2 dimensionale -NMR Spektroskopie F.D. Sönnichsen Mittwoch, Oct 22 2008
2 dimensionale -NMR Spektroskopie
F.D. SönnichsenMittwoch, Oct 22 2008
• Kopplung über Bindungen• COSY (DQF-COSY)• TOCSY
• Kopplung durch den Raum• NOESY• ROESY
• Kopplung über Bindungen• HETCOR• (Long-range HETCOR or
COLOC)• INADEQUATE• INDIRECT-DETECTION
(HSCQ, HMQC, HMBC)
Homonuklear Heteronuklear
NMR – die Suppenterrine voller Abkürzungen
Problem
Bei komplexeren, größeren Verbindungen erschwert die Zahl der Resonanzen und deren eventuelle Überlappung die eindeutige Zuordnung
Beispiel: ein Protein (120 Aminosäuren)
ppm01234567891011
1D 1H-NMR Spektrum:Ein sehr kompliziertes Spektrum mit dramatischer Überlappung der Resonanzlinien. Man kann nur wenig Informationen extrahieren, und es ist bis auf ein paar Außnahmen unmöglich einzelne Resonanzen zuzuordnen.
Zwei dimensionales NMR (2D)
Die zwei grundlegenden/einfachen 1D-NMR Experimente
Der Prototyp eines 2D- Experimentes
Das einfachste 2D- Experiment
Mischung
N-fach wiederholen, Jedes Mal mit dem Δt1 –Delay um ein Inkrement verlängert. Die einzelnen FIDs werden getrennt gespeichert.
Direkte Dimension
Indirekte Dimension
Perioden im2D Experiment:
EquilibrierungVorbereitung
Frequenz-Bestimmung
Akquisition/Detektion
Die Wirkung von Pulsen auf die Magnetisierung
Vektor-Diagramm Analyse des 2D-Experimente –die Frequenzbestimung in der indirekten Dimension
FID 1:
FID 2:
FID 3:
FID 4:
90xT1=0
T1=τ
T1=2τ
T1=3τ
90x
Acq
Acq
Acq
Acq
t1
90x 90x
t2
n
Eine Komponente der Magnetisierung wird durch den zweiten Puls in Z-Richtung weitergedreht, während die zweite Komponente in der transversalen Ebene bleibt. Die Amplitude ist jedoch verringert, sie ist Sinus-moduliert. Was passiert wenn wir das Experiment wiederholen, jedesmal mit einer systematisch verlängerten Delay-Zeit?
x
Fourier transform with respect to t1
Zur Vereinfachung werden 2D-Spektren im allgemeinen nicht im Seitenblick gezeigt (links, „stacked plot“), sondern in der Aufsicht (rechts). In dieser liegen beide Frequenzachsen in der Papierebene, und die Intensität des Peaks ist vertikal angezeigt in der Form von Höhenlinien / Konturen.
Zwei Spins, I und S
F2
F1
Diagonalpeak von S
Diagonal
Cross peakωS, wS
ωI
ωI,ωI
Die Diagonale dieses Spektrums ist das 1D-Spektrum.
ωI,ωS
Das 2D COSY Experiment
H
• Dieses Zwei-Puls experiment ist auch tatsächlich ein sehr nützliches Experiment. Es wird benutzt, um koppelnde Protonen zu identifizieren, also Protonen die über J-Kopplungen miteinander verbunden sind. Das Experiment nennt sich COSY, als Abkürzung für homonuclear COrrelation SpectroscopY .
• Gleichzeitig ist anzumerken, dass alle 2D Experimente diese Grundstruktur haben, und sich nur in der Mitte durch das Einfügen weiterer/anderer Pulse und Delays unterscheiden.
• Für gekoppelte Spins (I,S) mischt sich die Magnetisierung während t1 (Ix -> IxSz).
• Der zweite Puls wirkt auf diesen gemischten Term, und konvertiert ihn (IxSz ->IzSx) .
• In t2- ensteht dann/ wird detektiert Magnetisierung beim Kern S (IzSx-> Sz), die vom Kern I stammt, und deren Frequenz während der t1–Frequenzbestimmung die Larmorfrequenz von Kern I war.
• Ergebnis: ein Peak, der in t1 mit der Frequenz I moduliert ist, und in t2 mit der Frequenz S moduliert ist
• Off-diagonal peak=ein Peak der nicht auf der Diagonalen des Spektrums liegt.
• Dieser Peak verbindet die miteinander koppelnden Protonen/Spin I und S, und wird zur Identifizierung der Kopplung/ der Nachbarschaft der Kerne benutzt.
F2
F1
(ähnliche peaks für S)
Diagonale
Cross peakωS
ωI
ωI,ωI
The correlation appears at the frequency of the two coupled spins, with the frequency of one proton in the direct dimension,and the frequncy of the other in the indirect dimension
ωI,ωS
CHI
HS
COSY Spektrum von Ethylacetat / Essigsäureester
1D Spektren an den Seiten sind zu Anfang hilfreich .
