111759552-tai-liệu-hướng-dẫn-thực-hanh

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH

VIỆN NGHIÊN CỨU CÔNG NGHỆ SINH HỌC VÀ MÔI TRƯỜNG

TÀI LIỆU HƯỚNG DẪN THỰC HÀNH

CHẨN ĐOÁN VI-RÚT ĐỐM TRẮNG TRÊN TÔM

BẰNG KỸ THUẬT NESTED - PCR

Cán bộ hướng dẫn

Huỳnh Đăng Sang

Tháng 9 năm 2012Lưu hành nội bộ

Bài 1. BỆNH ĐỐM TRẮNG

1. Tình hình dịch bệnh đốm trắng tại khu vực đồng bằng sông Cửu Long trong

những năm gần đây

Theo Chi cục Thủy sản Tiền Giang, năm 2010, số lượng thiệt hại bệnh đốm trắng trên tôm,

gây thiệt hại 66.972.000 con/275,82 ha, chiếm tỷ lệ 8,3 % lượng giống thả nuôi và 12,1 % diện

tích thả nuôi. Năm 2011, diện tích tôm nuôi bị thiệt hại là 951,04 ha, chiếm tỷ lệ 18,3% diện tích

thả nuôi. Nguyên nhân chính là do hoại tử gan tụy (chiếm khoảng 70% diện tích thiệt hại), còn

lại là do bệnh đốm trắng.

Tại tỉnh Cà Mau, năm 2011, diện tích tôm nuôi công nghiệp bị bệnh 538,85 ha (đốm trắng

86,33 ha, hoại tử gan tụy 452,53 ha). Trong 4 tháng đầu năm 2012, toàn tỉnh đã có 555 ha (cả

tôm sú và tôm thẻ chân trắng) bị chết, tập trung nhiều ở các huyện Đầm Dơi (với 234 ha tôm

chết), Phú Tân (215 ha), Cái Nước (67 ha) và thành phố Cà Mau (38 ha). Tôm chết chủ yếu bởi

các bệnh đốm trắng, hoại tử gan tụy

Trên địa bàn tỉnh Trà Vinh đã có 3.351 ha tôm nuôi, với gần 300 triệu con tôm sú bị chết tại

các huyện Trà Cú, Cầu Ngang, Duyên Hải, Châu Thành, ước thiệt hại hơn 300 tỷ đồng. Số diện

tích này nằm trong tổng diện tích 19.323 ha, với hơn 1,5 tỷ con tôm sú đã thả nuôi đầu vụ đến

nay tại các huyện trên. Tôm chết trong giai đoạn từ 15 – 45 ngày tuổi, chủ yếu nhiễm bệnh hoại

tử gan tụy, đốm trắng và đầu vàng.

Trong 8 tháng đầu năm 2012, mức độ thiệt hại nuôi tôm trên địa bàn tỉnh Sóc Trăng đến nay

đã chiếm gần 50%, trong đó diện tích thiệt hại do bệnh đốm trắng chiếm trên 40%.

2. Vi-rút đốm trắng (white spot disease virus)

2.1. Hình thái vi-rút

Virion có chiều dài dao động từ 210 đến 380 nm, bề dày từ 70 đến 167 nm. Phần phụ

giống như đuôi nằm ở một đầu của virion. Phần vỏ của dày 6-7 nm được cấu tạo từ màng

lipit gồm 2 lớp trong suốt được ngăn cách bới 1 lớp đục. Phần nhân nằm bên trong có cấu

trúc mạch vòng. Kích thước của nhân có khác biệt giữa các isolate, chiều dài từ 180 đến

420 nm và bề dày từ 54-85nm.

1

Hình 1. A) Hình thái của virion WSSV B) Ảnh chụp dưới kính hiển vi điện tử cho thấy phần phụ giống như đuôi (thước đo 250 nm) (Duran và ctv, 1996)

