PUSAT KARANTINABADAN KARANTINA IKANDAN KEAMANAN HASIL PERIKANANKEMENTERIAN KELAUTAN DAN PERIKANAN
Petunjuk Teknis Surveilan Megalocytivirus pada
PUSAT KARANTINA DAN KEAMANAN HAYATI IKANBADAN KARANTINA IKAN, PENGENDALIAN MUTUDAN KEAMANAN HASIL PERIKANANKEMENTERIAN KELAUTAN DAN PERIKANAN
Petunjuk Teknis Surveilan Megalocytivirus padaIkan Hias Air Tawar dan Laut
2016Petunjuk Teknis Surveilan Megalocytivirus pada
Air Tawar dan Laut
PETUNJUK TEKNISSurveilan Megalocytivirus pada Ikan Hias
Air Tawar dan Laut
Tim Penyusun:
Prof. Dr. Ir Slamet Budi Prayitno, M.Sc
Prof. Bambang Sumiarto
Dr. Arief Taslihan
Heri Yuwono, S.Pi, M.P
Ir. Asep Dadang Koswara, M.Si
Ir. Muhammad Ridwan, M.P
M. Ghufron Purnama, M.Si
Iwan Supriadi, S.P, M.P
Usman Affandi, S.Pi
Inda Wahyuni, S.St.Pi, M.Si
Nani Sri Rahayu, A.Pi
Sri Supriyanti, S.Pi
Bazar Ristiyawan, S.Pi
Petunjuk Teknis Surveilan Megalocytivirus pada Ikan Hias Air Tawar dan Laut i
KATA PENGANTAR
Puji syukur kami panjatkan kepada Allah SWT, atas berkat dan rahmat-
Nya Petunjuk Teknis “Surveilan Megalocytivirus pada Ikan Hias Air Tawar dan
Laut” dapat diselesaikan dengan baik.
Seiring pesatnya produksi komoditas perikanan dan meningkatnya lalu-
lintas perdagangan ikan hias antar negara dewasa ini telah memunculkan
kekhawatiran akan penyebaran penyakit eksotik lintas Negara. Salah yang
menjadi satu isu penting saat ini adalah terkait penyebaran Megalocytivirus.
Oleh karena itu deteksi dini untuk mengetahui adanya infeksi Megalocytivirus
pada komoditas ikan di Indonesia sangat diperlukan untuk mengurangi
dampak kerugian yang ditimbulkan. Ditambah lagi adanya potensi penularan
virus ini, maka diperlukan upaya pencegahan dan kewaspadaan terhadap
meluasnya penyebaran.
Untuk menjawab kebutuhan tersebut, Pusat Karantina dan Keamanan
Hayati Ikan telah menyusun petunjuk teknis pelaksanaan surveilan
Megalocytivirus, dengan harapan petunjuk teknis ini dapat menjadi acuan
bagi tim surveilan agar pelaksanaan kegiatan surveilan dapat lebih terukur,
terarah, dan hasilnya dapat dipertanggung jawabkan secara ilmiah.
Bersama ini tak lupa kami ucapkan terimakasih yang sebesar-besarnya
kepada :
1. Prof. Dr. Ir Slamet Budi Prayitno, M.Sc; Prof. Bambang Sumiarto; Dr. Arief
Taslihan; serta Ir. Asep Dadang Koswara, M.Si selaku narasumber dalam
penyusunan petunjuk teknis ini;
2. Semua pihak yang terlibat dalam penyusunan petunjuk teknis ini yang
tidak dapat kami sebutkan satu persatu.
Kami menyadari bahwa masih banyak kekurangan dalam
penyusunannya sehingga saran dan masukkan yang membangun sangat kami
harapkan demi penyempurnaan di masa yang akan datang.
Jakarta, Januari 2016Kepala Pusat Karantina danKeamanan Hayati Ikan
Riza Priyatna
Petunjuk Teknis Surveilan Megalocytivirus pada Ikan Hias Air Tawar dan Laut ii
DAFTAR ISI
KATA PENGANTAR ...................................................................................................... i
DAFTAR ISI..................................................................................................................... ii
BAB I. PENDAHULUAN
1.1. Latar Belakang ................................................................................................ 1
1.2. Tujuan................................................................................................................ 3
1.3. Dasar Hukum .................................................................................................. 3
BAB II. KAJIAN PUSTAKA
2.1. Megalocytivirus ............................................................................................... 5
2.2. Ethiology Megalocytivirus .............................................................................. 7
2.3. Pathogenitas dan Epidemiologi Megalocytivirus ..................................... 8
2.4. Kondisi Terkini Megalocytivirus ..................................................................... 9
2.5. Surveilan .......................................................................................................... 10
2.6. Aspek Legalitas dalam Surveilan di Indonesia .......................................... 10
2.7. Unsur Surveilan ................................................................................................ 11
BAB III. METODELOGI SURVEILAN MEGALOCYTIVIRUS
3.1. Disain Program Surveilan untuk Penentuan Area Bebas Pathogen
Tertentu..............................................................................................................12
3.2. Infrastruktur Surveilan.......................................................................................12
3.2.1. Laboratorium.........................................................................................12
3.2.2. Metode Uji..............................................................................................13
3.2.3. Petugas Pengambil Contoh Uji...........................................................13
3.2.4. Alur Data ................................................................................................13
3.3. Disain Surveilan.................................................................................................14
3.3.1. Alat dan Bahan.....................................................................................14
Petunjuk Teknis Surveilan Megalocytivirus pada Ikan Hias Air Tawar dan Laut iii
3.3.2. Penentuan Metoda Diagnosis, Sensistifitas dan Spesifitas
Pengujian .............................................................................................15
3.3.3. Lokasi Pengambilan Contoh Uji........................................................15
3.3.4. Penentuan Jumlah Contoh Uji..........................................................15
3.3.5. Metode Pengambilan Contoh Uji ....................................................16
BAB IV. EVALUASI DAN PELAPORAN SURVEILAN MEGALOCITYVIRUS
4.1. Format Pelaporan............................................................................................19
4.2. Mekanisme Pelaporan....................................................................................19
4.3. Waktu Pelaporan.............................................................................................20
BAB V. PENUTUP
DAFTAR PUSTAKA
DAFTAR GAMBAR
DAFTAR TABEL
DAFTAR LAMPIRAN
Petunjuk Teknis Surveilan Megalocytivirus pada Ikan Hias Air Tawar dan Laut iv
DAFTAR GAMBAR
Gambar 1. Diagram Skematik Penampang Partikel Megalocytivirus ......... 6
Gambar 2. Inclusion Body-bearing Cells (IBCs) dari Dwarf Gourami
yang Terinfeksi Megalocytivirus ...................................................... 7
Gambar 3. Alur Informasi dari Farm ke Pusat Data ......................................... 14
Gambar 4. Diagram Sistem Pooling Contoh Uji untuk qPCR .......................... 18
Gambar 5. Pencatanan dan Pelabelan .......................................................... 25
Gambar 6. Kurva Standar ................................................................................... 34
Gambar 7. Kurva Pengujian Sampel ................................................................. 36
Petunjuk Teknis Surveilan Megalocytivirus pada Ikan Hias Air Tawar dan Laut v
DAFTAR TABEL
Tabel 1. Komposisi Kaktail untuk qPCR .............................................................. 32
Tabel 2. Program Amplifikasi ............................................................................... 33
Tabel 3. Keterangan Gambar Kurva Standar Hasil Amplifikasi Real Time ... 35
Tabel 4. Keterangan Gambar Pengujian Hasil Amplifikasi Real Time ........... 37
Tabel 5. Pencatanan dan Pelabelan ................................................................ 25
Petunjuk Teknis Surveilan Megalocytivirus pada Ikan Hias Air Tawar dan Laut vi
Petunjuk Teknis
Surveilan Megalocytivirus
pada Ikan Hias Air Tawar dan Laut
Diterbitkan Oleh:
Pusat Karantina dan Keamanan Hayati Ikan
Badan Karantina Ikan, Pengendalian Mutu dan Keamanan Hasil Perikanan
Kementerian Kelautan dan Perikanan
Jalan Medan Merdeka Timur No. 16
Gedung Mina Bahari II Lantai 6 Jakarta Pusat 10110
Telp. (021) 3513277, Fax. (021) 3513275
2016
Petunjuk Teknis Surveilan Megalocytivirus pada Ikan Hias Air Tawar dan Laut 1
BAB I
PENDAHULUAN
1.1. Latar Belakang
Peningkatan produksi komoditas perikanan dewasa ini sangat pesat,
terlihat dengan grafik peningkatan produksi yang ditampilkan oleh negara
produsen. Dibalik itu, kekhawatiran akan perkembangan jenis penyakit baru
sangat menghawatirkan, yang dapat menjadi masalah besar bagi negara
yang terkena wabah. Tercatat Koi Herpes Virus, Early Mortality Syndrome
dengan cepat menyebar tanpa batas wilayah negara. Penyebaran
penyakit eksotik lintas negara antara lain adalah disebabkan peningkatan
lalu lintas ikan global. Muncul dan berkembangnya penyakit baru dan
menjadi wabah menakutkan menyebabkan kesadaran bagi setiap negara
untuk melakukan perlindungan terhadap negaranya agar tidak tertular
penyakit eksotik melalui prosedur sanitary and phytosanitary (OIE, Aquatic
Code, 2014).
