12-Mikrobak_laboratoriumi_vizsgalata_2010

1

MikrobiológiaMikrobák tenyésztése, kimutatása,

laboratóriumi vizsgálata

Budapesti Corvinus EgyetemÉlelmiszertudományi Kar

Mikrobiológia és Biotechnológia Tanszék

2010. május 6.

Mikrobiológiai munka lépései1.Előkészítés:� steril tenyészedény: autoklávozás� steril oltóeszköz

�Oltókacs, oltótű: a gázláng külső 2/3-ában vörös izzásig történőhevítéssel�Pipetta: 180°C-on, szárítószekrényben, 1 óra

�Szélesztő üvegbot: alkoholos lelángolás

� steril tápközeg: autoklávozás � steril oltóhelyiség

�Felület: UV lámpa, fertőtlenítőszer�Levegő: UV lámpa�Lamináris box

2.Oltás: Steril oltóeszközzel, aszeptikus körülmények között inokulum (oltótenyészet) bejuttatása a steril tápközegbe

3.Inkubáció (tenyésztés): termosztátban megadott hőmérsékleten, megadott ideig

4.Értékelés5.Szennyezett eszközök, tápközegek autoklávozása, majd

mosogatása

2

Tápközegek összetevői�Víz: biztosítja azt a közeget, amelyben az anyagcsere folyamatok végbemennek�Szénforrás: a szerves széntartalmú vegyületek felépítéséhez

�Autotróf: levegő CO2

�Heterotróf (mikróbák nagy része): szerves széntartalmú vegyületek�Egyszerű szénhidrátok: glükóz�Összetett szénhidrátok�Húskivonat�Pepton

�Nitrogénforrás: a szerves nitrogéntartalmú vegyületeke felépítéséhez

�Szervetlen nitrogénforrások: ammóniumsók, nitrátsók, nitritsók�Szerves nitrogénforrások: húskivonat, pepton, természetes fehérjék, aminosavak

�Ásványi anyagok: (kationok, anionok)�Sejt ozmotikus nyomásának kialakítása�Membrántranszport szabályozása�Enzimaktivitás szabályozása

�Vitaminok: élesztőkivonat

�Halmazállapot szerint:Folyékony Szilárd: zselatin, agar, szilikagél(tápleves) (táptalaj)

�Eredet szerint:�szintetikus: szerves, szervetlen (ismert összetétel)

�félszintetikus: paradicsomos, burgonyás táptalaj

�természetes: tej-, burgonyafőzet

Tápközegek csoportosítása

3

�Hatás szerint:�alap tápközeg: minden mikrobacsoport számára szükséges C, N, víz ásványisó, vitamin komponenst tartalmazza

�elektív tápközeg: csak bizonyos mikrobák szaporodását teszi lehetővé, pl. cellulóz bontó mikroorganizmusok

�szelektív tápközeg: különleges összetevőt tartalmaz, pl. antibiotikum, nehéz fémsó, pH

�differenciáló tápközeg: valamilyen indikátort tartalmaz, az anyagcsere reakciók alapján tesz különbséget

�speciális hatású tápközeg: pl. spóráztató táptalaj

Tápközegek csoportosítása

�Készenléti állapot szerint:

Tápközegek csoportosítása

Összemérendő

Félkész

Gyári kész

4

Az oltás a mikroorganizmusok tenyésztését megelőző mikrobiológiai művelet.

Lényege: Steril oltóeszköz segítségével steril tápközegbe aszeptikus (fertőzésmentes) körülmények között juttatjuk be azokat a mikrobákat, amelyeket szaporítani kívánunk.

Inokulum: Az oltáshoz felhasznált mikroba-sejttömeg.

Oltás

�A használt oltóeszköz fajtája

(oltókacs, oltótű, pipetta, szélesztő üvegbot)

�Az oltásra használt tenyészet halmazállapota

(folyékony, szilárd)

�A beoltott tápközeg halmazállapota

(folyékony, szilárd)

�Az oltás formája, típusa

Oltási módok

5

Folyadék tenyészet:Táplevesbe oltunk.

Tenyésztési módok

A szaporodást többféleképpen észlelhetjük:

� tápleves zavarosodás� gyűrűképződés� hártyaképződés� üledékképződés

üledékképzés

hártyaképzés

Ferde agar tenyészet:Kémcsöves ferde tápagar felületére oltunk kaccsal egyenes vagy hullámvonalban.

Alkalmazás: aerob mikroorganizmusokfenntartására.

A ferdített agar viszonylag nagy felületet biztosít az inokulum szétkenéséhez.

