101-1 書報討論

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101-1 書報討論2012 Seminar in Life Science

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2012 Seminar in Life Science目的表達能力臨場應變組織整理能力資料收集能力專業英文能力

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2012 Seminar in Life Science上課規定文獻選擇標準：

三年內生命科學相關 SCI 期刊避免臨床、公衛以及非研究報告（如 letter

to editor, short communication 等）選擇高點數期刊（ >5 ）或是長篇幅的文章（超過 8-9 頁）要有相當準備

可以的話請你的專題研究或是實習的老師幫忙鑑定一下適不適合你

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2012 Seminar in Life Science上課規定當次演講同學請提前到場準備

發放大綱上傳檔案（檢查檔案）借器材（簡報遙控器）

下次上課演講同學請一併到場幫忙準備，同時幫忙計時

準時開始演講是重要的禮貌

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2012 Seminar in Life Science上課規定每次上課三位同學報告，每位報告時間

20-25 分鐘，報告時間不足 15 分鐘或超過 30 分鐘者需重講

準時結束演講也是重要的禮貌

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2012 Seminar in Life Science上課規定定期點名

沒到一次扣總成績 5 分要更換報告順序請先通知，演講者無故缺席

一律當掉（這是演講的大忌）請假請附上假單

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2012 Seminar in Life Science上課規定成績

成績為演講時間控制、投影片內容、演講內容與技巧與回答問題表現四項綜合認真問問題的同學加分（總成績 0.5 ）演講者須於報告的隔週繳交問題的書面回覆（連同投影片 email 給我），未交及遲交者總成績扣 20 分

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2012 Seminar in Life Science上課規定飲食請低調（以不干擾他人為原則）討論請低聲禁止攜帶任何電子用品手機請關機或是調整為靜音以上是聽演講一般的禮貌

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2012 Seminar in Life Science上課規定報告當天請提供一張 A4 的大綱（可雙面）給

每個聽眾大綱內容最少應包含：

○ 中英文題目、期刊及日期○ 報告人姓名、學號及報告日期○ 中英文摘要○ 本篇文章的結論整理（中英文）

請給老師一份原始文獻的紙本

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2012 Seminar in Life Science演講技巧熟讀文章內容，把每個你不知道不瞭解的部分

查清楚弄懂（因為你永遠不知道聽眾會問哪些問題）

事先在家裡練習，把講不順的地方改進，必要時把通順的說法背起來（同時也可以順便調整演講的時間）

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2012 Seminar in Life Science演講技巧用心組織與微調投影片編排，好的投影片

可以幫助你順暢的表達

投影片是輔助你演講的工具，所以投影片上的內容應該是「提示」與「大綱」，而不是演講內容的全部

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2012 Seminar in Life Science演講技巧確實的介紹與文獻內容相關的背景資料，

有助於引導聽眾進入狀況

在敘述重要的發現與結論時使用中性的科學或描述，幽默雖然有助於維持聽眾的注意力，但是切記流於搞笑

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2012 Seminar in Life Science演講技巧掌握每一個從你口中說出的字詞，避免造

成混淆誤會

充分瞭解文獻的內容可以幫你帶來自信

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2012 Seminar in Life Science演講技巧當文獻篇幅不大時，可以多講一些背景資料，

篇幅太長時可以將背景與材料方法簡述（但不是砍掉不講）

不要拘泥於你選的文獻，好的演講往往會加入一些補充資料使得演講更順暢（請注意資料的可靠度）

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2012 Seminar in Life Science演講技巧適當的使用動畫可以幫助聽眾瞭解（但是

不要流於浮濫）

在講解圖表時可以加入色彩或是輔助符號（如箭頭）也可以幫助聽眾瞭解

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2012 Seminar in Life Science演講技巧將實驗內容整理成流程圖對聽眾的理解會很有幫助

在準備投影片時，可以站在客觀的立場想想看這篇文獻的邏輯和說服力

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2012 Seminar in Life Science回答問題技巧確實的瞭解聽眾的問題，必要時可以請發

