η2Ο:ACN, v/v, 1:1 ανά φρεάτιο. Για την ανάλυση των
προτύπων δειγµάτων και των δειγµάτων νεογνών µε HPLC-MS/MS, ενέθηκαν 5 µL δείγµατος, η ροή των διαλυτών ήταν 0,2 mL/min, ενώ η
βαθµίδωση των διαλυτών που χρησιµοποιήθηκε περιγράφεται στο Κεφάλαιο «Αποτελέσµατα-Συζήτηση».
ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ-ΣΥΖΗΤΗΣΗ
Στo πλαίσιo της εργασίας βελτιστοποιήθηκαν όλες οι παράµετροι που αφορούν την ανίχνευση των ουσιών µε το φασµατογράφο µάζας ΜS/
MS ώστε να λαµβάνεται µέγιστο σήµα για κάθε µία από τις προς ανάλυση ουσίες.
Η µελέτη των παραµέτρων ανίχνευσης των προς µέτρηση ουσιών σε λειτουργία θετικού ιοντισµού ηλεκτροψεκασµού (ESI),
πραγµατοποιήθηκε µε απευθείας έγχυση προτύπων διαλυµάτων των ουσιών στο MS/MS. ∆οκιµάστηκαν διαφορετικές ενέργειες ιοντισµού και
θραυσµατοποίησης και προσδιορίστηκαν οι µεταβάσεις των ιόντων για την ανάλυση των ουσιών. Οι µεταβάσεις των ιόντων που βρέθηκαν
ταυτίζονταν µε τις αναφερόµενες στη βιβλιογραφία και παρουσιάζονται στον Πίνακα 1 µαζί µε τις βέλτιστες συνθήκες θραυσµατοποίησης και
ιοντισµού για την κάθε ουσία.
Πίνακας 1. Μεταβάσεις ιόντων φαινυλαλανίνης, τυροσίνης, ακετυλοκαρνιτίνης, ακυλοκαρνιτινών και παράµετροι ανίχνευσης για το MS/MS.
ΕΛΛΗΝΙΚΗ ΕΤΑΙΡΙΑ ΚΛΙΝΙΚΗΣ ΧΗΜΕΙΑΣ-
ΚΛΙΝΙΚΗΣ ΒΙΟΧΗΜΕΙΑΣ
Αλωπεκής 47, 10676 Αθήνα
τηλ. επικ. 2103645751, fax 2103645392
7
Για τον χρωµατογραφικό διαχωρισµό των ουσιών δοκιµάστηκαν διάφορα µίγµατα διαλυτών τόσο µε ισοκρατική όσο και µε βαθµιδωτή
έκλουση καθώς και διαφορετικές ταχύτητες ροής. Η σύσταση των διαλυτών της κινητής φάσης που χρησιµοποιήθηκε στο τελικό πρωτόκολλο
ήταν 0,4 mM επτα-φθορο-βουτυρικό οξύ (HFBA) σε Η2Ο (διαλύτης Α) και 0,1% HCOOH σε ACN (∆ιαλύτης Β). H ροή των διαλυτών ήταν
0,2 mL/min. Για το διαχωρισµό των ουσιών στη στήλη πραγµατοποιήθηκε βαθµιδωτή αλλαγή των διαλυτών από 100:0 Α:Β, έπειτα γραµµική
µεταβολή σε 40:60 Α:Β στα 2,50 λεπτά, γραµµική µεταβολή σε Α:Β Η2Ο÷ACN στα 3 λεπτά και επαναφορά στην αρχική σύσταση, 100:0
Α:Β, στα 4 λεπτά. Ακολούθησε εξισσορόπηση της στήλης για ένα λεπτό. Όπως φαίνεται στο Σχήµα 7, όπου παρουσιάζεται το
χρωµατογράφηµα προτύπου δείγµατος, µε τις συνθήκες που επιλέχθηκαν επιτυγχάνεται πλήρης διαχωρισµός των προς µέτρηση ουσιών.
Σχήµα 7: Χρωµατογράφηµα προτύπου δείγµατος
ΑΝΑΛΥΣΗ ∆ΕΙΓΜΑΤΩΝ
Για τον προσδιορισµό των ουσιών σε αποξηραµένες κηλίδες αίµατος απαιτείται έκλουση των ουσιών απο την κηλίδα µε κατάλληλο διαλύτη
σε συνδυασµό µε υπερήχους, µεταφορά του υπερκειµένου σε άλλο σωλήνα, ξήρανση και ανασύσταση σε µίγµα ACN-H2O ώστε να µην
επηρεαστεί η σύσταση της κινητής φάσης. η όλη διαδικασία θα πρέπει να έχει ως αποτέλεσµα τη µέγιστη δυνατή ανάκτηση των προς µέτρηση
ουσιών απο την κηλίδα. Η βέλτιστη διαδικασία περιελάµβανε εκχύλιση των δειγµάτων µε MeOH υπό ανάδευση 20 λεπτών ακολουθούµενη
από έκθεση των δειγµάτων σε υπερήχους επί 20 λεπτά, ξήρανση και ανασύστασή τους µε µίγµα ACN:Η2Ο 30:70 v/v. Υπό αυτές τις συνθήκες,
το ποσοστό ανάκτησης που προσδιορίστηκε για την κάθε ουσία µε χρήση κηλίδων αίµατος στις οποίες είχαν προστεθεί γνωστές
συγκεντρώσεις δευτεριωµένων ουσιών ήταν υψηλότερο απο 85 % για όλες τις ουσίες.
Οι µέθοδοι που βασίζονται στην απευθείας έγχυση του δείγµατος στο φασµατογράφο µάζας είναι κυρίως ηµι-ποσοτικές, ο δε προσδιορισµός
των προς µέτρηση ουσιών βασίζεται στο λόγο του σήµατος που παρέχεται απο την κάθε ουσία προς το σήµα της αντίστοιχης δευτεριωµένης
ουσίας που προστίθεται στο διάλυµα έγχυσης σε σταθερή συγκέντρωση. Στην παρούσα µελέτη, έχοντας ως στόχο την ανάπτυξη ποσοτικής
µεθόδου πέραν της προσθήκης δευτεριωµένων ουσιών, παρασκευάστηκε σειρά προτύπων δειγµάτων των ουσιών σε αποξηραµένες κηλίδες
αίµατος. Για την ανάλυση των ουσιών χρησιµοποιήθηκαν κηλίδες διαµέτρου 6.4 mm ενώ ο όγκος του δείγµατος έγχυσης ήταν 5 µL.
