10/1/17 TS. Vũ Bích Ngọ[email protected] 1 · • Điều kiện thích hợp – Phase rắn • Cơ chất hay phase mà tế bào phát triển eg. glass, plas−c, collagen,

10/1/17 TS.VũBíchNgọ[email protected] 1

SINH HỌC CỦA TẾ BÀO ĐỘNG VẬT

Đặcđiểmsinhhọccủatếbào

Cácyếutốảnhhưởngđếnsựthànhcôngcủanuôicấytếbào

10/1/17 TS.VũBíchNgọ[email protected]

ĐẶC ĐIỂM CỦA TẾ BÀO ĐỘNG VẬT

Tínhcơhọcyếu(dễvỡ)

Tăngtrưởng,phânchiachậm(20-40giờ)Hiệusuấtsinhchấtcóhoạtcnhsinhhọcthấp


4

Chukìtếbào

M Mitosis

G1 Gap1

G2 Gap2

G0

S Synthesis

G1 check point •  cell big •  environment suitable

G2 check point •  DNA replicated •  cell big •  environment suitable

Metaphase check point •  chromosome align on spindle

5

Chukìtếbào

•  Interphase:–  Nhìnchungkéodàitừ12-14giờtrongmôđộngvậtcóvú–  TếbàođangtổnghợpRNA,tạoproteinvàpháttriểnvềkíchthước

•  Gap0(G0):tếbàothoátrakhỏichukìtếbàovàkhôngphânchia•  Gap1(G1):tếbàogiatăngkíchthước,tổnghợpRNAvàprotein,có1G1

Checkpoint•  SPhase:sựnhânđôiDNAxảyra•  Gap2(G2):tếbàosẽcếptụcpháttriểnvàsảnxuấtcácproteinmới.Có1G2

Checkpoint•  MitosishayMPhase:

–  Sựpháttriểnvàtổnghợpprotein–  Tếbàochiathành2tếbàogiốngnhau.–  Mitosisthườngxảyratừ1-2giờ–  CóCheckpointtronggiữakìcủaMitosis(MetaphaseCheckpoint)đểđảmbảo

tếbàohoànthànhxongsựphânchia.

•  Làđiểmquantrọngquyếtđịnhsựphânchiacủatêsbaof

•  Khitếbàovượtquađiểmnày,đivàophaseS,quátrìnhphânchiakhôngthểđảongược.

Chukìtếbào

•  Đảmbảotếbàophânchiathuậnlợi

•  Nếutếbàobịlỗihoặctổnthương,G”checkpointsẽdừnglạiđểsửachữa

•  Nếutổnthươngkhôngthểđảongược,tếbàođivàoquátrìnhapoptosisàđảmbảoDNAhưhỏngtếbàokhôngtruyềnchothếhệsauàquantrọngtrongngănngừaungthư

Chukìtếbào

Chukìtếbào

9

SỰTĂNGSINHINVITRO

•  SựTĂNGSINHcủatếbàotrongnuôicấyphụthuộc:–  Trạngtháitựnhiêncủatếbào:

•  Vaitròcủabộgen–GiớihạnHayflick•  Vaitròcủasựbiểuhiệngen

–  Môitrườngnuôicấy•  Cơchấttếbàobám•  Thànhsinhlívàsinhhoácủamôitrườngnuôi•  Thànhphầncủaphasekhí•  Nhiệtđộnuôi•  Tươngtáctếbào-tếbàovàtếbào-chấtnền

ThờigiannhânđôicủarBMMSCkhôngthayđổitrongsuốtquátrìnhnuôitrongkhiởhASC,rASC,

hBMMSCthờigiannàytănggấp2

IzadpanahR,TryggC,PatelB,etal.BiologicProper�esofMesenchymalStemCellsDerivedFromBoneMarrowandAdiposeTissue.Journalofcellularbiochemistry.2006;99(5):1285

ThayđổikiểugenvàkiểuhìnhDunghợp,biếnnạp,tảinạp…àtếbàothayđổikiểugenvàkiểuhình

•  Ởmỗitếbàophânchia,sựtựlàmmớivàbiệthoáđượcquyếtđịnhbởitươngtáccủayếutốbêntrongvàcnhiệuhướngdẫnhoặccnhiệuchọnlọcbênngoài

Thayđổikiểugenvàkiểuhình

•  MSCcủacácloàicókhảnăngbiệthoáthànhtếbàomỡnhưnhauởpass5(6-8ngày)