問的人再解釋一下問題的重點

虛心接受聽眾的意見，理性的討論聽眾的問題

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2012 Seminar in Life Science回答問題技巧使用中性客觀的方式回答問題，最好能展

現自信

遇到不清楚的部分請直接回答「不清楚，會再去找答案，並且在書面回覆中答覆」

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2012 Seminar in Life Science回答問題技巧回答問題先想清楚再說出口

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2012 Seminar in Life Science絕對不能犯的錯誤把文章內容剪下貼上，然後邊看投影片邊翻譯或解釋（請整理成大綱並且把內容背起來）

用含糊的說法把不懂的部分混過去（是的，老師沒有這麼好混過去）

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2012 Seminar in Life Science絕對不能犯的錯誤回答問題時不懂卻硬拗，甚至與發問的人爭吵

自己也不知道這篇文獻在講啥，不知道這篇研究的動機目的

使用翻譯軟體

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2012 Seminar in Life Science絕對不能犯的錯誤投影片內容或是回答問題時只顧著搞笑

演講時間嚴重失控

講到一半卡在台上，不知道要怎麼接下去（所以複雜的演講內容要背起來）

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2012 Seminar in Life Science絕對不能犯的錯誤把文章內容，尤其是討論的部分偷工減料自行刪減

把作者的意見斷章取義

投影片順序亂七八糟，演講時投影片跳來跳去

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2012 Seminar in Life Science絕對不能犯的錯誤一邊講一邊翻 paper （或者是你自己整

理的重點）

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2012 Seminar in Life Science常犯的小錯誤錯字會造成不必要的誤解，而且會降低聽

眾對演講者的印象慣性的口語文字，例如「然後」結巴以及口腦不協調（練習和背記演講內

容）

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2012 Seminar in Life Science常犯的小錯誤聲音太小聲一邊講一邊笑錯誤的發音答非所問

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2012 Seminar in Life Science重講重講只有一次機會請針對第一次報告的缺陷進行改善沒有重講或是重講不及格者當掉

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投影片範例2011 Seminar in Life Science

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Cloning, purification and characterization of a thermostable

carboxylesterasefrom Anoxybacillus sp. PDF1

Protein Expression and Purification, 2011, In Press

Fulya Ay, Hakan Karaoglu, Kadriye Inan, Sabriye Canakci and Ali Osman Belduz

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2012 Seminar in Life Science

Anoxybacillus sp.

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Anoxybacillus sp. PDF1 Seferihisar Karakoc Hotspring in Turkey

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Lipases Lipases (triacylglycerol acylhydrolases; EC 3.1.1.3)

(Protein Data Bank)

(http://www.biochem.arizona.edu/classes/bioc462/462a/NOTES/ENZYMES/enzyme_mechanism.html)

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Lipases Esterases (carboxylic–ester hydrolases; EC 3.1.1.1)

(http://www.bio.anl.gov/molecular_and_systems_biology/Enzymatic_Screening/enzyme4.html)

(http://www.hull.ac.uk/php/chsanb/Pestweb/pest2.html)

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Lipases

Consensus a.a. sequence: Gly-X-Ser-X-Gly

Ser-Asp-His : “catalytic triad”

Hydrolysis and synthesis of esters

Hydrolysis and transesterification of triacylglycerols

Resolution of racemic mixtures

(http://www.biochem.arizona.edu/classes/bioc462/462a/NOTES/ENZYMES/enzyme_mechanism.html)

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Carboxylesterase Food industry, biological detergent, medical

applications and enzymatic production of

lipophillic chemicals

Extreme stability at elevated temperatures and

in organic solvents

High regio- and stereo-specificity, no cofactor

required, stable even active in organic solvents

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Aim Cloning and characterization of a

thermostable carboxylesterase from Anoxybacillus sp. PDF1

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FrameworkIsolation and idetification of

Anoxybacillus sp. PDF1

Carboxylesterase cloning

Overexpression of PDF1Est in E. coli

Purification of PDF1Est by heat-shock and ion-exchange

Temperature pH Metal ion and other reagents

Kinetic parameters

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Cloning PDF1Est was directly cloned by PCR according the

sequence of A. flavithermus lipase

PCR primers:EstF1:5’-CCCATGGTGTAAGATGATTCC-3’

