2003〜2009年にブリ類から分離された類結節症原因菌 ...2003〜2009年にブリ類から分離された類結節症原因菌 Photobacterium damselae subsp. piscicidaの薬剤感受

2003〜2009年にブリ類から分離された類結節症原因菌Photobacterium damselae subsp. piscicidaの薬剤感受

性およびRAPD解析による分類

誌名誌名 水産増殖 = The aquiculture

ISSNISSN 03714217

著者著者

古下, 学福田, 翼福田, 穣山下, 亜純柳, 宗悦前野, 幸二田中, 真二杉原, 志貴安部, 昌明長野, 泰三芝, 恒男

巻/号巻/号 61巻2号

掲載ページ掲載ページ p. 163-169

発行年月発行年月 2013年6月

農林水産省 農林水産技術会議事務局筑波産学連携支援センターTsukuba Business-Academia Cooperation Support Center, Agriculture, Forestry and Fisheries Research CouncilSecretariat

水産増殖 (AquacultureSci.) 61(2)， 163-169 (2013)

2003~2009年にブリ類から分離された類結節症原岡菌

Photobacterium damsel，αe subsp.ρiscicid，αの薬剤感受性

およびRAPD解析による分類

古下学1，*・福田翼1.福田穣2.山下亜純3・柳宗悦4・前野幸二4

田中真二5・杉原志貴6・安部昌明7・長野泰三7.芝 恒男1

Antimicrobial Susceptibi1ity and Molecular Diversity of

Photobαcterium dαmselαe subsp. piscicidαIsolated in J apan from 2003 to 2009

Manabu FURUSHITA1，*， Tsubasa FUKUDAl， Yutaka Fu即 DA

2，Azumi Y品 仏SHITA3，

Soetsu YANAGI4， Kouji MAEN0

4， Shi吋iTANAKA5， Yukitaka SUGIH皿A

6，

Masaaki ABE7， Taizo NAGAN0

7 and Tsuneo SHIBA

1

Abstract: Susceptibility to 14 antimicrobials was examined for 247 Photobacterium damselae subsp.

Piscicida isolates from the several species of genus Seriola cultured in ]apan from 2003 to 2009. The

isolates showed resistance to at least one of 10 antimicrobials (ampicillin (ABPC)， oxytetracycline

(OTC)， chloramphenicol (CP)， kanamycin (KM)， dihydrostreptomycin (DSM)， flumequin (FMQ)，

oxolinic acid (OA)， sulfamonomethoxine (SMMX)， trimethoprimσMP)， fosfomycinσOM))，

whereas the multiple resistance to OTC， Cp， KM， FMQ， OA and SMMX was shown by 55.5% of

the isolates. All of the isolates were susceptible to florfenicol (FF)， gentamycin (GM)， bicozamycin

(BCM) and enrofloxacin (ERFX). Random amplified polymorphic DNA侭APD)pa仕ernsof the

isolates were classified into 5 patterns (P2~ P6). An emergence of a new predominant multiple

resistance pattern (ABPC' OTC' DSM・FMQ. SMMX 'TMP' FOM) was correlated with the change

of the predominant RAPD pa仕ernfrom P2 to P4.

Key words: Seriolα; Photobacterium damselae subsp. piscicida; Antimicrobial susceptibility; RAPD

2012年12月12日受付;2013年 2月27日受理.

1水産大学校食品科学科 (Departmentof Food Science and Technology， National Fisheries Univ.， Nagata-honmachi，

Shimonoseki， Yamaguchi 759-6595， ]apan).

2大分県農林水産研究指導センター水産研究部 (FisheriesResearch Division， Oita Prefectural Agriculture， Forestry and

Fisheries Research Center， Saiki， Oita 879-2602， ]apan). 3愛媛県農林水産研究所水産研究センター (Centerfor Marine Studies， Ehime Prefectural Research Institute for

Agriculture， Forestry and Fisheries， Shitaba， Uwajima， Ehime 798-0104， ]apan).

4鹿児島県水産技術開発センター(KagoshimaPrefectural Fisheries Technology and Development Center， 16D-10，Ibusuki，

Kagoshima 891-0315， ]apan). 5三重県水産研究所水産資源育成研究課 (MiePrefecture Fisheries Research Institute， Hamajima， Shima， Mie 517-0404， ]apan).

