1 TEJIDO TEJIDO VECTORES VECTORES mRNA DNA mRNA DNA cDNA DNA digerido cDNA DNA digerido (doble cadena metilado) (doble cadena metilado) DNA CLONABLE LIGACI DNA CLONABLE LIGACI DNA-VECTOR DNA-VECTOR DNA RECOMBINANTE DNA RECOMBINANTE INTRODUCCION EN CELULA HUESPED INTRODUCCION EN CELULA HUESPED LIBRARY LIBRARY cDNA o genómica cDNA o genómica Bibliotecas Bibliotecas Bibliotecas cDNA BM 2009
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1 TEJIDOVECTORES TEJIDO VECTORES mRNA DNA cDNA DNA digerido cDNA DNA digerido (doble cadena metilado) DNA CLONABLE LIGACION DNA-VECTOR DNA CLONABLE LIGACION.
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TEJIDOTEJIDO VECTORESVECTORES
mRNA DNAmRNA DNA
cDNA DNA digeridocDNA DNA digerido(doble cadena metilado)(doble cadena metilado)
DNA CLONABLE LIGACION DNA-VECTOR DNA CLONABLE LIGACION DNA-VECTOR
DNA RECOMBINANTEDNA RECOMBINANTE
INTRODUCCION EN CELULA HUESPEDINTRODUCCION EN CELULA HUESPED
LIBRARYLIBRARY cDNA o genómicacDNA o genómica
Bibliotecas Bibliotecas
Bibliotecas cDNA BM 2009
2
Vectores usadosVectores usados:gt10gt11ZAPTriplEx
Bibliotecas cDNA BM 2009
Paso 1Paso 1
Paso 2Paso 2
Paso 4Paso 4
Paso 5Paso 5
Paso 6Paso 6
Paso 8Paso 8Paso 7Paso 7
Paso 3Paso 3
Paso 9Paso 9
Estrategia general construcción biblioteca de expresiónEstrategia general construcción biblioteca de expresión
Paso 10Paso 10
(if necessary)
3Bibliotecas cDNA BM 2009
Pasos 1 y 2: Fuente y purificación del mRNA Pasos 1 y 2: Fuente y purificación del mRNA
Preparación de poliA+ mRNA
T T T(30)
•Fuente de mRNA:
Alta relación secuencia interés/ mRNA total.
Baja tasa de degradación.
•Métodos de enriquecimiento:
Uso de drogas para selección de líneas celulareso estímulos específicos.
Fraccionamiento del mRNA o cDNA.
Clonado sustractivo. 3´A A A
5´
4Bibliotecas cDNA BM 2009
Paso 3: Síntesis de la primera cadena de cDNA Paso 3: Síntesis de la primera cadena de cDNA
Transcriptasas reversas (RT): DNA pol RNA dependiente ALV (Avian leukemia virus) y MoMLV (Moloney strain of murine leukemia virus)
AAAAAA(A)nA
AAAAAA(A)nA
5´cap
mRNA
Transcriptasa reversa
dATP
dTTP
dGTP
dCTP
AAAAAA(A)nA 3´
AAAAAA(A)nA
cDNA:mRNA
TTTTTT(n)T
Oligo dT
5´cap
mRNA
Transcriptasa reversa
dATP
dTTP
dGTP
dCTP
AAA(A)nA 3´
AAA(A)nA
AAA(A)nA
AAA(A)nA
cDNA:mRNA
Random primers
Random primers
5Bibliotecas cDNA BM 2009
Paso 4: Síntesis de la segunda cadena de cDNA Paso 4: Síntesis de la segunda cadena de cDNA
RNAasa H: nicks mRNA en mRNA:DNA
DNA pol
dNTPs
cDNA doble cadena
AAAAAA(A)nA AAAAAA(A)nA
RT con oligo dT
AAAAAA(A)nATTTTTTTTTT
TTTTTTTTTT
Degradación RNA
TTTTTTTTTT
Transferasa terminal dCTP
CCCCC
Fragmento KlenowdNTP´s + oligo G
TTTTTTTTTTCCCCCGGGGG
cDNA doble cadena
AAAAAAAAA
Transferasa terminalPor reemplazo
6Bibliotecas cDNA BM 2009
Paso 3,4 y 6: Síntesis de cDNA clonado. Uso de adaptadores. Paso 3,4 y 6: Síntesis de cDNA clonado. Uso de adaptadores.
7Bibliotecas cDNA BM 2009
Paso 3,4 y 6: Síntesis de cDNA clonado direccionado. Oligo dT-primer adaptador. Paso 3,4 y 6: Síntesis de cDNA clonado direccionado. Oligo dT-primer adaptador.
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Paso 3,4,5 y 6: Síntesis de cDNA clonado direccionado. Metilación. Uso de adaptadores. Paso 3,4,5 y 6: Síntesis de cDNA clonado direccionado. Metilación. Uso de adaptadores.
Bibliotecas cDNA BM 2009Fosforilación de los fragmentos antes de ligar al vector
9Bibliotecas cDNA BM 2009
Paso 3 y 4: Síntesis de la primera y segunda cadena de cDNA Paso 3 y 4: Síntesis de la primera y segunda cadena de cDNA
Esquema para la construcción de una biblioteca full-length
Vectores: dejaron el 60 % del genoma salvaje (crecimiento lítico)Tamaños que se empaquetan eficientemente: 105-78 % del genoma (10-20 kpb)
Elección del vector:• ER empleada.•Tamaño del fragmento a ser insertado.•Expresión del cDNA en bacterias.•cDNA debe ser “rescatado” del vector en forma de plásmido.
14Bibliotecas cDNA BM 2009
Pasos 7 y 8: Esquema preparación biblioteca en vectores derivados de fago Pasos 7 y 8: Esquema preparación biblioteca en vectores derivados de fago
Vector desfosforiladoRelación molar alta [Vector / inserto]Extremos no compatibles
Ligación
Selección-Screening
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CI
Bibliotecas cDNA BM 2009
gt10: 5-11 kbgt10: 5-11 kb
Cepas E. coli hfl – (mutantes proteasa Hfl) NO degrada CII S! CI lisogenia
Fagos CI forman placas de lisis en cepas hfl-
Marcador de selección de fagos recombinantes: CI
CI
Lisogenia Lisis
gen CI
cDNA- EcoRIgt10-EcoRI
Ligación
Empaquetamiento in vitro
Infección E. coli hfl-
Plaqueo en top agar Formación placas de lisis
Screening hibridización sondas
Esquema:
(amplificación)
16Bibliotecas cDNA BM 2009
Screening biblioteca: Hibridización con sondas
Plaqueo en top agar y formación placas de lisis
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gt11: 7 kbgt11: 7 kb
Screening biblioteca de expresión: Inmunodetección
Bibliotecas cDNA BM 2009
plac lacZ
EcoRI
Inserción cDNA en EcoRI
Proteína de fusiónCI 857: mutante inactivo del represor a 45ºCS 100: mutación ambar en el gen S lisis
Infección cepa E. coli SupF Incubación 10-15´ a 45ºC
Inducción ciclo lítico
cDNA- EcoRIgt11-EcoRI
Ligación
Empaquetamiento in vitro
Infección E. coli
Plaqueo en top agar. Incubación a 42ºC Formación placas de lisis