Pada perdagangan ikan hias antar negara kekhawatiran akan
masuknya jenis virus baru adalah menjadi isu yang penting. Salah satu
permasalahan terkait dengan perdagangan ikan hias adalah dikhawatirkan
membawa Megalocytivirus, yang bagi negara tertentu merupakan isolat
baru yang dapat mengancam perikanan di negara pengimpor.
Perdagangan internasional ikan hias hidup merupakan rute utama masuknya
Megalocytivirus ke area geografis baru (Whitington Chong, 2007 dalam
Rimmer et al., 2012.
Megalocytivirus termasuk famili Iridoviridae yang banyak menyerang
organisme perairan baik ikan maupun amphibi. Laporan Sung et al. (2010)
infeksi Megalocytvirus pada ornamental fish menyebabkan kematian antara
30 sampai 100%. Secara patologi anatomi ikan yang terinfeksi
Megalocytivirus menunjukkan gejala anemia, radang dan pembengkakan
pada limpa dan ginjal, pada sel-sel yang diserang terbentuk inclusion body-
bearing cell (IBC) serta mengalami nekrosis jaringan (Mahardika et al., 2008).
Petunjuk Teknis Surveilan Megalocytivirus pada Ikan Hias Air Tawar dan Laut 2
Di Indonesia, infeksi Megalocytivirus telah terdeteksi pada jenis ikan air
tawar dan air laut (Abidin, 2013). Jenis ikan air tawar di Indonesia yang
dilaporkan terinfeksi adalah ikan gurami hias, sedangkan pada ikan air laut
yaitu ikan kerapu bebek, kerapu lumpur, kerapu macan, serta ikan
capungan. Pemerintah Indonesia melalui Kementerian Kelautan dan
Perikanan (KKP) telah menetapkan Megalocytivirus sebagai salah satu
kelompok Hama dan Penyakit Ikan Karantina (HPIK) golongan I dengan
daerah penyebaran Megalocytivirus di Indonesia saat ini adalah Sumatera
Utara, Sumatera Barat, Kepulauan Riau, Lampung dan Bali (Anonim, 2015).
Oleh karena itu deteksi dini untuk mengetahui adanya infeksi
Megalocytivirus pada komoditas ikan sangat diperlukan untuk mengurangi
dampak kerugian yang disebabkan karena serangan Megalocytivirus.
Ditambah lagi adanya potensi penularan virus ini, sehingga pemeriksaan
dan pengawasan kesehatan ikan perlu dilakukan untuk mencegah
meluasnya penyebaran. Selain itu, terdapat Biosecurity Advice 2014/11
tentang Quarantine Policy For Freshwater Ornamental Finfish From Approved
Countries yang diterbitkan oleh Department of Agriculture Australia pada
tanggal 8 September 2014 menyebutkan ketentuan karantina terkait bebas
Megalocytivirus untuk beberapa jenis ikan hias (Gouramies, Poeciliids, Betas,
Paradise Fish, dan Cichlids) yang akan diimpor oleh Australia dari negara-
negara yang telah disetujui untuk melakukan ekspor ke Australia, termasuk
Indonesia.
Sebagai langkah lanjut, Badan Karantina Ikan, Pengendalian Mutu
dan Keamanan Hasil Perikanan bekerjasama dengan Direktorat Kesehatan
Ikan dan Lingkungan dan Badan Penelitian dan Pengembangan Kelautan
dan Perikanan akan melaksanakan active targetted surveillance yang
dilakukan di beberapa wilayah untuk membuktikan ada tidaknya
Megalocytivirus dan gejala klinis yang mencurigakan pada populasi sumber
ikan selama kurun waktu minimal 2 (dua) tahun.
Petunjuk Teknis Surveilan Megalocytivirus pada Ikan Hias Air Tawar dan Laut 3
1.2. Tujuan
Petunjuk teknis Surveilan Megalocytivirus pada Ikan Hias ini disusun
sebagai acuan bagi tim surveilan dalam:
- Mendeteksi, menentukan prevalensi dan faktor risiko Megalocytivirus
pada ikan hias air tawar di wilayah sentra budidaya ikan hias Jawa
Barat, DKI Jakarta, Sumatera Utara.
- Mendeteksi dan menentukan prevalensi dan faktor risiko
Megalocytivirus pada ikan hias air laut di wilayah sentra budidaya ikan
hias Sulawesi Utara, Sulawesi Tengah, Sulawesi Tenggara, Bali.
- Menentukan dan menetapkan area bebas infeksi Megalocytivirus
pada farm ikan hias di sentra budidaya ikan hias Jawa Barat, DKI
Jakarta, Sumatera Utara, Sulawesi Utara, Sulawesi Tengah, Sulawesi
Tenggara, Bali.
1.3. Dasar Hukum
1. Undang-Undang Nomor 16 Tahun 1992 tentang Karantina Hewan,
Ikan, dan Tumbuhan;
2. Undang-Undang Nomor 7 Tahun 1994 tentang Pengesahan
Agreement Establishing The World Trade Organization khususnya
tentang SPS Agreement (Sanitary and Phytosanitary).
3. Undang-Undang Nomor 31 tahun 2004 tentang Perikanan,
sebagaimana diubah dengan Undang-Undang Nomor 45 tahun
2009;
4. Peraturan Pemerintah Nomor 15 tahun 2002 tentang Karantina
Ikan;
5. Peraturan Menteri Kelautan dan Perikanan Nomor
PER.05/MEN/2005 tentang Tindakan Karantina untuk Pengeluaran
Media Pembawa Hama dan Penyakit Ikan Karantina;
6. Peraturan Menteri Kelautan dan Perikanan Nomor
PER.13/MEN/2007 tentang Sistem Pemantauan Hama dan Penyakit
ikan Karantina
Petunjuk Teknis Surveilan Megalocytivirus pada Ikan Hias Air Tawar dan Laut 4
7. Keputusan Menteri Kelautan dan Perikanan Nomor: 80/KEPMEN-
KP/2015 tentang Penetapan Hama dan Penyakit Ikan Karantina,
Golongan, Jenis Media Pembawa dan Sebarannya;
8. Keputusan Menteri Kelautan dan Perikanan Nomor: 81/KEPMEN-
KP/2015 tentang Penetapan Area yang Tidak Bebas Penyakit Ikan
Karantina, Golongan dan Media Pembawanya di Dalam Wilayah
Negara Republik Indonesia.
Petunjuk Teknis Surveilan Megalocytivirus pada Ikan Hias Air Tawar dan Laut 5
BAB II
KAJIAN PUSTAKA
4. 1. Megalocytivirus
Megalocytivirus merupakan salah satu genus dalam famili iridoviridae.
Famili Iridoviridae, beranggotakan lima genera, yaitu Irridovirus,
Chloriridovirus, Ranavirus, Lymphocystivirus, dan Megalocytivirus, dan semua
sudah disekuen lengkap (She et al., 2010, Wou et al., 2013). Megalocytivirus
adalah genus yang terakhir ditambahkan ke dalam family ini (Chinchar , et
al., 2005).
Menurut Chao et al. (2004), genus Megalocytivirus awalnya diusulkan
pada tahun 2003 yang kemudian diterima oleh International Committee on
Taksonomi Virus (ICTV) dan ditambahkan dalam keluarga Iridoviridae.
Taksonomi Megalocytivirus menurut Andrew et al, 2012 dalam International
Committee on Taksonomi Virus (ICTV) adalah sebagai berikut:
Filum : Vira
Sub filum : Deoxyvira (DNA viruses).