6長崎県総合水産試験場 (NagasakiPrefectural Institute of Fisheries， Taira， Nagasaki 851-2213， ]apan).

7香川県水産試験場 (KagawaPrefectural Fisheries Experimental Station， Yashimahigashimachi Takamatsu， Kagawa

761-0111， ]apan). *連絡先 (Correspondingauthor): Tel，か81)83-286-5111;FAX， (+81)83-286-7434; E-mail，卸ushita@fish-u瓜 .jp(M. Furushita).

164 古下・福田・福田・山下・柳・前野・田中・杉原・安部・長野・芝

類結節症原因菌として知られる Photobαcterium

damselae subsp. piscicidaは， 1963年チェサピーク

湾の whiteperch Morone americanαや stripedbass

M. saxatilisから初めて分離されたが (Snieszkoet

al. 1964)， そ れ 以来 seabass Dicentrarchus labrax

(Balebona et al. 1992)， gilthead sea bream Spαrus

αurata (Toranzo et al. 1991)， cobia Rαchycentron

ca仰 dum(1ρpez et al. 2002) などからの分離が続い

ている。

日本では，この病原菌による1969年のブリ Seriola

quinqueradiataの大量艶死が報告されて以来(窪田

ら 1970;楠田・山岡 1972)，ブリ類の主要な病原菌

として注目されている (Kusudaand Kawai 1998)。

2011年の統計では， 日本の魚類養殖生産量の約62%

はブリ類であり(農林水産省大臣官房統計部 2012)，

本菌による類結節症の発生は大きな経済的な損失に

なる。そこで日本ではブリ類の類結節症の治療のた

めに 7種類(アンピシリン，オキソリン酸，フロル

フェニコール，ピコザ、マイシン，ホスホマイシン，

チアンフェニコール，アモキシシリン)の薬剤使用

が認可されているが，本菌についての薬剤耐性の報

告 (Aokiand Kitao 1985; Kim and Aoki 1993; Thyssen

and Ollevier 2001; Bakopoulos et al. 2005; Kawanishi et

al. 2006; Martinez-Manzanares et al. 2008)が続き，投

薬効果が下がり新たな問題となっている。 2007年に類

結節症に対するワクチンが承認されているが，現在で

も本感染症の発生が確認されており(柳ら 2012)，抗

生物質治療の重要性は下がっていない。したがって，

P. damselae subsp.ρiscicid，αの薬剤感受性の変動を調

べて，類結節症のより効果的な抗生物質投与法，すな

わちより高い感受性を示す抗生物質を探求することが

必要で、ある。

一方，P. damselae subsp.ρiscicid，αは，分離地域，

分離源に関わらず，形態学的，生化学的，生理学的性

状が同一で、あると報告され (Magarinoset al. 1992)，

極めて多様性が小さいことが示唆されている。一般に

多様性は，細菌集団内での薬剤耐性の広がり過程を考

える上で重要である。そこで，本研究では，本菌にお

ける薬剤耐性の広がりを考察するため， 2003~2009年

に西日本の養殖ブリ類から分離された P.damselae

subsp. piscici均株について薬剤感受性試験を行うとと

もに，菌種の DNA多型調査に強力なツールであると

言われている RAPD(Random amplified polymorphic

DNA) 解析 (Magari負oset al. 2000; Kawanishi et al.

2006; Kijima-Tanaka et al. 2007) によって分離株の多

様性を調べた。

材料および方法

供試菌株

2003~2009年に西日本 6 県において類結節症を発

症したブリ類 Seriolaquinqueradi，αta，丘 lalandi，S.

