(19) 대한민국특허청(KR) (12) 등록특허공보(B1) (45) 공고일자 2012년06월26일 (11) 등록번호 10-1160095 (24) 등록일자 2012년06월20일 (51) 국제특허분류(Int. Cl.) C12N 15/82 (2006.01) A01H 1/00 (2006.01) C12N 15/29 (2006.01) C07K 19/00 (2006.01) (21) 출원번호 10-2009-0125389 (22) 출원일자 2009년12월16일 심사청구일자 2009년12월16일 (65) 공개번호 10-2011-0068431 (43) 공개일자 2011년06월22일 (56) 선행기술조사문헌 US20030165543 A1 KR1020040087094 A KR1020070007582 A US20030204864 A1 (73) 특허권자 경기도 경기도 수원시 팔달구 효원로 1 (매산로3가) (72) 발명자 소호섭 경기도 화성시 진안동 935번지 월드메르디앙APT 104-807 한영희 경기도 수원시 팔달구 세지로314번길 73 (지동) (뒷면에 계속) (74) 대리인 신명건, 권경희 전체 청구항 수 : 총 7 항 심사관 : 김정희 (54) 발명의 명칭 설사병 백신활성 유전자를 발현하는 형질전환 벼 및 그의 생산방법 (57) 요 약 본 발명은 설사병 백신활성 유전자를 발현하는 형질전환 벼 및 그의 생산방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 설사병의 주된 원인세균인 콜레라균과 대장균으로 부터 유래된 유전자를 유전자 재조합 방법에 의해 벼에 삽입 하여서 제조되는 형질전환 벼의 생산 방법, 상기 방법으로 얻어지는 형질전환 벼, 상기 형질전환 벼로 부터 얻 어지는 설사병의 백신으로 유용한 융합단백질 및 그의 수득방법에 관한 것이다. 본 발명에 따르면, 설사병 백신활성 유전자를 발현하는 형질전환 벼를 생산하여 이를 식물성 사료로써 가축에 게 제공함으로써 축산산업에서 항생물질의 사용을 현저하게 감소시켜 농가의 축산 비용을 줄이는 경제적인 효 과를 얻을 수 있다. 이러한 항생물질 사용량의 감소는 경제적인 효과 이외에 소비자 건강에도 기여할 수 있다. 대 표 도 - 도4 등록특허 10-1160095 -1-
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(19) 대한민국특허청(KR) (12) 등록특허공보(B1) · 홍순성 경기도 수원시 권선구 매실로 70, lg삼익아파트 113동 605호 (호매실동) 양문식 전라북도
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(19) 한민 특허청(KR)
(12) 등 특허공보(B1)
(45) 공고 2012 06월26
(11) 등 10-1160095(24) 등 2012 06월20
(51) 특허 (Int. Cl.)
C12N 15/82 (2006.01) A01H 1/00 (2006.01)
C12N 15/29 (2006.01) C07K 19/00 (2006.01)(21) 원 10-2009-0125389
(22) 원 2009 12월16
심사청 2009 12월16
(65) 공개 10-2011-0068431
(43) 공개 2011 06월22
(56) 행 사 헌
US20030165543 A1
KR1020040087094 A
KR1020070007582 A
US20030204864 A1
(73) 특허
경 도
경 도 원시 달 원 1 (매산 3가)
(72)
경 도 시 진안동 935 지 월드 앙APT104-807
한
경 도 원시 달 지 314 73 (지동)
(뒷 에 계 )
(74) 리
신 건, 경
체 청 항 : 7 항 심사 :
(54) 사병 신 하는 질 벼 그 생산
(57) 약
본 사병 신 하는 질 벼 그 생산 에 한 것 , 욱 상 하게는
사병 주 원 균 라균과 균 래 재 합 에 해 벼에 삽
하여 는 질 벼 생산 , 상 얻어지는 질 벼, 상 질 벼 얻
어지는 사병 신 한 합단 질 그 득 에 한 것 다.
본 에 , 사병 신 하는 질 벼 생산하여 식 사료 가 에
게 공함 산산업에 항생 질 사 하게 감 시 가 산 비 는 경
과 얻 다.
러한 항생 질 사 량 감 는 경 과 에 비 건강에도 여할 다.
