1

7/21/2019 1

http://slidepdf.com/reader/full/15695cef41a28ab9b028bf513 1/46

NOŢIUNI FUNDAMENTALE

DE BIOLOGIE CELULARĂ ŞIMOLECULARĂ

7/21/2019 1


ORGANIZAREA CELULELOR PROCARIOTEORGANIZAREA CELULELOR PROCARIOTE

- membrană celulară, citoplasmă, perete celular- suprafaţa celulelor procariote poate să fie acoperită de pili (permit ataşarea celulelorla anumite suprafeţe) sau flageli (mişcări ondulatorii - deplasarea celulelor în apă)- nu prezinta nucleu si nici organite intracelulare

- genomul celulelor - un singur cromozom- conţin plasmide, care se pot replica independent de cromozomul celulei gazdă

Fig.1 – Reprezentarea unei ceue pr!cari!te

7/21/2019 1


ORGANIZAREA CELULELOR EUCARIOTEORGANIZAREA CELULELOR EUCARIOTE

- mult mai mari decât celulele procariote, organizare mult mai complexă- membrana plasmatică, citoplasmă, organitele intracelulare, nucleul, citoschelet(forma şi deplasarea celulelor)

- nucleu - cea mai mare parte a materialului genetic (sinteza acizilor nucleici)- ribozomi - sinteza proteinelor, sinteza şi transferul lipidelor spre diferite organite,aisg. homeostazia calciului, plierea proteinelor şi controlul calitati, adiţia coalentăa zaharurilor la nielul lanţurilor polipeptidice în curs de sinteză- aparatul trans Golgi are loc sortarea glicoproteinelor

- lizozomii ! compartimentele degradatie ale celulei- peroxizomii - procese metabolice cum ar fi oxidarea acizilor graşi şi detoxifiereacelulelor de peroxidul de hidrogen- mitocondriile sintetizează "#$, contin "%& mitocondrial

7/21/2019 1


7/21/2019 1


'n *+ rancis ric a sugerat existenţa unui flux informaţional

unidirecţional între "%&, "/& şi proteine. "ceastă idee a deenit dogma centrală a

biologiei moleculare. onform acestei dogme, atât în celulele procariote cât şi încelulele eucariote ADN este transcris într-o moleculă de ARN mesager, apoi

mesajul genetic este tradus conform codului genetic într-o secvenă de aminoacizi

corespunzătoare unui lan polipeptidi c. %e-a lungul timpului s-a constatat că acest

lucru nu este respectat întotdeauna.

FLU'UL GENETIC INFORMATIONAL

Fig.3." Fu(u in)!r%a*iei +enetice

7/21/2019 1


7/21/2019 1


= prin hidroliza acizilor nucleici în mediu acid se formează baze azotate > pentoze >acid fosforic

a-" bazele azotate care intr& 2n c!%p!zi*ia ADN p!t )i 4aze purinice ,a3enina/+uanina- #au 4aze pirimidinice ,ti%in&/ cit!zin&-

Fig.2. 5 6tructura 4aze!r purinice Fig.3. 5 6tructura 4aze!r piri%i3inice

4-" pent!za " D2-deoxiriboza

Fig.4. 5 6tructura D7"3e!(iri4!zei

7/21/2019 1


= prin stabilirea unor legături N-glicozidice între gruparea semiacetalică apentozei şi atomul de azot din poziţia a unei baze purinice sau din poziţia aunei baze pirimidinice -? nucleozide

= esterii fosforici ai nucleozidelor la gruparea hidroxil de la atomul de carbon din poziţia*@ sau A@ din pentoză -? nucleotide = acizii nucleici conţin nucleozid-*-fosfaţi

Fig.6. 5 6tructura nuce!ti3e!r

Fig.5. 5 6tructura nuce!zi3e!r

7/21/2019 1


Fig.7. 5 6tructura unei catene ADN

= prin stabilirea unor legaturi fosfodiesterice între deoxiribonucleotide -? catenă ADN

8 t!ate e+&turie internuce!ti3ice au aceeaşi orientare 3e"a un+u unui

an* p!inuce!ti3ic/ a#t)e c& )iecare caten& are ! anu%it& polaritate

8 #tructura unei catene e#te #cri#& 2nt!t3eauna 2n direcia 5!" 3!