dumeriliから分離された P.damselae subsp. piscicida

247株を供試した (Table1)。保存株の培養は， 1%

NaCl 添力日 Brain-Heart1nfusion Agar (BHIA， Beckton

Dickinson)， 25'Cで行った。菌の同定は， Zappulli et

al. (2005)が報告した P.damselae subsp. pゐcicid，α同

定のための PCR-RFLP法を用いて行った。菌株は，

1% NaCl 添加 BHIAまたは 1%NaCl 添加 TrypticSoy

Broth (Beckton Dickinson) を用い250

Cで培養して薬

剤感受性試験に用いた。

薬剤感受性試験

薬剤感受性試験は，米国臨床検査標準委員会

(NCCLS) により提唱された標準試験法 (National

committee for clinical laboratory standards 2002，

2003) に基づき，最小発育阻止濃度 (M1C)測定法

により行った。すなわち19もNaCl添加 TrypticSoy

Agar (Beckton Dickinson) 上の 3~5 コロニーを

McFarland標準液 NO.0.5相当になる様に滅菌生理食

塩水に懸濁し，これを滅菌生理食塩水で10倍希釈し

た菌液をミクロプランター(佐久間製作所)を用いて

MIC (最小発育阻止濃度)測定用培地に接種した。

MIC測定用培地には，各薬剤を含んだ、 2%NaCl 添加

Muller-Hinton Agar (Becton Dickinson) を用いた。

判定は， 250

C， 48時間培養後に行った。薬剤感受性

試験に用いた薬剤は，日本の養殖漁場で用いられてい

るアンピシリン (ABPC)，ピコザマイシン (BCM)，

オキシテトラサイクリン (OTC)，ホスホマイシン

(FOM) ，オキソリン酸 (OA)，フルメキン (FMQ)，

フロルフェニコール (FF)，スルファモノメトキシン

(SMMX)の8種類と，畜産または臨床に用いられる

クロラムフェニコール (Cp)，カナマイシン (KM)，

ジヒドロストレプトマシシン (DSM)，ゲンタマイ

シン (GM)， トリメトプリム (TMP)，エンロフロ

キサシン (EFRX) の 6種類である。薬剤感受性試

験の精度用菌株として，P. damselae subsp.ρゐcicida

ATCC51736， P. damselae subsp.ρiscicida ATCC17911，

Escherichia coli ATCC25922， Pseudomonas aeruginosa

ATCC27853， Staphylococcus aureus ATCC29231，

Enterococcus faecalis ATCC29212， Aeromonas salmoni-

Cl・dasubsp. salmonicida ATCC33658を用いた。

Photobacterium damselae subsp. piscicid，αの薬剤感受性 165

RAPD解析

RAPD解析には， Magarinos et a1. (2000)の方法を

用いた。 DNAt白出は， QuickGene DNA tissue kit S

(Fujifilm) を用いて行二った。 PCRi夜には， Ready-

To-Go RAPD Analysis Beads (GE Healthcare)を用い，

プライマーはPrimer5 (5' -MCGCGCMC-3') を用い

た。 PCR増幅は， 950

C 1分， 350

C 1分， 720

C 2分を

45サイクルで行った。増幅産物は， 3%アガロースゲ

ルで、電気泳動し確認した。

果

薬剤感受性試験

分離された251株の内，P d，αmselae subsp.ρiscicid，α

に特徴的な200bpの PCR増幅産物と制限酵素 BstUI

の消化による125bp， 76 bpの切断片長が確認された

247株を Pdamselae subsp. piscicidaと同定した。

P damselae subsp. pisc似da247株の薬剤に対する薬

剤感受性試験の結果を Table2に示す。すなわち，

MIC分布において二峰性を示した薬剤は10薬剤

(ABPC， OTC， CP， KM， DSM， FMQ， OA，

SMMX， TMP， FOM) であった。この二峰性のピー

クの中間値をブレークポイントとした。薬剤感受性の

判定で耐性菌株が80%以上となった薬剤は， FMQ

(96.0%)， OTC (95.1%)， SMMX (82.6%)であった。

また， 日本において，類結節症の治療に汎用されてい

る ABPCには， 24.3%の菌株が耐性を示した。水産用

医薬品として使われていない薬剤では CPとKMに対

してそれぞれ61.9%，59.5%の耐性率が認められた。

次に，薬剤耐性株の耐性パターンを Table3に示

す。すなわち耐性パターンには，単剤耐性から 8剤耐

性までの27パターンが確認された。なかでも OTC.

CP・KM. FMQ . OA . SMMXの 6薬剤に耐性を示

す株が全株中の55.5%を占め，毎年優占もしくは主要

な耐性パターンとなった。また 7薬剤以上の薬剤に

耐性の株は， 2007年以降毎年見られ， 2008年以降に

優占となった 7剤耐性パターン ABPC. OTC . DSM .