Kelas : Deoxycubica (cubical symmetry)
Ordo : Haploviridae (no envelope)
Family : Iridoviridae (812 capsomeres)
Genus : Megalocytivirus
Spesies : Infectious spleen and kidney necrosis virus
Megalocytivirus memiliki satu spesies yang terdaftar pada International
Committee on Taxonomy of Viruses (ICTV), yaitu Infectious Spleen and
Kidney Necrosis Virus (ISKNV). Beberapa varian virus yang termasuk kedalam
genus Megalocytivirus tetapi belum dapat dimasukan dalam spesies antara
lain: Red seabream iridovirus (RSIV), Sea bass iridovirus (SBIV), African
lampeye iridovirus (ALIV), Grouper sleepy disease iridovirus (GSDIV), Dwarf
Petunjuk Teknis Surveilan Megalocytivirus pada Ikan Hias Air Tawar dan Laut 6
gourami iridovirus (DGIV), Taiwan grouper iridovirus (TGIV), Rock bream
iridovirus (RBIV), Orange-spotted grouper iridovirus (OSGIV), Turbot iridovirus
(TBIV), Spotted knife jaw iridovirus (SKIV) (Andrew et al, 2012).
Subramaniam et al., 2013 membagi Megalocytivirus berdasarkan gen
major capsid protein (MCP) menjadi 3 genotipe, yaitu; Genotipe I (Infectious
spleen and kidney necrosis virus, Dwarf gourami iridovirus, African lampeye
iridovirus, dan Murray cod iridovirus) meliputi isolate dari berbagai spesies
ikan laut di Jepang, Korea, Cina, dan Thailand. Genotipe II (Red Sea bream
iridovirus, Grouper sleppy disease iridovirusdan Rock bream iridovirus) terdiri
atas isolate dari spesies ikan air tawar di negara-negara Asia Tenggara
termasuk China, Indonesia, dan Malaysia, dan ikan laut yang ditangkap di
Laut Cina Selatan. Genotipe III (Turbot reddish body iridovirus dan Korean
flounder iridovirus) terutama terdiri dari isolate dari spesies flatfish di Korea
dan Cina.
Virus anggota Irridovirus adalah virus kategori besar, bentuk virion
icosahedral, double-stranded DNA (dsDNA), terdiri dari filament
nucleoprotein dikelilingi oleh membran lipid yang mengandung protein trans
membran yang belum diketahui fungsinya (Gambar 1).
Gambar 1. Diagram skematik penampang dari partikel Megalocytivirus, menunjukkan
capsomers, transmembran proteins dalam lapisan lipid, dan inti nucleoprotein
(Andrew et al, 2012).
Petunjuk Teknis Surveilan Megalocytivirus pada Ikan Hias Air Tawar dan Laut 7
4. 2. Ethiologi Megalocytivirus
Infeksi Megalocytivirus dicirikan dengan formasi sel-sel membesar dan
sel-sel nekrotik. Di bawah electron mikroskopi, sel-sel membesar merupakan
IBCs (inclusion body bearing cell) yang kemungkinan merupakan sel
makrofage yang terinfeksi virus, dan sel tersebut membesar seiring
perkembangan badan inklusi (inclusion body) yang secara halus dibatasi
oleh membrane halus dengan inti dan sitoplasma sel inangnya (Chinchar et
al., 2005). Sel-sel membesar pertama ditemukan di jaringan limpa dan ginjal,
yang selanjutnya sel-sel tersebut menyebar ke beberapa organ dalam
seperti hati, jantung, lambung, usus dan ginjal belakang melalui peredaran
darah (Chao et al., 2004; Mastuti dan Mahardika, 2010).
Mahardika et al. (2004a dan 2009a) melaporkan bahwa kumpulan sel-
sel membesar terbentuk akibat reaksi dari protein antivirus yang terdapat
dalam sistem pertahanan tubuh ikan secara alami. Akan tetapi kapan mulai
terbentuknya sel-sel membesar tersebut pada jaringan limpa dan ginjal
(organ target) belum dilaporkan. Pada Mikroskop electron terlihat inclusi
body yang mengandung banyak virus di dalamnya (gambar 2).
Keterangan :
Detail virus. Virus berbentuk hexagonal
dan diameter yang berukuran 140-150
nm.
Gambar 2. Mikroskop Elektron,
inclusion body-bearing cells
(IBCs) dari Dwarf Gourami yang
Terinfeksi Megalocytivirus.
(Sumber : Sudthongkonget al., 2002a).
Petunjuk Teknis Surveilan Megalocytivirus pada Ikan Hias Air Tawar dan Laut 8
Virus dari genus Megalocytivirus menginfeksi sel-sel target melalui
proses endocytosis (reseptor-mediated endocytosis). DNA virus masuk ke
dalam inti sel dan berkembangbiak (perkembangbiakan virus tahap
pertama). DNA virus selanjutnya keluar dari inti sel ke dalam sitoplasma
melalui membran inti yang rusak atau pecah (rupture) dan berkembangbiak
di dalam VAS (virtual assembly site) (perkembangbiakan virus tahap kedua).
Di dalam sitoplasma sel tersebut, DNA virus akan membentuk partikel virus
(viral-concatemer) (Chinchar et al., 2005; Chao et al., 2004; Mahardika dan
Miyazaki, 2008).
4. 3. Pathogenitas dan Epidemiologi Megalocytivirus
Virus anggota Irridovirus dapat menginfeksi invertebrata dan
vertebrata poikilothermal, termasuk hewan yang dapat terinfeksi adalah
insekta, ikan, amfibia dan Reptil (She et al., 2010). Genus Megalocytivirus
diketahui sebagai penyebab penyakit yang signifikan, mortalitas dan
kerugian ekonomi pada ikan, khususnya ikan hias (Rimmer et al., 2012b).
Megalocytivirus adalah virus dsDNA yang menyebabkan infeksi sistemik
pada ikan budidaya air tawar maupun ikan budidaya air laut. Wabah
Megalocytivirus bersifat epizootic yang dapat menyebabkan kematian
massal ikan budidaya dalam waktu yang relative singkat (1-2 minggu dari
awal kejadian) sehingga menyebabkan kerugian ekonomi yang cukup besar
bagi pembudidaya. Secara patologi anatomi, ikan yang terinfeksi
Megalocytivirus menunjukkan gejala anemia, radang dan pembengkakan
pada limpa dan ginjal, pada sel-sel yang diserang terbentuk inclusion body-
bearing cell (IBC) serta mengalami nekrosis jaringan (Mahardika et al., 2008).
Di Indonesia, infeksi iridovirus pertama kali dilaporkan menginfeksi dan
menyebabkan kematian massal pada ikan kerapu lumpur Epinephelus
tauvina di Sumatera (Owen, 1993; Koesharyani et al., 2001). Selanjutnya,
iridovirus dilaporkan dapat menginfeksi ikan kerapu lumpur Epinephelus
coioides dan E. bleekery (Mahardika et al., 2001; Koeshariyani et al., 2001),
induk kerapu lumpur (Mahardika et al., 2003) kerapu macan E. fuscoguttatus
Petunjuk Teknis Surveilan Megalocytivirus pada Ikan Hias Air Tawar dan Laut 9
dan kerapu batik E. polyphekadion (Mahardika et al., 2004b), kerapu sunu
Plectropomus indicus (Mahardika et al., 2009b), dan kakap putih Lates
calcarifer (Mahardika dan Mastuti, 2010).
Infeksi iridovirus pada ikan kerapu dikenal dengan sebutan grouper
sleepy disease iridovirus (GSDIV) karena gejala klinis yang ditimbulkan yaitu
ikan tidur dengan satu sisi tubuh di dasar bak (Sudthongkong et al., 2002;
Mahardika et al., 2004a). Megalocytivirus juga pernah dilaporkan
menginfeksi ikan African Lampeye dan Dwarf Gourami yang dipelihara di
Sumatera dan diekspor ke Jepang melalui Singapore (Sudthongkong et al.,
2002).
4. 4. Kondisi Terkini Megalocytivirus
Epizootic Haematopoetic Necrosis Virus (EHNV), famili Iridoviridae dan
genus Ranavirus, Bohle iridovirus dan lymphocystis virus adalah tiga genera
Irridovirus yang endemik di Australia (Rimmer et al., 2012a). Karantina ikan
Australia melaporkan 5 species ikan yang mengalami kematian lebih dari
25% pada pasca karantina dan diketahui memiliki gejala Megalocytivirus-like
inclusion bodies pada pengamatan histopatologi serta positif pada
pengamatan PCR. Ikan dengan gejala tersebut diimpor dari Singapora,
Malaysia dan Sri Lanka. Sebanyak 97 dari 111 ikan dari bak terinfeksi telah
diuji positiv Megalocytivirus melalui pemeriksaaan dengan PCR (Tidaklan et
al., 2014).