8 2n #ucce#iunea #$%& 5 +uanina are +ruparea 5O9 3e a C:; nean+a<at&

2ntr"! e+&tur& )!#)!3ie#teric&/ iar ti%ina are +ruparea 5O9 3e a C=; i4er&

A"TG"C

7/21/2019 1


Fig.7. 5 6tructura unei catene ADN

7/21/2019 1


7/21/2019 1


= ADN p!ate #& a3!pte %ai %ute c!n)!r%a*ii>

8 conormaia ,3e#c!perit& 3e ?at#!n @i Cric- reprezentat& 3e ! eice 3u4& cu

!rientare #pre 3reapta/ cu pa#u 3e =/ n%/ care cuprin3e perec$i 3e 4aze

az!tate a ni0eu unei #pire

8 conormaia #/ eice 3u4& cu !rientare 3reapt&/ %ut %ai c!%pact&/ 2n care

pa#u eicei e#te 3e 7/ n% @i nu%&ru 3e 4aze 3e a ni0eu unei #pire e#te 3e

8 conormaia ,zig-zag - c!re#punz&t!are unei eice cu !rientare #pre #tn+a/

nu%&ru 3e 4aze 3e a ni0eu unei #pire e#te 3e 7/ iar pa#u eicei e#te 3e H/: n%

Fig.. 5 C!n)!r%a*ia ADN

7/21/2019 1


0:. 8/B"&0<"/3" B3&861910 9" $/8"/08#3 (3. 890)

= o singură moleculă de "%& (nucleoid) C un singur cromozom

8 cr!%!z!%u 4acterian e#te )!r%at 3in domenii ac&tuite 3in :" 4/ ae

c&r!r capete #unt #trn# reunite cu a<ut!ru un!r proteine ancorate la nielul membraneicelulare

proteine 89 :

8 pr!teinee 9U #unt 3i%eri 4azici @i #unt a#e%&n&t!are $i#t!ne!r -?

compactarea #D;

Fig.1<. - Reprezentarea #c$e%atic& a cr!%!z!%uui 4acterian 3e E. c!i

7/21/2019 1


:. 8/B"&0<"/3" B3&861910 9" 31"/08#3

= organizat în mai mulţi cromozomi (DE la om) - nucleu

= împachetarea "%& se face sub forma unei structuri nucleoproteice complexe - cromatină

= cromozomii îşi modifică gradul de condensare în diferite stadii ale ciclului celular ariind întreforma foarte compactă în metafază la forma difuză din interfază= compactarea cromozomilor - existenţa mai multor nivele de organizare a cromatinei= maForitatea proteinelor din cromatină sunt histone

8 %a#& %!ecuar& %ic& ,"7 Da-

8 =J a%in!acizi 4azici 5 izin&/ ar+inin&8 cinci ca#e 3e $i#t!ne> 97A/ 97B/ 9=/ 9H @i 9

8 c!n3en#area @i 3ec!n3en#area cr!%atinei e#te 3epen3ent& 3e %!3i)ic&ri c$i%ice ani0eu $i#t!ne!r cu% ar )i 3e e(e%pu/ acetiarea re#turi!r 3e izin& 3in re+iunie N"

ter%inae 2n ti%pu tran#crierii

Fig.11. – Or+anizarea ADN a eucari!te

7/21/2019 1


= fiecare cromozom reprezintă o moleculă de "%&= cromozomii sunt formaţi din gene ! segmente indiiduale de "%& care conţininstrucţiunile necesare pentru sinteza unei proteine care are un rol bine determinat încelula care o produce

8 +ena c!n*in #ec0en*e 3e ADN 3enu%ite exoni ,expre((ed region(- @i introni ,interening (e=uence(-8 ei%inarea intr!ni!r are !c prin pr!ce#u 3e (plicing al #>; me(ager 8 di(continuitatea genelor e#te ! tr&#&tur& caracteri#tic& !r+ani#%e!r #uperi!are

Fig.12. – 6tructura cr!%!z!%uui a eucari!teFig.13. – 6tructura unei +ene

7/21/2019 1


:0. ;0840&#3<" "%&

= procesul de biosinteză a "%& se numeşte replicare

8 pp. 3e#)acerea 3upe(uui 3e ADN parenta @i #inteza un!r catene c!%pe%entarecu )iecare 3intre cee 3!u& catene parentae "K dou* molecule identice de #D;