FMQ. SMMX・TMp.FOMは，水産用医薬品とし

Table 1. The number of isolates of Photobαcterium damselae subsp. piscicida

Prefecture Total

Nagasaki Oita Ehime Mie Kagoshima Kagawa

2003 2 2

2004 1 10 20 2 33

2005 2 25 27

2006 5 17 15 37

2007 5 9 6 8 3 31

2008 10 64 1 1 76

2009 4 36 1 41

Table 2. Minimum inhibitory concentration of antimicrobials against Photobαcterium damselae subsp.ρiscicida

MIC (μg/ml) MIC50 MIC90 Break Numberof

Antibiotics point resistant く0.1250.25 0.5 1 2 4 8 16 32 64 128 256 512 >512 (μg/ml) (μg/ml) (μg/ml) isolates (%)

ABPC 187 2 10 22 21 5 云0.125 32 1 60 (24.3)

OTC 2 7 3 8 32 189 5 1 32 32 2 235 (95.1)

CP 2 4 71 17 2 12 104 35 16 32 4 153 (61.9)

FF 143 77 27 0.5 2

KM 1 17 78 2 2 147 >512 >512 128 147 (59.5)

DSM 55 138 3 15 32 4 32 256 64 54 (21.9)

GM 93 151 3 8 8

ERFX 23 177 47 0.25 0.5

FMQ 9 1 9 100 127 1 2 2 0.5 237 (96.0)

OA 8 2 73 18 98 48 2 4 1 164 (66.4)

SMMX 3 40 1 6 197 >512 >512 256 204 (82.6)

TMP 6 117 27 36 13 11 7 25 5 1 2 32 48 (19.4)

BCM 2 7 13 219 5 1 4 4

FOM 2 30 51 87 21 1 5 22 27 1 4 128 16 56 (22.7)

166 古 下 ・福 田・ 福 田・山下・柳・ 前野 ・ 田中・ 杉原 ・安部・ 長野 ・芝

Table 3. Relationship between antimicrobial resistance profile and RAPD pa仕ern

N* Antimicrobial resistance profile RAPD 1solates in 2003 to 2009

pa抗ern 03 04 05 06 07 08 09 。 2

3

1 。 1

1

1

1 ABPC

1

1

OA

SMMX

SMMX

円

Lワ臼

A坤

4

9“qδ

1

OTC 2

1

1

1

2 OA SMMX 2 1

2 KM SMMX 3 1

2 OTC FMQ 2 14 2

2 OTC FMQ 4 1 1

3 OTC FMQ OA 2 1 6

3

3

OTC

OTC

FMQ SMMX

FMQ SMMX

FMQ OA SMMX

ワム

A堂

内

4

1

6

3 l

4 OTC CP FMQ SMMX 2 1

4 OTC FMQ OA SMMX 4 1

5 OTC CP FMQ OA SMMX 4 1

5 OTC KM FMQ OA SMl¥広 4 1

5 ABPC OTC CP FMQ SMMX 2 2

6 ABPC OTC CP FMQ OA SMl¥α 2 2

6 ABPC DSM FMQ SMMX TMP FOM 4 1

6 ABPC OTC DSM FMQ SMMX FOM 4 1 1

6 ABPC OTC FMQ SMMX TMP FOM 4 1

6 ABPC OTC DSM FMQ TMP FOM 2 6

6 ABPC OTC DSM FMQ TMP FOM 4 5

6 OTC CP KM FMQ SMMX FOM 2 l

6 OTC CP KM FMQ OA SMMX 2 2 25 22 12 5 4 8 6 OTC CP KM FMQ OA SMMX 4 1 7 33 18 6 OTC CP KM FMQ OA SMMX 5 1

ーーーーーーーーーー』ーーーーーーーーーーーーーーーーーーーーーーーーーーーーーーーーーー ーーーーーーーー『 咽曲ー・・ ーーーーー ーーーーーーーーーー』ーーーーーーー ーーーー働ー帽--骨ーーーーーーー---ーー・・・・ーーーーー→ーーーーーー-ー7 ABPC OTC CP KM FMQ OA SMMX 2 1 1