Teknik diagnosis berbasis molekuler telah dikembangkan untuk
keperluan deteksi Megalocytivirus. Salah satunya adalah secara Polymerase
Chain Reaction (PCR), karena dengan teknik ini diagnosis dapat dilakukan
dengan cepat terutama untuk perdagangan ikan hias lintas negara (Rimmer
et al., 2012). Aplikasi PCR sebagai perangkat deteksi Megalocytivirus dipilih
karena PCR mempunyai spesifisitas dan sensitifitas yang tinggi. Primer telah
dibuat untuk PCR didisain untuk deteksi daerah target gen dari berbagai
genotipe virus sehingga mampu deteksi baik ISKNV-like dan RSIV-like
Megalocytivirus genotypes (Rimmer et al., 2012).
Petunjuk Teknis Surveilan Megalocytivirus pada Ikan Hias Air Tawar dan Laut 10
4. 5. Surveilan
Surveilan adalah kegiatan koleksi data yang dilakukan secara
sistematik, penyusunan dan analisis terhadap informasi terkait dengan
kesehatan hewan, selanjutnya melakukan diseminasi terhadap hasil informasi
yang diperoleh kepada pihak yang memerlukannya agar dapat dilakukan
tindakan pengendalian (Corsin et al., 2009). Surveilan merupakan bagian
dari kajian epidemiologi yang bertujuan untuk mendapatkan informasi
mengenai penyakit di suatu wilayah, termasuk di dalamnya aras, distribusi
dan faktor penyebab. Target kegiatan tersebut adalah melakukan
pencegahan, pengendalian, pengobatan dan eradikasi sehingga tidak
menimbulkan kerugian yang lebih besar.
Tujuan dilakukan surveilan adalah (1) membuktikan bahwa penyakit
tertentu tidak terdapat disuatu area, (2) keperluan untuk melakukan
notifikasi, (3) menentukan keberadaan atau disitribusi penyakit endemik
termasuk perubahan dalam hal insidensi dan prevalensi. Laporan surveilan
sangat diperlukan untuk keperluan pengendalian penyakit maupun sebagai
bahan informasi secara internasional bagi negara partner dagang.
Berdasarkan cara memperoleh data, surveilan dapat dibedakan
menjadi surveilan pasif dan aktif. Survellan secara pasif melakukan
pengumpulan data dilakukan secara non-random, seperti berdasarkan
laporan pembudidaya, laboratorium yang menerima sampel untuk
dilakukan diagnosis. Surveilan aktif memperoleh data melalui cara terstruktur,
pengambilan sampel dilakukan secara random maupun secar sistematik.
4. 6. Aspek Legalitas Pelaksanaan Surveilan di Indonesia
Kegiatan surveilan adalah mengacu pada Peraturan Menteri Kelautan
dan Perikanan Nomor Per.13/MEN/2007 tentang Sistem Pemantauan Hama
dan Penyakit Ikan Karantina, yang menjadi payung hukum bagi
pelaksanaan kegiatan surveilan dan monitoring penyakit ikan. Berdasarkan
payung hukum tersebut kemudian dapat dikembangkan peraturan
peraturan yang menjadi produk hukum turunannya, antara lain adalah
Petunjuk Teknis Surveilan Megalocytivirus pada Ikan Hias Air Tawar dan Laut 11
pelaksanaan kegiatan surveilan, penanganan masalah darurat terkait
munculnya wabah, hingga pemberian bantuan apabila terjadi wabah
kepada pembudidaya.
4. 7. Unsur Surveilan
Beberapa istilah dipergunakan terkait dengan pelaksanaan surveillan,
yaitu populasi, unit epidemiologi dan klastering. Surveilan harusnya dilakukan
dengan mempertimbangkan seluruh individu dalam populasi yang peka
terhadap infeksi patogen target dari suatu negara, zona atau kompartemen.
Estimasi Population At Risk total setiap spesies yang peka terhadap suatu jenis
patogen sangat diperlukan.
Kegiatan surveillan harus menetapkan unit epidemiologi, termasuk
didalamnya adalah karier, reservoir, vektor, status kekebalan, status usia dan
resistensi genetik, sex dll. Unit epidemiologi tersebut perlu dipertimbangkan
dan dimasukkan dalam laporan.
Jarang terjadi suatu jenis penyakit tersebar secara merata. Pada
umumnya, penyebaran penyakit terjadi di lingkup klaster, terbatas pada
suatu area tertentu (farm, kompartemen atau zona) yang dibatasi oleh aliran
air, waktu dan kelompok umur. Informasi klaster ini sangat penting bagi
interpretasi data yang diperoleh.
Petunjuk Teknis Surveilan Megalocytivirus pada Ikan Hias Air Tawar dan Laut 12
BAB III
METODELOGI SURVEILAN MEGALOCYTIVIRUS
3.1. Disain Program Surveilan untuk Penentuan Area Bebas Patogen
Tertentu
Penghitungan jumlah sampel untuk program surveillan dibuat
berdasarkan hipotesis nol, bahwa prevalensi patogen ada di area yang
disurveilan pada batas serendah mungkin, umumnya ditentukan 2%. Dasar
penentuan hipotesis nol tersebut adalah sebagai pertimbangkan bahwa,
hampir tidak mungkin area 100% bebas dari penyakit.
3.2. Infrasutruktur Surveilan
3.2. 1. Laboratorium
Ada dua tipe laboratorium terkait dengan program surveilan, yaitu
laboratorium rujukan (reference laboratory) dan laboratorium uji (testing
laboratory). Penentuan laboratorium adalah berdasarkan fungsi
laboratorium terkait dengan kegiatan diagnosis.
Laboratorium rujukan adalah laboratorium yang ditunjuk sebagai
laboratorium tempat melakukan kegiatan validasi metode uji, melakukan
pelatihan, dan menjalankan kerjasamanya dengan laboratorium rujukan
yang telah ditunjuk oleh OIE. Laboratorium rujukan harus berstatus
terakreditasi ISO 17025 oleh KAN atau badan akreditasi internasional lainnya.
Laboratorium uji adalah laboratorium yang bertugas untuk melakukan
pengujian sampel. Laboratorium uji berada di bawah kendali laboratorium
rujukan dalam pemilihan metode uji, dan pelatihan SDM oleh laboratorium
rujukan. Penetapan laboratorium rujukan dan laboratorium uji untuk kegiatan
surveilan Megalocytivirus pada ikan hias ini lebih jauh ditetapkan dengan
Keputusan Kepala Badan Karantina Ikan, Pengendalian Mutu dan
Keamanan Hasil Perikanan.
Petunjuk Teknis Surveilan Megalocytivirus pada Ikan Hias Air Tawar dan Laut 13
3.2. 2. Metode Uji
Metode uji untuk pengujian Megalocytivirus adalah Real-Time PCR
(qPCR, sesuai permintaan Australia) dan PCR Konvensional Nested PCR
(sesuai dengan metode standar OIE). Metode uji sudah dilakukan validasi
dan koordinasi laboratorium rujukan.
3.2. 3. Petugas Pengambil Contoh Uji (PPC)
Pengambilan contoh uji dilakukan oleh petugas pengambil contoh uji
(PPC). Petugas Pengambil harus petugas yang terlatih, dibuktikan dengan
sertifikat. Tenaga PPC harus sudah dilakukan pelatihan dengan materi,
pengenalan penyakit terkait dengan Megalocytivirus, termasuk didalamnya
gejala klinis penyakit, dasar populasi, pola penyebaran penyakit, metode
pengambilan contoh, Teknik pembedahan dan preservasi, serta pengiriman
sampel.
3.2. 4. Alur Data
Alur data, dimulai dari Petugas Pengambilan Contoh Uji. Setelah
mengambil contoh uji berupa ikan dan data kuesioner, selanjutnya dikirim ke
Laboratorium UPT KIPM atau Laboratorium UPT DJPB yang ditunjuk
berdasarkan SK Kepala Badan KIPM, untuk selanjutnya dilakukan
pemeriksaan terhadap contoh uji. Data hasil analisa contoh uji beserta data
kuesioner selanjutnya dikirim ke Pusat Data (Pusat Karantina dan Keamanan
Hayati Ikan) untuk dilakukan verifikasi, penggolongan (collation), selanjutnya
setelah semua data terkumpul dilakukan analisa untuk menentukan
prevalensi dan faktor risiko.
