1 1 GCB – Rodzinnie, Zakopane, 24-26.10.2007 Katedra Chemii Analitycznej Wydział Chemiczny Politechnika Gdańska ul. G. Narutowicza 11/12 80-952 GDAŃSK e-mail: [email protected]Dr inż. Piotr KONIECZKA JAK WYZNACZA SIĘ PARAMETRY WALIDACYJNE Granica wykrywalności i granica oznaczalności 2 GCB – Rodzinnie, Zakopane, 24-26.10.2007 Limit detekcji Limit wykrywalności Wykrywalność Granica detekcji GRANICA WYKRYWALNOŚCI Nazewnictwo
This document is posted to help you gain knowledge. Please leave a comment to let me know what you think about it! Share it to your friends and learn new things together.
Określenie minimalnej zawartości analitu, dla której wartości sygnału można przypisać obecność analitu – granica wykrywalności.
Określenie minimalnej zawartości analitu, dla której wartości sygnału można przypisać ilość analitu – granica oznaczalności.
LODsygnał/szum = 3
LOQsygnał/szum = 10
sygnał
szum
Definicje
3
5
GCB – Rodzinnie, Zakopane, 24-26.10.2007
Stosunek sygnału do szumu (ang. Signal to Noise Ratio –S/N): wielkość bezwymiarowa, która określa stosunek sygnałuanalitycznego do średniego poziomu szumów tła dla określonejpróbki.
• jego wartość może służyć do określania wpływu poziomu szumu na względny błąd pomiaru,
• najbardziej praktyczną metodą jego wyznaczenia jest stosunek średniej arytmetycznej serii pomiarów dla próbek ślepych (bądźzawierających analit na bardzo niskim poziomie) do wartości odchylenia standardowego uzyskanego dla tej serii pomiarów,
Definicje
6
GCB – Rodzinnie, Zakopane, 24-26.10.2007
Granica wykrywalności (ang. Limit of Detection - LOD)najmniejsza ilość lub najmniejsze stężenie substancji (pierwiastka, jonu, związku) możliwe do wykrycia za pomocądanej procedury czy też techniki analitycznej z określonym prawdopodobieństwem.
• związana ściśle z określoną procedurą analityczną (wartość zależy zarówno od poziomu zawartości oznaczanego składnika, jak i obecności innych składników występujących w analizowanej próbce),
• najmniejsze stężenie analitu, przy którym istnieje pewność jego obecności w próbce,
• jej wartość charakteryzuje się wymiarem zawartości czy stężenia (takim jak oznaczany analit czyli np. µg/dm3),
• ściśle związana z poziomem szumów stosowanego urządzenia pomiarowego (najczęściej to trzykrotność tego poziomu szumów),
Definicje
4
7
GCB – Rodzinnie, Zakopane, 24-26.10.2007
Granica oznaczalności (ang. Limit of Quantification - LOQ):najmniejsza ilość lub najmniejsze stężenie substancji, możliwe do ilościowego oznaczenia za pomocą danej proceduryanalitycznej z założoną dokładnością i precyzją.
• jej wartość jest zawsze wielokrotnością wyznaczonej wartości granicy wykrywalności – najczęściej: LOQ = 3 · LOD,
• chociaż znane są takie definicje granicy oznaczalności, w których jej wartość jest równa 2 · LOD czy też 6 · LOD,
Definicje
8
GCB – Rodzinnie, Zakopane, 24-26.10.2007
poza zakresem liniowym
wysoka pewność
niska niepewność
wysoka niepewność
szumy
MB
LOD
LOQ
-3
0
-2-1
123456789
101112
Zaw
artość
anal
itu
[wyr
ażon
a w
kro
tno ś
ci o
dch
ylen
ia s
tan
dard
oweg
o –
s]
Granica wykrywalności a niepewność
5
9
GCB – Rodzinnie, Zakopane, 24-26.10.2007
Sposób wyznaczania wartości granicy wykrywalności zależy od następujących czynników:
• natury procedury analitycznej – (procedura manualna bądź teżprocedura oparta na wykorzystaniu odpowiedniego przyrządu pomiarowego),
• charakterystyki procedury instrumentalnej,
• możliwości uzyskania (sporządzenia) tzw. ślepych próbek,
Metody wyznaczania wartości granicy wykrywalności
10
GCB – Rodzinnie, Zakopane, 24-26.10.2007
W przypadku metody klasycznej (nieinstrumentalnej), dla której nie jest możliwe wyznaczenie poziomu szumów stosowanego urządzenia pomiarowego, stosuje się metodę szacowania poziomu granicy wykrywalności w oparciu o własne doświadczenia.
