CROMATOGRAFÍA DE GASES CON DETECTOR DE ESPECTROMETRÍA DE MASAS: GC-MS 20-02-2015 Dr. Rafael Núñez Gómez.
CROMATOGRAFÍA DE GASES CON DETECTORDE ESPECTROMETRÍA DE MASAS:
GC-MS
20-02-2015 Dr. Rafael Núñez Gómez.
software
Muestreador automático
Cromatograma
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Funcionamiento del GC: la columna cromatográfica
5% diphenyl dimethylpolysiloxane
La elevada resolución en GC capilar, evita el tener que usar muchas columnas de diferentes selectividades.
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Funcionamiento del MS: la fuente de ionización por Impacto Electrónico (EI)
Ionización “dura”, produce gran fragmentación
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Funcionamiento del MS: la fuente de ionización por Impacto Electrónico (EI)
• La EI es muy reproducible, incluso entre equipos de distintos fabricantes
• Posibilidad de LIBRERÍA DE ESPECTROS DE MASAS . “HUELLAS DACTILARES DE LAS MOLECULAS”
• El software de los equipos GCMS permite comparar los espectros de masas con los que proporciona la librería suministrada para identificar compuestos desconocidos
(en el SIC la librería es la NIST-08)
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Funcionamiento del MS: la fuente de ionización por Ionización Química Positiva (CI)
Ionización blanda, proporciona información del PESO MOLECULAR DEL COMPUESTO
MeOH
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Funcionamiento del MS: el analizador de masas (Trampa de Iones)
Full Scan, SIM o Ms/Ms
Separa los iones por sus masas y después los cuenta
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Funcionamiento del MS: el analizador de masas (Trampa de Iones)
De espectro de masas a cromatograma
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Funcionamiento del MS: el analizador de masas (Trampa de Iones)
• Análisis TIC Full Scan: el cromatograma (señal vs tiempo) es de todos los iones.
• Análisis SIM: el cromatograma (señal vs tiempo) es de uno o unos pocos iones.
• Análisis Ms/Ms: el cromatograma (señal vs tiempo) es de los iones “hijo” procedentes de la fragmentación de un ion “padre” previamente seleccionado.20-02-2015 Dr. Rafael Núñez Gómez.
Funcionamiento del MS: El Software. La librería NIST 08
-15-14
NIST 08: 220.460 espectros
NIST 14: 276.248 espectros
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CUANDO USAR GC-MS
Según las características de la investigación
• Compuestos desconocidos (identificación o información estructural)• Compuestos conocidos (screening o cuantitativo)
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1. Compuestos desconocidos: metabolitos de pesticidas.
OxyfluorfenTebuconazol Muestra inicial
Muestra a los 30 díasDisminución clara de Oxyfluorfenpero no de Tebuconazol
Oxifluorfen Inicial
A los 30 días
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OxyfluorfenTebuconazol Muestra inicial
Muestra a los 30 díasDisminución clara de Oxyfluorfenpero no de Tebuconazol
RH-35451
RH-120162
RH-35450
Metabolitos de Oxifluorfen tras estudiar los espectros de fragmentación. No se tienenlos patrones puros ni aparecen en la librería.
1. Compuestos desconocidos: metabolitos de pesticidas.
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2. Compuestos desconocidos:Presencia de Salicilato de Hexilo en plantas de olivo infectadas con E. Olivina
Planta no infectada
Planta infectada
Salicilato de metilo
Salicilato de hexilo
Planta no infectada
Planta infectada
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3. Compuestos conocidos: análisis de hidrocarburos aromáticos policíclicos (PHAs) por SIM
naftaleno
C1-naftalenos
C2- naftalenos
C3- naftalenos
fenantreno
BTEX
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Patrón con 90 pesticidas (método desarrollado para 130)
4. Compuestos conocidos:Análisis de pesticidas por Ms/Ms
El MS separa lo que no separa el GC: máximo poder de confirmación.
