1 Imunofluorescencija • 1944. - Robert Coons – protutijela se mogu označiti molekulama koje imaju sposobnost fluorescencije • fluorokromi - apsorbiraju svjetlost jedna valne duljine (ekscitacija), a emitiraju svjetlost druge valne duljine (emisija) • fluorescencijski mikroskop – izvor UV svjetla – vizualizacija molekula protutijela obilježenih fluorokromom vezanih za antigene na stanicama ili tkivnim preparatima
17
Embed
1944. - Robert Coons – protutijela se mogu označiti ... · -protočna citometrija je jedna od ključnih metoda u imunologiji i staničnoj biologiji -tipizacija leukemija protočnim
This document is posted to help you gain knowledge. Please leave a comment to let me know what you think about it! Share it to your friends and learn new things together.
Transcript
1
Imunofluorescencija
• 1944. - Robert Coons – protutijela se mogu označiti molekulama koje imaju sposobnost fluorescencije
• fluorokromi - apsorbiraju svjetlost jedna valne duljine (ekscitacija), a emitiraju svjetlost druge valne duljine (emisija)
• fluorescencijski mikroskop – izvor UV svjetla – vizualizacija molekula protutijela obilježenih fluorokromom vezanih za antigene na stanicama ili tkivnim preparatima
2
Imunofluorescencija
Na koje regije protutijela se konjugiraju fluorokromi?
3
Imunofluorescencija
Koje su prednosti indirektnog bojenja staničnih ili tkivnih preparata pomoću
fluorescencijskih protutijela nad direktnim?
4
Detekcija IgM protutijela pomoću anti-IgM protutijela s konjugiranim rodaminom
Detekcija β stanica Langerhansovih otočića gušteraće pomoću protutijela specifičnih za enzim dekarboksilazu
glutaminske kiseline (GAD) konjugirana na zelenu fluorescencijsku boju (npr. fluorescein)
Detekcija α stanica pomoću protutijela specifičnih za hormon glukagon konjugirana na narančastu fluorescencijsku boju
(npr. rodamin)
5
Primjeri upotrebe -za identifikaciju subpopulacija limfocita (CD4+ i CD8+ subpopulacija T limfocita) -za identifikaciju pojedinih vrsta bakterija -za detekciju Ag-Ab kompleksa u autoimunim bolestima -za detekciju komponenti komplementa u tkivima -za lokalizaciju hormona i ostalih staničnih produkata, in situ (lokalizaciji antigena u tkivnim preparatima ili u subcelularnim odjeljcima) -može se koristiti za mapiranje lokacije ciljnih antigena Područje imunohistokemije, te fluorescencijske mikroskopije (izuzetno važne tehnike za istraživanje molekularne arhitektura tkiva ili organa)
PRIMJENA (u klinici i istraživanju) – određivanje vrste i broja leukocita u uzorku krvi (koliko stanica eksprimira ciljni antigen, distribucija stanica u uzorku, veličina stanica) -analiziranje populacija stanica koje su označene s 2 ili čak 3 različita protutijela (svako označeno različitom fluorescencijskom bojom) (postoje brojne varijacije takvih multikolornih analiza) -protočna citometrija je jedna od ključnih metoda u imunologiji i staničnoj biologiji -tipizacija leukemija protočnim citometrom, odn. imunofenotipizacija -mjerenje subpopulacija T stanica (važan prognostični indikator za AIDS) - itd.....
Protočni citometar
10
PRIMJENA U ISTRAŽIVANJU U PODRUČJU BIOLOGIJE MORA: uzorak fotosintetskog pikoplantona iz mora pokazuje 3 različite populacije
Protočni citometar
11
Alternative reakcijama antigena i protutijela protein A i G
Protein A - Staphylococcus aureus Protein G - Streptococcus
12
Alternative reakcijama antigena i protutijela avidin (streptavidin) – biotin kompleks
avidin – glikoprotein iz bjelanjka jajeta streptavidin – bakterijski protein (Streptomyces avidinii) biotin – vitamin esencijalan za sintezu masti Ka: oko 1015
13
Alternative reakcijama antigena i protutijela avidin (streptavidin) – biotin kompleks
14
Alternative reakcijama antigena i protutijela avidin (streptavidin) – biotin kompleks
15
Alternative reakcijama antigena i protutijela avidin (streptavidin) – biotin kompleks
16
Alternative reakcijama antigena i protutijela avidin (streptavidin) – biotin kompleks
17
Imunoelektronska mikroskopija
Površina B-staničnog limfoma: Veće točke – protutijela specifična za MHC klasu II označena česticama zlata veličine 30 nm Manje točke – protutijela specifična za MHC klasu I označena česticama zlata veličine 15 nm
• vizualizacija specifičnih intracelularnih komponenti • oznaka visoke elektronske gustoće
– feritin (globularni protein plazme, veže željezo) – čestice koloidnog zlata
konjugirana na Fc regiju specifičnog protutijela (direktno bojanje) ili na sekundarno protutijelo (indirektno bojanje)