103266924 Recuento de Coliformes Totales y Termotolerantes E COLI[1]

“Universidad Nacional Jorge Basadre Grohmann”FACULTAD DE CIENCIAS- ESBI

PRÁCTICA DE LABORATORIO:

RECUENTO DE COLIFORMES TOTALES, TERMOTOLERANTES: Técnica del número más probable (NMP) y aislamiento de E.coli

INTEGRANTES:-Tania Arias Ch. -Germán Mamani

COLIFORMES

Son bacilos Gram negativos no

esporulados, forma bacilar.

Aerobias o anaerobias facultativas.

Fermentan la lactosa con producción de Ácido y gas a 30-37ºC en 48 horas

Capacidad para crecer en presencia

de sales biliares.

Se encuentra en:

Intestino del hombre, animales, y en

otros ambientes como:

Suelo, plantas, cáscaras de huevo,

etc.

COLIFORMES

Los principales microorganismos indicadores en alimentos son:

Indicadores de condiciones de manejo o de eficiencia de proceso: Mesófilos aerobios (o cuenta total) , cuenta de

hongos y levaduras y cuenta de coliformes totales.

Indicadores de contaminación fecha o bacterias entéricas: Coliformes fecales, E. coli y enterococos.

COLIFORMES

La selección de indicadores en un alimento depende fundamentalmente de:

Los riesgos implicados

Lo que se requiera saber para: liberar, controlar o mejorar el alimento,

manteniendo el enfoque preventivo.

COLIFORMES

E. coli, es un microorganismo indicador pues:

Ser detectables y estar presentes. Su crecimiento y número debe ser

correlativamente negativa a la calidad. Contados y diferenciados de otros

microorganismos. Contables en poco tiempo. Su crecimiento no debe ser alterado por

otro componente de la flora.

COLIFORMES

Se consideran excelentes indicadores de la eficiencia de los procesos de sanitización y desinfección, así como de calidad sanitaria en agua, vegetales y diversos productos procesados.

Su determinación se basa generalmente en la capacidad de fermentar lactosa

COLIFORMES

Los coliformes fecales o Termotolerantes,

fermentan la lactosa entre 43,.5 – 45,5ºC, y la

facultad de producir Indol en agua peptonada

(Pascual,1922).

COLIFORMES

Los coliformes totales, fermentan la lactosa a 35 +-1ºC generalmente:

Escherichia Enterobacter

Citrobacter Klebsiella.

COLIFORMES

Existen 3 fases o etapas:

Prueba presuntiva.

Prueba confirmatoria.

Prueba concluyente.

Análisis de Coliformes en Agua y Alimentos

Fuente: Youself, E. Ahmed; Carlstrom, Carolyn; “Microbiología de los alimentos – Manual de laboratorio”;2003; Ed. Acribia.

TABLA 1: Métodos de análisis de coliformes

Pruebas presuntivas, confirmativas y concluyentes en el análisis de coliformes de alimentos

Fuente: Youself, E. Ahmed; Carlstrom, Carolyn; “Microbiología de los alimentos – Manual de laboratorio”;2003; Ed. Acribia.

Procedimiento según la FDA:MUESTRA + Tampón fosfato Butterfield

Homogenizar la muestra con

solución diluyente

10 -1 10 -2 10 -3

INCUBAR

1. Prueba presuntiva de

coliformes

Consultar tabla NMP para 3 diluciones

2. Prueba confirmativa de coliformes totales

4. Prueba completa para

E.coli

3. Prueba confirmativa de

coliformes tolerantes

FUENTE: FDA

MÉTODO NORTEAMERICANO MÉTODO BRITÁNICO MÉTODO CALDO LACTOSA 2% DE BILIS VERDE

BRILLANTE, Y CONFIRMACIÓN EN MEDIO SÓLIDO

RECUENTO DE COLIFORMES TOTALES

MÉTODO NORTEAMERICANO

RECUENTO DE COLIFORMES TOTALES (ICMSF)

1ml 1ml10 -1

10 -210 -3

C/U con 9ml de

AP

C/U con 10ml de

LST

INCUBAR: 35 -37 ºC por 24 – 48 h.

25 gr MUESTRA + 225ml AP

Verificar gas y turbidez

Prueba presuntiva:

Prueba presuntiva:

+ + + ++ +---

Prueba confirmativa:

Verificar gas y turbidez

Verificar gas y turbidez

10 ml Caldo Brilla

INCUBAR: 35 -37 ºC por 24 –

48 h.

+ + - - - -

2 0 0

caldo LST

Fuente: ICMS. Segunda Edición. Editorial Acribia.