8 repicarea 2ncepe a ni0eu un!r re+iuni #peci)ice 3e ADN 3enu%ite ?>/ ,!ri+ine3e repicare-/ #e 3e#)&@!ar& #u4 ac*iunea #D; polimerazei @i 2ncepe 3e a ni0eu unui primer #>; #intetizat #u4 ac*iunea primazei

Ini*ierea pr!ce#uui 3e repicare a ni0eu #ec0en*ei ORI

7/21/2019 1


8 pr!ce# (emicon(erati " rezut& 3!u& %!ecue 3e ADN i3entice/ )iecarec!n*inn3 ! caten& n!u"#intetizat& @i ! caten& parenta&

8 pr!ce# (emidi(continuu " #inteza catenei c!%pe%entare cu catena =5: #e )acec!ntinuu/ 2n 3irec*ia :=. 6inteza catenei c!%pe%entare cu catena := #e )ace3i#c!ntinuu/ 3ar t!t 2n 3irec*ia :=

Repicarea ADN e#te un pr!ce# #e%ic!n#er0ati0

Repicarea ADN e#te un pr!ce# #e%i3i#c!ntinuu

7/21/2019 1


= enzime implicate in procesul de replicareG

8 #D; primaza cataizeaz& reac*ia 3e )!r%are a pri%eruui ARN 3e a

ni0eu c&ruia 0a 2ncepe #inteza ADN #u4 ac*iunea ADN p!i%erazei 8 !elicazele #unt pr!teine care #e 3epa#eaz& rapi3 3e"a un+u

%!ecuei 3e ADN #eparn3 cee 3!u& catene ae 3u4uui $ei(

8 proteinele de (tabilizare a #D; monocatenar ,pr!teinee 66B 1 #in+e

#tran3e3 4in3in+ pr!tein- #e ea+& a catena 3e ADN e(pu#& )&r& a%a#ca 4azee az!tate care r&%n a#t)e 3i#p!ni4ie pentru repicare

8 topoizomerazele rez!0& pr!4e%ee t!p!!+ice ap&rute 2n cur#u

3e#)acerii 3upe(uui 3e ADN

7/21/2019 1


8 #D; polimeraza " a3au+& 3NTP"uri #ucce#i0/ a cap&tu =; a unei %!ecue 3e ARN pri%er,"7 3e nuce!ti3e- #intetizat 3e ADN pri%az&

" atacu nuce!)i a +rup&rii 5O9 3e a cap&tu =; a %!ecuei pri%era#upra unei %!ecue 3e 3NTP ainiat& 2n !r3inea 3ictat& 3e #ec0en*aADN te%pate %!n!catenar cu care )!r%eaz& e+&turi 3e $i3r!+en - nu p!ate ini*ia #inteza 3e n!0! a unei catene 3e ADN-are ac*iune aut!c!rect!are =": ,pr!!)rea3in+- 2n3ep&rtn3 nuce!ti3ee+re@it 2nc!rp!rate 2n catena 2n cur# 3e #intez&. Ace#t ucru per%ite

c!n#er0area in)!r%a*iei +enetice. Fact!ru 3e er!are pentru 2nc!rp!rarea+re@it& a unei nuce!ti3e 2ntr"! caten& 3e ADN n!u #intetizat& e#te 3eQ 4aze

8 #D; ligaza

" reune@te )ra+%ente 3e ADN rezutate 2n ur%a repic&rii" cataizeaz& )!r%area unei e+&turi )!#)!3ie#terice 2ntre +ruparea$i3r!(i 3e a cap&tu =; a unui )ra+%ent 3e ADN @i +ruparea :; %!n!)!#)at aatuia- enzi%a nece#it& prezen*a unui 3!n!r a unui re#t 3e aci3 a3eniic , #$@ a eucari!te- care #e )i(eaz& a cap&tu :; %!n!)!#)at a )ra+%entuui 3e ADN