•  rASCvàhBMMSCthờigiantạogiọtmỡdàihơnởpass10;khôngcókhảnăngtạomỡsaupass15

•  rBMMSCvàhASC:ítthayđổikhảnăngbiệthoá,thờigianhìnhthànhgiọtmỡkhôngkhácnhauchođếnpass20


•  hASCvàrBMMSCbiệthoáthànhdòngtếbàotạoxươngtrongsuốtquátrìnhnuôicấy

•  rASCvàhBMMSCmấtkhảnăngbiệthoáthànhdòngtếbàotạoxươngsaupass10


•  Chiềudàitelomeregiảmtheotuổi•  Hoạtcnhcủatelomerasecaonhấtởcácpassđầu�ên

•  mứcđộhoạtđộngcủatelomerasekhácnhaugiữacácloàivàcácnguồnthu:giảmnhiềunhấtởrASCvàhBMMSC

Yếutốphiênmã•  chịutráchnhiệmđiềuhoàđặccnhsinhhọccủatếbào–  POUđượcmãhoábởiOct-4– Oct-2,Sox-2vàRex1điềuhoàchặtchẽtrongquátrìnhpháttriểnphôi

à Duytrìcnhđa�ềmnăngcủatếbào•  Cácyếutốkhác(bổsungtừngoài):địnhhướngsựbiệthoácủatếbào(BMP-6,TGF-β3,dexamethasone,ascorbate2-phosphate,proline,pyruvate,insulin,transferrin,selenousacid,5aza-cys�dine)

Tínhchấtcầngiáđỡ

-TBbámvàogiáđỡđểcóthểsốngsót,phânchia-Ngoạitrừ:hồngcầu,TBungthư,1sốdòngTBliêntục


19

SỰBÁMDÍNHINVITRO

•  Sựbámdínhtếbàolàcầnthiếtchosựtăngsinhvàbiệthóa

•  Cácphântửbámdínhtếbào:–  Tươngtáctếbào-tếbào:CAMs,cadherins–  Tươngtáctếbào-chấtnền:integrin,transmembrameproteoglycan

•  Phứchợpnốichặt(Tightjunc�onalcomplex)trongtếbàobiểumôchosựtươngtáctếbào-tếbào.

ExperimentalMethods2006 20

Cácnhântốảnhhưởngđếnsựbámdính

•  Sựphântáchbằngenzyme�êuhủycácphântửbámdínhvàchấtnềnngoạibào

•  Hầuhếttếbàotừmôrắnpháttriểndạngmonolayer

•  BềmặtbaophủvớiMatrixkíchthíchsựtăngsinhvàbiệthóa`

21

KÌMHÃMTIẾPXÚC-ĐIỀUHOÀSỰTĂNGSINH

•  Kìmhãm�ếpxúc•  Kíchthíchsựtăngsinh– Mậtđộthấp– Cáccnhiệutừmôitrường:cácnhântốtăngtrưởng

•  Ứcchếsựtăngsinh– Giớihạnmậtđộ:mậtđộtếbàocao– Kìmhãm�ếpxúc:tươngtáctếbào– Cáccnhiệutừmôitrường:p53geneproduct


Cácyếutốảnhhưởngđếnsựthànhcôngcủanuôicấytếbào

•  Tếbàothíchhợp•  Điềukiệnthíchhợp

–  Phaserắn•  Cơchấthayphasemàtếbàopháttriểneg.glass,plas�c,collagen,agar

–  Phaselỏng•  Cácđặccnhsinhlívàlíhóacủathànhphầnmôitrườngnuôi

–  Phasekhí–  Nhiệtđộ–  Độvôtrùngcủamôitrường


Pharắn

•  Tếbàocầnbámdínhvàomộtgiáthểđểsinhtrưởngvàdichuyển

•  Dụngcụphổbiếnnâấtlàpolystyreneplas�c

•  Nhữngcơchấtkhácnhưglass,filterwells•  Bềmặtcótêểđượcxửlívới:

–  PhủvớicơchấtnềnnhưCollagen,poly-l-lysine,matrigel

–  Lớpfeeder:monolayerofsuppor�ngcells,perhapspromotecellgrowthanddifferen�a�onbycellcontactandsubstancesecreted•  Neuronsonglialcellfeederlayers


Phaselỏng

•  Thànhphầncủamôitrường– Muốivôcơ•  Cânbằngápsuấtthẩmthấu•  Điềuhòađiệnthếmàng:sodium,potassiumvàcalciumions.•  Cầnthiếtchosựbámdínhnhưenzymecofactor.