W oparciu o wyniki analizy próbek o znanej zawartości analitu (roztwory wzorcowe) oszacowuje się ten poziom stężenia, przy którym możliwe jest jego wykrycie.
Sposób ten można także stosować w przypadku metod instrumentalnych.
Oszacowanie wzrokowe
6
11
GCB – Rodzinnie, Zakopane, 24-26.10.2007
Może być stosowana jedynie w przypadku, gdy istnieje możliwość uzyskania linii bazowej szumów – otrzymanej gdy oznaczeniu końcowemu jest poddawana tzw. ślepa próbka, bądź też próbka zerowa.
Sposób obliczania:
• wyznaczyć wartość stosunku sygnału do szumu dla próbki ślepej (jeśli to jest możliwe) lub dla próbki o bardzo niskiej zawartości analitu,
• zastosować wprost definicję granicy wykrywalności.
Obliczanie na podstawie wartości stosunku sygnał/szum (S/N)
12
GCB – Rodzinnie, Zakopane, 24-26.10.2007
W przypadku np. metod chromatograficznych można wartośćLOD wyznaczyć na podstawie uzyskanego chromatogramu dla próbki ślepej.
W tym celu określa się poziom szumów – mierząc na chromatogramie zakres zmiany sygnału w pobliżu czasu retencji dla analitu (można przyjąć np. wartość zakresu czasu retencji jako tRanalitu ± 0,5 minuty).
Następnie tę wielkość mnoży się przez 3 i przelicza uzyskanąwartość sygnału na wartość stężenia.
Obliczanie na podstawie wartości stosunku sygnał/szum (S/N)
7
13
GCB – Rodzinnie, Zakopane, 24-26.10.2007
Sposób postępowania:
• przeprowadzić 10 niezależnych pomiarów dla 10 niezależnie przygotowanych ślepych próbek,
• obliczyć dla tak uzyskanych 10-ciu wyników wartośćśrednią oraz wartość odchylenia standardowego,
• wyznaczyć wartość granicy wykrywalności w oparciu o zależność:
Metoda bardziej pracochłonna jednak i zarazem metrologicznie bardziej poprawna.
sxLOD śr ⋅+= 3
Obliczanie na podstawie wyników oznaczeń dla próbek ślepych
14
GCB – Rodzinnie, Zakopane, 24-26.10.2007
Uzyskanie wartości liczbowej dla wartości średniej w praktyce jest rzadko możliwe - paradoksalnym wydaje się uzyskanie wyniku dla wartości, która z definicji powinna być poniżej wartości granicy oznaczalności.
Zastosowanie powyższego sposobu jest możliwe jedynie w przypadku, gdy poziom stężenia analitu jest mierzalny dla próby ślepej (poziom zawartości analitu w ślepej próbce jest co najmniej równy wartości granicy oznaczalności).