ΑΝΑΛΥΤΙΚΑ ΧΑΡΑΚΤΗΡΙΣΤΙΚΑ Για την εκτίµηση της γραµµικότητας της αναπτυχθείσας µεθόδου παρασκευάστηκαν επτά πρότυπα δείγµατα αποξηραµένων κηλίδων αίµατος
που αντιστοιχούσαν σε µία ευρεία περιοχή συγκεντρώσεων ως προς τον κάθε αναλύτη. Τα πρότυπα αυτά δείγµατα αναλύθηκαν µε την
αναπτυχθείσα µέθοδο και υπολογίστηκε το εµβαδό της επιφάνειας της χρωµατογραφικής κορυφής που αντιστοιχούσε σε κάθε αναλύτη. Για
την κατασκευή της καµπύλης βαθµονόµησης αφαιρέθηκε η τιµή της µηδενικής συγκέντρωσης από τις τιµές των υπολοίπων προτύπων
δειγµάτων και οι καθαρές τιµές που ελήφθησαν για κάθε αναλύτη αντιστοιχήθηκαν µε τη συγκέντρωσή του στο πρότυπο δείγµα. Οι καµπύλες
βαθµονόµησης (Σχήµα 8) ήταν γραµµικές για συγκεντρώσεις από 24 έως 800 µmol/L για την Phe και την Tyr, από 3 έως 100 µmol/L για την
C2 και από 0,1 έως 10 µmol/L για τις C6, C8 και C10 µε συντελεστές συσχέτισης r2 ≥ 0.998. Η γραµµική περιοχή απόκρισης καλύπτει τόσο τη
φυσιολογική περιοχή συγκεντρώσεων όσο και τις συγκεντρώσεις που µπορεί να προσδιοριστούν σε δείγµατα ασθενών µε PKU ή MCADD.
Τεύχος 8
8
Τα όρια ανίχνευσης και ποσοτικοποίησης είναι αρκετά χαµηλότερα από τις συγκεντρώσεις των αναλυτών σε δείγµατα µη ασθενών και
εποµένως η ευαισθησία της µεθόδου κρίνεται επαρκής για την ανάλυση πραγµατικών δειγµάτων.
Για τον έλεγχο της ακρίβειας της αναπτυχθείσας µεθόδου, πραγµατοποιήθηκαν πειράµατα ανάκτησης για όλες τις προς µέτρηση ουσίες σε
δείγµατα αίµατος. Βρέθηκε ότι η εκατοστιαία ανάκτηση για την Phe κυµαινόταν από 96 έως 105%, για την Tyr από 97-105%, ενώ για τις C2,
C6, C8, και C10 από 93 έως 109%. Σε όλες τις περιπτώσεις, η ανάκτηση των εξωγενώς προστιθέµενων ουσιών ήταν στα όρια (85-115%) που
απαιτούνται για να χαρακτηριστεί µία µέθοδος ακριβής και αξιόπιστη.
Η ειδικότητα της µεθόδου αξιολογήθηκε συγκρίνοντας τους λόγους σήµατος προδρόµου ιόντος προς θυγατρικό ιόν που προσδιορίστηκαν για
τα πρότυπα διαλύµατα των προς µέτρηση ουσιών σε H2O, τα πρότυπα δείγµατα και τα δείγµατα νεογνών.
Τα αποτελέσµατα έδειξαν ότι δεν υπήρχε αξιοσηµείωτη διαφορά µεταξύ των 3 διαφορετικών µητρών δείγµατος, γεγονός που υποδεικνύει ότι
δεν υπάρχουν παρεµβολές στο σήµα από τα συστατικά της µήτρας του δείγµατος. Εποµένως, η µέθοδος έχει υψηλή ειδικότητα όσον αφορά
τον προσδιορισµό των συγκεκριµένων αναλυτών σε δείγµατα αποξηραµένων κηλίδων αίµατος νεογνών.
0 2 4 6 8 100
5
10
15
20
25
30
Εµ
βα
δόν κ
ορ
υφ
ής
Συγκέντρωση οκτανοϋλο-καρνιτίνης (µmol/L)
ΕΛΛΗΝΙΚΗ ΕΤΑΙΡΙΑ ΚΛΙΝΙΚΗΣ ΧΗΜΕΙΑΣ-
ΚΛΙΝΙΚΗΣ ΒΙΟΧΗΜΕΙΑΣ
Αλωπεκής 47, 10676 Αθήνα
τηλ. επικ. 2103645751, fax 2103645392
0 200 400 600 8000
100
200
300
400
500
600
700
Εµ
βα
δό
ν κ
ορ
υφ
ής
Συγκέντρωση Φαινυλαλανίνης (µmol/L)
0 200 400 600 8000
20
40
60
80
100
120
Εµ
βα
δό
ν κ
ορ
υφ
ής
Συγκέντρωση Τυροσίνης (µmol/L)
0 20 40 60 80 1000
50
100
150
200
250
Eµ
βα
δόν κ
ορ
υφ
ής
Συγκέντρωση Ακετυλο-καρνιτίνης (µmol/L)
0 2 4 6 8 100
2
4
6
8
10
12
14
16
18
Εµ
βα
δόν κ
ορ
υφ
ής
Συγκέντρωση εξανοϋλο-καρνιτίνης (µmol/L)
0 2 4 6 8 100
5
10
15
20
25
30
35
Εµ
βα
δόν κ
ορ
υφ
ής
Συγκέντρωση δεκανοϋλο-καρνιτίνης (µmol/L)
Σχήµα 8: Ενδεικτικές καµπύλες βαθµονόµησης των προς µέτρηση ουσιών. Κάθε σηµείο είναι η µέση τιµή των δύο µετρήσεων
± SD
9
Το όριο ανίχνευσης, το όριο ποσοτικοποίησης καθώς και η ενδο- και δι- αναλυτική διακύµανση για όλες τις προς µέτρηση ουσίες
παρουσιάζονται στον Πίνακα 2.
Πίνακας 2: Όρια ανίχνευσης, ποσοτικοποίησης, ενδο- και δι-αναλυτική διακύµανση των προς µέτρηση ουσιών
Για τον προσδιορισµό του ορίου κατωφλίου για την καθεµία από τις ουσίες το οποίο αντιστοιχεί στη συγκέντρωση που διαχωρίζει τους
πάσχοντες από τους µη πάσχοντες, αναλύθηκαν 450 δείγµατα νεογνών. Για το σκοπό αυτό, αναλύθηκαν µε την αναπτυχθείσα µέθοδο
αποξηραµένες κηλίδες αίµατος νεογνών σε απορροφητικό χαρτί που χορηγήθηκαν από το Μαιευτήριο Λητώ µε τη συγκατάθεση των γονέων
και µετά από έγκριση από την επιστηµονική επιτροπή του µαιευτηρίου. Από τις τιµές που ελήφθησαν για τα 450 δείγµατα, προσδιορίστηκαν η
ελάχιστη τιµή, η µέγιστη τιµή, η διάµεσος τιµή καθώς και η µέση τιµή και η τυπική απόκλιση των µετρήσεων που αντιστοιχούσαν στο σύνολο
των δειγµάτων. Το όριο κατωφλίου υπολογίστηκε ως η µέση τιµή 450 δειγµάτων συν 2 φορές την τυπική απόκλιση. Τα όρια που
προσδιορίστηκαν παρουσιάζονται στον Πίνακα 3.