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Muestra con 90 pesticidas (método desarrollado para 130)
4. Compuestos conocidos:Análisis de pesticidas por Ms/Ms. Cuantitativo con patrón interno (P.I.)
Clorpirifosr2 0,997719RSD 7,179%
Etofenproxr2 0,997033RSD 7,751%
Tetraconazolr2 0,998165RSD 9,252%
Entre 10 y 100 ppb (ng/ml)20-02-2015 Dr. Rafael Núñez Gómez.
CUANDO USAR GC-MS
Según las características de
la matriz
• Gases permanentes (nuevo equipo microGC)• Compuestos volátiles (HS, SPME, nuevo ITEX-2)• Soluciones acuosas (SPME con o sin derivatización)• Soluciones orgánicas (inyección líquida)• Otras matrices requieren de extracción previa
Según las características de la investigación
• Compuestos desconocidos (identificación o información estructural)• Compuestos conocidos (screening o cuantitativo)
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Nuevo equipamiento: análisis de gases permanentes mediante MicroGC
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Nuevo equipamiento: análisis de gases permanentes mediante MicroGC
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Análisis de compuestos volátiles: el automuestreador con Head Space
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• Extracción-Cocentración-Análisis, todo automatizado y en línea con el GC
• Muy sensible (ppt)• Análisis de volátiles• Análisis de sólidos (Head Space)• Análisis de soluciones acuosas (Head
Space o Inmersión)
Análisis de compuestos volátiles: el automuestreador con SPME
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Análisis de volátiles en Plantas con SPME.
20-02-2015 Dr. Rafael Núñez Gómez.
Análisis de volátiles en Plantas con SPME.
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Ejemplo de análisis de volátiles en Plantas.Identificación de volátiles en plantas de tomate
Muestra problema Posible compuesto CAS number Formula
Inyecc. Planta L8 (1) 1-28-
2013 3-04-47
Tiempo Retencion
Indice de Retencion
Indice de Retencion
Teorico (NIST)
13,278 936,3 alfa pinene 7785-70-8 C10H16 948
15,212 969,1 1,3,5-Cycloheptatriene, 3,7,7-trimethyl 3479-89-8 C10H14 1010
16,197 986,3 beta pinene 127-91-3 C10H16 943
16,694 995,0 2-Carene 554-61-0 C10H16 948
17,014 1000,7 γ-Terpinene 99-85-4 C10H16 998
17,582 1010,9 α-Terpinen 99-86-5 C10H16 998
18,298 1023,8 limonene 138-86-3 C10H16 1018
19,202 1040,4 1,3,6-Octatriene, 3,7-dimethyl-, (Z,E) 13877-91-3 C10H16 976
21,106 1076,3 α-Terpinolen 586-62-9 C10H16 1052
32,859 1326,8 sesquiterpeno 1 C15H24
33,097 1332,4 δ-Elemene 20307-84-0 C15H24 1377
35,4 1388,2 β-Elemene 515-13-9 C15H24 1398
36,76 1422,2 β-Caryophyllene 87-44-5 C15H24 1494
37,03 1429,0 γ-Elemene 339154-91-5 C15H24 1465
37,59 1443,3 sesquiterpeno 2 C15H24
38,194 1458,9 α-Caryophyllene 6753-98-6 C15H24 1579
39,22 1485,8 Germacrene D 23986-74-5 C15H24 1515
42,32 1570,1 sesquiterpeno 3 C15H24
43,23 1595,8 Caryophyllene oxide 1139-30-6 C15H24O 1507
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Nuevo equipamiento: el Automuestreador con ITEX-2
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Análisis de soluciones acuosas con SPME:Degradación de dicloroanilina por hongos.
Inmersión
Directa para poco
volátiles
Espacio en
Cabeza para
volátiles
DOS OPCIONES DE MUESTREO
SOLUCIÓN ACUOSA
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Análisis de soluciones orgánicas: inyección de líquidos.