2.2. Bộ gen

Genome của WSSV là sợi đôi DNA dạng vòng, với lượng A + T chiếm 59%. Kích thước genome

khác nhau giữa các isolate, Thái Lan 293 kbp, Trung Quốc 305 kbp, Đài Loan kpb. Kết quả phân

tích trình tự cho thấy genome của WSSV có chứa từ 531 đến 684 khung đọc mở (open reading

frame, ORF) với codon bắt đầu là ATG. Trong đó, 181 - 184 ORFs mã hóa protein chức năng có

kích thước từ 51 đến 6077 amino acid. Khoảng 21 - 29 % ORFs mã hóa protein WSSV. Các

protein này gồm những enzyme tham gia vào quá trình tổng hợp nucleic acid và nhân bản DNA

như DNA polymerase, non-specific nuclease, tiểu phần của ribonucleotide reductase, thymidine

kinase, thymidylate kinase. Các protein có chức năng giả định gồm collagen - like protein,

flagellin, chitinase…

Hình 2. Cấu trúc tổng quát bộ gen vi-

rút đốm trắng (dòng Thái Lan)

2

2.3. Đặc điểm bệnh lý

Tôm bị bệnh có màu hồng đến hồng đỏ, xuất hiện những đốm màu trắng có đường kính từ 0,5-

3 mm ở mặt trong lớp vỏ kitin vùng đầu ngực và đốt bụng thứ 5, 6 sau đó lan ra toàn thân. Ở ao

nuôi, tôm bị bệnh dạt vào bờ và có dấu hiệu bệnh 1 đến 2 ngày trước khi chết. Tỉ lệ chết có thể lên

đến 100% trong vòng 10 ngày kể từ lúc bắt đầu bệnh

Hình 3. Các đốm trắng xuất hiện trên vỏ đầu

ngực của tôm bệnh

2.4. Các con đường lây truyền

Bệnh đốm trắng do WSSV lây lan rất nhanh qua 2 con đường chính. Lây lan theo

chiều dọc, từ bố mẹ nhiễm lây cho con. Lây lan theo chiều ngang, tôm nhiễm vi-rút từ

nguồn nước nuôi, từ cua, còng mang vi-rút từ ao này sang ao kia, từ dụng cụ sản xuất mang

mầm bệnh, từ tôm chết, chim, cò vô tình đưa vào ao.

2.5. Vật chủ mang mầm bệnh

WSSV đã được phát hiện cảm nhiễm nhiều loài vật chủ khác nhau Penaeus monodon,

P. japonicus, P. indicus, P. chinensis, P. merguensis, P. aztecus, P. stylirostris, P.

vannami, P. duorarum và P. setiferus; tôm càng xanh - Macrobrachium rosenbergii, cua -

Calappa lophos, Portunus sanguinolentus, Charybdis granulata và C. feriata.

2.6. Phòng bệnh

Cho đến nay, công tác phòng bệnh vẫn là biện pháp hiệu quả nhất để hạn chế thiệt hại

do bệnh đốm trắng. Sự phòng ngừa gồm có các biện pháp sau: chọn tôm bố mẹ, tôm giống

có chất lượng tốt, không nhiễm WSSV, nguồn nứớc cấp cho ao nuôi tôm phải lắng lọc và

khử trùng, vớt tôm chết ra khỏi ao, ngăn chặn không cho tôm và giáp xác khác vào ao nuôi,

duy trì các yếu tố môi trường thích hợp cũng như chất lượng thức ăn tốt, khẩu phần ăn hợp

3

lý. Nước nuôi tôm bị bệnh WSSV phải xử lý bằng Clorua vôi nồng độ (30 - 50 g/m3),

không được xả ra ngoài. Khi phát hiện bệnh tốt nhất là thu hoạch ngay.

2.7. Phương pháp chẩn đoán

Để phát hiện mầm bệnh WSSV có trên tôm bằng nhiều ph ơng pháp khác nhau như:ƣ

phương pháp mô học xác định bệnh dựa trên các thể vùi hiện diện trong tế bào biểu mô;

phương pháp lai tại chỗ (In situ hybridization) dấu hiệu xác định bệnh là kết quả lai giữa

đoạn gen dùng làm mẫu dò và đoạn gen của tác nhân gây bệnh trong điều kiện nghiêm

ngặt; phương pháp PCR xác định bệnh dựa trên là sản phẩm khuếch đại của một đoạn gen

đặc trưng của tác nhân gây bệnh; phương pháp Dot blot và Southern blot đ ợc thực hiệnƣ

với sản phẩm của PCR; phương pháp miễn dịch huỳnh quang dấu hiệu định bệnh là kết

quả kết hợp đặc hiệu giữa kháng nguyên và kháng thể, sử dụng kính hiển vi điện tử.