도 - 도4
등록특허 10-1160095
- 1 -
(72)
지
울특별시 악 7 16, 302동 1004( 천동, 낙 타운)
재욱
경 도 원시 31, 신안 303동1002 ( 동, 림아 트)
경열
경 도 시 우동 55 지 동탄 당마 슬아 트 145동 1803
경 도 원시 통 청 33, 삼 미안433동 1204 ( 통동)
경 도 원시 매실 70, LG삼 아 트113동 605 ( 매실동)
양 식
라 도 주시 진 내 120, 4차아트 402동 504 ( 천동1가)
경 도 원시 매실 70, LG삼 아 트107동 1803 ( 매실동)
한
경 도 원시 달 양 50 30, 벽산블루APT 121동 404 ( 동)
등록특허 10-1160095
- 2 -
특허청
청 항 1
1) 열 1 시 는 Vibrio cholerae 독 B 브 니트 , 열 2 시 는
Escherichia coli 독 B 브 니트 bar pMJ103 에 삽 하여 재 합
하는 단계;
2) 상 pMJ103 재 합 아그 리움에 삽 하여 질 균주 얻는 단계;
3) 러 도 벼 에 상 단계 2)에 얻어진 질 아그 리움 하여 공동 양하는
단계;
4) 상 단계 3) 생 러 별하여 2차 양한 후, 2차 양 러 별하는 단계;
5) 별 2차 양 러 양하여 재 식 체 MS0 지에 근시키는 단계;
6) 상 단계 5)에 얻어진 근 식 체 시 양에 앙하여 벼 질 체 하는 단계 포
함하는 것 특징 하는 사병 신 하는 질 벼 생산 .
청 항 2
1항에 생산 는 사병 신 하는 질 벼.
청 항 3
2항에 벼에 는 합단 질.
청 항 4
3항에 어 , 상 합단 질 사병 신 가지는 것 합단 질.
청 항 5
3항 또는 4항에 어 , 상 합단 질 가 사병 신 가지는 것 합단 질.
청 항 6
5항에 어 , 상 합단 질 돼지 또는 사병 신 가지는 것 합단 질.
청 항 7
3항에 합단 질 하는 사병 신 .
상 한
야
본 사병 신 하는 질 벼 그 생산 에 한 것 , 욱 상 하게[0001]
는 사병 주 원 균 라균과 균 래 재 합 에 해 벼에
삽 하여 는 질 벼 생산 , 상 얻어지는 질 벼, 상 질 벼
얻어지는 사병 신 한 합단 질 그 득 에 한 것 다.
경
(Vaccination)에 사 는 질 신 라 하 , 근에는 열에 안 하고 경 여가 가능할 뿐만[0002]
아니라 보다 하게 보 는 신 개 연 가 진행 고 다.
재 신 개 시 가지고 는 가지 고가 생산 비, 과 시에 하는 냉[0003]
등록특허 10-1160095
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비 경 담 신 여 어 움, 주사 맞는 것에 한 사람들 보편 거 감 등 다.
라 , 상 같 해결하고, 택 거 누리지 못하고 는 개 어린
해 라도 체 신 개 고 는 것 계 다.
러한 체 신 개 연 에 질 통한 경 식 신 그 가능 아 신개[0004]
새 운 향 리 매 하고 다. 경 식 신 재 합 신 안 과 경 신 에 어
월 과 시킨 항원 식 체 , 식 체에 질 시
식 취하듯 경 여 시행함 역 도하게 다.
신 에 라 여러 가지 태 할 는 , 병원체에 항원 하는[0005]
만 하여 균 나 , 식 에 생산하는 재 합 신 가 진보 태 신
간주 고 다( 1999).
식 신에 한 연 에 해 담 에 B 간염 러 신 (Mason 등 1992, Thanavala 등 1995), 감[0006]
담 에 균 사병 신 (Haq 등 1995), 러 사병 신(Mason 등 1998) 등 생산하 다.
본 들 사 병에 주 원 균 라균 Vibrio cholerae (CTB) 내독 가진 균[0007]
(ETEC, enterotoxigenic E. coli ) 독 없 역 도가 가능한 B 브 니트(subunit)
라독 (CTB) 균 열 가변 내독 B 브 니트(LTB) 과 (over expression)하는
pMJ103 에 삽 시 벼 질 하여 사병 신 합단 질 할 는 질 벼 생
산하 해 본 행하 다.
내
해결 하고 하는 과
본 사병 주 원 균 라균과 균 역 도가 가능한 [0008]
재 합 벼에 질 시 는 사병 신 하는 질 벼 생
산 공하는 것 다.
또한, 본 상 생산 는 사병 신 하는 질 벼 공하는[0009]
것 다.
본 다 상 한 질 벼 는 사병 신 는 합단 질 공하는[0010]
것 다.
본 또다 상 한 합단 질 하는 사병 신 공하는 것 다. [0011]
과 해결 단
하, 본 상 하 다 과 같다.[0012]
본 [0013]
1) 열 1 시 는 Vibrio cholerae 독 B 브 니트 , 열 2 시 는[0014]
Escherichia coli 독 B 브 니트 bar pMJ103 에 삽 하여 재 합
하는 단계;
2) 상 pMJ103 재 합 아그 리움에 삽 하여 질 균주 얻는 단계;[0015]
3) 러 도 벼 에 상 단계 2)에 얻어진 질 아그 리움 하여 공동 양하는[0016]
단계;
4) 상 단계 3) 생 러 별하여 2차 양한 후, 2차 양 러 별하는 단계;[0017]
5) 별 2차 양 러 양하여 재 식 체 MS0 지에 근시키는 단계;[0018]
6) 상 단계 5)에 얻어진 근 식 체 시 양에 앙하여 벼 질 체 하는 단계 포[0019]
함하는 것 특징 하는 사병 신 하는 질 벼 생산 것 다.
