LASSBio-1632: Novo protótipo inibidor de PDE4 Compostos PDE4A PDE4B PDE4C PDE4D LASSBio-1632 90,4±0,2 22,7±2,4 5,9±2,3 8,8±0,6 LASSBio-448 11,8±1,13 0,9±0,9 21,3±1,3 33,1±1,1 Rolipram 91,0±0,4 52,6±1,2 9,3±1,3 72,9±1,2 Cilomilaste 105,4±5,6 101,1±2,9 116,3±0,0 121±4,1 1 3 5 7 -50 0 50 100 150 Rolipram LASSBio-1632 LASSBio-448 PDE4A1A Cilomilast Compostos (log[nM]) % Atividade de PDE4A1A Figura 2. Curvas concentração resposta de LASSBio-1632, LASSBio-448 e dos padrões rolipram e cilomilaste frente a PDE4A. Figura 3. Estabilidade química de LASSBio-448 e LASSBio-1632. A) em pH 2; B) em pH 7.4. Tabela 2 – Solubilidade aquosa determinada de LASSBio-1632, LASSBio-448 e dos padrões rolipram e cilomilaste. 0 30 60 90 120 150 180 210 240 0 20 40 60 80 100 120 LASSBio-448 LASSBio1632 Tempo (min) % de Recuperação em pH 2 0 30 60 90 120 150 180 210 240 0 20 40 60 80 100 LASSBio-448 LASSBio-1632 Tempo (min) % de Recuperação em pH 7.4 CI 50 PDE4A Rolipram = 357,6 nM CI 50 PDE4A Cilomilaste = 2,7 μM CI 50 PDE4A LASSBio-1632 = 477,2 nM A série de derivados sulfonilidrazônicos funcionalizados foi planejada a partir da aplicação da estratégia de restrição conformacional seguida de bioisosterismo não clássico e simplificação molecular sobre a estrutura do protótipo antiasmático LASSBio-448 (Figura 1). Os 10 derivados foram sintetizados em rota linear com bons rendimentos globais (> 50%). LASSBio-448 O CH 3 O H N S CH 3 O O O O CH 3 Restrição Conformacional Simplificação Molecular Homologação O CH 3 O N N S CH 3 O O W 3 W 2 W 1 R LASSBio-1632 e análogos Figura 1. Gênese dos novos candidatos a protótipos de fármacos inibidores seletivos de PDE-4. Os 10 derivados foram ensaiados quanto a sua capacidade de inibir as quatro isoformas da enzima PDE4 (A, B, C e B) mostrando percentual de inibição variando de 31,5-90,4% a 10μM. LASSBio-1632 apresentou um percentual de inibição comparável aqueles encontrados para os padrões rolipram e o fármaco cilomilaste (Tabela 1), destacando-se como o derivado mais promissor de LASSBio-448 apresentando potência inibitória de 477,2 nM frente à enzima PDE4A (Figura 2). Tabela 1 – Percentual de inibição de LASSBio-1632 (10 μM) e LASSBio-448 (10 μM) sobre as isoformas de PDE4 (A, B, C e D). Composto t 1/2 (min) t 1/2 (h) LASSBio-448 2310 38,5 LASSBio-1632 419,0 7,0 Tabela 3 – Meia vida (t ½) plasmática de LASSBio-448 e LASSBio-1632. Os estudos de estabilidade plasmática foram realizados utilizando-se plasma de ratos Wistar. O cálculo do tempo de meia vida foi realizado utilizando-se a expressão: t 1/2 = 0,693/a, sendo a inclinação da reta do logaritmo neperiano da [amostra] vs. o tempo de incubação. * A solubilidade experimental foi determinada por ultravioleta-UV. Amostras em tampão aquoso pH 7.4 a 37 ºC por 4h. 0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 min -5 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 mAU 306nm4nm (1.00) 1/2.403 2/5.685 LASSBio-1632 0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 min -2.5 0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 17.5 20.0 22.5 25.0 mAU 306nm,4nm (1.00) 1/2.405 2/3.137 3/3.449 4/4.520 5/5.689 0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 min 0 10 20 30 40 50 60 mAU 306nm4nm (1.00) 1/2.414 2/5.695 A B C M2 M1 1632 1632 0 min 120 min 120 min (s/ cofatores) Tabela 4 – Meia vida (t ½)* microssomal de LASSBio-448 e LASSBio-1632. Figura 4. Metabolismo microssomal hepático de ratos Wistar machos. A) tempo 0min na presença de cofatores; B) tempo 120min na presença de cofatores; C) tempo 120min. Na ausência de cofatores. Aparelho: Shimadzu – LC20AD; Coluna: Kromasil 100-5 C18 250-4,6 mm; Fase móvel: 70% ACN, 30% água, 0,1% TFA; Fluxo: 1mL/min; Detector:SPD-M20A (Diode Array); Comprimento de onda: 306 nm . * O cálculo do tempo de meia vida foi realizado utilizando-se a expressão: t 1/2 = 0,693/a, sendo a inclinação da reta do logaritmo neperiano da [amostra] vs. o tempo de incubação. 0 3 9 27 0 2 4 6 8 Metacolina [mg/mL] + + + + ** * * * * * * * Resistência (cmH 2 O.s)/mL 0 3 9 27 0 50 100 150 200 250 Metacolina [mg/mL] + + + + * * * * * * * * * * * * * * * Elastância (cmH 2 O/mL) Salina LPS (25 μg/25 μL) + LASSBio-1632 (25 mol/kg) + LASSBio-1632 (50 mol/kg) + LASSBio-1632 (100 mol/kg) + Rolipram (100 mol/kg) Figura 5. Efeito de LASSBio-1632 sobre a função pulmonar de camundongos desafiados com LPS. (A) resistência das vias aéreas e (B) elastância pulmonar. Os animais foram tratados 1h antes da instilação com o LASSBio-1632 por via oral. Os resultados representam média erro padrão da média (n= 7). +P<0,05 comparado ao grupo salina. *P<0,05 comparado ao grupo LPS. Descoberta de um novo protótipo inibidor de PDE4A, de estrutura química original, ativo por via oral; O novo protótipo possui estabilidade química em pH 2 e pH 7.4 e estabilidade em plasma de ratos. 1 Soderling, S. H. & Beavo, J. A. Curr. Opin. Cell Biol. 2000, 12: 174-179. 2 Sutherland, E. W. & Rall, T. W. J. Biol. Chem. 1958, 232: 1077-1091. 3 Francis, S. H. et al. Phys. Rev. 2011, 91: 651-690. 4 Undewood, D. C. et al. Pharmacol. Esp. Ther. 1998, 284-420. 5 Madan, A. et al. Xenobiótica. 2007, 37, 736. A B Compostos Solubilidade* (g/L) Experimental LASSBio-1632 0,2.10 -3 LASSBio-448 9,5.10 -3 Rolipram 4,4.10 -3 Cilomilaste 5,8.10 -3 LASSBio-448 LASSBio-1632 t 1/2 Microssomal 15,9 min 24 min Metabol. CYP450 sim sim A B