7 ABPC OTC CP KM FMQ OA SMl¥庇 4 3

7 OTC CP KM DSM FMQ OA SMMX 2 1

7 ABPC OTC DSM FMQ SMMX TMP FOM 4 22 6

7 ABPC OTC DSM FMQ SMMX TMP FOM 6 1 ーーーーーーー四回骨骨・・・ー ーーーーーーーーーーー--ーーーーーーーーーーーーーーーーーー・ーーーーーーーーーーーーーーーーーーーーー『骨・・・ー----------ー---ーーー・ーーーーーーーーーーーー』ーーーーーーーーーーー--骨骨8 ABPC 0τ℃ DSM FMQ OA SMMX TMP FOM 2 2

8 ABPC OTC DSM FMQ OA SMMXτ乱ilP FOM 4 1 2

8 ABPC OTC CP DSM FMQ SMMX TMP FOM 4 1

N * means the number of antimicrobials to which the isolates are resistant. Predominant antimicrobial resistance profiles are stained faint gray.

て認め られていない DSMとTMPを含んでいた。 類の RAPDパタ ーンが確認された (Fig.1)。すなわち

精度確認用の P.damselαe subsp.ρiscicida ATCC17911

株の みが P1を示し，分 離株の RAPDパ ターン

は P2 ~ 6 に 分 類 され， 1干damselaesubsp.ρiscicida

ATCC51736株は P2 を示した。 P1 以外の P2 ~ 5 で

RAPDによる遺伝子多型解析

P. damselae subsp.ρiscicida 247株に対し， RAPDに

よる DNA多型解析を行った とこ ろ， P1~P6 の 6 種

Photobαcterium damselae subsp. piscicid，αの薬剤感受性 167

Table 4. RAPD patterns of Photobacterium damselae subsp. piscicida

Year RAPD pattern

Total P1 P2 P3 P4 P5 P6

2003 2 2

2004 30 (6.7) 2 l 33 (6.1)

2005 26 1 27

2006 37 37

2007 13 (5.9) 17 (17.6) 1 31 (12.9)

2008 6 69 (34.8) 1 (100) 76 (32.9)

2009 12 (25.0) 29 (27.6) 41 (26.8)

Parentheses show the percentage of isolates which were resistant to 7 and more antimicrobials.

)

p

b

(

M 5 6 2 3 4

1000

500

100

Fig. 1. Electrophoresis of random amplified DNA of

Photobacterium damselae subsp.向cicida.Lane M， 100bp

D NA ladder; lane 1， }ヲ damselaesubsp. piscicida Aτ'CC17911

(Pattern 1); lane 2， ATCC51736 (Pattern 2); lane 3， Strain

051981 (Pattern 3); Lane 4， pp05-113 (Pattern 4); Lane 5，

MEP0701 (Pattern 5); lane 6， PP08-27 (Pattern 6).

は 500bp以上のバンドが同ーとなり，非常に近似の

RAPDパターンであった。分離株の RAPDパターン

分布を Table4に示す。RAPDパターン P2を示す株

は， 126株 (51.0%) と最も多く， 2006年まで優占と

なった。一方2006年以前には 1株しか観察されなかっ

た RAPDパターン P4を示す菌群が2007年以降は優占

となり， 116株 (47.0%) がこのパターンを示した。

RAPDパターン P4の優占的かっ急激な出現時期は，

7薬剤以上の耐性パターンの出現時期と一致してい

た。RAPDパターン P3は， 2004年に 2株， 2005年に

1株が示したが，それ以降このパターンを示す株は見

られなかった。RAPDパターン P5は2007年に， P6は

2008年に 1株が各パターンを示した。

考察

2003~2009年に西日本でブリ類から分離された

類結節症原因菌 P.damselae subsp. Piscicidaの薬剤

感受性試験を行った。 これまで，P. damselae subsp.

pおcicid，αの薬剤感受性について報告が複数なされて

いるが (Aokiand Kitao 1985; Takashima et a1. 1985;