- prin atacu nuce!)i a +rup&rii 5O9 3in cap&tu =; a ceuiat )ra+%ent #e 0

7/21/2019 1


Fig.14. – A ecani#%u 3e actiune a pr!teine!r 66B

Fig.15. – Mecani#%u 3e actiune a ADN i+azei

7/21/2019 1


7/21/2019 1


CORECTAREA ERORILOR DE REPLICARE

= bacteriile sunt capabile să se diidă la fiecare A+ de minute= în cazul în care "%& polimeraza nu poate să corecteze eficient erorile de replicarecare apar la nielul catenelor nou sintetizate, intervine un sistem de corectare a

erorilor

8 acest sistem diferă de celelalte sisteme de reparare a "%& prin faptul cănu recunoaşte nucleotidele greşit încorporate, ci sesizează tensiunile care

apar la nivelul dublului !elix de ADN datorită necomplementarităţii bazelor 8 complexul proteic de corectare a erorilor de replicare interine numai la

nivelul catenelor recent sintetizate care conin resturi de adenină nemetilate

8 complexul de corectare a erorilor de replicare este reprezentat deproteinele "ut# şi "ut$

8 corectarea erorilor de replicare este foarte importantă deoarece asigurăconserarea informatiei genetice de la nielul "%&

7/21/2019 1


Fig.15. C!rectarea er!ri!r 3e repicare a E. C!i

7/21/2019 1


MECANI6ME DE REPARARE A ACIZILOR NUCLEICI

= /epararea leziunilor de la nielul "%& se face cu aFutorul unor enzime specifice care

recunosc şi îndepărtează bazele sau nucleotidele modificate

= /ecunoaşterea, excizia şi repararea regiunilor modificate de la nielul "%& este un

proces foarte complex care implică cel puţin H factori de natură proteică

I Repararea ADN prin excizia bazelor azotate se face prin recunoaşterea bazelor

modificate de către o glicolază ADN specifică care cliează legătura &-glicozidică dintre bazamodificată şi pentoză cu formarea unui situs apurinic sau apirimidinic . $rin acţiunea unei

endonucleaze a apare o breşă care a fi reparată în etapa următoare de către ADN polimerază şi

ADN ligază

I Repararea ADN prin excizia nucleotidelor se face prin interenţia unei endonucleaze

care a îndepărta fragmentul de "%& care conţine baza modificată împreună cu un anumit numărde nucleotide care o încadrează. /epararea se a face prin interenţia ADN polimerazei şi ADN

ligazei

%eroderma pigmentosum este o boală autozomală recesiă, caracterizată printr-o

sensibilitate extremă la lumină şi prin dezoltarea a numeroase tumori la nielul pielii. ;olnaii

prezintă o deficienă la nivelul mecanismelor de reparare a ADN prin excizia nucleotidelor

7/21/2019 1


Fig.16. " Mecani#%u 3e reparare a ADNprin e(cizia 4aze!r

Fig.17 . " Mecani#%u 3e reparare a ADNprin e(cizia nuce!ti3e!r

7/21/2019 1


CLONAREA

7/21/2019 1


TIPURI DE CLONARE

= CCB?;#>C 1 a crea c!pii i3entice

8 &lonarea #D; – c!narea +ene!r/ te$n!!+ia ADN rec!%4inant 5 #e re)er& a

tran#)eru unui )ra+%ent 3e ADN 3e intere# 3intr"un !r+ani#% 2ntr"un ee%ent +enetic

cu capacitate 3e aut!repicare ,%utipicare-/ 3e e(. un pa#%i38 &lonarea reproducti* 5 te$n!!+ie utiizat& pentru a +enera un ani%a care 0a

a0ea ADN nucear i3entic cu a unui at ani%a care tr&ie#te 2n prezent #au a e(i#tat

2n trecut ,e(. Oaia D!-

8 &lonarea terapeutic* 5 c!narea e%4ri!ni!r 5 pr!3ucerea e%4ri!ni!r u%ani

care 0!r )i utiiza*i 2n cercetare 2n #c!pu trat&rii un!r 4!i incura4ie

= &$'NA reprezintă un indiid distinct din punct de edere genetic sau un set de indiizi identici

7/21/2019 1


CLONAREA ADN

7/21/2019 1


CLONAREA ADN

= &lonarea ADN permite izolarea şi manipularea unor fragmente din genomul unuiorganism prin inserarea lor în ectori autonomi care se replică independent de "%&-ul celulei gazdă

= #ubclonarea presupune transferul unui fragment de "%& clonat dintr-un ector înaltul, fiind utilizată pentru

8 in0e#ti+area un!r re+iuni #curte 3intr"un )ra+%ent c!nat 3e 3i%en#iuni %ari

8 pentru tran#)eru unei +ene 2ntr"un 0ect!r care per%ite e(pre#ia 2n anu%ite#pecii