4

Bài 2.LY TRÍCH DNA

1. Tổng quan về phương pháp ly trích

Bước 1: Phá vỡ màng tế bào và màng nhân. Thông thường người ta nghiền tế bào

hoặc mô trong một hỗn hợp chất tẩy (SDS, sarcosyl, CTAB) và protein K. Hỗn hợp này sẽ

phá vỡ màng tế bào và màng nhân, giải phóng DNA ra môi trường đồng thời phân hủy các

protein liên kết với DNA.

Bước 2: Loại bỏ các thành phần không mong muốn, thường sử dụng dung dịch

phenol:chloroform

Bước 3: Kết tủa nucleic acid. Mục đích của việc kết tủa là nhằm thu nhận nucleic

acid dưới dạng cô đặc, một mặt nhằm bảo vệ chúng khỏi sự phân hủy của các enzyme, mặt

khác có thể hòa tan chúng lại trong dung môi theo nồng độ mong muốn. Hai cách kết tủa

thông dụng là dùng ethanol hoặc isopropanol. Trong cả hai phương pháp, nucleic acid sẽ

được thu nhận lại bằng ly tâm. Sau đó, cặn kết tủa phải được rửa trong ethanol 70% để loại

bỏ các muối hoặc các dấu vết của isopropanol còn dính lại.

2. Thực hành

2.1. Phân nhóm

Sinh viên trong lớp (20 - 30 sinh viên) được chia thành 5 nhóm (4 - 6 sinh viên/nhóm). Mỗi

sinh viên ly trích 1 mẫu.

2.2. Chuẩn bị mẫu, hóa chất, dụng cụ, thiết bị

Mẫu: mẫu tôm sú, tôm chân trắng được mua ở trại giống hoặc mua tại chợ (sinh viên tự

chuẩn bị mẫu cho thực hành)

Hóa chất: SDS (sodium dodecyl sulphate) và NaOH

Dụng cụ:

Kẹp, kéo, đèn cồn, khay đựng nước đá, bút ghi mẫu.

Micropipet 100 - 1000 µl.

Thiết bị: Máy ly tâm, bếp điện.

Vật tư tiêu hao:

5

Chày vô trùng dùng nghiền mẫu trong tube ly tâm

Tube ly tâm 1,5 ml đã hấp khử trùng

Đầu côn xanh, vàng đã hấp khử trùng

Găng tay, khẩu trang, khăn giấy

2.3. Pha dung dịch ly trích DNA thô

Dung dịch ly trích DNA thô có nồng độ NaOH 0,025 N, SDS 0,0125% (theo

Kiatpathomchai và ctv, 2001) được pha theo các bước sau:

• Pha 100 ml NaOH 1N (MW=40)

Cân 4 g NaOH hòa trong 100 ml nước cất 2 lần

Hấp khử trùng ở 121oC trong 20 phút

• Pha 100 ml SDS 0,5% (MW=288,38)

Cân 0,5 g NaOH hòa trong 100 ml nước cất 2 lần

Hấp khử trùng ở 121oC trong 20 phút

• Dung dịch ly trích thô, thành phần như bảng sau

Dung dịch ly trích DNA thô 200 ml Nồng độ cuốiNaOH 1N 5 ml NaOH 0,0025 NSDS 0,5% 5 ml SDS 0,0125%

H2O 190 ml

2.4. Ly trích DNA

DNA được tách chiết theo nghiên cứu của Kiatpathomchai và ctv (2001). Quy trình được

tiến hành như sau:

Dùng kẹp lấy mang tôm cho vào eppendorf 1,5 ml và thêm 500 µl dung dịch

đệm ly trích thô DNA (0,025 N NaOH và 0,0125% SDS).

Dùng chày vô trùng nghiền cho mẫu đồng nhất.

Thêm 300 µl dung dịch ly trích thô DNA, tiếp tục nghiền.

Đun sôi eppendorf ở 100oC trong 20 phút (thấy dung dịch trong mẫu sôi lên).

Làm lạnh mẫu nhanh: chuyển eppendorf vào nước đá lạnh trong 5 phút.

6

Ly tâm ở 9.000 vòng/phút trong 5 phút. Hút dịch nổi vào eppendorf mới.

Nên thực hiện phản ứng PCR ngay sau khi tách chiết. Tuy nhiên có thể giữ mẫu ở -

20oC trong thời gian ngắn (khoảng 1 - 2 ngày).