등록특허 10-1160095
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하, 본 욱 상 하 다 과 같다.[0020]
본 에 어 는, 사병 원 균 라균과 균 독 B 브 니트 CTB(Kang 등 2004a)[0021]
LTB(Kang 등 2004b) 학 에 양 았 들 가 삽 질 리
에는 CaMV 35S 프 , Nos 미 nptⅡ 가 는 pMY Glb 프 , pinⅡ 미
bar 가 는 pMJ103 하 다. 본 에 가능한 는, 람직하 는 pMJ103
다.
도 2는 열 1 시 는 CTB 열 2 시 는 LTB 포함하는 본 에 [0022]
질 벼 하 한 리 pMJ103 나타낸 것 다.
리 pMJ103에 상 한 CTB LTB 가 삽 것 PCR 검 하 다.[0023]
본 에 는 식 질 체 하는 아그 리움 시엔 (Agrobacterim tumefaciens)[0024]
하 다. 식 질 체 하는 주 는 아그 리움 시엔 는 Ti 플라 미드
(tumor-inducing plasmid) 가지고 다. Ti 플라 미드 에 아그 리아가 식 에 감염
crown gall 라고 하는 (tumor)가 생하게 다. Ti 플라 미드 살펴보 , T-
DNA라는 가 , 는 식 게 DNA에 동 재 합(homologous recombination)에 해
끼어들어가는 다. 라 에 식 에 도 하고 하는 고, Ti 플라 미드 아그
리아에 삽 하여 아그 리아 식 러 에 감염시 키우 진 식 만들어진다.
본 에 어 ‘ 내 양’ 란 균 상태 양 건 갖 어진 양 내에 식 양하는 것[0025]
미한다.
CTB LTB 포함하는 pMJ103 삽 아그 리아에 해 벼 러 감염시[0026]
질 벼 도, 별하 , 별 질 벼에 하여 블럿(Southern Blot) 실시한 결과,
벼 게 내에 도 LTB CTB 삽 상태 하 다.
또한, T-DNA 주변 염 열 (Flanking Region Analysis) 결과 LTB CTB 가 벼 염[0027]
색체 특 에 삽 었 하 다.
게 질 벼 아 가 87.5% 비하여 62.0% 아 나타내었 나, [0028]
80% 상 아 나타내어 질 도 벼 비 상 생산량 보할 다.
역 트립(Immuno Strip) 처리 격리 실 내에 앙 재 후 타 처리에 한 생 검 통하여[0029]
본 에 사병 신 하는 질 벼가 질 체 고 었 하 다.
본 에 든 질 계통에 한 GM1 강 리 사 드(ganglioside) 결과, 든 질 계통[0030]
사병에 한 신 역할 하는 pentamer 가지는 신 나타났다. 라 본
생산 는 사병 신 하는 질 벼 사병 신 합단 질 생산할
, 본 에 라 질 벼는 그 체 또는 합단 질 하여 신 사 할
다.
또한, 본 상 한 질 벼 함 하는 경 사병 신 사 [0031]
다.
본 는 질 벼 또는 합단 질 포함하는 사병 신 또는 신 [0032]
그 여 상에 한 없 나, 람직하 는 가 , 욱 람직하 는 돼지, , 돈, 또는 아지에게
여 다.
상 신 본 에 질 벼 그 사 하거나 건 시킨 후 말 태 사 할 [0033]
, 또한 다 식 또는 식 과 함께 통상 에 라 하게 사 다.
질 벼 합량 사 에 라 당하게 결 다.
과
사병 신 하는 질 벼 생산하는 본 에 안 한 에 해 [0034]
사병 신 단 질 얻 다.
본 에 , 사병 신 하는 질 벼 생산하여 식 사료 가 에[0035]
등록특허 10-1160095
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게 공함 산산업에 항생 질 사 하게 감 시 가 산 비 는 경
과 얻 다.
러한 항생 질 사 량 감 는 경 과 에 비 건강에도 여할 다.[0036]
실시 한 체 내
하, 본 실시 에 하여 욱 상 하 다 과 같다.[0037]
실시 1 질 [0038]
식 질 에 하 하여 CTB LTB 는 pMJ103 HB101 같 헬 플라 미드[0039]
함께 트리 런탈 (tri parental mating) 아그 리움에 들 함께 재 합시 다.
pMJ103 에 삽 균주 니는 트 마 신 100mg L-1
첨가 액체 YEP 지 3 ml에 하여 28℃[0040]
에 250rpm 2 간 진탕 양하여 식하 플라 미드 DNA 키트(AccuPrep, 니아)
하여 플라 미드 DNA 하 다.
프라 는 LTB 292bp 각, CTB 298bp 각, bar 302bp DNA 각 한 후 공[0041]