楠田ら 1988，1990; Kim and Aoki 1993; Thyssen and

Ol1evier 2001)，調査薬剤の種類や培地が異なってい

たために比較が難しい。そこで本研究では Kawanishi

et a1. (2006)が2002年に西 日本の養殖ブリ類分離 f

damsel，αe subsp.ρiscicida株で、行った NCCLS法に準拠

した薬剤感受性調査法を踏襲した。

本研究の MIC分布において 2峰性を示し，ブレー

クポイントを決めた薬剤は10薬剤であり， 2002年にブ

レークポイントが判定できた 8薬剤 (ABPC，KM，

OTC， OA， FMQ， CP， SMMX， TMP) (Kawanishi

et a1. 2006) より 2薬剤多い。ブレークポイントを比

較すると， FMQ， SMMXは2002年分離株と同じ値と

なったが， ABPC， KM， OTC， OA， CP， TMPは，

2002年分離株より 2~ 8倍高い値である。 しかし，

本研究のブレークポイン トを2002年分離株に適用しで

も，耐性株数に違いは見られなかった。2002年分離株

で見られず，本研究で初めて MIC分布の 2峰性とブ

レークポイントが確認されたのは DSM，FOMであ

る。これら 2薬剤のブレークポイントを2002年度分離

株に適用すると， DSM耐性菌が確認されるが， FOM

では確認できない。FOMは， 1994年に水産用医薬品

として承認された使用歴の短い薬剤であり，耐性は

22.7%であった。 また1990年に承認されたFFについて

は，本研究では耐性菌が見られなかった。

ABPC耐性 P.damselae subsp.ρiscicidaは， 1982年

に日本のブリ分離株から初めて報告され (Takashima

et a1. 1985)，以降1991年まで日本のブリ分離株におけ

る ABPC 耐性率が19.1~49.0%で推移したことが報告

されている (Takashimaet a1. 1985;楠田 ら 1988，1990;

Kim and Aoki 1993)。 しかしながら，その後2002年に

行われた調査では耐性率は2.8%でしかなく，本研究

168 古下・福田・福田・山下・柳-前野・田中・杉原・安部・長野・芝

でも 2003~2006年までの聞は o ~7.4%で推移し，そ

の後2008年と2009年にそれぞれ36.8%，29.8%にまで

急上昇する結果となった。この急激な ABPC耐性株

の増加時期は， 2007年を境に優占した RAPDパター

ンが P2から P4に大きく変化した時期と一致し，

RAPDパターン P4を示す115株中104株が ABPC耐性

であった。 ABPCi耐性株の急激な増加原因を突き止め

るために，聞き取りによる薬剤投与履歴を調べたが，

2008年と2009年の ABPC使用量は，それ以前に比べ

て増加したと言いきれる情報はなかった(データ未

掲載)。なお， 1981~1991年分離株の ABPC に対する

MICgo値は200μg/mlであり (Takashimaet a1. 1985;

阻m and Aoki 1993)，本研究の32μg/mlよりも 7倍

高い。

多剤耐性パターンについてみると， 2003~2006年

は 6薬 剤耐性パターン (OTC. CP・KM.FMQ.

OA. SMMX)が優占であり，これは2002年分離株の

薬剤耐性パターン (0τ'C. CP . KM . FMQ . OA .

SMMX) と同じであった。すなわち分離年，分離県

に関わらず本パターンの優占的分布が継続している

と考えられる。一方， 2002年分離株で報告された多剤

耐性パターン 5種類中 2パターンは本研究で見られた

が，毎年継続して出現する多剤耐性パターンはなかっ

た。これら散発的に出現するパターンは，優占的かっ

継続して出現する 6薬剤耐性パターンと薬剤の種類が

重なる部分が多いことから，この 6薬剤耐性パターン

を中心として，獲得または欠失によって新たな多剤耐

性パターンが出現している可能性がある。 2008年以降

増加した 7薬剤耐性パターン (ABPC. OTC . DSM .

FMQ . SMMX . TMP . FOM) は，水産用医薬品に含

められていない DSMとTMPを含み，本報告以前に

は見られない耐性パターンである。

耐性パターンと RAPD遺伝子多型 (Table3， 4)

との関係について見てみると， 7薬剤以上に耐性を示

す株は， 2006年までは各年分離株中 o~6.1%だった

のに対し， 2007年以降12.9~32.9%に増加し ABPC 耐

性率の急激な増加時期と一致していた。すなわち，

RAPDパターン P4が突然優占になり始めた2007年

と一致し， 2008年以降では， RAPDパターン P4を示

す菌群の21.4~31.8% (6~22株)が ABPC. OTC.

