2010-TP Nº2 Biotecnología Aguas

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TP Nº2ANÁLISIS BACTERIOLÓGICO DE AGUAS

Basil Natalia Jefe de TP: Ing. Ricardo Mateucci

Garaventa PaulaGhirardelli Ignacio

Profesor: Lic. Jorge Pascual.Cukjati PaulaVarela Pablo 2010

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1. OBJETIVO

El objetivo de la práctica es cuantificar la carga microbiana en aguas cloacales.Y así determinar el grado de contaminación a través de la búsqueda de bacterias coliformes en la muestra deagua en estudio.

Se realizarán los siguientes recuentos:

A - Recuento de coliformes totales (CT).B - Confirmación de Escheriquia Coli (Coliformes Fecales).C - Confirmación de Bacterias Intermedias Aerogeneses Cloacae (IAC).

2. METODOLOGÍA.

Sembrado en profundidad de una muestra de agua en dos medios de cultivo diferentes:

Sembrado en PCA: Se siembra 1 ml de muestra en tres concentraciones diferentes (con la Conc. Original=10º, 10-1 y 10-2 de la conc. Inicial.), junto con 15 ml de solución de PCA.

Incubación:

PCA, incubación durante 48 hs. a 37 ºC

Sembrado en Caldos de Cultivo.

a) Mc Conckey doble y simple, incubación durante 48 hs. a 44 ºC. b) Citrato de Koser, incubación durante 24 hs, 37 ºC.

Pruebas IMYIC.

a) INDOL.b) VOGES PROSKAUER.c) ROJO DE METILO.d) CITRATO DE SIMON.

3. OBSERVACIONES Y RESULTADOS

1- Tanto la muestra de partida como la solución 1/10, presentan muchas unidades formadoras que superan ampliamente las 300 UFC (1280x8) lo que hace difícil el recuento debido a que se comete mucho error.

2- Se procedió al recuento de colonias de las placas de la ya que en la diluciones más concentradas se superaban las 300 UFC.

Datos de incubación y resultados de recuento. (Entramos a Tabla NMP con 3/3/3 en todos).

Recuento Coliformes Totales Mc Conckey (UFC/100ml) >110000

Recuento Coliformes Fecales Mc Conckey (UFC/100 ml) >110000

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Resultados de Pruebas IMVIC.

Grupos INDOLROJO DE METILO

VOGES PROSKAUER

CITRATO SIMON

Escheriquia Coli (CF) - + + +

IAC + - - +

INDOL: La muestra se coloreó de amarillo. ROJO DE METILO: siguió la vía de 2,3 butanodiol, virando al amarillo. VOGES PROSKAUER: viró al verde.

CITRATO DE SIMON: Quedó mitad verde y Mitad Azul, por lo que asumimos la presencia de ambos tipos de bacterias.

4. CONCLUSIONES

En el caso de Siembra en profundidad nuestra muestra dio fuera del rango estipulado de 30-300 UFC/ml, habría que haber hecho una o dos más diluciones, es decir solución 1/1000 y solución 1/10000. También presentó un recuento de aerobios que superó las 500 UFC/ml establecidas por la ley por lo que debería considerarse no satisfactoria. Las aguas afectadas al presente análisis bacteriológico se encontrarían contaminadas, y por lo tanto, de acuerdo a los resultados obtenidos, no son aptas para el consumo humano.Sí, resultó ser satisfactoria con respecto a la cantidad de bacterias permitidas en el agua potable ya que el recuento de coliformes no supera el máximo permitido, por lo que, nuestra agua es apta.

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5. CUESTIONARIO

1- ¿Cómo pueden clasificarse los medios de cultivo empleados? Explicar la clasificación según la función de los componentes.

Para la Siembra en Profundidad por Volcado usamos:Plate Count Agar (PCA): La productividad de este medio, está basada en el alto contenido nutricional de sus componentes, que permite el desarrollo de las todas las bacterias presentes en la muestra. Busco entonces todo tipo de colonias con él.

Para la Siembra por Filtración:Busco un tipo específico de bacterias, por lo que necesitamos un medio de cultivo selectivo, o sea que inhiba todo lo que no quiero que crezca, favoreciendo el desarrollo de un Microorganismo específico.

