1 Aktuelle Aspekte der Zöliakie Herbert Wieser Deutsche Forschungsanstalt für Lebensmittelchemie Lichtenbergstr. 4, 85748 Garching in Zusammenarbeit mit der Europäischen Arbeitsgruppe für die Prolaminanalyse und - toxizität und den Partnern des BMBF- Leitprojekts „Zöliakie“
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1 Aktuelle Aspekte der Zöliakie Herbert Wieser Deutsche Forschungsanstalt für Lebensmittelchemie Lichtenbergstr. 4, 85748 Garching in Zusammenarbeit mit.
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Aktuelle Aspekte der Zöliakie
Herbert Wieser
Deutsche Forschungsanstaltfür Lebensmittelchemie
Lichtenbergstr. 4, 85748 Garching
in Zusammenarbeit mit der
Europäischen Arbeitsgruppe für die Prolaminanalyse und -toxizität
Lebenslange Intoleranz gegenüber Speicherproteinen (Gluten) aus Weizen, Roggen, Gerste und Hafer (?), die mit einer schweren Schädigung der Dünndarmschleimhaut (Zottenatrophie) einhergeht und zur Malabsorption von essentiellen Nährstoffen führt
Darmzottennormal zöliakiegeschädigt
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Symptome/Therapie
Häufige Symptome
Durchfälle Anämien
Erbrechen Avitaminosen
Leibblähungen Knochenschmerzen
Blässe Osteoporose
Gedeihstörungen Muskelschwund
Wesensveränderung Gewichtsverlust
Lebenslange strikte „glutenfreie Diät“
= keine Produkte aus Weizen, Roggen,
Gerste und Hafer außer reiner Stärke
(Tägliche Aufnahme von Gluten < 20 mg)
Therapie
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Chronik der Zöliakie
200 a.d. Patienten mit chronischem Durchfall = „koiliakos“
1888 Beschreibung der Zöliakie, Behandlung durch Diät
Toxische Wirkung von „Gluten“ „glutenfreie Diät“1950
1959
1960
1961
1970/71
1984/88
1997
Peptisch-tryptisches Glutenhydrolysat = toxisch
Zöliakie und Einheimische Sprue = identische Krankheit
Diagnose durch Dünndarmbiopsie
Toxizitätsprüfung von Proteinen (in-vivo, in-vitro)
10 0,0 <1,5 - <1,5 -a Gliadinstandard IRMM-480; Angaben entsprechen Gliadinprotein (= 86,4 % der Substanz).b Aus 10 g Mehl hergestellt und 10 min bei 240 °C verbacken.
Wiederfindung von Gliadin in Maisbrot
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Zusammenfassung Analytik
• Mit dem monoklonalen Antikörper R5 werden die Prolamine von Weizen, Roggen und Gerste mit hoher Spezifität und
Empfindlichkeit quantitativ erfasst.
• Der kombinierte Einsatz von 2-Mercaptoethanol und Guanidin erlaubt die vollständige Extraktion der Prolamine auch aus
erhitzten Produkten; die Effizienz des Antikörpers wird durch das Extraktionsmittel nicht beeinträchtigt.
• In naher Zukunft wird ein zertifizierter Gliadinstandard zur Verfügung stehen.
• Das entwickelte ELISA-System wurde in einem internationalen Ringtest erfolgreich getestet und vom „Codex Commitee on Methods of Analysis and Sampling (CCMAS)“ anerkannt. Seit kurzem sind kommerzielle Testkits erhältlich.
• Haferprolamine und Weizenglutenine werden nicht erfasst.
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BMBF - Ideenwettbewerb
BMBF - Leitprojekt
Entwicklung von
Weizen-, Roggen-,
und Gerstenproteinen
ohne Zöliakietoxizität
und deren Verwendung zur
Herstellung von Lebensmitteln
(http://vvgvg.org)
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Ziele
• Aufklärung toxischer Proteinstrukturen
• Eliminierung toxischer Strukturen durch Gentechnologie
• Produktion von zöliakieverträglichem, transgenem Weizen
• Produktion von backfähigem, transgenem Mais
• Produktion von zöliakieverträglichem Gluten durch transgene Hefe
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Partner
Wissenschaft Universität Hamburg
Institut für Allgemeine Botanik und Botanischer Garten(H. Lörz, D. Becker)
Technische Universität BerlinFachbereich für Lebensmittelwissenschaft und Biotechnologie(U. Stahl, F. Meuser)
St. Thomas´ Hospital, LondonRayne Institute(P.J. Ciclitira)
Deutsche Forschungsanstalt für Lebensmittelchemie, GarchingArbeitskreis Getreideproteine(H. Wieser)
Industrie Hauptsponsoren: Monsanto, Uniferm, Puratos, Bake Mark Verein zur Förderung und Verwertung von gentechnisch verbesserten
Getreideprodukten
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Teilprojekte Garching/London
• Identifizierung und Modifizierung toxischer Epitopeaus Gliadinen Immunmodulation ?