7

Bài 3. CHẨN ĐOÁN WSSV BẰNG NESTED - PCR

1. Tổng quan về PCR

1.1. Nguyên tắc của PCR

Phản ứng PCR được thực hiện trên cơ sở sinh tổng hợp DNA theo nhiều chu kỳ nối

tiếp nhau, mỗi chu kỳ gồm 3 bước như sau: biến tính (denature), bắt cặp (annealing), kéo

dài (extension)

Hình 4. Các bước trong phản ứng PCR

1.2. Các hạn chế của phương pháp PCR

• Sự ngoại nhiễm là vấn đề lớn nhất

Nguồn ngoại nhiễm lớn nhất thường là sản phẩm khuếch đại của những lần thao tác

trước. Có thể khắc phục 1 phần của vấn đề bằng các cách sau:

Thiết lập phản ứng và phân tích sản phẩm khuếch đại được tiến hành ở những địa

điểm cách xa nhau

Dụng cụ để thiết lập phản ứng không sử dụng vào các thao tác khác. Sử dụng đầu

típ có lọc khi hút hóa chất.

8

Dùng tia tử ngoại để loại bỏ các phần tử còn lại từ lần khuếch đại trước

Chia nhỏ các thành phần phản ứng

Sử dụng dUTP để thay thế cho dTTP. Trước mỗi phản ứng, người ta thêm vào

dung dịch phản ứng uracylglycosylase, enzyme này phân hủy tất cả các DNA có mang

dUTP nhiễm từ lần trước. Đồng thời, enzyme sẽ bị phân hủy bởi nhiệt ngay từ lần biến

tính đầu tiên.

• Sự nhân bản không đặc hiệu

Xảy ra khi mồi bắt cặp không đặc hiệu với những trình tự khác vơi trình tự đích. Một

số phương pháp để khắc phục

Phương pháp “hot start” với đặc điểm chủ yếu là tránh sự tiếp xúc của các thành

phần quan trọng trong phản ứng trước khi trình tự đích được biến tính hoàn toàn.

Phương pháp nested PCR sử dụng thêm 1 cặp mồi được thiết kế để bắt cặp với sản

phẩm khuếch đại của lần thứ nhất.

• Sai sót do Taq polymerase gây ra

Sự sao chép bởi Taq polymerase cho tỉ lệ sai khá cao (10-4, nghĩa là 10000 nucleotide thì

enzyme gắn sai 1 nucleotide). Đặc tính này không nghiêm trọng nếu ta chỉ cần xem xét kích thước

hay sự có mặt của 1 sản phẩm khuếch đại, nhưng có ý nghĩa lớn nếu cấn xác định chính xác trình tự

nucleotide. Không thể loại bỏ hoàn toàn các sai sót này mà chỉ có thể giảm bớt bằng cách đảm bảo

cân bằng nồng độ các nucleotide trong phản ứng, sử dụng các DNA polymerase chịu nhiệt có độ

trung thực cao như VentTM, Pfu, Ultma DNA polymerase.

2. Thực hành chẩn đoán WSSV

2.1. Giới thiệu đoạn mồi

Năm 1996, Lo và ctv đã thiết kế 2 cặp mồi: 146F1/146R1 và 146F2/146R2, phát hiện sự hiện

diện của WSSV bằng kỹ thuật nested - PCR. Cặp mồi 146F1/146R1 khuếch đại đoạn bên ngoài

với kích thước 1447 bp. Cặp mồi 146F2/146R2 khuếch đại đoạn bên trong với kích thước 941 bp.

Quy trình này được tổ chức thú y thế giới (OIE) công nhận là quy trình chuẩn và khuyến cáo các

phòng thí nghiệm sử dụng để chẩn đoán WSSV.

9

Hình 5. Vị trí của primer 146F1/146R1, 146F2/146R2 và kích thước sản phẩm(Lo và ctv, 1996)

2.2. Phân nhóm

Sinh viên trong lớp (20 - 30 sinh viên) được chia thành 5 nhóm (4 - 6 sinh viên/nhóm). Mỗi

mỗi nhóm thực hiện 1 mẫu.