Πίνακας 3: Τιµές ορίων κατωφλίου για τις προς µέτρηση ουσίες
Τα όρια κατωφλίου που υπολογίστηκαν από την ανάλυση των 450 δειγµάτων ήταν εντός του εύρους των ορίων κατωφλίου που έχουν
αναφερθεί στη βιβλιογραφία για όλες τις ουσίες [111].
Η µέθοδος συγκρίθηκε επιπλέον µε µία εµπορικά διαθέσιµη συσκευασία (MassChrom® Amino Acids and Acylcarnitines from Dried Blood
kit,Chromsystems) για τον ηµιποσοτικό προσδιορισµό των ουσιών που αφορούν τόσο την PKU όσο και την MCADD, µέσω της ανάλυσης των
450 δειγµάτων. Ο προσδιορισµός των ουσιών µέσω της εµπορικής συσκευασίας βασίζεται στη χρήση εσωτερικών προτύπων, είναι
ηµιποσοστικός ενώ η διάκριση µεταξύ πασχόντων και φυσιολογικών επιτυγχάνεται βάσει της τιµής δείγµατος ελέγχου που περιλαµβάνεται
στη συσκευασία και του οποίου η συγκέντρωση για κάθε ουσία αντιστοιχεί στις τιµές κατωφλίου. Στο Σχήµα 9 παρουσιάζονται τα
ιστογράµµατα συχνοτήτων των τιµών που ελήφθησαν για 450 δείγµατα και µε τις δύο µεθόδους και όπως φαίνεται, οι τιµές που
προσδιορίστηκαν για όλους τους αναλύτες ήταν παρεµφερείς.
Τεύχος 8
10
ΕΛΛΗΝΙΚΗ ΕΤΑΙΡΙΑ ΚΛΙΝΙΚΗΣ ΧΗΜΕΙΑΣ-
ΚΛΙΝΙΚΗΣ ΒΙΟΧΗΜΕΙΑΣ
Αλωπεκής 47, 10676 Αθήνα
τηλ. επικ. 2103645751, fax 2103645392
Σχήµα 9: Ιστογράµµατα συγκεντρώσεων των Phe, Tyr, C2, C6, C8, και C10 που προέκυψαν από ανάλυση 450 δειγµάτων νεογνών. Οι
συµπαγείς ράβδοι αντιπροσωπεύουν τις συγκεντρώσεις των δειγµάτων που προσδιορίστηκαν µε την αναπτυχθείσα µέθοδο, ενώ οι γραµµές
αντιπροσωπεύουν τις συγκεντρώσεις των ίδιων δειγµάτων που προσδιορίστηκαν µε την εµπορική συσκευασία. Οι κάθετες γραµµές
υποδεικνύουν το όριο κατωφλίου.
Eπιπλέον, προκειµένου να αξιολογηθεί η αναπτυχθείσα µέθοδος και από έναν εξωτερικό φορέα, το εργαστήριο έγινε µέλος του Newborn
Screening Quality Assurance Program του Centers for Disease Control and Prevention (CDC) και τα δείγµατα που εστάλησαν αναλύθηκαν µε
την αναπτυχθείσα µέθοδο. Από τα αποτελέσµατα προέκυψε ότι οι τιµές που προσδιορίστηκαν ήταν εντός των αναµενοµένων ορίων σύµφωνα
µε τα στατιστικά στοιχεία που παρέχονται στην αναφορά αυτού του οργανισµού ενώ η ενδοαναλυτική και η διαναλυτική διακύµανση ήταν
µικρότερες του 10% για όλες τις ουσίες.
11
ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ Στην παρούσα εργασία αναπτύχθηκε για πρώτη φορά µέθοδος HPLC-MS/MS, χωρίς παραγωγοποίηση, για τον ταυτόχρονο ποσοτικό
προσδιορισµό Phe, Tyr καθώς και C2, C6, C8 και C10 σε αποξηραµένες κηλίδες αίµατος νεογνών µε στόχο την ταυτόχρονη διάγνωση της PKU
και της MCADD.
Ο διαχωρισµός των αναλυτών µέσω HPLC, οδήγησε στην εξάλειψη παρεµβολών από τη βιολογική µήτρα. ∆ιαπιστώθηκε ότι υπήρχε υψηλή
Περαιτέρω λεπτοµέρειες των διαρθρωτικών µεταβάσεων προέκυψαν από µελέτες που χρησιµοποίησαν φθορισµό, φασµατοσκοπία IR, NMR
και φασµατοµετρία µάζας. Τα αποτελέσµατα αυτών των µελετών παρέχουν περαιτέρω λεπτοµέρειες στις δοµικές µεταβάσεις των άκρων, στον
ελεύθερο υποδοχέα έναντι του τριαδικού συµπλόκου. Υπάρχουν διακριτές δοµικές µεταβολές γύρω από τον δεσµευµένο αγωνιστή και
εκτεταµένος επαναπροσανατολισµός των διαµεµβρανικών ελίκων.
Όπως και σε άλλες πρωτεΐνες που µεταδίδουν πληροφορίες εξ αποστάσεως, ένα ελικοειδές πλαίσιο ενισχύει µια µικρή διαµορφωτική αλλαγή
που συµβαίνει στο ένα άκρο της πρωτεΐνης σε µια πολύ µεγαλύτερη διαµορφωτική αλλαγή στο άλλο άκρο. Οι έλικες είναι ραβδοειδές δοµές,
και θα µπορούσε κανείς να φανταστεί ένα 7ΤΜ υποδοχέα σαν µια οµάδα ράβδων βυθισµένη στη µεµβράνη. Εάν ένα πρόσδεµα δεθεί στο ένα
άκρο, η οµάδα ανοίγει σαν ένα µπουκέτο τριαντάφυλλα στο άλλο άκρο. Μικρές µεταβολές στο δίκτυο των αλληλεπιδράσεων της πλευρικής
αλυσίδας γύρω από τη θέση δέσµευσης του αγωνιστή µεταδίδονται σε µεγαλύτερες δοµικές αλλαγές στην ενδοκυττάρια πλευρά. Αυτό ανοίγει
µια θέση σύνδεσης για την πρωτεΐνη G και αποτελεί ένα σήµα που µεταδίδεται από το εξωτερικό προς το εσωτερικό του κυττάρου.