Analisa data menggunakan perangkat lunak (software) seperti
Statistix, atau GenStat atau SPS. Langkah terakhir adalah pelaporan dan
diseminasi hasil. Keluaran (output) berupa prevalensi, faktor risiko, rasio ganjil
(Odd Ratio, OR), dll.
Petunjuk Teknis Surveilan Megalocytivirus pada Ikan Hias Air Tawar dan Laut 14
Gambar 3. Alur Informasi dari Farm ke Pusat Data
3.3. Disain Surveilan
3.3.1. Alat dan Bahan
Peralatan yang dipergunakan dalam kegiatan surveilan adalah
berupa alat pemeriksaan kualitas air, peralatan pengambilan sampel
berupa jala dan seser, botol sampel volume 200 ml. Peralatan untuk
pembedahan dan preservasi sampel berupa dissecting set serta peralatan
pengujian di laboratorium.
Bahan yang dipergunakan dalam penelitian adalah bahan preservasi
sampel berupa alkohol 80%, preservative Bouin untuk tujuan pembuatan
preparat histologi.
Pusat Karantinadan Keamanan
Hayati Ikan
DirektoratKesehatan Ikandan Lingkungan
UPT KIPM UPT DJPB
PPC PPC
Farm Farm
Petunjuk Teknis Surveilan Megalocytivirus pada Ikan Hias Air Tawar dan Laut 15
3.3.2. Penentuan Metode Diagnosis, Sensitifitas dan Spesifisitas Pengujian
Metode diagnosis yang dipilih untuk ikan hias air tawar menggunakan
pengujian dengan metode qPCR dengan tingkat sensitifitas metode adalah
99%, dan spesifisitas uji 99%, sedangkan untuk ikan hias air laut menggunakan
metode konvensional PCR double step nested, dengan sensitivitas 95% dan
spesifisitas 99%.
3.3.3. Lokasi Pengambilan Contoh Uji
Penetuan lokasi pengambilan contoh uji dalam kegiatan surveilan
Megalocytivirus didasarkan pada wilayah asal ikan-ikan budidaya yang
berpotensi sebagai inang Megalocytivirus. Lokasi tersebut menjadi titik
pengambilan contoh uji dikarenakan, mayoritas eksportir mengambil ikan
dari wilayah tersebut.
Adapun lokasi yang ditetapkan untuk Surveilan Ikan Hias Air Tawar,
adalah: Bogor, Bekasi, Bandung, Depok dan Medan (Sumatera Utara),
sedangkan lokasi yang ditetapkan untuk Surveilan Ikan Hias Air Laut adalah
Luwuk Banggai (Sulawesi Tenggara).
3.3.4. Penentuan Jumlah Contoh Uji
Metode yang dipilih untuk pengambilan contoh uji adalah two stage
systematic sampling. Pertama memilih farm, kemudian memilih
tambak/kolam. Unit epidemiologi adalah tambak/kolam sebagai unit
terkecil.
Jumlah sampel yang akan diambil ditentukan berdasarkan asumsi
prevalensi 5%, tingkat kepercayaan 95%, sensitifitas uji 99% dan spesifisitas uji
95%. Selanjutnya dengan menggunakan program SurveiToolbox, maka
jumlah sampel yang harus diambil sebanyak 129 sampel.
Jumlah sampel untuk ikan hias air laut, menggunakan konvensional
PCR, double step nested, dengan asumsi prevalensi 5%, tingkat kepercayaan
95%, sensitifitas uji 95% spesifisitas uji 99%, didapatkan jumlah sampel dari
Petunjuk Teknis Surveilan Megalocytivirus pada Ikan Hias Air Tawar dan Laut 16
populasi ikan hias laut dari Banggai sebanyak 134 ekor. Ikan sejumlah 134
ekor ikan diambil dari keramba yang memasok ikan, dengan proporsi ikan
ditentukan berdasarkan jumlah ikan setiap keramba.
Contoh 1 (Pengujian dengan menggunakan metode qPCR):
Di Kab. Bogor terdapat 20 farm ikan hias air tawar. Kabupaten Bogor
dianggap sebagai satu kompartemen. Dari 20 farm disampling secara acak
sebanyak 30% dari jumlah farm (6 farm). Dengan asumsi prevalensi 5%,
tingkat kepercayaan 95% maka jumlah sampel yang harus diambil di
Kabupaten Bogor sebanyak 129 ekor. Maka jumlah sampel setiap farm yang
diambil sebanyak 129 ekor/6 farm = 22 ekor/farm
Jumlah sampel dalam satu kali surveilan sebanyak = 129 ekor
Jumlah sampel dalam 1 tahun (tujuh kali surveilan) sebanyak 129 x 7 = 903
ekor.
Contoh 2 (Pengujian dengan menggunakan metode konvensional PCR,
double step nested):
Di Kab. Luwuk Banggai terdapat 50 farm ikan hias air laut (Banggai Cardinal).
Kabupaten Luwuk Banggai dianggap sebagai satu kompartemen. Dari 50
farm disampling secara acak sebanyak 30% dari jumlah farm (15 farm).
Dengan asumsi prevalensi 5%, tingkat kepercayaan 95% maka jumlah
sampel yang harus diambil di Kabupaten Luwuk Banggai sebanyak 134 ekor.
Maka jumlah sampel setiap farm yang diambil sebanyak 134 ekor/15 farm =
9 ekor/farm
Jumlah sampel dalam satu kali surveilan sebanyak = 134 ekor
Jumlah sampel dalam 1 tahun (tujuh kali surveilan) sebanyak 134 x 7 = 938
ekor.
3.3.5. Metode Pengambilan Contoh Uji
Surveilan Ikan Hias Air Tawar
Surveilan ikan hias tawar, sebagai unit sampel adalah kolam, dengan
ikan adalah sub-sampel. Apabila dari hasil pemeriksaan ditemukan bahwa
Petunjuk Teknis Surveilan Megalocytivirus pada Ikan Hias Air Tawar dan Laut 17
apabila ikan yang diambil dari kolam positif terinfeksi Megalocytivirus, maka
kolam dinyatakan positif. Metode pengambilan sampel adalah secara
Simple Random Sampling atau menggunakan Systematic Random Sampling.
Pertama dilakukan penomoran terhadap semua farm di daerah surveilan.
Pengambilan sampel dengan Simple Random Sampling
menggunakan bantuan kartu random, kemudian dipilih sampel dari total
farm yang teridentifikasi. Pengambilan sampel berdasarkan Systematic
Random Sampling dengan cara, pertama ditentukan interval yaitu total farm
yang diidentifikasi dibagi dengan total sampel yang akan diambil,
selanjutnya ditentukan pengambilan sampel berdasarkan interval.
Surveilan Ikan Hias Air Laut
Surveilan ikan hias air laut, sebagai unit sampel adalah karamba
tancap, dengan ikan adalah sub-sampel. Apabila dari hasil pemeriksaan
ditemukan bahwa apabila ikan yang diambil dari keramba positif terinfeksi
Megalocytivirus, maka dinyatakan positif. Metode pengambilan sampel
yang digunakan adalah secara Simple Random Sampling atau
menggunakan Systematic Random Sampling. Pertama dilakukan terhadap
semua keramba di daerah surveilan. Pengambilan sampel dengan Simple
Random Sampling menggunakan bantuan kartu random, kemudian dipilih
sampel dari total farm yang teridentifikasi. Pengambilan sampel berdasarkan
Systematic Random Sampling dengan cara, pertama ditentukan interval
yaitu total farm yang diidentifikasi dibagi dengan total sampel yang akan
diambil, selanjutnya ditentukan pengambilan sampel berdasarkan interval.
Ikan diambil dari kolam, bak, akuarium maupun karamba dipilih
secara purposive, berdasarkan gejala klinis spesifik yang mengarah pada
gejala infeksi megalocytivirus. Ikan yang telah menunjukkan gejala kemudian
diambil dan dilakukan prosedur pengambilan dan preservasi.
Prosedur pooling sampel dapat dilakukan berbasis kolam, dengan
cara ikan dari tiap kolam dilakukan ekstraksi DNA, selanjutnya dibuat pool
Petunjuk Teknis Surveilan Megalocytivirus pada Ikan Hias Air Tawar dan Laut 18
untuk kemudian dilakukan pemeriksanaan qPCR. Pooling untuk farm
dilakukan seperti halnya pooling ikan perkolam, dengan cara ikan dari setiap
kolam dilakukan ekstraksi DNA, kemudian dilakukan pemeriksaan kualitas
dan kuantitas DNA, selanjutnya dilakukan pooling farm.