2.3. Chuẩn bị hóa chất, dụng cụ thiết bị

• Hóa chất thực hiện PCR:

Nước cất

PCR buffer 10 X

Taq polymerase 5U/µl

MgCl2 25mM

dNTP 10 mM

Primer146F1/146R1,

146F2/146R2 10µM

DNA ly trích

• Dụng cụ, thiết bị

Micropipet 0,5 - 10 µl, 10 - 100 µl, 100 - 1000 µl

Đầu típ trắng, vàng, xanh

Tube PCR 0,2 ml

Máy luân nhiệt, tủ cấy vô trùng

10

Tên primer Trình tựVị trí của primer trên

trình tự trên GenBank AF440570

Kích thước

146F1 5’-ACT-ACT-AAC-TTC-AGC-CTA-TCTAG-3’ 259206–2592291447 bp

146R1 5’-TAA-TGC-GGG-TGT-AAT-GTT-CTT-ACG-A-3’ 260629–260653

146F2 5’-GTA-ACT-GCC-CCT-TCC-ATC-TCC-A-3’ 259457–259479941 bp

146R2 5’-TAC-GGC-AGC-TGC-TGC-ACC-TTG-T-3’ 260376–260398

Máy ảnh, găng tay, khẩu trang, khăn giấy

2.4. Thực hiện PCR bước 1 với cặp mồi 146R1/146F1

2.4.1. Tính thể tích các thành phần phản ứng cần hút

Thành phần phản ứng cho 1 phản ứng với tổng thể tích là 25 µl

Thành phần Nồng độ đầu Nồng độ cuối Thể tích cần hútH2O 16,7 µlPCR Buffer 10X 1X 2,5 µlMgCl2 25 mM 1,5 mM 1,5 µldNTP 10 mM 0,2 mM 0,5 µlPrimer 146F1 10 µM 0,5 µM 1,25 µlPrimer 146R1 10 µM 0,5 µM 1,25 µlTaq polymerase 5 U/ µl 1,5 U 0,3 µlDNA khuôn 1 µl

• Để tính thể tích PCR buffer, MgCl2, dNTP, primer cần hút, chúng ta sử dụng công

thức:

C1 x V1 = C2 x V2

C2: nồng độ cuối

V2: tổng thể tích của 1 phản ứng

C1: nồng độ đầu

V1: thể tích cần hút

Ví dụ: Cách tính thể tích primer cần hút.

Nồng độ đầu của primer là 10 µM (C1 = 10 µM)

Nồng độ cuối của primer trong 1 phản ứng là 0,4 µM (C2 = 0,4 µM)

Tổng thể tích của 1 phản ứng là 25 µl (V2 = 25 µl)

Sử dụng công thức trên, suy ra thể tích primer 10 µM cần hút: V1 = 1µl

• Để tính thể tích Taq polymerase cần hút, chúng ta sử dụng tam thức:

1 µl Taq polymerase 5 U

? µl Taq polymerase Cần 1,5 U cho 1 phản ứng

Sau khi tính thể tích cần hút cho 1 phản ứng, chúng ta tính thể tích cần hút cho n

phản ứng: lấy thể tích cho 1 phản ứng * n. Lưu ý: không tính đối với thể tích DNA ly

trích và phải tính dư thêm 1 hoặc 2 phản ứng để trừ hao hụt trong thao tác.

11

Thành phầnNồng độ

đầuNồng độ

cuốiThể tích cần

hút (µl)

Thể tích cần hút cho 6 phản ứng (n=6)

(µl)H2O 16,7 100,2PCR Buffer 10X 1X 2,5 15MgCl2 25 mM 1,5 mM 1,5 9dNTP 10 mM 0,2 mM 0,5 3Primer 146F1 10 µM 0,5 µM 1,25 7,5Primer 146R1 10 µM 0,5 µM 1,25 7,5Taq polymerase 5 U/µl 1,5 U 0,3 1,8

DNA khuôn 1 -

2.4.2. Thực hiện mix mẫu

Sử dụng micropipet để pha master mix chung, bao gồm các thành phần phản ứng trong 1

tube lớn (không hút DNA khuôn). Sau đó chia đều master mix vào n tube PCR 0,2 ml. Cuối

cùng, hút 1 µl DNA khuôn cho vào tube PCR 0,2 ml để được tổng thể tích 25 µl.

Lưu ý khi thực hiện:

- Mix mẫu trong tủ vô trùng, phải vệ sinh tủ trước khi sử dụng.