Obliczanie na podstawie wyników oznaczeń dla próbek ślepych
8
15
GCB – Rodzinnie, Zakopane, 24-26.10.2007
• wykonać 10 niezależnych oznaczeń dla próbek, w których poziom zawartości analitu jest bliski spodziewanej granicy wykrywalności (oczywiście próbki takie sporządzane sąpoprzez dodanie do próbek ślepych mierzalnych ilości analitu),
• obliczyć dla tak uzyskanych 10-ciu wyników wartośćśrednią oraz wartość odchylenia standardowego,
• wyznaczyć wartość granicy wykrywalności w oparciu o zależność:
sLOD ⋅+= 30
Obliczanie na podstawie wyników oznaczeń dla próbek ślepych
W przeciwnym przypadku stosować można modyfikację opisanej metody:
16
GCB – Rodzinnie, Zakopane, 24-26.10.2007
Kolejną modyfikacją tej metody jest opisany poniżej sposób:• sporządzić serię n próbek o zawartości analitu na poziomie
zbliżonym do spodziewanej wartości granicy wykrywalności (najdogodniej wzorce, w których matryca odpowiada swoim składem matrycy próbek rzeczywistych),
• wykonać analizę tak przygotowanych próbek otrzymując serię n wyników,
• obliczyć dla nich wartość średnią i wartość odchyleniastandardowego,
• wartość granicy wykrywalności obliczyć wg zależności:
sftLOD ⋅= ),(αgdzie: t – parametr testu t-Studenta,
f – liczba stopni swobody f = n -1,n – liczba niezależnych próbek,α – przyjęty poziom istotności,
Obliczanie na podstawie wyników oznaczeń dla próbek ślepych
9
17
GCB – Rodzinnie, Zakopane, 24-26.10.2007
Jeżeli przygotowane roztwory wzorcowe poddawane są przed oznaczeniem końcowym całej procedurze analitycznej tak wyznaczona wartość granicy wykrywalności stanowi granicęwykrywalności procedury analitycznej – MDL (methoddetection limit).
Jeżeli natomiast oznaczenia wykonywane są bezpośrednio w przygotowanych roztworach wzorcowych to w ten sposób wyznaczana jest wartość granicy wykrywalności urządzenia pomiarowego – IDL (instrument detection limit).
Obliczanie na podstawie wyników oznaczeń dla próbek ślepych
18
GCB – Rodzinnie, Zakopane, 24-26.10.2007
Polega na wykonaniu oznaczeń dla 3 poziomów stężeń analitu (bliskim spodziewanej wartości granicy wykrywalności).
Dla każdego poziomu zawartości analitu należy wykonać po co najmniej 6 oznaczeń, a następnie dla każdej z tak uzyskanych serii pomiarów obliczyć wartości odchyleń standardowych.
Z kolei wyznacza się zależność liniową wiążącą obliczone wartości odchylenia standardowego z wartościami stężeń:
wyraz wolny tej zależności to wartość so a wyznaczona na tej podstawie wartość granicy wykrywalności obliczana jest zgodnie ze wzorem:
Najczęściej jednak, wykorzystywana procedura analityczna oparta jest, na etapie oznaczenia końcowego, o zasadę pomiaru pośredniego, czyli takiego dla którego wymagany jest dodatkowy etap procedury analitycznej – kalibracja.
W takim przypadku także i ten etap będzie miał wpływ na wartość granicy wykrywalności.
Obliczenie granicy wykrywalności oparte jest w tym przypadku o następującą zależność:
bsLOD ⋅
=3,3
gdzie: s – wartość odchylenia standardowego,b – współczynnik kierunkowy prostej kalibracyjnej,
Obliczanie na podstawie wartości odchylenia standardowego zbioru sygnałów i kąta nachylenia krzywej kalibracyjnej
13
25
GCB – Rodzinnie, Zakopane, 24-26.10.2007
Wartość odchylenia standardowego można w tym przypadku wyznaczyć w trojaki sposób:
1. odchylenie standardowe wyników uzyskanych dla serii próbek ślepych,
Obliczanie na podstawie wartości odchylenia standardowego zbioru sygnałów i kąta nachylenia krzywej kalibracyjnej
26
GCB – Rodzinnie, Zakopane, 24-26.10.2007
Ważnym jest fakt odpowiedniego doboru stężeń roztworów wzorcowych w celu wyznaczenia krzywej kalibracyjnej (wiadomo jest, że krzywa kalibracyjna ma zakres prostoliniowy w ściśle określonym przedziale stężeń i z całąpewnością jej przebieg ma inną charakterystykę dla poziomu zawartości w pobliżu granicy wykrywalności).