Gambar 4. Diagram Sistem Pooling Sampel untuk qPCR
qPCR
Laporan Hasil Uji (LHU)
Petunjuk Teknis Surveilan Megalocytivirus pada Ikan Hias Air Tawar dan Laut 19
BAB IV
EVALUASI DAN PELAPORAN SURVEILAN MEGALOCYTIVIRUS
4. 1. Format Pelaporan
UPT KIPM dan UPT DJPB yang telah selesai melaksanakan kegiatan
surveilan dan telah selesai Laporan Hasil Ujinya, segera membuat laporan
kegiatan. Hasil surveilan Megalocytivirus dilaporkan menggunakan format
Lampiran 1.
4. 2. Mekanisme Pelaporan
Laporan hasil pelaksanaan kegiatan disampaikan dalam bentuk soft
copy dan ditujukan ke Kepala Pusat Karantina dan Keamanan Hayati Ikan
dengan alamat email: [email protected], dan ke Direktorat
Kesehatan Ikan dan Lingkungan dengan email:
[email protected]. Sedangkan Laporan dalam bentuk
hardcopy (CD) dikirim melalui alamat:
Pusat Karantina dan Keamanan Hayati Ikan,
Badan Karantina Ikan, Pengendalian Mutu dan Keamanan Hasil Perikanan
Gedung Mina Bahari II Lantai 6
Jl. Medan Merdeka Timur No. 16, Jakarta Pusat
Jakarta 10110
Direktorat Kesehatan Ikan dan Lingkungan,
Direktorat Jenderal Perikanan Budidaya
Gedung Mina Bahari IV Lantai 7
Jl. Medan Merdeka Timur No. 16, Jakarta Pusat
Jakarta 10110
Petunjuk Teknis Surveilan Megalocytivirus pada Ikan Hias Air Tawar dan Laut 20
4. 3. Waktu Pelaporan
Laporan pelaksanaan surveilan Megalocytivirus disampaikan ke Pusat
Karantina dan Keamanan Hayati Ikan dan Direktorat Kesehatan Ikan dan
Lingkungan dengan ketentuan :
1. Per-kegiatan surveilan Megalocytivirus, selambat-lambatnya 1 (satu)
minggu sebelum digunakan sebagai dasar penerbitan Health
Certificate;
2. Akhir pelaksanaan kegiatan surveilan Megalocytivirus (tahunan),
selambat-lambatnya 1 (satu) minggu sebelum akhir tahun.
Petunjuk Teknis Surveilan Megalocytivirus pada Ikan Hias Air Tawar dan Laut 21
BAB V
PENUTUP
Kegiatan surveilan Megalocytivirus memerlukan dukungan
sumberdaya manusia, sarana, prasarana dan dana yang memadai serta
dilakukan secara terpadu dengan melibatkan semua komponen tim, baik
pusat, unit pelaksana teknis, para pakar/ahli penyakit ikan serta
pembudidaya. Untuk itu kegiatan surveilan Megalocytivirus memerlukan
adanya petunjuk teknis serta kebijakan yang integratif.
Dengan tersusunnya Petunjuk Teknis Surveilan Megalocytivirus pada
Ikan Hias Tawar dan Laut ini, diharapkan pelaksanaan kegiatan surveilan
yang dilaksanakan oleh Tim Surveilan dapat lebih terukur, terarah, dan
hasilnya dapat dipertanggung jawabkan secara ilmiah.
Petunjuk Teknis Surveilan Megalocytivirus pada Ikan Hias Air Tawar dan Laut 22
DAFTAR PUSTAKA
Abidin, L.O.B., 2013, Deteksi Molekuler Megalocytivirus pada Ikan Budidaya
dengan Metode Polymerase Chain Reaction-Restriction Fragment
Length Polymorphism. Tesis Program Studi Bioteknologi Sekolah
Pascasarjana UGM. Yogyakarta.
Andrew M. Q. King, Michael J Adams, Eric B. Carstens and Elliot J. Lefkowitz.,
2012. Virus Taxonomy. Ninth Report of the International Committee on
Taxonomy of Viruses. International Union of Microbiological Societies.
Virology Division. Elsevier Academic Press.
Cameron, A. R. 1999. Survey Toolbox. A Practical Mannual and Software
Package for Active Surveillance of Livestock Disease in Developing
Countries. Monograph. Vol. 54. ACIAR, Australian Center for
International Agricultural Research.
Chao, C.B., C.Y. Chen, Y.Y.Lai, C.S. Lin and H.T. Huang. 2004. Histological,Ultrastructural, and in situ Hybridization Study on Enlarged Cells inGrouper Ephinephelus Hybrids Infected by Grouper Iridovirus in Taiwan(TGIV). Dis. Aquat. Org., 58:127-142
Chinchar VG, Essbauer S, He JG, Hyatt A, Miyazaki T, Seligy V, Williams T(2005). "Family Iridoviridae 145-162. In Fauquet CM, Mayo MA, ManiloffJ, Desselburger U, Ball LA (eds). Virus Taxonomy, Eighth report of theInternational Committee on Taxonomy of Viruses. Academic Press,San Diego, USA
Corsin, F., M. Georgiadis, K. L. Hammell, B. Hill. 2009. Guide fo Aquatic Animal
Health Surveillance. Published by The World Organization for Animal
Health (OIE)
Mahardika, K., I. Koesharyani, K. Sugama, A. Priyono and K. Yuasa. 2001.Histopathological Study of Iridovirus Infection in Epinephelus coioidesand Epinephelus bleekeri. In: Sugama K, Ikenou H, Kawahara S(eds)Proceedings of Mariculture Technology and Sea FarmingDevelopment. Jakarta, Indonesia. Japan International CooperationAgency, Jakarta, P 334-341.
Mahardika, K., I. Koesharyan, A. Prijono and K. Yuasa. 2003. Infeksi Iridoviruspada Induk Kerapu Lumpur (Epinephelus coioides) Jurnal PenelitianPerikanan Indonesia. Edisi Akuakultur, 9 (1): (11-15).
Mahardika, K., Zafran, A. Yamamoto, and T. Miyazaki. 2004a. Susceptibility ofJuvenile Humpback Grouper (Cromileptes altivelis) to Grouper SleepyDisease Iridovirus (GSDIV). Dis Aquat Org. 59:1-9.
Petunjuk Teknis Surveilan Megalocytivirus pada Ikan Hias Air Tawar dan Laut 23
Mahardika, K., I. Koesharyani and Zafran. 2004b. Uji Kerentanan Ikan KerapuLumpur, Epinephelus coioides dan Kerapu Batik, Epinephleusmicrodon terhadap Infeksi Iridovirus. Jurnal Penelitian PerikananIndonesia, Edisi Akuakultur, 10 (2): 83-88.
Mahardika, K., Haryanti, A. Muzaki and T. Miyazaki. 2008. Histopathologicaland Ultrastructural Features of Enlarged Cells of Humpback GrouperCromileptes altivelis Challenged with Megalicytivirus (FamilyIridoviridae) after Vaccination. Dis. Aquat. Org., 79: 163-167.
Mahardika, K., and T. Miyazaki. 2009a. Electron Microccopic Features ofCulture Grunt Fin Cells Infected with Megalocytivirus. Aquaculture Sci.,57 (1): 9-18.
Mahardika, K. A. Muzaki and K. Suwirya. 2009b. Pathogenecity of GrouperSleepy Disease Iridovirus (GSDIV: Megalocytivirus, Family Iridovirdae) toCoral Trout Grouper Plectrophomus leopardus. IndonesianAquaculture Journal, 4 (2): 121-130.
Mahardika, K. I. Mastuti and Haryanti. In Pres. Effectivity of Inactive GSDIV(Grouper Sleepy Disease Iridovirus) Vaccine in Grouper Fish(Cromileptes altivelis and Epinephleus fuscoguttatus) Against GSDIVInfection. Indonesia Aquiaculture Journal, 27.
Martin, S. W. A. H. Meek, P. Willberg. 1987. Veterinary Epidemiology, Principles
and Methods. Iowa State Univeristy Press/Ames. Pp.: 24-27.
Mastuti, I., Y.N. Asih and K. Mahardika. 2010. Quantitative HistopathologicalAnalysis of Enlarged Cells Derived from Humpback Grouper.Cromileptes altivelis Infected with Grouper Sleepy Disease Iridovirus(GSDIV). Indonesian Aquaculture Journal, (2): 91-100.