These couple No coupling
crosspeaks
3J = 12 Hz
Ein weiteres Beispiel
1D-NMR spectra of Ipsenol
Which peaks are neighbors and are coupled ? beyond matching coupling constants
Homonuclear spectra are symmetric as the coupling from one proton to the other is the same as the reverse! Therefore , one often symmetrizes these during processing and plotting.
DQF-Cosy
Das DQF-COSY ist eine Variante des COSY experimentes. Es ist sehr ähnlich, und zeigt praktisch identische Information-Peaks. Es ist jeder etwas weniger empfindlich, hat aber schärfere Diagonalen und Singulett-Unterdrückung, sieht von daher besser aus.
Um CROSS peaks im COSY zu sehen , brauchen wir Kopplunskonstanten von mehreren Hz. Daher sehen wir Kopplungen in diesem Experiment nur für die rot-umrandeten Kopplungen, primär alle geminal und vicinal protons , rarely for protons which are separated by 4 or more bonds
COSY Zusammenfassung• Ein 2D-Experiment, mit zwei Frequenzachsen• Ein Proton – Proton Experiment, d.h. homonuklear• Die Diagonale ist das 1D-Spektrum• Das Spektrum ist symmetrisch• Basiert auf 2,3J Kopplungen, die die Magnetisierung von
Spins mischen und dadurch correlieren-verbinden• Koppelnde Protonen sind verbunden durch Kreuzpeaks-
Cross peaks oder off-diagonal peaks (Correlations)
Cross Peaks enstehen nur durch große Kopplungen, also normalerweise:
Geminale Protonen • Vicinale Protonen, Dieder-Winkel abhängig. • Selten weiter Kopplungen , aber öglich ccasionaly longer
range coupling if J>2 Hz (Homoallyl coupling)
Korrelation von unterschiedlichen KernenDas HETCOR Experiment(traditionelle,ursprüngliche Weg, Protonen mit HeteroAtomen zu koppeln)Jetzt selten benutztNOTE: Detektion des Kohlenstoffes
Das HMQC Experiment(Heteronuclear multiple quantum coherences)Benutzt die direkte 1J-Kopplung der gebundenen Atome. Detektiert mit Proton. Sehr empfindlich . Der benutzte Wert für J ist typischerweise145 Hz.
Note: der Entkoppler –Decoupler während der Detektionszeit führt zur Aufnahme von Singuletts,ungespaltete Signale
Note: the spectra are flipped, as the detected dimensions are opposite in the experiments, and it is convention to present the direct dimension F2 at the bottom
These spectra also show nicely that largely down/upfield shifts of proton and carbon resonances are largely correlated.
Note: no diagonal! Since hetero!
J. B. Lambert & E. P. Mazzola, Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy, Pearson Prentice Hall, 2004
HSQC –Analoges Experiment zum HMQC
•Das HSQC ist wesentlich komplizierter auf der spektroskopischen Seite (Zahl der Pulse, delays etc.)•Gleiche Peaks wie das HMQC - Korrleation von H mit direkt gebundenen X-Kern (13C oder 15N)•selektive Nutzung der 1J-Kopplung
Das HMBC experiment• Wir haben Protonen direkt verbunden (COSY) • Wir haben 13C mit direkt gebunden Protonen verbunden mit der 1J
coupling (HMQC)• Können wir auch Fernkopplungen nutzen?
1. Das HMBC selektiv detektiert Protonen und 13C die über kleine 2,3J Kopplungen verbunden sind (Größenordnung 10 Hz).
2. Hilfreich zum detektieren von quartären Kohlenstoffen3. Und zum Verbinden von Spinsystemen öber quartäre C hinweg
MB steht für Multiple bonds
1
1
2
2
3
3
1
1
2
2
3
3
2JH1-C2
3JH3-C1
IpsenolNote : the arrows indicate artifacts, i.e. direct couplings which are not completely removed. These are 1J couplings, ad can be identified by their large splitting. Since we don‘t decouple during t2, the 1J couplings constant splits the signal into a doublett, with the ~145 J separation
More on 2D:
• Also, the principle can be extended to 3D, 4D and even higher experiments, i.e. even more frequencies can be simultaneously detected What is the caveat ?
•• A 1D spectrum takes minutes, a 2D hours,
a 3D days, a 4D ……
More on 2D:
• Many more 2D experiments can be created , that correlate the same or further nuclei with desired specificity
• Most of these experiments correlate nuclei using coupling constants, i.e. the correlate through bonds.
• Some also offer the possibility to correlate nuclei through space
References
J. B. Lambert & E. P. Mazzola, Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy, Pearson Prentice Hall, 2004
RM Silverstein, FX Webster & DJ Kiemle, Spectrometric Identification of Organic compounds Wiley 2005.