Caldo Mac Conkey Doble y Simple concentración: (Inhibidor y diferencial) Los medios selectivos y diferenciados distinguían en medio Gramm - negativa bacterias mientras que inhibe el crecimiento de Gramm - positivo bacterias. Entonces detecto Enterobacterias.Está diseñando para detectar la fermentación de lactosa mediante cambio de color de incoloro a rojo/rosa. La Peptona es la fuente de aminoácidos y de otros factores de crecimiento, La lactosa es el hidrato de carbono fermentable, La bilis de buey estimula el crecimiento de las bacterias coliformes e inhibe a gran parte de la flora gram positiva, El púrpura de bromocresol es el indicador de pH. Los coliformes, son microorganismos que fermentan la lactosa, con producción de ácido y gas, entonces permite distinguir los gérmenes que fermentan la lactosa de aquellos que no lo hacen. Al acidificar el medio, se produce un viraje del indicador de pH del color púrpura al amarillo.

Agar Cetrimida: El agar de Cetrimida es un tipo de agar usado para el aislamiento selectivo de las bacterias gram-negative, Aeruginosa de los Pseudomonas y de otras especies del género.La fórmula de este medio está desarrollada para favorecer la selección de P. aeruginosa y estimular la formación de pigmentos. La cetrimida es un detergente catiónico que actúa como agente inhibidor, libera el nitrógeno y el fósforo de las células de casi toda la flora acompañante.La formación de Amonio cuaternario inhibe el crecimiento del resto de Microorganismos.Si es prueba positiva, se presencia fluorescencia verde bajo luz U.V y pigmentación verde pálida espontánea de los Microorganismos.

Citrato de Koser: Medio liquido utilizado en la clasificación de enterobacterias.Es un medio para detectar aquellos microorganismos que utilizan el citrato como única fuente de carbono y las sales de amonio como única fuente de nitrógeno.Lo usamos para identificar presencia de IAC.Si es prueba IAC positiva, la solución pasa de Verde a Azul.

2- Si espera un recuento total a 37°C de 10000 ufc/mL ¿cómo procedería?. ¿Qué diluyentes se pueden emplear?, justifique esta respuesta.

Hay que tener en cuenta que cada bacteria va a dar lugar a una colonia.El recuento de colonias en muy grande por lo que conteo estimativamente dividiendo las placas de Petri que correspondan a la mayor dilución, y así entonces solamente contaremos aquellas placas en las cuales el número de colonias se encuentre comprendido entre 30-300 unidades.Empleamos una dilución de 1/100.

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Supongamos que tenemos una muestra en la cual hay 10.000 bacterias en 1mL.

Como se formarían 10.000 colonias y éstas no se pueden contar en 1 placa, se tiene que diluir. Entonces realizamos una dilución 10-2, diluimos a 1/10: tomamos 1mL de la muestra y 9ml de disolvente. Ahora tendríamos 1.000 bacterias en 1ml por lo que será necesario diluir otra vez a 1/10 con lo que nos quedaríamos con 100 bacterias en 1mL que ya podemos contar en la placa.Es importante usar un líquido de dilución desprovisto de acción bactericida. En la mayoría de los casos puede utilizarse agua corriente, agua destilada o solución fisiológica o agua peptonada 0,1 % con pH ajustado a 7.

Una vez realizada la dilución seriada pertinente hay que llevarlo a un medio de cultivo.Para hidratar el medio de cultivo se debe agregar una pequeña cantidad de agua destilada PH=7, agitar y luego agregarle el resto de agua.

3-¿Cómo procedería si desconoce los recuentos esperados de aerobios mesófilos y de coliformes totales?

Si de aerobios mesófilos espero alta concentración, siembro en profundidad. Para coliformes totales, ya que estos son parte de la clasificación anterior y si se trata de aguas no muy contaminadas (no de cloacas, p ej.) realizaría una dilución de 10 en 100.O sea realizaría varias diluciones pero en cada una sembraría una muestra con su medio. Luego elegiría las placas con recuento óptimo.

En el caso de Coliformes totales, fecales y E. coli:

NMP MÉTODO DE N.M.P. (Número más Frecuente): basado en un método estadístico.Dependiendo del número de m.o que sospechamos que puede tener la muestra existen distintas tablas de trabajo de números más probables), llevar a la tabla los valores obtenidos en tres diluciones consecutivas, donde por lo menos la dilución menor tenga tres (3) tubos positivos y la dilución mayor tenga cero (o) tubos positivos y reportar según lo establecido.

4- ¿En qué situaciones son adecuadas la siembra en profundidad y la siembra por filtración?

A) Filtración: Si espero bajo recuento, de sembrado de grandes cantidades de muestra, siembro por filtración.

• Aguas embotelladas• Aguas de red• Aguas de bebida desinfectadas• Aguas de bebida con bajo contenido bacteriano

Se pueden examinar grandes volúmenes de agua; teóricamente casi cualquier volumen de agua se puede filtrar a través del disco y los microorganismos de cualquier volumen quedarán en el disco.