–  Carbohydrate•  Hầuhếtchứa4-20mMglucose•  Nguồnnănglượng:glycolysis


Phaselỏng

–  ProteinsandPepcdes•  Đượcsửdụngđểthaythếhiệndiệntronghuyếtthanheg.transferrin,fibronec�n

–  Aminoacids•  Quantrọngchosựtăngsinhvàbiệthóa•  glutaminecóthểđivàochutrìnhKreb’scycle

–  Fa�yAcidsandLipid•  Quantrọngtrongmôitrườngserumfreemediae.g.cholesterolandsteroidscầnthiếtchocáctếbàođặcbiệt.


Phaselỏng

–  Vitamin•  vitaminsBcầnthiếtchosựpháttriểnvàsựtăngsinh•  Tiềnchấtchocácco-factors•  Vitaminsthườngsửdụnglàthiamine,riboflavinandbio�n

–  TraceElement•  zinc,copper,seleniumvàtricarboxylicacidintermediates.•  SeleniumisadetoxifiervàgiúptáchcácgốcO2tựdo


Phaselỏng

–  Hệđệm•  HầuhếtcáctếbàocầnpHtốiưu:7.2-7.4•  KiểmsoátpHcầnthiếtchonuôicấytốiưu:

–  Hệthốngđệmbicarbonate/CO2–  Hệđệmhóachất:HEPES

•  MôitrườngnuôicấythươngmạinhưpHindicator–  vàng(acid)hayhồng(alkali)

–  Ápsuấtthẩmthấu•  Tươngtựápsuấtthẩmthấu290mOsm


Phaselỏng

–  Huyếtthanh•  Nhântốkhôngxácđịnh:albumins,growthfactorsvàgrowthinhibitors•  Giatăngkhảnăngđệm•  Tăngkhảnăngbámdínhvàtrunghòachấtđộc•  Quantrọngchocáctếbàopháttriểnchậmhaykhinuôimậtđộthấp•  Biếnthiếntừngmẻ•  Huyếtthanhbấthọatnhiệt(incuba�onat56ºCfor30minutes)cóthểgiúpgiảmrủironhiễm


Phasekhí

–  Carbondioxide•  Quantrọngchohệđệm

–  5-10%CO2–  Sảnxuấtsảnphẩm:pyruvate

–  Oxy•  Hầuhếttếbàocầnthiếtphânápoxythấp•  anaerobicglycolysis•  NồngđộoxycaocóthểgiatănggốcO2tựdo

H3C C C O−

O O

C S

O

H3C CoA

HSCo A

NAD+ NADH

+ CO2

Pyruvate Dehydrogenase

pyruvate acetyl-CoA


Hìnhdạngtếbàokhinuôi

•  Hìnhdạngtếbàokhinuôicấyở2dạngchính:–  Pháttriểnhuyềnphù(nhưmộttếbàođơnhaycáccụmnhỏtếbào)

•  Dòngtếbàothutừmáu(leukaemia,lymphoma)–  Pháttriểndạngmonolayerbámdínhvàodụngcụnuôi.

•  Tếbàothutừcácmôrắn(lungs,kidney),endothelial,epithelial,neuronal,fibroblasts Hela-Epithelial

MRC5-Fibroblast SHSY5Y-Neuronal

BAE1-Endothelial


Nhiệtđộ

– Nhiệtđộtốiưuphụthuộcvàoloài•  Nhiệtđộcơthểmàtếbàođượcthunhận•  Nhiệtđộcủacủavùngmôthunhậntếbào(skintemperaturemaybelowerthantherestofthebody)


Kĩthuậtvôtrùng

•  Visinhvậtlàvấnđềnguyhạichínhtrongnuôicấytếbào•  Ngănngừasựnhiễm:

–  Khángsinh–  CảithiệnđiềukiệnPTN–  Kĩthuậtvôtrùng

•  Bềmặtsạchvàgọngàng•  Người“sạch”

–  Rửatay–  Nón,khẩutrang,găngtay

•  Hóachấtvàmôitrường•  Dụngcụnuôicấy

------------HẾT--------

10/1/17 TS. Vũ Bích Ngọ[email protected] 1 · • Điều kiện thích hợp – Phase rắn • Cơ chất hay phase mà tế bào phát triển eg. glass, plas−c, collagen,

Documents