MÉTODO BRITÁNICO

RECUENTO DE COLIFORMES TOTALES (ICMSF)

1ml 1ml10 -

1 10 -2

10 -3

C/U con 9ml de

AP

C/U con 10 mL

Caldo Mac Conkey

(Púrpura de Bromocresol) INCUBAR: 35 -37 ºC por 24 – 48 h.

25 gr MUESTRA +

225ml AP

Verificar gas y turbidez

Prueba presuntiva:

Prueba confirmativa:

Verificar gas y turbidez

Caldo Mac Conkey

(Púrpura de Bromocresol)

+ + + ++ +---

3 12

MÉTODO CALDO LACTOSA 2% DE BILIS VERDE BRILLANTE, Y CONFIRMACIÓN EN MEDIO SÓLIDO

RECUENTO DE COLIFORMES TOTALES (ICMSF)

1ml 1ml10 -

1 10 -2

10 -3

C/U con 9ml de

AP

C/U con 10ml de

Brilla

INCUBAR: 35 -37 ºC por 24 – 48 h.

25 gr MUESTRA

+ 225ml AP

Verificar gas y turbidez

Prueba presuntiva:

Prueba presuntiva:

+ - - -+ +---

Prueba confirmativa:

Verificar gas y turbidez

Verificar gas y turbidez

caldo brilla

INCUBAR:Con VRBA (Agar bilis lactosa rojo neutro cristal violeta): 24 horas/ 35 – 37ºC

Con Agar ENDO: 48 horas/ 35 – 37ºC

Siembra en superficie de tubos positivos

MÉTODO NORTEAMERICANO MÉTODO BRITÁNICO MÉTODO CALDO LACTOSA 2% DE BILIS VERDE

BRILLANTE, Y CONFIRMACIÓN EN MEDIO SÓLIDO

RECUENTO DE COLIFORMES

TERMOTOLERANTES

MÉTODO NORTEAMERICANO

RECUENTO DE COLIFORMES TERMOTOLERANTES (ICMSF)

1ml 1ml10 -

1 10 -2

10 -3

C/U con 9ml de

AP

C/U con 10ml de

LST

INCUBAR: 35 -37 ºC por 24 – 48 h.

25 gr MUESTRA

+ 225ml AP

Verificar gas y turbidez

Prueba presuntiva:

Prueba presuntiva:

+ + + ++ +---

Prueba confirmativa:

Verificar gas y turbidez

Verificar gas y turbidez

10 ml Caldo Brilla

INCUBAR: 44,5 +- 0,2 °C por 24 – 48 h.

+ + - - - -

2 0 0

caldo LST

Tomar asadas

MÉTODO BRITÁNICO

RECUENTO DE COLIFORMES TERMOTOLERANTES (ICMSF)

1ml 1ml10 -

1 10 -2

10 -3

C/U con 9ml de

AP

C/U con 10 mL

Caldo Mac Conkey

(Púrpura de Bromocresol) INCUBAR: 35 -37 ºC por 24 – 48 h.

25 gr MUESTRA

+ 225ml AP

Verificar gas y turbidez

Prueba presuntiva:

+ + + ++ +---

+ + + ++ +---

Verificar gas y turbidez

Verificar gas y turbidez

10 ml Caldo Brilla

INCUBAR: 44°C +- 0,1 °C por 24 – 48 h.

+ + + + + +

23 1

caldo LST

Tomar asadas de los tubos

positivos

Tomar asadas de los tubos positivos

Prueba Indol44 ºC

Producción de gas e Indol positivo+ + + + + +

Coliformes termotolerantes

PRUEBAS IMViC PARA

IDENTIFICACION DE COLIFORMES

Fuente: ICMS. Segunda Edición. Editorial Acribia.

Pruebas de identificación de organismos coliformes: IMViC

Gas en caldo lactosado

biliado a 44-45.5° C

Prueba de indol

Prueba rojo de metilo

Prueba de Vogues

Proskauer

Crecimiento en citrato

E. ColiTipo ITipo II

+-

+-

++

--

--

IntermediosTipo ITipo II

--

-+

++

-b-b

++

Enterobacter aerogenes

Tipo ITipo II

--

-+

--

++

++

Enterobacter cloacae

- - - + +

IrregularesTipo ITipo IITipo IV

-++

+--

++-

--+

--+

Fuente: ICMS

NMP PARA AGUA POTABLE25 gr

MUESTRA +

225ml AP

INCUBAR: 35 -37 ºC por 24 – 48 h.