- Khi mix mẫu, đặt các tube hóa chất trên gel đá hoặc đá bào để giữ lạnh các hóa chất

- Các hóa chất như H20, MgCl2, PCR buffer, dNTP, primer đóng đá khi bảo quản ở - 20oC

nên phải rã đông và trộn đều trước khi hút.

- Taq polymerase rất dễ hỏng nên khi lấy ra khỏi tủ âm nên phải cho ngay vào master mix

và cất lại vào tủ âm.

- Để tránh tạp nhiễm vào hóa chất, nên cất hết các hóa chất trước khi mở nắp các tube chứa

DNA khuôn.

2.4.3. Thực hiện chu trình nhiệt

Chu trình nhiệt được cài đặt như bảng

12

2.5. Thực hiện PCR bước 2 (nested PCR) với cặp mồi 146F2/146F2

Sản phẩm PCR của bước 1 trở thành khuôn DNA cho PCR bước 2 khi thực hiện với

cặp mồi 146F2/146F2. Cách tính thể tích thành phần phản ứng, thực hiện mix mẫu, chu kì

nhiệt giống với bước 1. Sau khi thực hiện xong, sản phẩm PCR được điện di kiểm tra ngay

hoặc trữ ở tủ âm.

Lưu ý: vì bước 2 sử dụng sản phẩm PCR của bước 1 để làm khuôn nên khả năng bị tạp

nhiễm từ mẫu này sang mẫu, từ sản phẩm PCR vào hóa chất là rất cao. Khi thực hiện phải

cẩn thận, phải cất hết hóa chất, đóng nắp hết các tube chứa master mix trước khi mở nắp

tube PCR 0,2 ml.

13

Nhiệt độ Thời gian Số chu kỳ940C 4 phút 1940C 1 phút

40550C 1 phút720C 2 phút720C 5 phút 140C ∞

14

Bài 4. ĐIỆN DI TRÊN GEL AGAROSE

1. Tổng quan về phương pháp điện di trên gel agarose

Agarose là một trong các dạng của polysaccharide. Các nhà sinh học phân tử đã khai

thác đặc tính thể gel trong điện di để phân tách DNA. Agarose sẽ tạo thành các hạt agarose

sau khi tan ở nhiệt độ cao hoặc đun sôi trong vài phút. Khi nguội lại, những hạt agarose sẽ

kết tụ lại với nhau. Giữa các hạt có những lỗ rất nhỏ. Kích thước của các lỗ này xê dịch

chút ít theo nồng độ của agarose gel. Trong điện trường, DNA di chuyển từ điện cực âm

sang điện cực dương, vì DNA mang điện tích âm. Khi DNA di chuyển qua các lỗ của

agarose, sự cọ xát giữa các hạt agarose và phân tử DNA tao ra lực kháng làm ngăn cản sự

dịch chuyển của DNA. DNA có phân tử càng lớn thì lực cản càng mạnh, di chuyển càng

chậm và ngược lại. Nhờ vậy mà chúng ta có thể phân tách được các đoạn DNA trên gel

agarose.

Sau khi điện di trên gel, các đoạn DNA được phân ra tùy theo trọng lượng phân tử.

Chúng ta có thể quan sát chúng bằng mắt nhờ kĩ thuật nhuộm màu DNA với

ethidiumbromide và chiếu tia UV.

2. Thực hành phân tích sản phẩm PCR trên gel agarose trong quy trình chẩn đoán

WSSV bằng nested PCR

2.1. Chuẩn bị hóa chất, dụng cụ

Agarose

Dung dịch đệm TBE 0,5X

Loading dye

Khuôn đổ gel và lược

Bể điện di

Bể nhuộm ethidiumbromide

Micropipet 0,5 - 10 µl

Đầu côn trắng

Giấy bạc, găng tay, khẩu trang

Máy ảnh

Lò vi sóng

2.2. Tiến hành đổ gel

Sản phẩm PCR được phân tích trên gel agarose 1%. Để đổ gel agarose 1%, tiến hành cách

bước sau:

15

Kiểm tra lại số mẫu để chọn số giếng trên gel để từ đó chọn thể tích khuôn

phù hợp

Tính lượng agarose cần dùng

gel agarose 1% 100 ml dung dịch TBE 0,5X cần 1 g agarose

60 ml TBE 0,5X (thể tích của khuôn) ? g agarose

Sử dụng quy tắc tam suất, lượng agarose cần dùng là 0,6 g.