7/21/2019 1


= C$#@CBC 9&B?;E>// #D;

8 Iz!area pa#%i3uui care c!n*ine ADN 3e intere#8 Di+e#tia cu en3!nuceaze 3e re#tric*ie

8 6epararea )ra+%ente!r rezutate 2n ur%a 3i+e#tiei cu en3!nuceaze 3ere#tric*ie prin eectr!)!rez& 2n +e 3e a+ar!z&

8 Puri)icarea )ra+%ente!r 3!rite

8 Li+area )ra+%entuui 3e intere# cu un n!u 0ect!r pentru !4*inerea unei%!ecue n!i/ rec!%4inante

8 Tran#)eru pa#%i3uui rec!%4inant !4*inut 2ntr"! tupin& 3e E. c!i,tran#)!r%are- care per%ite %utipicarea ace#tuia

8 6eec*ia 4acterii!r tran#)!r%ate

8 Anaiza pa#%i3uui rec!%4inant ,3i+e#tie cu enzi%e 3e re#tric*ie/#ec0en*iere

7/21/2019 1


7/21/2019 1


= #@B/&#$// #BC &B?;E>// #D;

8 #ec0entierea ADN

8 iz!area @i anaiza pr!%!t!ruui unei +ene @i a at!r ee%ente 3e c!ntr!8 in0e#ti+area )unc*iei pr!teine!r prin pr!3ucerea un!r cantit&*i %ari a )!r%e!rn!r%ae #au %utante ae ace#t!ra

8 i3enti)icarea %uta*ii!r care pr!0!ac& anu%ite 4!i

8 4i!te$n!!+ia 5 pr!3ucerea c!%ercia& a #ca& ar+& a un!r pr!teine #au a at!r

%!ecue cu i%p!rtan*& 4i!!+ic&

7/21/2019 1


SECTORI DE CLONARE. SECTORI DE E'PRE6IE

= (ector ! ehicul "%& utilizat pentru transferul materialului genetic

= (ectorii de clonare au următoarele caracteristici8 c!n*in ! regiune ?>/ @i #e repic& in3epen3ent 3e +en!%u ceuei +az3&

8 c!n*in un mar)er de (elecie ,3e e(e%pu ! +en& care c!n)er& rezi#ten*& a un

anu%it anti4i!tic #au ! +en& care per%ite #upra0ie*uirea ceue!r 2n anu%ite c!n3i*ii3e cre@tere-. Printre cee %ai cun!#cute +ene care c!n)er& rezi#ten*& a un anti4i!tic

#e nu%&r& ampr care c!3i)ic& - lactamaza/ ! enzi%& care 3e+ra3eaz& anti4i!ticee

3in ca#a peniciine!r ,3e e(. a%piciina- @i tet# care c!3i)ic& ! pr!tein& ce

)unc*i!neaz& ca ! p!%p& tran#%e%4ranar& care p!%peaz& tetracicina 2n e(teri!ru

ceuei 8 c!n*in ! #ec0en*& A& Aultiple cloning (ite: 2n care #e p!ate in#era )ra+%entu 3e

ADN 3e intere# cu a<ut!ru enzi%e!r 3e re#tric*ie

7/21/2019 1


)*+lasmidele ! au fost utilizate primele ca ectori de clonare. 4unt molecule

circulare extracromozomiale mici, cu dimensiuni cuprinse între J-J++ Kb care există în copii multiple (până la câtea sute) în celulele gazdă de 3. coli

Fig.1. " Reprezentarea #c$e%atica a unui pa#%i3

7/21/2019 1


7/21/2019 1


.*&osmidele sunt obţinute prin fuziunea

unor plasmide de dimensiuni mari cuanumite secenţe de "%& din bacteriofagul

L. $ermit clonarea unor secenţe de "%&

foarte mari (până la D*+++ de perechi de

baze). osmidele conţinG

8 origine de replicare ?>/ 8 mar)eri de (elecie

8 un (itu( A& a ni0eu c&ruia 0a )i

in#erat& +ena 3!rit& prin 3i+e#tie cu enzi%e 3e

re#tric*ie

8 un (itu( co( care reprezint& #ec0en*e 3eADN 3in 4acteri!)a+u nece#are pentru

2%pac$etare

Fig.21. 5 Utiizarea c!#%i3e!r in te$n!!+ia ADN rec!%4inat

= Gectorii de expre(ie

7/21/2019 1


= Gectorii de expre(ie

8 #unt utiiza*i pentru e(pre#ia pr!teinei c!3i)icate 3e +ena 3e intere# 2ntr"un anu%it #i#te%