ΣΧΗΜΑ 4 Η δοµική βάση του µηχανισµού
σηµατοδότησης των GPCR. Μη ενεργοποιηµένος
βAR (2bar.pdb) φαίνεται αριστερά, και
ενεργοποιηµένος βAR συνδεδεµένος µε πρόσδεµα
και πρωτεΐνη G (3sn6.pdb) δεξιά. Στην κορυφή, ο
υποδοχέας στην µεµβράνη απεικονίζεται µε µπλε
κορδέλα που ιχνηλατεί τον σκελετό. Η κάτω εικόνα
είναι από το εσωτερικό της κυτταρικής µεµβράνης,
µε τον υποδοχέα να φαίνεται µε τρισδιάστατο
µοντέλο µε τις υδρόφοβες πλευρικές αλυσίδες να
απεικονίζονται µε σκούρο µπλε
19
ΕΛΛΗΝΙΚΗ ΕΤΑΙΡΙΑ ΚΛΙΝΙΚΗΣ ΧΗΜΕΙΑΣ-
ΚΛΙΝΙΚΗΣ ΒΙΟΧΗΜΕΙΑΣ
Αλωπεκής 47, 10676 Αθήνα
τηλ. επικ. 2103645751, fax 2103645392
Μια υψηλής ανάλυσης δοµή ενός ενεργού τριµερούς συµπλόκου, βρέθηκε πρόσφατα από τον Kobilka και τους συνεργάτες του. Αυτή η δοµή
του βAR σε σύζευξη µε ετεροτριµερή G-πρωτεΐνη και αγωνιστή, µας παρέχει µια πιο λεπτοµερή µατιά στη δοµική µετάβαση που διέπει το
µηχανισµό ενεργοποίησης µέσω της σύγκρισης µε το µη ενεργοποιηµένο υποδοχέα. Οι µικρές διαρθρωτικές αλλαγές γύρω από το πρόσδεµα
διαδίδονται στο εσωτερικό µε πολύ εντονότερη διαρθρωτική µετάβαση από ό,τι αναµενόταν. Υπάρχει µια µεγάλη µετατόπιση της έλικας 6 και
ένα άνοιγµα µιας βαθιάς υδρόφοβης σχισµής στην ενδοκυττάρια πλευρά του υποδοχέα (Σχήµα 4). Η C-τελική έλικα του Gα εισχωρεί σε αυτή
τη σχισµή και αυτό οδηγεί σε µεγάλες δοµικές αλλαγές στην πρωτεΐνη G, η οποία µε τον τρόπο αυτό ενεργοποιείται. Οι δοµικές αλλαγές
προκύπτουν από την αναδιάταξη του δικτύου των αλληλεπιδράσεων στον υποδοχέα.
Οι εκλεπτυσµένες εξελίξεις στη µοριακή βιολογία των τελευταίων ετών µας έδωσε την ικανότητα να κατασκευαστεί ένα σχετικά σταθερό
τριαδικό σύµπλοκο. Η εγγενής αστάθεια του συµπλόκου του υποδοχέα και της πρωτεΐνης G παρουσίασε µια σηµαντική πρόκληση. Το
σύµπλοκο είναι βραχύβιο, επιτρέποντας πολλές αλλαγές στην ενεργοποίηση της πρωτεΐνης G για κάθε σύνδεση µε πρόσδεµα.
Ένα µακρόβιο τριαδικό σύµπλοκο κατάλληλο για κρυστάλλωση προέκυψε από τον συνδυασµό πέντε βιοχηµικών στρατηγικών: επεξεργασία
µε απυράση του συµπλόκου µε GDP-δεσµευµένη µε πρωτεϊνη G, σταθεροποίηση του συµπλόκου χρησιµοποιώντας ένα πρόσφατα
αναπτυγµένο απορρυπαντικό, επιλογή ενός αντισώµατος καµελίδης - ενός νανοσωµατίδιου που σταθεροποιεί τη Gβ-υποµονάδα σε µια καλά
καθορισµένη χωροδιάταξη -, οµοιοπολική σύζευξη αγωνιστή, και την κλωνοποίηση της Τ4-λυσοζύµης εντός του βρόχου µεταξύ της έλικας 5
και 6 ώστε να µειωθεί η κινητικότητα του. Μελέτες ανταλλαγής ισοτόπων του µη τροποποιηµένου συµπλόκου σε συνδυασµό µε
φασµατοµετρία µάζας, δείχνουν ότι η δοµή του υποδοχέα στο τριαδικό σύµπλοκο είναι ουσιαστικά η ίδια όπως σε ένα µη τροποποιηµένο
σύµπλοκο.
Νεότερες δοµές
Η πρώτη φορά που απεικονίστηκε ένας υποδοχέας 7ΤΜ ήταν η δοµή της ροδοψίνης που βρέθηκε από τους Gebhard Schertler και Richard
Henderson χρησιµοποιώντας µικροσκόπιο κρυο-ηλεκτρονίων, που δείχνει τις επτά α-έλικες στην µεµβράνη. Για να επιτευχθεί υψηλότερη
ανάλυση αλλά και τρισδιάστατες δοµές, ο Tetsuji Okada και οι συνεργάτες του ανέπτυξαν µια στρατηγική καθαρισµού που οδήγησε σε καλώς
περιθλασµένους κρυστάλλους. Οι Krzysztof Palczewski και Okada έλυσαν την τρισδιάστατη δοµή της µη ενεργοποιηµένης ροδοψίνης,
παρέχοντας µια πιο λεπτοµερή άποψη των ελίκων στη µεµβράνη και τους βρόχους.
Η πραγµατοποίηση κρυσταλλογραφικών µελετών ενεργοποιηµένων από πρόσδεµα GPCRs απουσία αγωνιστή αποτελούσε µια πρόκληση
λόγω της σηµαντικής κινητικότητας των υποδοχέων. Ο Kobilka απάντησε σε αυτή την πρόκληση µαζί µε τον Gebhard Schertler και τον
Raymond Stevens χρησιµοποιώντας αντισώµατα, κλωνοποίηση και προσθήκη χοληστερόλης. Σε αυτή τη δοµή, οι έλικες του υποδοχέα είναι
περισσότερο παράλληλες σε σχέση µε το τριαδικό σύµπλοκο, και το ενδοκυττάριο µέρος του υποδοχέα δεν παρουσιάζει καµία µεγάλη
υδρόφοβη επιφάνεια (Σχήµα 4). Η µη-ενεργοποιηµένη δοµή βAR διαφέρει από αυτή της ροδοψίνης στην περιοχή σύνδεσης µε το πρόσδεµα
και σε άλλες περιοχές που παρουσιάζουν ασθενέστερες αλληλεπιδράσεις µεταξύ των κυτταροπλασµατικών άκρων των ελίκων 3 και 6.
Ο Klaus Peter Hofmann παρουσίασε κρυσταλλικές δοµές της οψίνης και της οψίνης δεσµευµένης µε θραύσµα πεπτιδίου από την πρωτεΐνη G
τρανσδουσίνης. Αυτές οι δοµές της ροδοψίνης χωρίς προσδέµατα παρουσιάζουν ένα µερικώς ενεργοποιηµένο υποδοχέα, µε µετατοπισµένη
κλίση και περιστροφή της έλικας 6 και µε σύνδεση του πεπτιδίου G σε µια σχισµή στην ενδοκυττάρια πλευρά.
