1 LA FABRICATION INDUSTRIELLE DES LA FABRICATION INDUSTRIELLE DES VACCINS VACCINS ET LEUR CONTRÔLE ET LEUR CONTRÔLE Jean Fran Jean Fran ç ç ois SALUZZO ois SALUZZO Consultant WHO Consultant WHO
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LA FABRICATION INDUSTRIELLE LA FABRICATION INDUSTRIELLE DES VACCINS DES VACCINS ET LEUR CONTRÔLEET LEUR CONTRÔLE
Jean FranJean Franççois SALUZZOois SALUZZOConsultant WHOConsultant WHO
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1.1. LA FABRICATION DES VACCINS LA FABRICATION DES VACCINS
- La production de principe actif- La production de principe actif
- La mise sous forme pharmaceutique - La mise sous forme pharmaceutique
2.2. LA QUALITE DES VACCINS LA QUALITE DES VACCINS
3. LES SPECIFICITES DE LA PRODUCTION DE 3. LES SPECIFICITES DE LA PRODUCTION DE VACCINSVACCINS
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Les Vaccins simples à usage Les Vaccins simples à usage humainhumain
Vaccins
bactériens
Vaccinsviraux
BCG
RougeoleRubéoleOreillonsVaricelleFièvre Jaune
Polio oraleRotavirus
VACCINS VIVANTS
Méningite Typhoïde Pneumocoque Haemophilus*
Coqueluche
Rage Polio inject. Hépatite A Encéphalitejaponaise
Grippe
Papillomavirus
Hépatite B
CoquelucheacellulaireDiphtérie Tétanos
VACCINS INERTES
Typhoïde
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Fabrication d’un vaccinFabrication d’un vaccin
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LES ACTEURSLES ACTEURS
Les bactériesLes bactéries
LLes viruses virus
Les cellules eucaryotesLes cellules eucaryotes ::
- pour productions virales
- pour production par génie génétique Hépatite B : levures ou cellules de Hamster chinois
POUR PRODUIRE DES VACCINS DE QUALITE, IL FAUT DISPOSER DE GERMES BIEN CARACTERISES ET DE PROPRIETES CONSTANTES
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LE SYSTEME DES SEMENCES LE SYSTEME DES SEMENCES PREVIENT LA DERIVE GENETIQUE PREVIENT LA DERIVE GENETIQUE
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LA CULTURE DES BACTERIESLA CULTURE DES BACTERIES
SEMENCE : congelée ou lyophilisée
INOCULUM : repiquage sur milieux nutritifs (liquides ou gélosés)
PRECULTURE : petit fermenteur (quelques dizaines de litres)
- phase de croissance
CULTURE : fermenteurs de plusieurs centaines ou milliers de litres
- phase de croissance
- phase d'expression des antigènes
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LA CULTURE DES BACTERIES LA CULTURE DES BACTERIES
• Milieux complexes (bactéries fastidieuses)
• Matières premières contrôlées (analyses, origine)
• Stérilité, asepsie
• Maîtrise des paramètres de culture
- temps - pureté pH
- température - numération
- pression - aspect des germes
- mousse - métabolites
- agitation - aération
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LA CROISSANCE EXPONENTIELLELA CROISSANCE EXPONENTIELLE
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Dans la culture des bactéries,Dans la culture des bactéries,on recherche : on recherche :
- de grands volumes
- une très forte aération
- une très forte agitation
- des milieux concentrés pour augmenter les
concentrations bactériennes
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Les virus sont des êtres rudimentaires, parasites obligatoires des cellules. Leur culture implique nécessairement la culture préalable de cellules animales
Cellules animales
Culture cellulaire
Infection
Culture virale
Virus
LA CULTURE DES VIRUS LA CULTURE DES VIRUS
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Les cultures de cellules Les cultures de cellules animalesanimales
1) Cultures sur organes
Ensemencement d ’œufs embryonnés de poule
- cavité amniotique : Vaccin oreillons
- cavité allantoïdienne : Vaccin grippe
2) Organes animaux mis en culture (cellules primaires)
- dilacération, trypsination des tissus animaux
(reins de singes, embryons de poulets)
ex. Vaccin rougeole
3) Cellules diploïdes à durée de vie limitée (origine embryonnaire)
Cellules MRC5 (vaccin rage)
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Les cultures de cellules Les cultures de cellules animalesanimales
4) Lignées de cellules animales (cellules hétéroploïdes)
- cellules immortalisées (vero, MDCK, PERC6)
- multiplication sur des surfaces adhérentes
- ou multiplication sur billes ou en suspension (avenir)
Les lignées de cellules non-tumorigènes ne croissent que sur un support solide, et s'arrêtent de croître au contact les unes des autres
ex. : vaccins polio injectable et oral ; vaccin hépatite B ; vaccin rage ; vaccin rubéole ….