8 8 c!n*in pe n+& ee%entee 3e#cri#e a 0ect!rii 3e c!nare @i un promotor a3iacent re+iunii

2n care a )!#t in#erat& +ena 3e intere#

8 3e %ute !ri e(pre#ia pr!teine!r e(!+ene 2n E. c!i #e )ace utiizn3 un pa#%i3 cu

pr!%!t!r T

8 Sect!ru c!n*ine un pr!%!t!r T/ un #itu# pentru e+area ri4!z!%i!r ,RB6-/ un c!3!n

#tart/ un MC6 2n care e#te c!nat& +ena 3e intere# @i un c!3!n #t!p. E(pre#ia pr!teinei are !c 2n

tupini 3e E. C!i care pr!3uc T ARN p!i%eraza 3up& ce au )!#t 2n preaa4i in3u#e cu IPTG,iz!pr!piti!+aact!piran!zi3-.

Fig.22. 5 E(pre#ia pr!teine!r cu a<ut!ru 0ect!ri!r 3e e(pre#ie

7/21/2019 1


ELECTROFOREZA ADNELECTROFOREZA ADN

=moleculele de "%& la p5 fiziologic sunt încărcate negati datorită grupărilor fosfat=probele cu "%& migrează către polul poziti la aplicarea unui câmp electric

=densitatea de sarcină este uniformă de-a lungul secenţei astfel că în cazul fragmentelor liniaremigrarea a fi iners proporţională cu mărimea acestor fragmente

8 )ra+%entee 3e ADN 3e 3i%en#iuni %ici ,%ai %ici 3e : 3e nuce!ti3e- p!t )i #eparate prin

eectr!)!rez& 2n gel de poliacrilamid*

8 )ra+%entee 3e ADN %ai %ari ,2ntre =" nuce!ti3e- #e p!t #epara prin eectr!)!rez& 2n gel de agaroz*

= eidenţierea - cu aFutorul bromurii de etidiu

8 pr!prietatea 3e a #e in#era 2ntre 4azee az!tate @i 3e a )!r%a c!%pe(e nec!0aente 3e ADN 8 gelurile pot fi izualizate cu o lampă /(

8 limita de detecţie a "%& este de 0,) 1 0,2 ng

7/21/2019 1


= F#&$?>/ &#>C /;FB9C;$C## A/%>#>C# #D; H; %CB DC #%#>?E

8 m*rimea ragmentelor de #D; " )ra+%entee 3e ADN inear %i+reaza in +eu 3e a+ar!z& cu !

%!4iitate care e#te in0er# pr!p!rti!naa cu %a#a %!ecuara

8 concentraia gelului de agaroz* 5 +eurie %ai c!ncentrate #unt )!!#ite pentru %i+rarea

)ra+%ente!r 3e ADN %ai %ici

8 bbromura de etidiu 5 #e intercaeaz& 2ntre 4azee az!tate 3in ADN %!3i)icn3

%!4iitatea ace#tuia

8 olta,ul – ! 3at& cu cre#terea 0!ta<uui apicat/ )ra+%entee 3e ADN %ai %ari 0!r %i+ra

pr!p!r*i!na %ai rapi3 3ect cee %ai %ici. Rez!utia cea %ai 4una a %i+rarea )ra+%ente!r %ai

%ari 3e 7 4 #e !4*ine prin %en*inerea unui 0!ta< 3e %a(. : Sc% ,0a!area 2n c% #e re)er& a

3i#tan*a 3intre eectr!zi-

7/21/2019 1


= lla migrarea unei probe de "%& plasmidial în gel de agaroză se pot obsera trei benzi carecorespund mai multor forme ale moleculei de "%&G

8 orma circular* relaxat* 5 ADN circuar rezutat prin unirea capete!r an*uui inear

8 orma de cerc de(*cut ! se desfac două spire ale formei lineare şi se reunesccapetele

8 orma (upra+ncol*cit* " %ut %ai c!%pact& c!%parati0 cu )!r%a rea(at& 3e aceea@iun+i%e