Miyazaki, T. 2007. Color Atlas of Fish Histopathology, Vol.2. Shin-SuisanShimbun-Sha, Tokyo, Japan, P 325-335.
Nolan D1, Stephens F, Crockford M, Jones JB, STidakw M. 2014. Detection and
Characterization of Viruses of the Genus Megalocytivirus in
Ornamental Fish Imported into an Australian Border Quarantine
Premises: an Emerging Risk to National Biosecurity. J Fish Dis 2014 Jan
30. doi: 10.1111/jfd.12222.
Owen, L., 1993. Report On Sleepy Grouper Disease. Deprt. of Biomedical andTropical Veterinary Science, James Cook Univ. of North QueenslandTownville, Austalia. 4811
Petrie, A and Watson, P. 2006. Statistics for Veterinary and Animal Science.
Blackwell Publishing. Hongkong.
Petunjuk Teknis Surveilan Megalocytivirus pada Ikan Hias Air Tawar dan Laut 24
Rimmer, A.E., Joy A. Becker, Alison Tweedie, Richard J. Whittington. 2014.
Development of a Quantitative Polymerase Chain Reaction (Qpcr)
Assay for the Detection of Dwarf Gourami Iridovirus (DGIV) and Other
Megalocytiviruses and Comparison with the Office International des
Epizooties (OIE) Reference PCR Protocol. Aquaculture 358–359 (2012)
155–163.
Subramaniam K., Shariff M., Omar A.R., and Hair-Bejo M.: Megalocytivirus
Infection in Fish. Rev. Aquaculture 2012; 4: pp. 221-233
Sudthongkong, C., M. Miyata and T. Miyazaki. 2002. Iridovirus Disease in TwoOrnamental Tropical Freshwater Fishes: African Lampeye and DwarfGourami. Dis Aquat Org, 48:163-173.
Sung, C., Chi, S., Huang, K., and Lu, J., 2010, Rapid Detection of Grouper
Iridovirus by Loop-mediated Isothermal Amplification. J. Marine Syst.,
18: 568-573.
Thrusfield M. 2007. Veterinary Epidemiology. 2nd edition. Blackwell, London.
Yanong RPE, Waltzek TB (2010). "Megalocytivirus Infections in Fish, withEmphasis on Ornamental Species." University of Florida Institute ofFood and Agricultural Sciences Extension
Petunjuk Teknis Surveilan Megalocytivirus pada Ikan Hias Air Tawar dan Laut 25
Lampiran 1. Pencatatan dan Pelabelan
Semua data terkait dengan sampel dicatat secara lengkap sejarah
spesimen (ikan sampel) pada saat pengumpulan:
a) Pengamatan gejala klinis di lapangan seperti data dasar (nama
pemilik, alamat, pendidikan), spesies yang ikan yang dibudidayakan,
umur, ukuran, asal (liar, budidaya, nomor farm, kolam dll.),
b) Semua catatan lain yang diperlukan (kuesioner).
Pelabelan harus disertakan bersama spesimen selama fiksasi, penyimpanan
dan transportasi ke laboratorium.
Selalu menggunakan pensil 2B dan dicatat pada label yang tahan air,
jangan menggunakan balpoint karena akan larut dalam alkohol.
Gambar 5. Sampel dimasukkan dalam botol jenis PE dan pelabelan
menggunakan pensil 2B pada kertas yang direndam dalam
larutan alkohol 80% atau fiksatif.
Petunjuk Teknis Surveilan Megalocytivirus pada Ikan Hias Air Tawar dan Laut 26
Lampiran 2. Kuesioner
Faktor risiko terkait terjadinya wabah Megalocytivirus adalah melalui
informasi dari kuesioner. Kuesioner dikembangkan untuk mendapatkan data
sekunder terkait dengan identitas pembudidaya, sumber benih ikan, aspek
biosekuriti yang dilakukan oleh pembudidaya, aspek biosekuriti yang
dilakukan oleh pengepul (second man), dan aspek biosekuriti yang
dilakukan di pihak eksportir.
Informasi terkait dengan data dasar meliputi nama pembudidaya,
alamat tempat berbudidaya, asal mendapatkan benih, telur atau induk,
biosekuriti yang dilakukan oleh pembudidaya terkait dengan sumber air dan
perlakuan air, cara isolasi terhadap pengaruh luar atau sumber infeksi dll.
Selain itu juga data kemana ikan yang dihasilkan dijual.
Biosekuriti di tingkal pengepul (second man) berisi tentang nama,
alamat domisili, fasilitas, teknik biosekuriti, asal mereka mendapatkan ikan,
perlakuan selama pemeliharaan di tingkat pengepul, seperti pemberian
pakan (jenis, dosis), obat yang digunakan, kejadian kematian selama
karantina dan target pemasaran.
Informasi di tingkat eksportir adalah tentang nama dan alamat domisili
perusahaan, informasi dari mana mereka mendapatkan pasokan ikan,
fasilitas penampungan ikan, biosekuriti yang dilakukan, perlakuan selama
penampungan, seperti jenis pakan dan obat-obatan yang digunakan,
apakah terjadi kematian, dan negara target ekspor.
Petunjuk Teknis Surveilan Megalocytivirus pada Ikan Hias Air Tawar dan Laut 27
Data Kuesioner
Nama
Pewawancara
Tanggal Data
ID
Provinsi Kabupaten
Kecamatan Desa
Farm ID Pemilik
Farm
Jenis
kelamin
o M
o F
Usia
(thn)
Nomor yang
Bisa Dihubungi
Berapa kolam yang
dimiliki
Dari mana sumber
air untuk kolamnya
o Air sungai
o Air sumur
o Lain2 (sebutkan)
Tipe pengelolaan air
yang digunakan
o Air dari sumber langsung digunakan tanpa perlakuan
o Air disterilkan dengan bahan desinkfektan (sebutkanjenis, dosis)
o Air ditampung dalam tandon
Sistem pembuangan
limbah
o Dibuang langsung ke perairan umum
o Ditampung dalam petak penampungan dandiperlakukan dengan bahan kimia/desinfektan
o Limbah ditampung tanpa ditreatmen dan dibuanglangsung ke perairan umum
Tipe kolam o Bak semen
o Bak fiber
o Kolam lapis plastik
o Kolam tanah, tanah liat
o Lain-lain (Sebutkan)
Kehilangan air
harian
o <10%
o 10-30%
o >30%
Petunjuk Teknis Surveilan Megalocytivirus pada Ikan Hias Air Tawar dan Laut 28
Apakah digunakan
aertor di kolam?
o Ya
o Tidak
Tipe aerator o Kincir
o Blower
o AirO2
o Lain-lain (sebutkan)
Pengamatan
selama
pemeliharaan
o Air berbusa di permukaan
o Air berwarna kemerahan
o pH turun mendadak
o plankton blooming (warna)
Lokasi kolam
(koordinat GPS)
Apakah ada farm sekitar tempat usaha?, berapa jaraknya? o Ya
o Tidak
Informasi tentang kasus penyakit
atau kematian ikan di lokasi.
o Tidak ada
o Ada, jumlah besar (penyebab tidakdiketahui)
o Jenis penyakit, apabilaada....................................
Spesies ikan o ……….
o ……….
o ……….
Asal ikan o Wild stock
o Culture stock
Jenis pakan yang
digunakan?
o Ikan rucah
o Pakan buatan/pelet merek ....................................
o Lain-lain, sebutkan.............................................
Penyimpanan
pakan
o Cool storage
o DI simpan dengan cara tertentu,sebutkan...................................