Obliczanie na podstawie wartości odchylenia standardowego zbioru sygnałów i kąta nachylenia krzywej kalibracyjnej
przypadku pomiarów instrumentalnych – istnieje możliwość wyznaczenia stosunku sygnał/szum,
próbka o znanej zawartości analitu (roztwór wzorcowy lub wzorzec matrycowy),
Obliczanie na podstawie stosunku sygnał/szum
• metoda szybka,• metoda szacunkowa,• stosowana przeważnie w
przypadku klasycznych (nieistrumentalnych) metod analitycznych,
• wymagane doświadczenie analityczne,
próbka o znanej zawartości analitu (roztwór wzorcowy lub wzorzec matrycowy),
Oszacowanie wzrokowe
Wady/zaletyWymaganiaMetoda obliczania wartości granicy wykrywalności
Metody obliczania granicy wykrywalności –wymagania, wady i zalety
38
GCB – Rodzinnie, Zakopane, 24-26.10.2007
• metoda dość szybka,• uwzględnia się wpływ etapu
kalibracji na wartość LOD,
seria próbek wzorcowych –3 poziomy stężeń,wykonanie po co najmniej 6 pomiarów dla każdej z próbek wzorcowych,
Obliczanie w oparciu o metodę graficzną
• metoda praco- i czasochłonna,• nie uwzględnia wpływu
kalibracji na wartość LOD,• wykorzystuje się parametr
prawdopodobieństwa w wyznaczeniu LOD,
seria próbek ślepych lub o znanej zawartości analitu (roztwór wzorcowy lub wzorzec matrycowy),
Obliczanie na podstawie wyników oznaczeń dla próbek ślepych
Wady/zaletyWymaganiaMetoda obliczania wartości granicy wykrywalności
Metody obliczania granicy wykrywalności –wymagania, wady i zalety
20
39
GCB – Rodzinnie, Zakopane, 24-26.10.2007
• metoda praco- i czasochłonna,
• uwzględnia się wpływ etapu kalibracji na wartość LOD,
• „umotywowana”metrologicznie,
seria próbek ślepych lub o znanej zawartości analitu (roztwór wzorcowy lub wzorzec matrycowy),roztwory wzorcowe do sporządzenia krzywej kalibracyjnej,
Obliczanie na podstawie wartości odchylenia standardowego sygnałów i kąta nachylenia krzywej kalibracyjnej
• metoda pośrednia – LODobliczone na podstawie wyznaczonej LOQ,
• wartość LOD (LOQ) powiązana z założonąprecyzją pomiarów,
seria roztworów wzorcowych,założona wartośćwspółczynnika zmienności dla granicy oznaczalności,
Obliczanie na podstawie wartości granicy oznaczalności
Wady/zaletyWymaganiaMetoda obliczania wartości granicy wykrywalności
Metody obliczania granicy wykrywalności –wymagania, wady i zalety
40
GCB – Rodzinnie, Zakopane, 24-26.10.2007
Do obliczania wartości granicy wykrywalności stosuje się roztwory wzorcowe. Powinny one charakteryzować się, w przypadku obliczania granicy wykrywalności dla procedury analitycznej (MDL), dwiema podstawowymi cechami:• jak najbardziej zbliżony skład matrycy do składu matrycy dla
próbek rzeczywistych,
• stężenie analitu na poziomie zbliżonym do spodziewanej wartości granicy wykrywalności,
Wartość odchylenia standardowego ściśle zależy od poziomu zawartości oznaczanego składnika.
Może się zdarzyć, iż stosowane stężenia dla próbek wzorcowych znacznie przewyższają obliczoną wartość granicy wykrywalności.
Sposoby sprawdzania poprawności wyznaczonej wartości granicy wykrywalności
21
41
GCB – Rodzinnie, Zakopane, 24-26.10.2007
W celu sprawdzenia poprawności wyliczonej wartości granicy wykrywalności należy sprawdzić następujące zależności:
10 · MDL > cmin
MDL < cmin
gdzie: cmin – stężenie analitu w próbkach roztworu wzorcowego o najniższym stężeniu,
Nie spełnienie pierwszej z zależności oznacza, iż stężenie w przygotowanych roztworach wzorcowych jest za wysokie i należy przeprowadzić obliczenia wartości granicy wykrywalności dla nowo przygotowanych roztworów wzorcowych o niższym stężeniu.