EstR1:5’-CGGAATTCCTATCTACCAATCTAATGATTC-3’

NcoI

EcoRI

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Cloning pGEM-T vector system

AA

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Cloning pGEM-T vector system

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Cloning PDF1Est was directly cloned by PCR according

the sequence of A. flavithermus lipase

PCR primers:EstF1:5’-CCCATGGTGTAAGATGATTCC-3’

EstR1:5’-CGGAATTCCTATCTACCAATCTAATGATTC-3’

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Cloning PDF1Est was a 714 bp ORF encoding a

hypothetical 246 a.a. protein (26 kDa)

PDF1Est was identified as carboxylesterase by

Blast search

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Expression pET28a(+)

T7 promoterE. coli BL21(DE3):pLysS pLysS

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Expression of PDF1Est2 L LB with 50 mg/mL

kanamycin

1 mM IPTG induction at OD600 = 0.6

11,000 rpm for 5 min. after 4 h, 37 induction℃

Sonication in 50 mM Tris-HCl (pH 8.0) buffer80 % power, 0.6 cycles/5 min.

14,800 rpm for 15 min. to collect cell-free supernatant

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Purification of PDF1Est55 oC, 15 min, 14,800 rpm 15min,

discard precipitate

Q-Sepharose Fast Flow (50 ×1.5 cm)Gradient elution 0-0.6 M NaCl with

1 mL/min flow rate

Dialysis overnight against 20 mM Tris-HCl (pH 8.0)

14,800 rpm for 15 min. to collect cell-free supernatant

Protein conc. (Bradford) and enzyme activity assay

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Purification of PDF1EstCrude

Heat-treated

Ion-exchange purified

PDF1Est, ~26 kDa

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Substrate specificity

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Enzyme activity test

p-NPB(10 mM in MeCN): EtOH:50 mM Tris-HCl (pH 8.0) = 1:4:95

0.3 mL enzyme solution + 0.9 mL substrate solution incubated for 20 min.

OD405 (yellow)

p-nitrophneyl butyrate

Unit definition:1 U of enzyme = amount of enzyme

liberating 1 mmol of p-NP/min at 60oC

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Effect of Temperature 40-90oC preincubation for 30 min.

Residual activity at 60oC

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Effect of pH Preincubation for 30 min. at pH 5-10

Residual activity at pH 8

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Effect of metal ion

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Effect of reagents

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Kinetic parameters

Km = 0.348 mMVmax = 3725.8 U/mgKcat = 1500 ±54.50/s

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Discussion The identity of PDF1Est to lipases/esterases:

91% to A. flavithermus WK180% to Geobacillus stearothermophilus Est3079% to G. kaustophilus HTA42679% to G. thermolevorans EstA79% to G. thermodenitrificans NG80 Est30

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Discussion The classification of PDF1Est (Arpigny and

Jaeger, 1999):

Some similarity to the family VI:23-26 kDaActive to short-chain triacylglyceridesCatalytic triad: Ser93, Asp192 and His 222

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Phylogenic analysis MEGA 4.1 software (neighbor joining method)

IV

VI

new

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Discussion Belongs to new carboxylesterase family

Heat-treatment and Q-Sepharose

purification yield high activity and pure

carbpxyesterase

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Discussion Short chain fatty acid substrate is preferred

(to long chain)

Good thermo-stability among

carboxylesterases

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Discussion PDF1Est follow simple Michelis-Menten

kinetics

Km value is in the range of industrial

esterase (0.1-0.00001 M)

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Discussion Inhibit by Co2+ and Zn2+

Ca2+ independent

Not a metalloprotein (not inhibited by EDTA)

Serine esterase (inhibited by PMSF)

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Conclusion The stability of the enzyme in broad pH

and high temperature suggests its usefulness in industrial applications

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E. Coli BL21 series

101-1 書報討論

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