6

Magas agar tenyészet:�Az oltótűn lévő inokulumot szúrással juttatjuk a szilárd magas agarba.�Felolvasztott, 45 °C-ra visszahűtött folyékony tápagarbapipettával juttatjuk be az inokulumot.

Szúrt tenyészet magas agarba

Alkalmazás: �a légkörinél kisebb oxigénkoncentrációt igénylő (mikroaerofil),�anaerob mikroorganizmusok esetében.

Lemez tenyészet:Szélesztés: Petri-csészében előre kiöntött és megszilárdult táptalaj felületén kaccsal vagy szélesztőüvegbottal kenjük szét az inokulumot.

7

Lemez tenyészet:Lemezöntés: Üres Petri-csészébe 1 ml mikroba szuszpenziót pipettázunk, erre felolvasztott, 45 °C-ra visszahűtött tápagart öntünk, majd a kettőt óvatosan összekeverjük még a dermedés előtt.

Aerob tenyésztés�Szilárd tápközeg esetében a felületen való szélesztéssel.�Folyékony tápközeg esetében rázógépen.

Anaerob tenyésztés�A redoxpotenciál csökkentése a levegő (oxigén) eltávolításával.�A redoxpotenciál csökkentése a tápközeghez adagolt redukálóanyagokkal.

8

InkubálásMeghatározott ideig, meghatározott hőmérsékleten, termosztátban.

Tiszta tenyészet készítésCél: Vegyes mikroba tenyészetekből egy-egy mikroba csoportot, vagy egy-egy mikrobát különítsünk el, s annak más mikrobáktól mentes úgynevezett tiszta tenyészetét állítsuk elő.

9

Hígítási sor készítésCél: A vizsgálandó mintában lévő mikrobák olyan mértékű kihígítása, hogy tenyésztés után az egyes sejtekből származó telepek leszámolhatóak legyenek.

100.

000

sejt

/ml

10.0

00 s

ejt/

ml

1.00

0 se

jt/m

l

100

sejt

/ml

57*106*10 = 5,7*108 sejt/ml

Nagyítás I.

10

Fénymikroszkóp

Mechanikai részek:1. tubus: a nagyító lencserendszert

tartja; 2. beállítócsavarok (makro-, illetve

mikrocsavar); 3. tárgyasztal; 4. állványzat;

Optikai részek:5. Tárgylencse (objektív);6. szemlencse (okulár); 7.-12.: megvilágító lencserendszer:

7. fényforrás; 8. megvilágító rekesz; 9. apertura rekesz; 10. lámpa gyűjtőlencse; 11. kondenzor; 12. tükör

A mikroszkóp optikai képalkotása

Az okulárban a tárgy nagyított, fordított állású, látszólagos képe látható.

A mikroszkóp nagyítása:

Okulár lencse nagyítása X objektív lencse nagyítása (10x) X binokuláris tubus nagyítása (1,5x)

A fénymikroszkóppal elérhető legnagyobb nagyítás: 1000x-1500x

11

FeloldóképességAz a legkisebb távolság, amelynek két végpontja még két különállópontként érzékelhető a mikroszkópban. A kép részletgazdagságát jellemzi.A feloldóképesség jele: d

λ

n * sin u

Ahol: λ: az alkalmazott fény hullámhosszan: a tárgy és az objektív lencse közötti anyag

törésmutatója (levegő = 1)u: az objektív lencse félnyílásszöge (umax=72 °)n*sun u: numerikus apertura

d =

A mikroszkóp annál jobb, minél jobb a feloldóképessége, tehát minél kisebb a d értéke. A d értékét az n növelésével lehet javítani: ncédrusolaj= 1,5. A cédrusolaj alkalmazását nevezzük homogén immerziós vizsgálatnak.

Feloldóképesség

12

Nagyítás II.

150x-es nagyítás

(10-es objektív)

600x-os nagyítás

(40-es objektív)

1500x-os nagyítás

(100-as objektív)