Ο Kobilka βρήκε την κρυσταλλική δοµή του βAR αγωνιστή συζευγµένου µε ένα νανοσωµατίδιο ως υποκατάστατο για τη G-πρωτεΐνη. Οι
διαρθρωτικές µεταβολές σε σχέση µε τον ανενεργό βAR είναι εντυπωσιακά όµοιες µε τις διαρθρωτικές αλλαγές της οψίνης σε σχέση µε τη
ροδοψίνη. Τα ευρήµατα αυτά εξάλειψαν τον τεχνητό διαχωρισµό ανάµεσα στους υποδοχείς που έχουν ενεργοποιηθεί από πρόσδεµα και
αυτούς που έχουν ενεργοποιηθεί από φως, και ολοκληρώθηκε η δίοδος είχε ανοίξει το 1986 για ένα κοινό διαρθρωτικό πλαίσιο στους GPCRs.
Αυτές οι λεπτοµέρειες που προέρχονται από ροδοψίνη έχουν εµβαθύνει την κατανόηση στους ενεργοποιούµενους από προσδέµατα υποδοχείς,
και αντιστρόφως.
20
ΕΛΛΗΝΙΚΗ ΕΤΑΙΡΙΑ ΚΛΙΝΙΚΗΣ ΧΗΜΕΙΑΣ-
ΚΛΙΝΙΚΗΣ ΒΙΟΧΗΜΕΙΑΣ
Αλωπεκής 47, 10676 Αθήνα
τηλ. επικ. 2103645751, fax 2103645392
Οι αναστολείς έχουν µεγάλη φαρµακολογική αξία, και ο Sir James W. Black µοιράστηκε το Βραβείο Νόµπελ Φυσιολογίας & Ιατρικής 1988
για την ανακάλυψη της προπρανολόλης και της σιµετιδίνης, οι οποίες αναστέλλουν τον βAR και τον υποδοχέα της ισταµίνης Η2, αντίστοιχα.
Η προπανολόλη και τα παράγωγά της είναι β-αποκλειστές (β-blockers), που χρησιµοποιούνται στη θεραπεία καταστάσεων που περιλαµβάνουν
καρδιακά προβλήµατα και αυξηµένη αρτηριακή πίεση. Άλλες φαρµακευτικές ενώσεις είναι αγωνιστές, που ενεργοποιούν, για παράδειγµα,
τους υποδοχείς της ντοπαµίνης και της σεροτονίνης και ανακουφίζουν από τη νόσο του Parkinson, την ηµικρανία και νευροψυχιατρικές
καταστάσεις, ή είναι ανάστροφοι αγωνιστές, οι οποίοι εµποδίζουν τη βασική δραστηριότητα, για παράδειγµα, του υποδοχέα GABA που
εµπλέκεται στη µνήµη και τη µάθηση.
Η δοµή του τριαδικού συµπλόκου και µια σειρά από άλλες δοµές παρέχουν µια βάση για την φαρµακολογική ανάπτυξη φαρµάκων µε υψηλή
επιλεκτικότητα, αποτελεσµατικότητα και λίγες παρενέργειες. Οι βιοχηµικές στρατηγικές που αναπτύχθηκαν από τον Kobilka για τους βAR
καθιστούν δυνατή την παραγωγή κρυστάλλων καθώς και άλλων υποδοχέων 7ΤΜ. Αυτές οι τεχνικές έχουν ήδη υιοθετηθεί από άλλες οµάδες
µε σκοπό την παραγωγή κρυστάλλων και να δώσουν υψηλής ανάλυσης δοµές για πλήθος σηµαντικών, από φαρµακευτική άποψη, υποδοχέων.
Αριστερά: Ο Robert J. Lefkowitz (Born: 1943, Bew York, BY, USA, Affiliation at the time of the award: Howard Hughes Medical Institute, Duke University
Medical Center, Durham, BC, USA)
∆εξιά: Ο Brian K. Kobilka (Born: 1955, Little Falls, MB, USA, Affiliation at the time of the award: Stanford University School of Medicine, Stanford, CA, USA)
Το µοριακό σύστηµα και σηµατοδότηση ανεξάρτητη από G-πρωτεΐνες
Η GPCR σηµατοδότηση είναι ένα κοµψό µοριακό σύστηµα µε συστατικά που χρησιµοποιούνται ξανά και ξανά για πολλά είδη των σηµάτων.
Ο ίδιος υποδοχέας µπορεί επίσης να σηµατοδοτεί διαµέσου διαφορετικών ενδοκυττάριων οδών ανάλογα µε την ταυτότητα του δεσµευµένου
προσδέµατος. Αυτό οφείλεται στην σχετική ευελιξία του υποδοχέα στην µεµβράνη, η οποία επιτρέπει διαφορετικούς αγωνιστές ή
αντίστροφους αγωνιστές να σταθεροποιούν διαφορετικές ενεργές ή ανενεργές µορφές.
Ο Lefkowitz και οι συνεργάτες βρήκαν οδούς ανεξάρτητες από G-πρωτεΐνες, στις οποίες οι υποδοχείς 7ΤΜ σηµατοδοτούν στο εσωτερικό του
κυττάρου µέσω άλλων πρωτεϊνών, συµπεριλαµβανοµένων των αρρεστινών. Εποµένως, ο όρος «7TM» και όχι ο όρος «GPCR» είναι ο
προτιµώµενος για αυτήν την οικογένεια υποδοχέων. Το µονοπάτι σηµατοδότησης επιλέγεται µε βάση την ταυτότητα του προσδέµατος, και ο
ίδιος 7ΤΜ υποδοχέας µπορεί να εµπλέκεται τόσο στην σηµατοδότηση εξαρτωµένης από G-πρωτεΐνη, όσο και στην ανεξάρτητη από πρωτεΐνη
G . Στην τρέχουσα ορολογία, αυτό αναφέρεται ως «µεροληπτικά προσδέµατα». Η µικρή δοµική µεταβολή στην εξωκυττάρια πλευρά του
υποδοχέα είναι σηµαντική για την ικανότητα των µεροληπτικών προσδεµάτων, ώστε να επιλεχθεί ένα µονοπάτι ενεργοποίησης. Η απόκτηση
περισσότερων πληροφοριών σε αυτό το φαινόµενο και τη δοµική βάση της, θα βελτιώσει την φαρµακολογική εξειδίκευση και την
εκλεκτικότητα µονοπατιού των φαρµάκων που στοχεύουν τους υποδοχείς 7ΤΜ.