• Toxizitätsprüfung von Gluteninen Einsatz in glutenfreien Backwaren ?
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Toxizitätstests
In-vivo-Test (Instillation in den Dünndarm) 500 – 1000 mg
In-vitro-Test (Gewebekultur-Test) 1 mg
In-vitro-Test (Stimulation der T-Lymphozyten) 0,2 mg
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Zöliakieaktivität synthetischer Gliadinpeptide
(in vivo, Sturgess et al., 1994; in vitro, Shidrawi et al., 1995)
(in vivo, Marsh et al., 1995; in vitro, Maiuri et al., 1996)
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Stimulation der T-Lymphozyten durch Gliadinpeptide
Zöliakiespezifische Stimulation der T-Lymphozyten (in-vitro) durch Peptide aus -Gliadinen (57-68, 62-75) nach Desamidierung von Q65 E65 durch Transglutaminase
( 57 - 68 )
( Arentz-Hansen et al., 2000 )
( 62 - 75 )L Q P F P Q P E L P Y
P Q P E L P PY Q P Q L P Y
Q
! Kein Nachweis, dass diese Peptide in-vivo die Darmschleimhaut schädigen
! Keine systematische Untersuchung, welche Aminosäuren außer E65 für die stimulierende Wirkung essentiell sind
(Arentz-Hansen et al., 2000)
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Methoden (1)
Gliadinhydrolysat
Extraktion von Gliadin aus Weizenmehl der Sorte „Rektor“ mit 60 % (v/v) Ethanol
Partialhydrolyse von Gliadin mit trägergebundenem Pepsin und Trypsin( PT-Gliadin)
Die in-vivo-Toxizitätsprüfung an vier erwachsenen Zöliakiepatienten hat gezeigt, dass das Peptid G8 ( 56-75) eine signifikante zöliakiespezifische Schädigung der Dünndarmschleimhaut hervorruft.
Die immunologischen Untersuchungen haben ergeben, dass das an Position 65 desamidierte Peptid G8 (G9) eine zöliakiespezifische Stimulation der T-Lymphozyten bewirkt. Für die Wirkung des Peptids sind die Positionen 62-71 essentiell.
P Q P L P Y P PE Q
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Peptidbindungsstellen
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Toxizitätsprüfung der HMW-Glutenine
1Dx5
1Dy10
90 785827
Bauplan
A B C
105 585
627A B C
Wiederkehrende Sequenzen
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Preparation of Crude HMW Subunits
Flour (Rektor)
50 % 2-PrOH
(3x, RT)
Extract Residue
50 % 2-PrOH + DTE + Tris-HCl
(2x, 60 °C)
Extract Residue
Solubles Precipitate
washing, freeze-drying
HMW subunits
1Dx5 29.4 %1Bx7 36.7 %1By9 11.9 %1Dy10 22.0 %
acetone
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RP-HPLC of Glutenin Fractions
Total glutenin subunits Crude HMW subunits
HMW 20 %
HMW 90 %
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Characterisation of Purified HMW Subunits
RP-HPLC SDS-PAGE
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ELISA-Result
Antibody Gliadin
R5 (Mendez et al., Madrid)a) Sandwichb) Competitive
0.09 %0.16 %
W6/8 (Ellis et al., London) 0.18 %
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Peptic Tryptic Digest of HMW Subunits
Control of hydrolysis by RP-HPLC on C18 silica gel
Angegeben ist der Stimulationsindex (SI);SI>2 = signifikante Wirkung; Nd = nicht bestimmt.
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Ergebnisse ECH
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Ergebnisse VH/CD
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Ergebnisse IEL
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Zusammenfassung HMW-Glutenine
Die immunologischen und toxikologischen Untersuchungen haben ergeben, dass ein Gemisch aus den HMW-Untereinheiten Nr. 5, 7, 9 und 10 zöliakiespezifische Reaktionen hervorruft. Aus den Ergebnissen geht nicht hervor, welche der vier Untereinheiten zöliakieaktiv ist.
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Ausblick
Isolierung und Testung einzelner rekombinanter HMW-Untereinheiten aus transgenem Mais und transgener Hefe
Mais(Uni Hamburg)
Hefe(TU Berlin)
1Dy10 1Dx5
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Danksagung
Prolamin Working Group
Paul J. Ciclitira, LondonRenate van Eckert, GrazConleth Feighery, DublinEnrique Mendez, Madrid
BMBF-Projekt
Dirk Becker, HamburgPaul J. Ciclitira, LondonErika Hinzmann, BerlinFriedrich Meuser, Berlin