Mikroszkópos preparátum fajtái

Élő állapotú készítmény Élettelen állapotúkészítmény

Natív

pl.élesztősejtek vizes szuszpenziója

Festett Egyszerű

egyféle festék, egy mikroba

Összetett

kettő vagy több festék, kettő vagy több

mikroba; differenciálóeljárás

Pozitív

a mikroba sejtet festi megpl. vitális festés

Negatív

a hátteret festi meg

13

Baktériumok vizsgálata

Baktérium morfológiaA baktériumsejtek jellegzetes alakjai

�Gömb: coccus�„Kokkoid”�Egyenes pálca�Hajlított vagy csavart pálca

A baktérium sejtek „elhelyezkedése” az osztódás után

Függ: a baktérium alakja, a sejtosztódás síkja

�Gömb:�Diplo-: a sejtek kettesével együtt maradnak

(az osztódás egy síkban történik)�Strepto-: a sejtek lánccá kapcsolódnak össze

(az osztódás egy síkban történik)�Tetrád: a sejtek négyesével helyezkednek el

(az osztódás két síkban történik)�Sarcina: a sejtek kockát alkotnak (8 sejt)

(az osztódás három síkban történik)�Staphylo-: a sejtosztódás síkja random,

pl. szőlőfürt alakzat

�Pálca: Az osztódás csak egy síkban történik:

14

Gömb (coccus)Egyesével, esetenként csomókban: pl. Micrococcus luteus

Párosával: pl. Streptococcus pneumoniae (tüdőgyulladás)

Láncszerűen: pl. Streptococcus thermophilus (tejtermékek)

Szőlőfürt alakzatban: pl. Staphylococcus aureus

Tetrád elrendeződés: pl. Pediococcus sp.

Kubikális elrendeződés: pl. Sarcina sp.

15

Egyenes pálcaSpórátlan: pl. Lactobacillus casei Lactobacillus bulgaricus

Spórás: pl. Bacillus (aerob)

Bacillus megateriumBacillus cereusBacillus anthracis

Clostridium (anaerob)Clostridium botulinumClostridium tetani

„Kokkoid”Párosával: pl. Enterobacter aerogenes

Láncszerűen: pl. Leuconostoc mesenteroides Oenococcus oeni

16

Hajlított vagy csavart pálca

Vibrio alak: egyszeresen hajlított; a vége elkeskenyedő, hegyes; pl. Vibrio cholerae

Spirillum alak: pl. Magnetospirillum sp.

Spirochete: pl. Borrelia sp.

Sejtfelületi nyúlványok

ATRICH MONOTRICH LOFOTRICH

AMFITRICH AMFI-LOFOTRICH PERITRICH

PILUS

17

Egyszerű festés� Tárgylemez zsírtalanítása, jelölése: tárgylemez láng

fölött való áthúzása

� Kenetkészítés: 2-3 kacsnyi szuszpenzió szétterítése a tárgylemezen kb. 0,5 cm-es körben

� Beszárítás levegőn

� Rögzítés hővel: a tárgylemez áthúzása a láng felsőharmadában 3-szor

� Festés: adott ideig, adott festékkel

���� Micrococcus flavus: genciánaibolya, 2 perc

���� Enterobacter aerogenes: szafranin, 5 perc

���� Bacillus megaterium: bázikus fuxin, 2 perc

� Öblítés, szárítás, HI vizsgálat

HI(homogén immerziós vizsgálat)

Lactobacillus(egyenes pálca)

Staphylococcus(gömb)

Enterobacter(„kokkoid”)

18

A Gram+ és a Gram- sejtfal

+

+

-

-

Lipopoliszacharid

Lipoprotein

++ vagy -Fehérje

-+Teichonsav

-+Poliszacharid

10 %50 %Peptidoglükán (murein)- N-acetilglükózamin

- N-acetilmuraminsav

Gram-Gram+

~80 %, ebből adódik a festési eljárásban a különbség

lipoidvegyüle-tek

A Gram+ és a Gram- sejtfal

A: Gram-pozitíva) murein-teichonsav rétegb) sejtmembrán

B: Gram-negatívc) murein rétegd) periplazmikus tére) külső membrán

1. murein 2. peptidkötés 3. teichonsav 4. lipid 5. fehérje 6.lipoprotein 7. lipopoliszacharid

19

A Gram-festés�Tárgylemez zsírtalanítása

�Kenetkészítés

�Szárítás levegőn

�Rögzítés hővel

�Festés kristályibolyával, 2 perc

�Öblítés

�Lúgol oldatos pácolás, 1 perc: festés stabilizálása (jód-pararosanilin festék-komplex)

�Öblítés

�Alkoholos differenciálás, 1 perc: a Gram- sejtfalból a lipid komponensek kioldódnak, így a festékkomplex távozik