21 ΕΛΛΗΝΙΚΗ ΕΤΑΙΡΙΑ ΚΛΙΝΙΚΗΣ ΧΗΜΕΙΑΣ-
ΚΛΙΝΙΚΗΣ ΒΙΟΧΗΜΕΙΑΣ
Αλωπεκής 47, 10676 Αθήνα
τηλ. επικ. 2103645751, fax 2103645392
Η µοριακή σχεδίαση της σηµατοδότησης µέσω 7ΤΜ χρησιµοποιείται ακόµη πιο ευρέως από τη φύση. Οι εννέα αδρενεργικοί υποδοχείς
επιτρέπουν ένα µοναδικό φυσιολογικό σήµα της ενισχυµένης συγκέντρωσης επινεφρίνης στο αίµα για να προκαλέσουν διαφορετικές
επιδράσεις σε διάφορα όργανα. Όταν η επινεφρίνη συνδέεται µε τους υποδοχείς στην καρδιά και τους πνεύµονες γίνεται ενεργοποίηση, ενώ
όταν συνδέεται µε τους υποδοχείς στο έντερο γίνεται απενεργοποίηση της διαδικασίας της πέψης. Βιοχηµικές µελέτες των χιµαιρικών
αδρενεργικών υποδοχέων, κατασκευασµένων από µέρη ενός υποδοχέα ενεργοποίησης και µέρη από ένα υποδοχέα φθίνουσας ρύθµισης, έχουν
καθορίσει τα τµήµατα του υποδοχέα που είναι υπεύθυνα για τη δέσµευση προσδέµατος και την ενεργοποίηση της πρωτεΐνης G, αντιστοίχως.
Αυτό έχει εµβαθύνει το επίπεδο της κατανόησης µας στην ποικιλοµορφία του µηχανισµού σηµατοδότησης.
Οµοιοπολικός έναντι µη οµοιοπολικού συνδέτη
Η ροδοψίνη έχει κεντρικό ρόλο στην όραση. ∆ιαφέρει από πολλούς άλλους υποδοχείς 7ΤΜ στο ότι το πρόσδεµα του συνδέεται οµοιοπολικά.
Συνεπώς, η σηµατοδότηση καθίσταται ανεξάρτητη από τη συγκέντρωση του προσδέµατος, και αυτό επιτρέπει στη ροδοψίνη να ανταποκριθεί
σε έναν άλλο τύπο σήµατος: την εισροή του φωτός. Η προσρόφηση ενός φωτονίου µετατοπίζει τη χωροδιάταξη του αµφιβληστροειδούς από
το cis- στο trans-ισοµερές, η οποία προκαλεί µια διαµορφωτική µεταβολή στη ροδοψίνη. Η ενεργή διαµόρφωση ευνοείται από το trans-
ισοµερές, ενώ το cis-ισοµερές σταθεροποιεί την ανενεργή µορφή. Μέσα στο κύτταρο, οι λειτουργίες της ροδοψίνης µέσω µιας πρωτεΐνης G
(τρανσντουσίνης) φωσφοδιεστεράσης και κυκλικού GMP, µοιάζει µε τη σηµατοδότηση του βAR υποδοχέα µέσω πρωτεΐνης G, αδενυλικής
κυκλάσης και cAMP.
Ο κανονισµός των υποδοχέων 7ΤΜ
Πρέπει να υπάρχουν µηχανισµοί για την απενεργοποίηση και τη ρύθµιση του σήµατος από έναν ενεργό GPCR, ειδάλλως το σήµα γίνεται
µόνιµο. Ένα θεµελιώδες ερώτηµα είναι, ως εκ τούτου, ποιοι µοριακοί µηχανισµοί ρυθµίζουν και τερµατίζουν το σήµα;
Βιοχηµικές µελέτες που πραγµατοποιήθηκαν κατά τη διάρκεια της δεκαετίας του 1970 και του 1980 µας παρέχουν αρκετές απαντήσεις. Το
σήµα µπορεί να διακοπεί από τη διάσπαση του αγωνιστή, αλλά µπορεί επίσης να τερµατιστεί ή µειωθεί η ρύθµιση µέσω της βιοχηµικής
ρύθµισης του υποδοχέα. Η έκθεση σε πρόσδεµα µπορεί να οδηγήσει σε φθίνουσα ρύθµιση. Η φωσφορυλίωση του ενδοκυτταριού τµήµατος
καθιστά τον υποδοχέα λιγότερο ευαίσθητο στην συγκέντρωση του προσδέµατος ή στο φως. Με άλλα λόγια, ο υποδοχέας καθίσταται
απευαισθητοποιηµένος. Ειδικά ένζυµα διεξαγάγουν αυτή τη χηµική τροποποίηση, για παράδειγµα, οι β-αδρενεργικοί υποδοχείς κινασών και η
κινάση ροδοψίνης. Η φωσφορυλίωση αυξάνει τη συγγένεια του υποδοχέα για ρυθµιστικές πρωτεΐνες που ονοµάζονται αρρεστίνες, που
οδηγούν σε περαιτέρω φθίνουσα ρύθµιση. Ο Kobilka διαπίστωσε ότι η εσωτερικοποίηση µέσω ενδοκυττάρωσης και η ανακύκλωση των
υποδοχέων αποτελεί άλλο µηχανισµό για τη ρύθµιση της σηµατοδότησης του υποδοχέα.
Σε ορισµένες γενετικές ασθένειες, οι µεταλλάξεις προκαλούν βασική δραστικότητα υποδοχέα. Οι µελέτες αυτών των µεταλλάξεων από τον
Lefkowitz µας παρέχουν πληροφορίες για ποιες ενδοµοριακές αλληλεπιδράσεις διατηρούν το κανονικό υποδοχέα ανενεργό όταν απουσιάζει ο
δεσµευµένος αγωνιστής. Σε µία θέση αδρενεργικού υποδοχέα, ανακάλυψε ότι άλλα 19 αµινοξέα, εκτός από το φυσικό ένα, οδηγούν σε
αύξηση της δραστικότητας. Η δραστικότητα του υποδοχέα µπορεί επίσης να διαµορφώνεται από τη σύνδεση των υποδοχέων της µεµβράνης
για να σχηµατιστούν οµο-ή ετεροδιµερή ή υψηλότερες ακόµα διατάξεις.
Βιβλιογραφία
Takeda S, Kadowaki S, Haga T, Takaesu H, Mitaku S (2002) Identification of G protein-coupled receptor genes from the human genome sequence. FEBS Lett 520, 97-101.
Fredriksson R, Lagerström MC, Lundin L-G, Schiöth HB (2003) The G-Protein-Coupled Receptors in the Human Genome Form Five Main Families. Phylogenetic Analysis, Paralogon
Groups, and Fingerprints. Mol Pharmacol 63, 1256-1272.
Wald G (1933) Vitamin A in the retina. Bature 132, 316.
Langley JN (1901) Observation on the physiological action of extracts of the supra-renal bodies. J Physiol (London) 17, 231-256
Dale HH (1906) On some physiological actions of ergot. J Physiol (London) 34, 163-206.
Furchgott RF (1964) Receptor mechanisms. Annu Rev Pharmacol 4, 21-50.
Rall TW, Sutherland EW (1958) Formation of a cyclic adenine ribonucleotide by tissue particles. J Biol Chem 232, 1065-1076.
Walsh DA, Perkins JP, Krebs EG (1968) An adenosine 3’,5’-monophosphate-dependent protein kinase. J Biol Chem 243, 3763-3765.