B) Profundidad : Si espero alto recuento de bacterias, siembro en profundidad.

Recuento en placa. Recuento de Microorganismos Aerobios Mesófilos (RAM) en agua sigue siendo el método más utilizado en la mayoría de los laboratorios de análisis microbiológicos. Se obtienen resultados no tan rápidamente, pero es adecuado a bajos volúmenes de agua a analizarse.

5- ¿Qué significado tienen las bacterias coliformes en un agua de bebida?

La presencia de bacterias coliformes en el suministro de agua es un indicio de que el suministro de agua puede estar contaminado con aguas negras u otro tipo de desechos en descomposición. Generalmente, las bacterias coliformes se encuentran en mayor abundancia en la capa superficial del agua o en los sedimentos del fondo.

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Los coliformes fecales, que se encuentran en los intestinos de los humanos y otros animales de sangre caliente, son un tipo de bacterias coliformes. La presencia de coliformes fecales en un suministro de agua es un buen indicador de que las aguas negras han contaminado el agua. Se pueden hacer pruebas específicamente para coliformes fecales o para el total de bacterias coliformes que incluye todos los tipos de bacterias coliformes y que puede indicar contaminación fecal.

6- ¿Existen otras bacterias normalmente en el intestino humano? ¿Cuáles recuerda?

En cada intestino humano habitan más de 100 billones (con b) de bacterias, que pertenecen a entre 500 y 1.000 especies distintas.Entre muchas otras, existen las siguientes bacterias:

Campylobacter: Origina la enfermedad campilobacteriosis., que es la causa más común de diarrea. Se encuentra su origen en carnes y pollos crudos o mal cocinados, leche no pasteurizada.

Escherichia Coli: cusa la “diarrea de viajero”, calambres, dolor de estómago, se encuentra en carnes mal cocidas, leche cruda, productos agrícolas.

Listeria Monocitogenes: Produce listeriosis, que es una enfermedad relacionada con el consumo de alimentos lácteos y cárnicos que fueron congelados durante mucho tiempo. Tiene síntomas similares a los de una gripe.

Salmonella: produce salmonelosis, es la más temida en los meses de calor. Los productos potenciales de presentarla son las carnes, pescado, huevos, lácteos y sus derivados. Si se cuecen bien a altas temperaturas esta bacteria desaparece, mientras que si se comen crudos, es fuente potencial de contaminación. Da diarrea, fiebre y dolor abdominal.

Shigella: produce Shigelosis. Son las malas condiciones higiénicas las que dan la presencia de esta bacteria. Se transmite en alimentos como ensaladas, leche y agua sucia.

Staphylococus Aureus: El nombre corresponde a una bacteria que produce una toxina que provoca vómitos al poco tiempo de ingerir alimentos contaminados con ella. Alimentos del tipo de fiambres, productos de pastelería y productos lácteos (todos de alto contenido proteico).

7- ¿Qué bacterias patógenas pueden transmitirse por el agua y ocasionar infecciones intestinales?

Sus agentes patógenos son biológicos, más que químicos, y los males que provocan casi siempre soncontagiosos. Por lo general, los agentes patógenos pertenecen al grupo de los microorganismos, que setransmiten en las heces excretadas por individuos infectados o por ciertos animales. De forma que estasenfermedades se suelen contraer al ingerirlos en forma de agua o de alimentos, contaminados por esasheces (vía fecal-oral).Los patógenos humanos transmitidos por el agua incluyen muchos tipos de microorganismos tales como:bacterias, virus, protozoos y, en ocasiones, helmintos (lombrices), todos ellos muy diferentes en tamaño,estructura y composición.

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8-

8- ¿Qué características definen al grupo coliforme?

Son Bacilos Cortos, Gram Negativos, que fermentan la lactosa y forman ácido y gas.Son Anaerobios facultativos, se multiplican a mayor rapidez a temperaturas entre 30 ºC y 37 ºC.Crecen abundantemente en medios corrientes como Agar y Caldos.Las coliformes son una familia de bacterias que se encuentran comúnmente en las plantas, el suelo y los animales, incluyendo a los humanos.

9- ¿Qué límite de bacterias coliformes se ha adoptado como máximo para una agua de bebida?