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Dans la culture des cellules Dans la culture des cellules animales, on recherche :animales, on recherche :
- de grandes surfaces
- une faible aération, généralement accompagnée
de CO2
- une agitation faible ou nulle
- des milieux iso-osmotiques, c'est-à-dire dont l'osmolalité est
proche de celle du sang
(# 285 mmol/kg)
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Récipients de culture virale :Récipients de culture virale :
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La récolte des culturesLa récolte des cultures
- Soit: Elimination du milieu par centrifugation aseptique (coqueluche cellulaire, levures pour vaccin Hépatite B)
- Soit: Récolte du milieu et sauvegarde ou élimination des cellules par centrifugation ou filtration aseptique (antigènes solubles ou virus excrétés) : vaccin viraux
Note : dans ce dernier cas, on peut parfois effectuer plusieurs récoltes et renouvellements du milieu, si les virus ne sont pas lytiques
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La concentration des antigènesLa concentration des antigènes
- par précipitation à l'aide de sels (sulfate d'ammonium) ou de solvants (éthanol, polyéthylène glycol) - [ex. anatoxines, polyosides]
- par ultrafiltration sur membranes filtrantes minérales ou organiques, à pouvoir de coupure calibré (pouvoir de retenir les grosses molécules) - 10 000, 50 000, 100 000, 300 000 daltons ex. : vaccin polio; rage.
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La purificationLa purification
- BUT : Séparer les antigènes recherchés de l'extrait brut concentré obtenu après récolte.
- MOYENS : Procédé effectué par étapes successives, qui s'adressent à des propriétés spéciales de l'antigène, pour le sélectionner parmi la masse des autres composants.
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La précipitation fractLa précipitation fractionnéeionnée
Exemple : - sels de calcium, d'ammonium
- solvants : éthanol, méthanol
polyéthylène glycol
Ici, on insolubilise tour à tour les différentes molécules présentes dans le mélange.
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La chromatographieLa chromatographie
Technique Caractère discriminant
- échanges d'ions (propriétés électriques des molécules)
- hydrophobe (hydrophilie des molécules)
- gel d'exclusion (taille des molécules)
- affinité (attirance des molécules par un motif : ligand)
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La purification - 3La purification - 3
L'ULTRACENTRIFUGATIONL'ULTRACENTRIFUGATION
Centrifugeuses soumises à des accélérations de plusieurs dizaines de milliers de fois la pesanteur terrestre ; on peut trier les molécules, en les sédimentant :
- par taille (ultracentrifugation de vélocité)
- par densité (ultracentrifugation isopycnique dans un milieu de densité croissante)
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L'inactivationL'inactivation
Certains antigènes sont inoffensifs
- polyosides bactériens
- germes atténués (virus rougeoleux, BCG)
D'autres sont pathogènes
- toxines (diphtérique, tétanique)
- germes virulents (B. pertussis, virus rabique)
Pour ces derniers, une fois purifiés, il faut inactiver leur pouvoir pathogène, c'est l'inactivation.
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L'inactivation L'inactivation (suite)(suite)
Par la chaleur (B. pertussis)
Par des agents chimiques (formol, Beta-propiolactone, …)
L'inactivation doit être totale, et respecter les structures immunogéniques de l'antigène.