Rodbell M, Birmbaumer L, Posh SL, Krans HM (1971) The glucagon-sensitive adenylyl-cyclase system in plasma membranes of rat liver. V. An obligatory role of guanyl-nucleotides
in glucagon action. J Biol Chem 246, 1877-1882.
Ross EM, Gilman AG (1977) Resolution of some components of adenylate cyclase necessary for catalytic activity. J Biol Chem 252, 6966-6969.
Gilman AG (1987) G proteins: transducers of receptor-generated signals. Annu Rev Biochem 56, 615-649. 11 (15)
Lefkowitz RJ, Roth J, Pricer W. Pastan I (1970) ACTH receptors in the adrenal: specific binding of ACTH-125I and its relation to adenylyl cyclase. Proc Batl Acad Sci USA 65, 745-
752.
22
ΕΛΛΗΝΙΚΗ ΕΤΑΙΡΙΑ ΚΛΙΝΙΚΗΣ ΧΗΜΕΙΑΣ-
ΚΛΙΝΙΚΗΣ ΒΙΟΧΗΜΕΙΑΣ
Αλωπεκής 47, 10676 Αθήνα
τηλ. επικ. 2103645751, fax 2103645392
Lefkowitz RJ, Roth J, Pastan I (1970) Radioreceptor assay for adrenocorticotropic hormone: new approach to assay of polypeptide hormones
in plasma. Science 170, 633-635.
Levitzki A, Atlas D, Steer ML (1974) The binding characteristics and number of beta-adrenergic receptors on the turkey erythrocyte. Proc Batl
Acad Sci USA 71, 2773-2776.
Lefkowitz RJ, Mukherjee C, Coverstone M, Caron M (1974) Stereospecific (3H)(minus)-alprenolol binding sites, beta-adrenergic receptors
and adenylate cyclase. Biochem Biophys Res Commun 60, 703-709.
Aurbach GD (1974) Beta-adrenergic receptor: strereospecific interaction of iodinated beta-blocking agent with high affinity site. Science 186,
1223-1224.
De Lean A, Stadel JM, Lefkowitz RL (1980) A ternary complex model explains the agonist-specific binding properties and the adenylate cy-
Το βραβείο Νόµπελ Ιατρικής / Φυσιολογίας 2012 απονεµήθηκε από κοινού στους Sir John Gurdon και Shinya Yamanaka για
την ανακάλυψη ότι «Ώριµα κύτταρα µπορούν να επαναπρογραµµατιστούν για να γίνουν πολυδύναµα».
Ο Sir John B.Curdon γεννήθηκε το 1933 στο Ηνωµένο Βασίλειο και ολοκλήρωσε τη διδακτορική του διατριβή στο
πανεπιστήµιο της Οξφόρδης το 1960 ενώ ήταν µεταδιδακτορικός ερευνητής στο Ινστιτούτο Τεχνολογίας της Καλιφόρνια.
Σήµερα είναι καθηγητής στο πανεπιστήµιο του Cambridge.
Στην οµιλία του κατά τη διάρκεια της απονοµής του βραβείου επισήµανε, ότι, αν και το βραβείο Νόµπελ έχει δοθεί πολλές
φορές από κοινού σε κάποιους ερευνητές, πρώτη φορά οι δύο ερευνητές δεν έχουν δουλέψει µαζί ή µε τα ίδια υλικά.
Επιπρόσθετα, είπε, είναι αξιοπερίεργο ότι τη χρονιά που έκανε την πρώτη του ανακάλυψη, το 1962, όταν απέδειξε ότι η
εξειδίκευση των κυττάρων είναι αναστρέψιµη, ήρθε στον κόσµο ο Dr. Shinya Yamanaka.
Ο Sir John Gurdon δούλευε µε αυγά ή έµβρυα βατράχων. ∆ουλεύοντας µε αγάπη και αυταπάρνηση στο αντικείµενο έρευνας
που επέλεξε, αγάπησε πρωτίστως τα πειραµατόζωά του και τόνισε ότι διαφέρουν από άλλα µικρά ζώα ενώ έχουν φιγουράρει σε
αρκετά έργα λογοτεχνίας. Ας µην ξεχνάµε – υπενθύµισε στο λόγο του - ότι οι « Βάτραχοι» του Αριστοφάνη κέρδισαν το πρώτο
βραβείο κωµωδίας το 405 π.χ..
Το 1962 σε ένα πείραµά του αντικατέστησε τον ανώριµο πυρήνα του κυττάρου σε ένα ωάριο ενός βατράχου µε τον πυρήνα από
ένα ώριµο εντερικό κύτταρο. Το τροποποιηµένο κύτταρο αυγών αναπτύχθηκε σε κανονικό γυρίνο. Έτσι διαπίστωσε ότι τα
κύτταρα διατηρούν το DNA που δεν χρησιµοποιούν και ότι η κυτταρική διαφοροποίηση δεν είναι «µονόδροµος».
Ο Dr Shinya Yamanaka, γεννήθηκε στην Osaka της Ιαπωνίας, απέκτησε το πτυχίο του το 1977 στο Πανεπιστήµιο του Κόµπε
και έλαβε το διδακτορικό του στο Πανεπιστήµιο της Osaka. Σήµερα είναι καθηγητής στο Πανεπιστήµιο του Κιότο και ανώτερος
ερευνητής στο Ινστιτούτο Gladstone.
Ο Yamanaka δουλεύοντας µε ποντίκια απέδειξε 40 χρόνια αργότερα ότι και τα διαφοροποιηµένα κύτταρα των θηλαστικών
είχαν αντίστοιχες ιδιότητες. Εισάγοντας 4 γονίδια σε διαφοροποιηµένα κύτταρα ποντικιού πέτυχε να τα µετατρέψει σε
πολυδύναµα βλαστοκύτταρα. Τα πολυδύναµα βλαστικά κύτταρα που προκύπτουν (κύτταρα IPS) θα µπορούσαν να µετατραπούν
µε την κατάλληλη µοριακή καθοδήγηση σε όλους τους κυτταρικούς τύπους του οργανισµού. Τα αποτελέσµατα αυτά
δηµοσιεύτηκαν το 2006.
Οι Gurdon και Yamanaka άλλαξαν κυριολεκτικά την έως τώρα γνώση της κυτταρικής διαφοροποίησης. Με τις ανακαλύψεις
τους ανοίγονται νέα πεδία έρευνας σε πολλές επιστήµες και ο επαναπρογραµµατισµός των ανθρώπινων κυττάρων δηµιουργεί
νέες ευκαιρίες για τη µελέτη ασθενειών και µεθόδων θεραπείας τους.
Όπως είπε και σε µια συνέντευξή του ο Dr Yamanaka είναι πάνω από όλα γιατρός και ο στόχος του είναι να φέρει την
τεχνολογία των βλαστοκυττάρων (IPS) σε κλινικές, ασθενείς, στο κρεβάτι του ασθενούς.