Odwrotnie, nie spełnienie drugiej zależności oznacza, że stężenie analitu w przygotowanych roztworach wzorcowych jest za niskie, należy przeprowadzić ponowne pomiary i obliczenia stosując roztwory wzorcowe o wyższej zawartości analitu.
Sposoby sprawdzania poprawności wyznaczonej wartości granicy wykrywalności
42
GCB – Rodzinnie, Zakopane, 24-26.10.2007
Sprawdzenie poprawności wartości stężenia w oparciu, o które wyznaczano wartość granicy wykrywalności można także przeprowadzić szacując wartość stosunku sygnału do szumu na podstawie zależności:
sx
NS śr=
Zgodnie z definicją granicy wykrywalności wartość tego stosunku powinna mieścić się w przedziale 3 do 10.
W przypadku gdy obliczona wartość jest wyższa, wartośćstężenia roztworu wzorcowego jest zbyt wysoka i należałoby przeprowadzić ponowne pomiary dla niższych stężeńzawartości analitu w próbkach roztworów wzorcowych.
Sposoby sprawdzania poprawności wyznaczonej wartości granicy wykrywalności
22
43
GCB – Rodzinnie, Zakopane, 24-26.10.2007
Należy również zwrócić uwagę, w trakcie pomiarów dla roztworów wzorcowych, na wartość tzw. odzysku metody analitycznej.
Obliczyć ją można na podstawie zależności:
% 100⋅=cxR śr
Zbyt niska wartość tego parametru wpływa na niedoszacowanie obliczonej wartości granicy wykrywalności.
R powinno zawierać się w przedziale 80-120%
Sposoby sprawdzania poprawności wyznaczonej wartości granicy wykrywalności
44
GCB – Rodzinnie, Zakopane, 24-26.10.2007
Opisane metody sprawdzania poprawności wyliczonej wartości granicy wykrywalności mogą być stosowane jedynie w przypadku, gdy pomiary są wykonywane z wykorzystaniem sporządzonych roztworów wzorcowych.
Sposoby sprawdzania poprawności wyznaczonej wartości granicy wykrywalności
23
45
GCB – Rodzinnie, Zakopane, 24-26.10.2007
Podstawowym kryterium sprawdzającym wartośćwyznaczonej granicy wykrywalności jest spełnienie wymogów stawianych danej procedurze analitycznej.
Sposoby sprawdzania poprawności wyznaczonej wartości granicy wykrywalności
46
GCB – Rodzinnie, Zakopane, 24-26.10.2007
Wartość stężeniax ≥ LOQWykryto, nie oznaczonoLOD ≤ x < LOQNie wykrytox < LOD
Zapisanie wynikuWartość wynikux
Poprawne podawanie wartości wyników pomiarów w pobliżu granicy wykrywalności i oznaczalności
24
47
GCB – Rodzinnie, Zakopane, 24-26.10.2007
Wybór odpowiedniej metody wyznaczania granicy wykrywalności zależy od celu jakiemu ma ona służyć jak i wymogów danej procedury analitycznej. W przypadku walidacji procedury analitycznej zalecanym jest wykorzystanie metody, która w swych założeniach opiera się o metrologię chemiczną – wartość wyznaczonej granicy wykrywalności jest związana z parametrami statystycznymi takimi jak poziom prawdopodobieństwa, liczba stopni swobody. W przypadku pomiarów jednostkowych, gdy wymagane jest jedynie oszacowanie wartości LOD wskazanym jest stosowanie metod mniej czasochłonnych.
PODSUMOWANIE
48
GCB – Rodzinnie, Zakopane, 24-26.10.2007
Przy podawaniu wartości LOD należy podać również opis i parametry metody jaka została wykorzystana przy jej obliczaniu.