Fig.23. 5 Mi+rarea ADN pa#%i3ia in +e 3e a+ar!za

7/21/2019 1


= enzimele de restricţie sunt endo-deoxiribonucleaze care acţionează asupra unei secenţespecifice de "%& bicatenar prin hidroliza unor legături fosfodiesterice pe cele două catene de

"%&

=nucleazele existente în diferite organisme au rolul de a distruge moleculele de ADN străin

= "%&-ul celulei gazdă este proteFat de atacul acestor enzime deoarece prezintă în mod

normal o modificare a structurii situsurilor specifice acelei enzime

= enzimele de restricţie se obţin astăzi fie prin clonare, fie prin extractie din organismele

gazdă

= numele lor reprezintă o parte a numelui speciei şi genului din care au fost extrase şi

uneori un indicati al tulpinii sau al mutantului testat

ENZIME DE RE6TRICTIE

7/21/2019 1


= există A clase de enzime de restricţieG

8 CLA6A I 5 cu acti0itate 3e re#tric*ie @i %!3i)icare

8 CLA6A II 5 recun!#c #ec0en*e 3e H/:/ nuce!ti3e

8 CLA6A III 5 acti0itate 3e re#tric*ie @i %!3i)icare= enzimele din clasa a 33-a recunosc secvene palindromice (secenţe în care ordinea bazelor de peuna din catene este opusă cu cea a bazelor de pe catena complementară)

Fig.24. 5 6tructura unui pain3r!%

7/21/2019 1


Fig.24. 5 Tipuri 3e #ec0ente recun!#cute 3e cee = ca#e 3e enzi%e 3e re#trictie

= î t i ţi i i f t d "%& bi t t lt f t d

7/21/2019 1


Ta4e. Enzi%e 3e re#tric*ie

Enzi%a 6itu# 3erecun!a@tere 6pecie O4*inere

#pa / %%%&&& &&&%%%

#cetobacter pa(teurianum

C. coli

am 8/ %%#$&&

&&$#%%

acillu(

amIloli=ueacien(

C. coli

gl // #%#$&$ $&$#%# acillu( globigii

C. coli

Dpn / %#$& &$#J% #rtiiciala inginerizata

genetic

C. coli

Cco >/ %##$$& &$$##%

C(c0eric0ia coli tulpinaK13

C. coli

Lpn / %%$#&& &&#$%% Lleb(iella pneumoniae

C. coli

= în urma restricţiei unui fragment de "%& bicatenar, pot rezulta fragmente de "%& cu capete drepte sau capete coezive

=dintre enzimele prezentate în tabelul de mai sus

7/21/2019 1


=dintre enzimele prezentate în tabelul de mai sus

8 Dpn I/ 9inc II @i P0u II #unt e(e%pe 3e en3!nuceaze ce +enereaz&

)ra+%ente 3e ADN cu capete 3repte

8 Apa I @i pn I #unt en3!nuceaze care +enereaz& )ra+%ente cu capete c!ezi0e

=f ragmentele de "%& cu capete compatibile sau cu capete drepte se pot liga într-o etapăulterioara obţinându-se astfel molecule noi de "%& recombinat

= pe baza acestui principiu, ectorii de clonare pot fi linearizaţi în urma restricţiei diriFate

cu una sau mai multe enzime de restricţie şi în respectiul loc pot fi inserate gene ale

căror capete restricţionate sunt compatibile cu capetele nou-generate ale ectorului

= enzimele de restricţie care produc capete coezie cu aceaşi extensie formează ofamilie de enzime. %eşi aceste enzime au secenţe de recunoaştere diferite, fragmentele

de "%& rezultate pot fi ulterior ligate în prezenţa "%& ligazei

Bam H I 5'-GGATCC-3'3'-CCTAGG-5'

Bcl 5'-TGATCA-3'3'-ACTAGT-5'

Bgl II 5'-AGATCT-3'3'-TCTAGA-5'

San 2A 5'-GATC-3'3'-CTAG-5'

REACTIA DE LIGARE

7/21/2019 1


= Reactia de ligare presupune reunirea a doua sau mai multor fragmente de "%& printr-olegatura coalenta in prezenta enzimei "%& ligaza. "ceasta reactie presupune formarea unei

legaturi fosfodiesterice intre captul A@-85 al unei nucleotide si *@ ! fosfat al alteia

= 45 ADN ligaza a fost extrasa din bacteriofagul #D

Fig.25. 5 Reactia 3e i+are

REACTIA DE LIGARE

1

Documents