The Bobel Prize in Physiology or medicine 2012
Bobelprize.org
10 Dec 2012
26
ΕΛΛΗΝΙΚΗ ΕΤΑΙΡΙΑ ΚΛΙΝΙΚΗΣ ΧΗΜΕΙΑΣ-
ΚΛΙΝΙΚΗΣ ΒΙΟΧΗΜΕΙΑΣ
Αλωπεκής 47, 10676 Αθήνα
τηλ. επικ. 2103645751, fax 2103645392
ΓΙΑ ΝΑ ΘΥΜΗΘΗΤΕ...ΤΙ ΕΛΕΓΕ Ο ΔΑΣΚΑΛΟΣ !!!
Την περίοδο του Εθνικού διχασμού στην Κρήτη, ένας επιθεωρητής δημοτικής εκπαίδευσης ανέβαινε μ' ένα μουλάρι σ' ένα ορεινό και δύσβατο χωριό, για να επιθεωρήσει τον εκεί δάσκαλο.
Στο δρόμο που επήγαινε συναντά έναν αγωγιάτη και τον ρωτά: «Δε μου λες, πατριώτη, ο δάσκαλος τι είναι;
Βενιζελικός ή Bασιλικός;». «Βενιζελικός», απαντά ο αγωγιάτης. «Α, το γαϊδούρι» σχολίασε ο επιθεωρητής.
Ο αγωγιάτης όμως ήταν Βενιζελικός και φίλος του δασκάλου και έτρεξε να μεταφέρει στον δάσκαλο τη στιχομυθία.
«Το και το, δάσκαλε. Σε είπε γαϊδούρι».
Την επομένη μπαίνει ο επιθεωρητής στην τάξη και ρωτά το δάσκαλο ποιο είναι το μάθημα της ημέρας. «Τα σημεία
της στίξεως», απαντά ο δάσκαλος. «Ας δούμε, λοιπόν, τι ξέρουν τα παιδιά», λέει ο επιθεωρητής.
Ο δάσκαλος σήκωσε ένα μαθητή, τον Σήφη, στον πίνακα και του είπε να γράψει τη φράση:
«Ο επιθεωρητής είπε, (κόμμα), ο δάσκαλος είναι γαϊδούρι (τελεία).
Αφού, έκπληκτος ο μαθητής, το έγραψε, τον ρωτά ο δάσκαλος: «Ποιος είναι, παιδί μου, γαϊδούρι;». «Ο δάσκαλος», ψέλλισε ο μαθητής. «Και ποιος το είπε;». «Ο επιθεωρητής, κύριε». «Ωραία», είπε ο δάσκαλος. «Σβήσε
τώρα το κόμμα και βάλ' το αλλιώς»:
«Ο επιθεωρητής, (κόμμα), είπε ο δάσκαλος, (κόμμα), είναι γαϊδούρι».
Μόλις τελείωσε ο μαθητής, τον ρωτά ο δάσκαλος: «Ποιος είναι τώρα, παιδί μου, το γαϊδούρι;». «Ο επιθεωρητής»,
απαντά δειλά ο μαθητής. «Και ποιος το είπε;» «Ο δάσκαλος», απαντά ο μαθητής.
Οπότε στρέφεται ο δάσκαλος στην τάξη και λέει: «Είδατε παιδιά τι κάνουν τα κόμματα; Πότε βγάζουν γάιδαρο τον
επιθεωρητή και πότε το δάσκαλο».!
Είπε μονολογώντας ο παππούς, καθισμένος στην πολυθρόνα του μπροστά στη τηλεόραση που ανακοίνωνε και
νέες μειώσεις στις συντάξεις: Όταν ήμουν μαθητής, άκουγα κάθε τόσο τη δασκάλα μου να λέει: «Να προσέχετε τα
κόμματα! Ένα λάθος κόμμα, μπορεί να σας χαλάσει τελείως τη σύνταξη!» Έπρεπε να περάσουν εξήντα χρόνια για
Είμαι εγώ που σκέφτομαι καθημερινά ,πως η ζωή μου είναι μία; Όλοι οι υπόλοιποι το ξεχνούν; Ή πιστεύουν πως θα έχουν κι άλλες, πολλές ζωές, για να κερδίσουν τον χρόνο που
σπαταλούν;
Ν' αντικρίζεις τη ζωή με μούτρα. Να περιμένεις την Παρασκευή που θα φέρει το Σάββατο και την Κυριακή για να ζήσεις. Κι ύστερα να μη φτάνει ούτε κι αυτό, να χρειάζεται να περιμένεις τις διακοπές. Και μετά ούτε κι αυτές να είναι αρκετές.
Να περιμένεις μεγάλες στιγμές. Να μην τις επιδιώκεις, να τις περιμένεις.
Κι ύστερα να λες πως είσαι άτυχος και πως η ζωή ήταν άδικη μαζί σου.
Και να μη βλέπεις ,πως ακριβώς δίπλα σου συμβαίνουν αληθινές δυστυχίες που η ζωή κλήρωσε σε άλλους ανθρώπους. Σ' εκείνους που δεν το βάζουν κάτω και αγωνίζονται.
Και να μην μαθαίνεις από το μάθημά τους.
Και να μη νιώθεις καμία φορά ευλογημένος που μπορείς να χαίρεσαι τρία πράγματα στη ζωή σου, την καλή υγεία, δυο φίλους, μια αγάπη, μια δουλειά, μια δραστηριότητα που σε κάνει να αισθάνεσαι ότι δημιουργείς, ότι έχει λόγο η ύπαρξή
σου.
Να κλαίγεσαι που δεν έχεις πολλά.
Που κι αν τα είχες, θα ήθελες περισσότερα. Να πιστεύεις ότι τα ξέρεις όλα και να μην ακούς. Να μαζεύεις λύπες και απελπισίες, να ξυπνάς κάθε μέρα ακόμη πιο
βαρύς.
Λες και ο χρόνος σου είναι απεριόριστος.
Κάθε μέρα προσπαθώ να μπω στη θέση σου. Κάθε μέρα αποτυγχάνω. Γιατί αγαπάω εκείνους που αγαπούν τη ζωή. Και που η λύπη τους είναι η δύναμή τους.
Που κοιτάζουν με μάτια άδολα και αθώα, ακόμα κι αν πέρασε ο χρόνος αδυσώπητος από πάνω τους.
Που γνωρίζουν ότι δεν τα ξέρουν όλα, γιατί δεν μαθαίνονται όλα. Που στύβουν το λίγο και βγάζουν το πολύ.
Για τους εαυτούς τους και για όσους αγαπούν.
Και δεν κουράζονται να αναζητούν την ομορφιά στην κάθε μέρα, στα χαμόγελα των ανθρώπων, στα χάδια των ζώων,
σε μια ασπρόμαυρη φωτογραφία, σε μια πολύχρωμη μπουγάδα.