DSM . FMQ . SMMX . TMP . FOMからなる 7薬剤

耐性パターンを示した。したがってクローン変化を起

こした何らかの要因が薬剤耐性パターンを変化させた

可能性がある。例えば， 日本の養殖で使用される外国

産ブリ類(カンパチ，ヒラマサ)種苗の生産地の環境

負荷，種苗入替え，抗生物質使用などの状況変化など

も要因の可能性として否定できない。

今後多剤耐性や ABPC耐性が増加した理由を明ら

かにし，効果的な防疫法や投薬治療法を開発していく

必要がある。

要 約

2003~2009年に日本の養殖ブリ類から分離され

た 類結節 症 原 因 菌 Photobacteriumdamselae sul】sp.

ρゐcicida 247株について薬剤感受性調査を行った。

その結果，全ての株が少なくとも 1剤以上に耐性を

示し， 2峰性により耐性が確認された薬剤は10薬剤

(アンピシリン (ABPC) オキシテトラサイクリン

(OTC) ，クロラムフェニコール (CP)，カナマイシン

(KM)，ジヒドロストレプトマシシン (DSM)，フル

メキン (FMQ)，オキソリン酸 (OA)，スルファモ

ノメトキシン (SMMX)， トリメトプリム (TMP)，

ホスホマイシン (FOM)) であった。また， 55.5%

の株が 6剤耐性パターン (OTC.CP・KM.FMQ.

OA. SMMX) を示した。 RAPD(Random amplified

polymorphic DNA) 解析により，分離株は， 5つの

RAPD パターン (P2~P6) に分類された。 7剤以

上の多剤耐性が2007年以降増加し，同時期に優占な

RAPDパターンが P2から P4に変化した。

謝 辞

本研究は，農林水産省[平成15~24年度水産防疫技

術対策事業jにより実施した。感謝の意を表する。

文 献

Aoki， T. and T. Kitao (1985) Detection of transferable R

plasmids in strains of the fish-pathogenic bacterium，

Pasteurellaρiscicida.]. Fish Dis.， 8， 345-350

Bakopoulos， v.， A. Adams and R. H. Richards (2005) Some

biochemical properties and antibiotic sensitivities of

Pasteurella piscicida isolated in Greece and comparison

with strains from ]apan， France and ltaly.]. Fish Dis.， 18，

1【 7.

Balebona， M. C.， M. A. Morinigo， ]. Sedano， E. Martinez-

Mazanares， A. Vidaurre旬， ].]. Borrego and A. E.

Toranzo (1992) Isolation of Pasteurellα戸iscicidafrom sea

bass in southwestern Spain. Bull. Eur. Ass. Fish Pathol.，

12，168-170.

Kawanishi， M.， M. Kijima， A. Kojima， K. Ishihara， H. Esaki， K.

Yagyu， T. T;紘ahashi，S. Suzuki and Y.五mura(2006)

Drug resistance and random amplified polymorphic DNA

analysis of Photobacterium d，αmselae subsp. Piscicida iso-

lates from cultured Seriola (yellowtail， amberjack and

kingfish) in] apan. Lett. Appl. Microbiol.， 42， 648-653.

Kijima-Tanal王a，M.， M. Kawanishi， Y. Fukuda， S. Suzuki and K.

Photobacterium damselae subsp. Piscicid，αの薬剤感受性 169

Ya幻TU(2007) Molecular diversity of Photobacterium dam-

selae subsp. piscicida from cultured amberjacks (Seriola

spp.) in ]apan by pulsed-field gel electrophoresis and

plasmid profiles.]. APPI. Microbiol.， 103， 381-389.

Kim， E. H. and T. Aoki (1993) Drug resistance and broad geo-

graphical distribution of identical R plasmids of

Pasteurella piscicida isolated from cultured yellowtail in

]apan. Microbiol. Immunol.， 37， 103-109.

窪田三郎・木村正雄・江草周三 (1970)養殖ブリ稚魚の細

菌性類結節症の研究一1.魚、病研究， 4， 111-118.

楠田理一・山岡政興 (1972)養殖ハマチの細菌性類結節症の

原因菌に関する研究一1.形態学的ならびに生化学的性

状による種の同定. 日水誌， 38， 1325-1332.