10 ml

1 ml 0,1 ml

Serie de diluciones con 9ml de diluyente

10 -2

10 -3

10 -4

NMP PARA AGUA DE MAR25 gr

MUESTRA +

225ml AP

Pre incubación: 35 -37 ºC por 3 horasIncubación a Baño María: 44,5°C x 21 a 23 horas

10 ml

1 ml 0,1 ml

Serie de diluciones con 9ml de diluyente

10 -2

10 -3

10 -4

CALDO: AL

FUENTE: MINISTERIO DE SALUD

Pruebas de identificación de organismos coliformes: IMViC

Indol (+)Rojo de

metilo (+)

Voges Proskauer

(-)

Citrato (-)

INVESTIGACIÓN DE E. coli

FUENTE: NORMA ISO

Uso de las Petrifilm:

Estas placas contienen un medio selectivo para E.coli coloreándose las colonias de azul violeta si esta esta presente, sin necesidad de realizas pruebas de identificación.

VENTAJAS: Evita errores humanos Ayudan a los procesadores de alimentos a muestrear

fácilmente, una detección rápida del microorganismo

MÉTODOS ALTERNATIVOS:

PETRIFILM

E.coli en MUG en presencia de luz UV

EN NUESTRO

LABORATORIO…

UTILIZAREMOS EL MÉTODO CALDO LACTOSA 2% DE BILIS VERDE BRILLANTE, Y CONFIRMACIÓN EN MEDIO SÓLIDO

MATERIALES

MUESTR

A

•Refresco presuntamente contaminado

DILUYENTE

•Agua peptonada

MEDIO

•Caldo lactosa 2% bilis verde brillante (brilla)

PROCEDIMIENTO (ICMSF)

1ml 1ml10 -1

10 -2 10

-3 C/U con 9ml de

AP

C/U con 10ml de

Brilla

INCUBAR: 35 -37 ºC por 24 – 48 h.

VACIAR LA MUESTRA AL

BEAKER

25 ml

AP

Agregar 1ml a cada tubo

1ra Lectura

VERIFICAR SI HUBIERA GAS Y TURBIDEZ

caldo brilla

+ + - -+ ----

INCUBAR:Con Agar ENDO: 48 horas a 35 – 37ºC

Sembrar en superficie tubos

positivos

Inocular con un asa los tubos positivos

INCUBAR:24 horas a 44ºC a baño maría

Realizar las pruebas de identificación: IMViC

Luego de analizar la muestra de refresco, se obtuvo una cepa sospechosa para E. coli, y luego de las pruebas bioquímicas IMViC:

RESULTADOS

Resultados

Prueba del INDOL

El indol es uno de los productos de degradación metabólica del aminoácido triptófano. Las bacterias que poseen la enzima triptofanasa son capaces de hidrolizar y desaminar el triptófano con producción de indol.Al añadir dos gotas del reactivo. Esperar 10 minutos para observar el color del halo formado.

Halo rojo: reacción +

ResultadosPrueba del ROJO

DE METILO

Esta prueba se fundamenta en el tipo y la proporción de productos de fermentación que se originan de la fermentación de la glucosaLa fermentación n ácido-mixta

Reactivo prueba de RM: solución indicadora Rojo de Metilo

Halo rojo: reacción (+)

ResultadosPrueba de VOGUES

PROSKAUER

Voges-Proskauer buscavía de fermentación del butanodiolGlucosa acetil-metil-carbinol butanodiolReactivo prueba de VP: Solución de naftol e K(OH)

Color marrón: reacción (–)

ResultadosPrueba del

CITRATO SODICO

Determinación sobre la capacidad de un organismo de utilizar citrato como única fuente de carbono y energía. Únicamente las bacterias capaces de metabolizar el citrato podrán multiplicarse en este medio y, al hacerlo, liberarán iones amonio lo cual basificará el medio. Sin crecimiento y color verde: reacción –

- Tener todo listo antes de iniciar la práctica - No demorar al momento de realizar las

diluciones - Homogenizar bien las diluciones - Marcar las pipetas que se usan para cada

dilución

Sugerencias:

I.C.M.S.F. 2000. Los Microorganismos de los Alimentos. Vol. I: Su significado y métodos de enumeración. 2a edición. Editorial Acribia, S.A. - Zaragoza (España).

Food and Drug Administration. 2001. Bacteriological Analytical Manual. 8th Edition. USA.

Youself, E. Ahmed; Carlstrom, Carolyn; “Microbiología de los alimentos Manual de laboratorio”;2003; Ed. Acribia.

Bibliografía:

GRACIAS !!