Límites permisibles para aguas de consumo

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Bacterias mesófilas viables: en agar Plate Count 24 hs. a 37ºC, no mas de 500 UFC/mlBacterias coliformes: NMP a 37ºC – 48 hs. (Caldo Mc Conckey o Lauril Sulfato), en100 ml; igual o menor a 3, (0 colonias en 100 ml de muestra).Ausencia de Escherichia coli: en 100 ml de muestra.Ausencia de Pseudomona aeruginosa: por 100 ml de muestra

Natación: menos de 200 colonias por 100 ml de la muestra de agua Navegar/Pescar: menos de 1,000 colonias por 100 ml de la muestra de agua

10- ¿Qué volumen tienen las porciones que se acostumbra sembrar cuando se trata de agua de bebida

Envase:Se deben utilizar frascos esterilizados y con envoltura externa. La capacidad debe ser de 200 cm3 a 250 cm3.Se siembran cantidades de a 1-10 ml.

Envío de muestras:Debe transcurrir el menor tiempo entre la extracción y la llegada al laboratorio, y que durante ese tiempo se mantenga entre 4 y 10 ºC. De lo contrario se producen modificaciones cuali -cuantitativas de la flora bacteriana.

11- Describa el método utilizado para el exámen bacteriológico de Aguas.

Para el exámen Bacteriológico de aguas se utilizó el Método de NMP o Wilson junto con lasPruebas IMYIC.

Determinación de bacterias aerobias totales

Se efectúan tres diluciones a partir de una muestra de agua contaminada empleando agua destilada estéril.Deben utilizarse tubos de ensayo y pipetas estériles.Si se trata de aguas poco contaminadas, se utilizará la muestra original y dos diluciones de 1/5 y 1/10.Si se trata de aguas muy contaminadas, se realizarán 3 diluciones sucesivas de 1/10 cada una, paraobtener tres muestras cuyas concentraciones finales sean 1/10, 1/100 y 1/1000.Se funde el medio y se enfría a 45 – 50º C.Se coloca asépticamente 1 ml de cada dilución en cada una de las cajas de Petri, previamente marcadascon las diluciones a sembrar.Se vierte en cada una de las cajas de Petri (X DUPLICADO) el medio fundido. Se mezcla con suaves movimientos de rotación y se deja solidificar.Las cajas se incuban invertidas en estufa a 37º C durante 48 Hs. El tiempo transcurrido desde que se efectúa la dilución hasta el agregado del medio de cultivo no debe ser superior a los 30 minutos.Después de la incubación se procede al recuento de colonias.

Determinación del número más probable de microorganismos coliformes totales:METODO DE WILSON.

Según el origen de la muestra se realizará la dilución correspondiente.

En tres tubos con 10 ml de caldo Mac Conkey doble concentración sembrar 10 ml de agua muestra.En tres tubos con 5 ml de caldo Mac Conkey simple concentración sembrar 1 ml de agua muestra.En tres tubos con 5 ml de caldo Mac Conkey simple concentración sembrar 0,1 ml de agua muestra.Llevar todos los tubos a incubar a 37º C 24 – 48 Hs.

Se considera positivo todo tubo que presenta ácido y gas, lo que indica que el agua posee bacteriascoliformes.

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El número más probable (NMP) de bacterias coliformes por 100 ml se calcula mediante una tabla estadística teniendo en cuenta la combinación de tubos sembrados con 10, 1 y 0,1 ml de agua y la combinación de tubos positivos.

Diferenciación de las bacterias coliformes

Determinación del NMP de bacterias colifecalesDe cada uno de los tubos Mac Conkey positivo, se repica con ansa rulo a tubos con 5 ml de caldo MacConkey concentración simple. Se incuba a 44º C durante 48 Hs.

A esta temperatura dan ácido y gas las bacterias colifecales. Mediante el empleo de esta tabla y usando la combinación original sembrada y la combinación de tubos positivos, tendremos un valor *”a” que mediante la aplicación de una fórmula convencional permitirá determinar el NMP de bacterias colifecales por 100 ml.

Determinación del NMP de bacterias intermedias aerogenes cloacae (IAC).

De todos los tubos positivos del caldo Mac Conkey incubado a 37º C hacer repiques con ansa recta a tubos con medio Citrato de Koser e incubar a 37º C durante 48 Hs. Se utiliza ansa recta con el objeto de no llevar a los tubos con citrato, material nutritivo del cultivo original. Esto es importante, pues pequeñas cantidades de peptona son suficientes para permitir el desarrollo de E. coli fecal y modificar por lo tanto los resultados del ensayo.

Se consideran como positivos los tubos que presenten coloración azul. Si el medio permanece verde, el ensayo se considera negativo.Si la coloración es dudosa, pueden agregarse unas gotas de solución de azul de bromotimol. El citrato es utilizado por las bacterias como única fuente de carbono produciendo amoníaco; esto hace que el pH aumente junto con el desarrollo microbiano y produce el viraje del indicador, lo que es originado únicamente por las bacterias del grupo IAC.