Se inyecta 1-2µl normalmente
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Patrón Fame MixSupelco 47885-U.
Ionización EI.
Patrón Fame MixSupelco 47885-U.
Ionización CI.
Ácido C18:0 como ester metílicoMW=158
No hay fragmentación, solo ión molecular M+1 =
m/z 159
Fragmentos típicos de los ácidos grasos (fames).El ión molecular m/z 158 apenas se observa
?
Análisis de soluciones orgánicas: ácidos grasos con EI y CI.Derivatizados como ésteres metílicos (fames)
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Análisis de soluciones orgánicas: aminoácidos en extracto de aceite de oliva (derivatizados como TBDMS).
Ala Gl
y
Val
Leu
i-Leu
Pro
Met Ser
Thre
Phe
Asp. Acid
Cys
Glu. Acid
Arg
Lys HisTyr
Tryptophan
P.I.
Patrón de 500pmoles/µl (derivatizados TBDMS)
Muestra real
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Análisis de azúcares en tomate Cherry (derivados TMSO).
Glucosa 1
Glucosa 2 + Galactosa 2
Fructosa 1Fructosa 2
SacarosaAprox. 8ppm
Inositol
Análisis de azúcares (derivados TMSO) en 67mg de Tomate Cherry
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Otras matrices requieren de extracción previa:
SecadoLiofilizadoHomogeneizadoExtracción por Líquido/Líquido, Ultrasonidos, Soxhlet, Columnas SPE, etc.ConcentraciónAclarado Adición de Patrón InternoDerivatización…
Lo debe realizar el usuario con nuestra
supervisión
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CUANDO USAR GC-MS
Según las características de
la molécula
• Peso molecular <500 u.m.a.• Polaridad baja o media (derivatización)• Fácilmente volatilizable (<300°C)• No ionizada• Siempre fragmenta
Ácidos grasos Aminoácidos Monosacáridos y disacáridos Alcanos PHAs Aldehidos, cetonas y alcoholes simples Volátiles en plantas Pesticidas y metabolitos Ácidos fenólicos Gases permanentes
Según las características de la investigación
• Compuestos desconocidos (exclusivamente por GCMS)• Compuestos conocidos (screening o cuantitativo)
Según las características de
la matriz
• Gases permanentes (nuevo equipo microGC)• Compuestos volátiles (HS, SPME, nuevo ITEX-2)• Soluciones acuosas (SPME con o sin derivatización)• Soluciones orgánicas (inyección líquida)• Otras matrices requieren de extracción previa
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Qué es la derivatización.
Es un proceso que permite:
1. El análisis de compuestos con poca volatilidad o estabilidad.
2. Mejorar el comportamiento cromatográfico o la detectabilidad.
Se realiza modificando químicamente los grupos funcionales (-OH, -COOH, -NH, -SH) para hacerlos más apolares e inertes.
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Qué es la derivatización.
1. Sililación:
R-OH R-O-Si(CH3)3 ; derivados TMS (uso general).R-OH R-O-Si(CH3)2C(CH3)3 ; derivados TBDMS (para aa).
2. Acilación:
R-OH R-O-COCH3
3. Alquilación:
R-COOH R-COOCH3 ; derivados FAME (para ácidos grasos).
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ANALISIS DE MUESTRAS MARCADAS CON ISOTOPOS ESTABLES 13C, 15N, 2H, 18O
Muestra natural Muestra marcada 13C 30%Muestra marcada 13C 99%
Fame C14:0MW 242
Fame C15:0MW 256
Fame C16:0MW 270
Fame C18:0MW 298
Fame 13C14:0MW 242+14=256
Fame 13C16:0MW 270+16=286
Fame 13C18:0MW 298+18=316
243
257
271
299
243252
271 282
300 310
257
287
317
20-02-2015 Dr. Rafael Núñez Gómez.
GraciasY recuerda…
20-02-2015 Dr. Rafael Núñez Gómez.