Cân đúng lượng agarose cần dùng (0,6 g) cho vào chai có chứa TBE 0,5 X (60 ml)

Đậy nắp chai, lắc đều, đặt vào lò vi sóng, đun 2 phút cho agarose tan hết.

Đổ vào khuôn, đặt lược vào để tạo các giếng trên gel. Đợi 40 phút cho gel đông, sau

đó gỡ gel ra khỏi khuôn một cách nhẹ nhàng, tránh làm vỡ gel. Có thể trữ gel trong

TBE 0,5 X

2.3. Tiến hành điện di

Trộn đều 5 µl DNA ly trích hoặc sản phẩm PCR với 1 µl loading dye. Sau đó hút

hỗn hợp này cho vào giếng.

Điện di dưới hiệu điện thế 80 V, trong 30 phút.

Nhuộm gel trong bể ethidium bromide trong 30 phút. Sau đó quan sát dưới tia UV.

Ghi nhận kết quả bằng máy ảnh.

2.4. Phân tích kết quả

Để kết luận mẫu xét nghiệm có DNA của WSSV hay không, chúng ta dựa vào kết quả

PCR bước 2 khi thực hiện với cặp mồi 146F2/146R2.

Kết luận mẫu xét nghiệm có DNA của WSSV khi: đối chứng dương có băng DNA

(941 bp), đối chứng âm không có băng, mẫu xét nghiệm có băng có cùng kích thước

với băng của đối chứng dương (941 bp)

Kết luận mẫu xét nghiệm không có DNA của WSSV khi: đối chứng dương có băng

DNA (941 bp), đối chứng âm không có băng, mẫu xét nghiệm không có băng có

cùng kích thước với băng của đối chứng dương (941 bp)

16

Ví dụ:

Hình 6. Kết quả điện di sản phẩm khuếch đại khi thực hiện nested PCR với mẫu tôm nghi ngờ nhiễm WSSV thu thập tại huyện Đầm Dơi. Giếng 1 và 9: đối chứng dương; giếng 7 và 15: đối chứng âm; giếng 2, 3, 4, 5, 6 sản phẩm mẫu khuếch đại với cặp mồi 146F1/146R1; giếng 10, 11, 12, 13, 14, sản phẩm mẫu khuếch đại với cặp mồi 146F2/146 R2; giếng 8: thang DNA 1000 bp. Điện di với gel agarose 1,5% dưới hiệu điện thế 80 V trong 30 phút. (Thiên Thị Kim Kỷ, 2012)

Kết quả PCR bước 2 khi thực hiện với cặp mồi 146F2/146R2 cho thấy:

Đối chứng dương có băng 941 bp

Đối chứng âm không có băng

5 mẫu xét nghiệm có băng cùng kích thước với đối chứng dương. Nên kết luận mẫu có DNA của WSSV.

17

TÀI LIỆU THAM KHẢO

1. Lo, C.F., Leu, J.H., Ho, C.H., Chen, C.H., Peng, S.E., Chen, Y.T., Chou, C.M., Yeh,

P.Y., Huang, C.J., Chou, H.Y.,Wang, C.H., Kou,G.H. 1996. Detection of

baculovirus associated with white spot syndrome (WSBV) in penaeid shrimps using

polymerase chain reaction. Dis. Aquat. Org. 25, 133–141.

2. Durand S., Lightner D.V., Nunan L.M., Redman R.M., Mari J & Bonami J.R.

(1996) Application of gene probes as diagnostic tools for white spot baculovirus

(WSBV) of penaeid shrimp. Diseases of Aquatic Organisms. 27, 59–66.

3. Kiatpathomchai1 Wansika, Vichai Boonsaeng, Anchalee Tassanakajon3,

Chainarong Wongteerasupaya, Sarawut Jitrapakdee, Sakol Panyim. 2001. A non-

stop, single-tube, semi-nested PCR technique for grading the severity of white spot

syndrome virus infections in Penaeus monodon. Diseases of Aquatic Organisms. 47,

235–239

4. Thiên Thị Kim Kỷ. 2012. Nghiên cứu phát hiện vi-rút đốm trắng (wssv) trên tôm tại

tỉnh Cà Mau bằng Nested - PCR. Khóa luận tốt nghiệp chuyên ngành công nghệ

sinh học.

18