�Öblítés

�Kontrasztfestés szafraninnal, 4 perc

�Öblítés, szárítás, HI vizsgálat

Festés kristály ibolyával

Lugol oldatos pácolás

Alkoholos differenciálás

Kontrasztfestés szafraninnal

Fixálás

Gram negatívGram pozitív

A Gram-festés

20

A Gram-festés

G- G+

G- és G+ keverék

Baktérium spóra�1 sejten belül 1 darab endospóra képződik�Ivartalan folyamat eredménye�A spórázást általában külső tényezők váltják ki (pl. tápanyagok kimerülése)�A kedvezőtlen körülmények átvészelésére létrejövő kitartóképlet, a faj fennmaradását szolgálja: a külső környezeti tényezőkkel ellenállóbbak, mint az őt létrehozó anyasejtFelépítés:�Spóraplazma:

�dehidratált állapotban van�fénytörő képesség fokozódik�hő- és sugárrezisztencia kialakulása�anyagcsere megszűnése: nyugvó állapot

�Többszörös fal:�membrán�spórafal�kortex (kéreg)�külső burkok�exospórium

Speciális vegyület: Ca-dipikolinát

21

Spóra festés� Zsírtalanítás

� Kenetkészítés

� Szárítás levegőn

� Rögzítés hővel

� I. festés: malachit zöld + hőkezelés, 15 perc (felgőzölés, agresszív festés)

� Öblítés

� II. festés (kontrasztfestés): szafraninnal, 2 perc (a spórát nem tartalmazó sejtek festésére

� Öblítés, szárítás

HI vizsgálat

Spóra festés

Bacullus subtilis

22

Élesztőgombák

1) Gram negatív coccus

2) Élesztőgomba3) Gram negatív

bacillus4) Fonalas gomba

Definíció:

Az élesztők jellegzetesen egysejtű, ivartalanul sarjadzással szaporodószervezetek. Az ivarosan szaporodó sejt mindig diploid, dikarion állapot nem fordul elő.

Aerob, heterotrófszervezetek, de anaerob körülmények között erjesztenek

Élesztőgombák csoportosítása-mesterséges rendszer

1. Valódi élesztőgombák:igazak rájuk a tipikus élesztő tulajdonságok

2. Álélesztőgombák:átmenetet képeznek a valódi és a fonalas gombák között

3. Imperfekt gombák: csak az ivartalan szaporodása ismert

23

Vegetatív szaporodási módok, mikroszkópos morfológia

1. Multipoláris sarjadzás

Az anyasejten bárhol keletkezhet sarj, a sarjak leválása után sarjhegek (ripacsok) keletkeznek.

Pl. Saccharomyces cerevisiae

2. Bipoláris sarjadzás

A sejt két végén képződnek a sarjak, a sarjhegek egymásra rakódnak; ez jellegzetes citrom alakot kölcsönöz a sejtnek

Pl. Kloeckera apiculata

3. SarjhasadásSzéles felületen történő sarjadzásPl. Schyzosaccharomyces pombe

– hasadó élesztőgomba

4. Álmicélium képzés

Sarjadzás után a sejtek nem válnak el egymástól, látszólag micéliumot képeznek (álmicélium)

A sejtek önálló anyagcserét folytatnak

• Differenciálatlan álmicélium: egyforma méretű sejtek. Pl. Candida

•Differenciált álmicélium: a főágban lévő sejtek hosszanti irányban megnyúltak, a mellékágakban lévő sejtek kisebbek. Pl. Pichia membranifaciens

24

5. Valódi micéliumA hifát alkotó rekeszek között anyagcsere kapcsolat van.

A micéliumok a végeknél feldarabolódhatnak,ez a feldarabolódás arthrospórákat eredményez.Pl. Geotrichum candidum

Ivaros szaporodás

Konjugációs tömlő

A két eltérő ivari jellegű egyed között konjugációs tömlő alakul ki.

Pl. Zygosaccharomyces bailii

Az élesztőspóra

• A spórák képződését ivaros folyamat előzi meg

• A spóra alakja fajra jellemző lehet

• A spóra mindegyike szaporítóképlet

• Az anyasejthez képest nem sokkal tér el az ellenállóképessége a külsőkörnyezeti tényezőkkel szemben

• Egy sejtben több mint egy spóra

25

Az élesztő sejt életciklusa

Vitális festés

Az élő és holt sejtek megkülönböztetését és megszámolását teszi lehetővéAz élő sejt dehidrogenáz enzime a metilénkék festéket színtelen leuko-metilénkékké redukálja, az elpusztult sejtek pedig megfestődnek.

Vizsgálandó mikroorganizmusok:– Geotrichum candidum– Kloeckera apiculata– Saccharomyces cerevisiae– Schizosaccharomyces pombe– Pichia mebranifaciens– Zygosaccharomyces bailii