Kusuda， R. and K. Kawai (1998) Bacterial diseases of cultured

marine fish in ]apan. Fish Pathol.， 33， 221-227.

楠田理一・板岡 陸・川合研児 (1988)1984年および1985年

に養殖ブリから分離されたPasteurellaPiscicidaの薬剤感

受性. 日水誌， 54， 1521-1526.

楠田理一・杉浦浩義・川合研児 (1990)1986年から1988年に

養殖ブリから分離された Pasteurellapおcicid，αの薬剤感

受性. 日水誌， 56， 239-242.

Iρpez， C.， P. R. Rajan， ]. H. Y. Lin， T. Y. Kuo and H. L. Yang

(2002) Disease outbreak in seafarmed cobia (Rachycentron

canadum) associated with Vibrio spp.， Photobacterium

damselae subsp. piscicida， monogenean and myxosporean

parasites. Bull. Eur. Ass. Fish Pathol.， 22， 206-211.

Magarinos， B.， ]. L. Romalde， 1. Bandin， B. Fouz and A. E.

Toranzo (1992) Phenotypic， antigenic， and molecular

characterization of Pasteurella piscicida strains isolated

from fish. Ap戸1.Environ. Micr叫 iol.，58， 3316-3322.

Magarinos， B.， A. E. Toranzo， ]. L. Barja and ]. L. Romalde

(2000) Existence of two geographically-linked clonal lin同

eages in the bacter匂1fish pathogen Photobacterium dαm-

selae subsp. jうiscicidaevidenced by random amplified

polymorphic DNA analysis. 砂idemiol. Ii処fect.，125，

213-219.

Mar白lez-Manzanares，E.， S. T. Tapia-Paniagua， P. Diaz-Rosales，

M. Chabril1on and M. A Mori白igo(2008) Susceptibility

of Photobacterium damselae subsp. piscicida strains

isolated from Senegalese sole， Solea senegalensis Kaup， and

gilthead seabream， Sparusαurata L.， to several antibacte-

rial agents，J Fish Dis.， 3，73-76.

National committee for clinical laboratory standards (2002)

Performance standar由 forantimicrobial disk and dilution

susceptibi1ity tests for bacteria isolated from animals.

Approved standard M31-A2. Wayne， PA: National

committee for clinicallaboratory standards， 86 pp.

National committee for clinical laboratory standards (2006)

Methods for dilution antimicrobial susceptibility tests for

bacteria that grow aerobically. Approved standard M7-A7.

Wayne， PA: National committee for clinical laboratory

standards， 49 pp.

農林水産省大臣官房統計部 (2012)平成23年漁業・養殖業

生産統計年報， 30pp.

Snieszko S. F.， G. L. Bullock， E. Hollis and]. G. Boone (1964)

Pasteureu，αsp. from an epizootic of white perch (Roccus

americanus) in Chesapeake bay tidewater areas. ].

Bacteriol.， 88， 1814-1815.

Takashima. N.， T. Aoki and T. Kitao (1985) Epidemiological

surveil1ance of drug-resistant strains of PasteurellαPiscι cida. Fish Pathol.， 20， 209-217.

τnyssen， A. and F. 01levier (2001) In vitro antimicrobial sus-

ceptibility of Photobacterium damselae subsp.戸iscicidato

15 different antimicrobial agents. Aquaculture， 200，

259-269.

Toranzo， A. E.， S. Barreifo， ]. F. Casal， A. Figueras， B.

Magarinos and ]. L. Barja (1991) Pasteurel10sis in cul-

tured gilthead seabream (Sparusαurata): first report in

Spain. Aquaculture， 99， 1-15.

柳 宗悦・平江多績・村瀬拓也・仁部玄通・加塩信広・竹

丸 巌 (2012)鹿児島県のカンパチ養殖における魚病

発生の変遷.鹿水技研報， 3， 45-55.

Zappulli， v.， T. Patarnel1o， P. Patarnello， F. Frassineti， R.

Franch， A. Manfrin， M. Castagnaro and L. Bargelloni

(2005) Direct identification of Photobacterium damselae

subspecies piscicida by PCR-RFLP analysis. Dis. Aquat.

Org.， 65， 53-61.