Mediante el empleo de la tabla y usando la combinación original sembrada y la combinación de tubospositivos obtendremos un valor **”b” que mediante la aplicación de una fórmula convencional permitedeterminar el NMP de las bacterias del grupo IAC por 100 ml.

Determinación de Pseudomonas aeruginosa (NO LO HICIMOS).

Pasar 100 ml de muestra por filtro Millipore y colocar sobre Agar Cetrimida. Utilizar otra placa como control de esterilidad del medio. Incubar a 37º por 24 horas.Para confirmar, observar las placas de Agar Cetrimida con exposición a lámpara de luz UV (longitud deonda larga). Las colonias de Pseudomonas aeruginoasa se ven fluorescentes.Informar como Presencia o Ausencia.

Luego realizamos las pruebas IMVIC.

Son cuatro pruebas bioquímicas: Indol, Rojo de Metilo, Voges-Proskauer y Citratos.Se emplean fundamentalmente para la identificación de las Enterobacterias (bacilos Gram negativos, anaerobios facultativos con metabolismo fermentador). Dependiendo de las condiciones, las enterobacterias, pueden realizar:Un metabolismo aerobio (si disponen de oxígeno), Una respiración anaerobia (si hay nitratos u otro aceptor de electrones) Y distintas fermentaciones.

El resultado de este test se expresa mediante cuatro símbolos de suma o resta (+ o -) según el resultado de cada prueba, siguiendo siempre el orden establecido por las iniciales del método. Así por ejemplo, el IMViC de la bacteria Salmonella y Citrobacter es -+-+. Para E.coli es ++-- y para Klebsiella y Enterobacter es --++.

Indol (I)

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Consiste en cultivar la especie en estudio en un caldo rico en triptófano; después de 24-48 horas de crecimiento, se extrae el indol producido con un disolvente orgánico, como xileno, y se determina su presencia con reactivos específicos como el reactivo de Kovacs el que adquiere un color rojo en la prueba del indol positiva y Amarillo cuando es Negativa.

Rojo de Metilo (M)

El rojo de metilo es un indicador de pH. (Fórmula: C15H15N3O2). Actúa entre pH 4,2 y 6,3 variando desde rojo (pH 4,2) a amarillo (pH 6,3). Por lo tanto, permite determinar la formación de ácidos que se producen durante la fermentación de un carbohidrato. Una reacción positiva (más o menos) indica que el microorganismo realiza una fermentación acidoláctica de la glucosa por la vía ácido-mixta, mientras que un color verde indica la vía de oxidación de 2,3 butanodiol.

Voges-Proskauer (VI)

Permite determinar la formación de acetil metil carbinol (AMC), el que es un producto intermediario de la fermentación que conduce a la formación de 2,3 butanodiol y que caracteriza a ciertas especies de las Enterobacteriaceae, por lo que indicará que la glucosa es fermentada por la vía butanodiólica.

Citrato (C)

Sirve para determinar si un microorganismo puede crecer utilizando citrato como única fuente de carbono. Se hace crecer la bacteria en caldo citrato. Un resultado positivo es cuando se observa turbidez en el tubo, debido al crecimiento bacteriano. Un resultado negativo es

Grupos INDOLROJO DE METILO

VOGES PROSKAUER

CITRATO SIMON

Escheriquia Coli + - + -

IAC - + - +

12- Una muestra de agua de río dio los siguientes resultados:

Análisis cuantitativo: se realiza una dilución 1/100 y se siembra 1,0 ml de la misma en profundidad. Se cuentan 50 colonias. ¿Cómo informaría dicha muestra? NMP por esquema de Wilson:

Tubos positivos por

10 ml 1,0 ml 0,1 ml

Mac Conkey 37ºC 3 1 1

Mac Conkey 44ºC 2 1 0

Citrato de Koser 37ºC 1 1 0

Entonces al buscar en la tabla NMP y aplicar la dilución 1/100 tenemos:

CT (UFC/100 ml) = 7500.CF (UFC/100 ml) = 1500.IAC (UFC/100 ml) = 700.

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Entonces calculamos:

IAC+CF= 2200.

700 CF ___________ 2200X= 2386 CF ___________ 7500

1500 IAC ___________ 2200X= 5114 IAC ___________7500

Por lo tanto tenemos por 1 Colonia:

7500 CT/100 ml.2386 CF/100ml.5114 IAC/100ml.

Como contamos 50 Colonias tenemos:

375000 CT/100 ml.119300 CF/100ml.255700 IAC/100ml.

De acuerdo a los resultados obtenidos, y basándose en la legislación (ver punto 9 del cuestionario), el agua no es apta para el consumo.