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SRAS-CoV - INACTIVATION BPL 1/4000SRAS-CoV - INACTIVATION BPL 1/4000SARSSARS--CCooVV VaccineVaccine Inactivation BPL 1/4000Inactivation BPL 1/4000SARSSARS--COV VACCINE COV VACCINE
INACTIVATIONINACTIVATION
TimeInfectious titer
(Log TCID50/ml)T0 7,355' 6,631h 5,522h 4,344h
8h
24h BP
L In
activ
atio
n 1/
4000
No detectable virus after 8h
After 24 hrs viral amplification: no detectable virus
HPA/P23 (18L scale) Inactivation kinetic BPL 1/4000
0
1
2
3
4
5
6
7
8
0 5 10 15 20 25 30
Time (hour)
infe
ctio
us tite
r (L
og T
CID
50/m
l)Detection limit
Plus de virus détectable après 8 h
Au bout de 24 h, test d’amplification : pas de virus résiduel
TempsTitre
Log TCID50/ml
Tit
re i
nfe
ctie
uxL
og
TC
ID50
/ml
Cinétique d’inactivation
Heure
Limite de détection
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Les contrôles de qualité des principes actifsLes contrôles de qualité des principes actifsÉtapes Contrôles Qualité
matières premières
semences
cultures
récoltes
purifications
inactivations
ANALYSESANALYSES
ANALYSESANALYSES
ANALYSESANALYSES
ANALYSESANALYSES
ANALYSESANALYSES
ANALYSESANALYSES
Les temps de contrôle représentent souvent plus des trois quarts du temps de cycle de la fabrication
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Le Service des mélangesLe Service des mélanges
- Réceptionne les différentes valences antigéniques
- Fabrique les valences vaccinales
- A l'aide de diluants, de stabilisants et d'adjuvants, formule le vaccin final vrac en un lot homogène qui est soumis aux contrôles d'activité.
L'ORDRE DES MELANGES, L'ASEPSIE, LA PRECISION DES MESURES, SONT PRIMORDIAUX POUR OBTENIR UN VACCIN DE QUALITE
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Le Service de répartitionLe Service de répartition
- Lave et stérilise les contenants
- Prépare l'équipement de remplissage
- Connecte le produit vrac désiré
- Remplit le produit dans les récipients finaux : seringues, ampoules, flacons.
L'ASEPSIE DE TOUTES LES OPERATIONS, LA GESTION DES OBJETS DE REPARTITION, LA CHAINE DE FROID, SONT DES FACTEURS CRITIQUES DE LA REPARTITION.
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La lyophilisationLa lyophilisation
Certains antigènes, tels les vaccins vivants, sont trop fragiles pour être gardés en dilution liquide, même au froid. On a alors recours à la congélation (B.C.G., vaccin polio oral) ou, plus souvent, à la lyophilisation.
La lyophilisation est la dessiccation d'une solution, congelée par évaporation de l'eau directement de l'état solide (glace), à l'état vapeur, sans passer par la phase liquide. Menée au froid et sous vide poussé, elle respecte les structures des molécules et des germes.
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Le Service de conditionnementLe Service de conditionnement
- Définit l'emballage secondaire du produit
- Approvisionne les blisters, les étiquettes, les notices, les étuis carton
- Prépare les machines (étiqueteuses, emballeuses)
LES VIDES DE CHAINE, LA RIGUEUR DE LA COMPTABILITE DE TOUS LES OBJETS DE CONDITIONNEMENT, LA VERIFICATION DES TEXTES IMPRIMES SONT PRIMORDIAUX POUR ASSURER UNE FIABILITE DU TRAVAIL, PARMI UNE MULTIPLICITE DE PRODUITS FINAUX.
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Caractéristiques propres aux Caractéristiques propres aux fabrications de vaccinsfabrications de vaccins
- Longueur des cycles de production
- Nombreux contrôles
- Origine des matières premières (traçabilité)
- Combinaisons vaccinales multiples
- Médicaments préventifs
Conséquences:
-Absence de génériques (établir une équivalence
biologique ou clinique)
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Caractéristiques propres aux Caractéristiques propres aux vaccinsvaccins(suite)
- Souches pathogènes
- A-coups de production : (campagnes de vaccinations, épidémies)
- Fragilité des principes actifs complexes
- Asepsie
- Chaîne de froid
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La chaîne de froidLa chaîne de froid
Les antigènes sont tous des molécules complexes,
fragiles.
La lyophilisation, les stabilisants, le froid visent à
garantir la stabilité, donc la qualité des vaccins.
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La chaîne de froid s'applique La chaîne de froid s'applique partoutpartout
- Chez le fabricant
- Dans les expéditions
- Dans les entrepôts (grossistes, pharmaciens, médecin)
- Avant la vaccination (particuliers, dispensaires)
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Lancement d'un nouveau vaccin Lancement d'un nouveau vaccin
6 7 8 9 10 11 122 3 4 510Années
INDUSTRIALISATION
PREUVE DU CONCEPT
PREUVE DU PRODUIT
Recherche
Développement
CONSTRUCTION DES INSTALLATIONS
Lots d'uniformité
Etudes de stabilité
Etudes cliniques phase IIILicence (AMM)
Production
MarketingVentes en Europe
Licences à l'étranger
Ventes à l'étranger
(essais sur animaux)
(cliniques phase I et II)
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