Berapa lama
pakan disimpan
o Kurang dari 3 hari
o 3-7 hari
o >7 hari
Sumber
induk/telur/larva
Apakah ada pengecekan kesehatan? Ya tidak
DGIV RSIV
o Ya
o Tidak
o Ya
o Tidak
o o
o Ya
o Tidak
o Ya
o Tidak
o o
Petunjuk Teknis Surveilan Megalocytivirus pada Ikan Hias Air Tawar dan Laut 29
o Ya
o Tidak
o Ya
o Tidak
o o
Apakah ada
perlakuan
terhadap ikan
yang baru datang
o Ditampung di wadah terpisah
o Diinkubasi selama 3-7 hari
o Benih baru datang dilakukan treatmen,sebutkan..................
o Benih langsung ditebar di kolam
Apakah ada
kematian, berapa
persen
o Tidak
o Ya
o < % perhari
o 1-5 % perhari
Apakah ikan
menunjukkan
gejala klinis,
seperti berenang
tidak teratur
o Ya, berupa ………………..
o Tidak
Pembuangan
limbah
o Tidak membuang limbah
o Membuang limbah langsung ke perairan umum
o Limbah ditampung dan ditreatmen
Apakah ada
perlakuan khusus
bagi pengunjung
o Ada
o Tidak
Apakah farm
memiliki fasilitas
footbath
o Ada
o Tidak
Jumlah ikan yang
diambil untuk
sampel
Jumlah
kolam
disampel
........................., tanggal ...... bulan, ....tahun
Pewawancara Pemilik farm,
(Nama Terang) (Nama Terang)
*) Coret yang tidak perlu
Petunjuk Teknis Surveilan Megalocytivirus pada Ikan Hias Air Tawar dan Laut 30
Lampiran 3. Prosedur qPCR Menggunakan Hydrolysis Probe
1. Peralatan
- alat pengukur konsentrasi DNA berbasis spektrofotometri UV;
- freezer (-20°C atau lebih rendah);
- heating block atau waterbath;- laminar flow;- mesin real-time PCR;- mini mixer.- mikropipet berbagai ukuran 0,1 µl – 1 000 µl;- alat bedah pinset dan gunting;- rak blok es;- sentrifus;- mini sentrifus- peralatan gelas- timbangan analitik dengan ketelitian 0,1 mg.
2. Bahan
- bufer tris EDTA (TE) (konsentrasi 10 mM Tris HCl 1 mM EDTA pH 7,5 );
- nuclease-free water;
- etanol p.a;- filtered microtip berbagai ukuran 10 µl – 1 000 µl ;- isopropanol (2-propanol);- kloroform;- kit real-time PCR komersial compatible dengan TaqMan®probe;- larutan ekstraksi DNA komersial;- larutan penghambat DNAse;- masker;- penggerus jaringan (pellet pestle);- plasmid standar positif Megalocytivirus;- sarung tangan (powder-free);- 1 set primer dan probe (AAHL-CSIRO, 2013:
Primer RSIV RT F: 5’-TGACCAGCGAGTTCCTTGACTT-3’
Primer RSIV RT R: 5’-CATAGTCTGACCGTTGGTGATACC-3’
RSIV probe : 5’-6FAM AAC GCCTGCATGATGCCTGGC TAMRA-3’
- tabung mikro ukuran 0,2 ml; 1,5 ml – 2 ml;- tabung atau microplate PCR optikal ukuran 0,1 ml - 0,2 ml atau tabung
kapiler ukuran 20 µl - 100 µl.
CATATAN : Bahan disesuaikan dengan metode standar yang digunakan
Petunjuk Teknis Surveilan Megalocytivirus pada Ikan Hias Air Tawar dan Laut 31
3. Prosedur
3.1. Persiapan Contoh Uji
- Ikan ukuran kecil (kurang dari 1 cm), maka ambil contoh uji secara
utuh.
- Ikan ukuran sedang (ukuran 1 cm – 6 cm) makan ambil contoh uji
dari insang, hati dan limpa.
- Ikan ukuran besar (ukuran lebih dari 6 cm) ambil contoh uji dapat
dari insang, hati dan limpa baik segar maupun beku (-20°C) atau
yang sudah diawetkan dalam larutan preservatif DNA.
3.2. Ekstraksi DNA dengan Metode Presipitasi
- Masukkan 20 mg contoh uji ke dalam tabung mikro 1,5 ml.
- Tambahkan 600 µl larutan kit ekstraksi DNA komersial Dodecyl
trimethyl bromide-ammonium (DTAB), homogenkan menggunakan
penggerus pelet.
- Inkubasikan pada 75°C selama 5 menit , dan dinginkan pada 25°C.
- Tambahkan 700 µl kloroform.
- Tutup tabung mikro dan kocok dengan minimixer selama 20 detik
- Sentrifugasi contoh uji pada 12 000 x g selama 5 menit.
- Pindahkan 200 µl cairan lapisan paling atas ke dalam tabung mikro
baru.
- Tambahkan larutan kit ekstraksi Cetyl trimethylammonium bromide
(CTAB) sebanyak 100 µl dan ddH2O sebanyak 900 µl.
- Kocok dengan minimixer dan inkubasikan pada 75°C selama 5
menit,
- Sentrifugasi pada 12000 x g selama 5 menit, pindahkan cairan
bening ke dalam tabung mikro baru yang berisi 300 µl etanol 95%.
- Homogenkan dengan minimixer
- Sentrifugasi pada 12 000 x g selama 5 menit.
- Buang supernatan, cuci pelet dengan 200 µl etanol 75%,
sentrifugasi pada 7 500 xg selama 2 menit.
Petunjuk Teknis Surveilan Megalocytivirus pada Ikan Hias Air Tawar dan Laut 32
- Keringanginkan pelet DNA, larutkan pelet DNA dengan ddH2O
atau TE buffer.
- Simpan larutan DNA pada -20°C apabila segera digunakan dan
untuk penyimpanan lebih lama pada freezer dengan suhu yang
lebih rendah (<-40°C) dalam bentuk alikuot.
CATATAN : Prosedur metode ekstraksi DNA disesuaikan dengan kit
komersial yang digunakan
3.3. Pengukuran DNA
- Ukur konsentrasi DNA dengan alat pengukur konsentrasi DNA pada
panjang gelombang 260 nm.
- Periksa kemurnian DNA dengan menghitung perbandingan hasil
pengukuran absorbansi pada panjang gelombang 260 nm dan
280 nm (Å260/ Å280);
- Lakukan pengenceran apabila konsentrasi yang diperoleh lebih
tinggi dari yang diperlukan;
- Simpan larutan DNA pada -20°C apabila tidak langsung
digunakan.
3.4. Amplifikasi
- Cairkan DNA template, Quantitect 2x PCR Master Mix, primer,
probe, Nuclease-free water dengan meletakkan di atas rak blok es
- Buat preparasi master mix sesuai dengan Tabel 1. Siapkan volume
mastermix n+1, (n= setiap 10 jumlah reaksi) lebih banyak dari yang
dibutuhkan. Contoh uji minimal dianalisis secara duplo
- Homogenkan semua bahan master mix dan distribusikan ke
masing-masing tabung/plate PCR optikal.
- Masukkan 2 μl template DNA (10 ng - 100 ng) contoh uji, kontrol
positif ekstraksi; kontrol negatif ekstraksi, kontrol positif amplifikasi
Petunjuk Teknis Surveilan Megalocytivirus pada Ikan Hias Air Tawar dan Laut 33
(DNA); kontrol negatif amplifikasi (NTC); dan 4 standar positif (10
copies; 102 copies; 103 copies; 104 copies).
- Lakukan amplifikasi dengan real time PCR, dengan kondisi sesuai
Tabel 2.
CATATAN 1 Seluruh proses preparasi reagen dilakukan pada kondisi dingin.
CATATAN 2 Prosedur metode amplifikasi disesuaikan dengan kit komersial yang
digunakan.
CATATAN 3 Untuk kebutuhan diagnosis cepat dapat menggunakan kontrol positif
amplifikasi (DNA), 4 standar positif (10 copies; 102 copies; 103 copies; 104
copies) dan kontrol negatif amplifikasi (NTC).
Tabel 1 - Komposisi Koktail untuk qPCR
No. Komponen Volume/Reaksi (μl) Konsentrasi Akhir
1. Quantitect 2x PCR master mix 12,5 1 x
2. Primer Forward (20 μM) 0,5 0,4 μM
3. Primer Reverse (20 μM) 0,5 0,4 μM
4. Probe (10 μM) 0,5 0,2 μM
5. DNAase free water 9 -
6. DNA Template 2 10 ng-100 ng
Total Volume 25
CATATAN komposisi koktail disesuaikan dengan kit komersial yang digunakan
dan sudah divalidasi
Tabel 2 - Program Amplifikasi
Proses Suhu (oC) Waktu Siklus
enzyme activation 50 2 menit 1
PCR initial activation 95 15 menit 1
Denaturasi 95 15 detik40
Annealing/extention 60 60 detik
CATATAN Profil amplifikasi disesuaikan dengan manual kit dan mesin
real time PCR yang digunakan
Petunjuk Teknis Surveilan Megalocytivirus pada Ikan Hias Air Tawar dan Laut 34
3.5. Interpretasi hasil
Analisis data sesuai dengan software real-time PCR yang digunakan.
a) Pengamatan setelah analisis data amplifikasi
Interpretasi kurva amplifikasi adalah sebagai berikut:
- contoh uji dinyatakan positif apabila terlihat naiknya kurva di atas
garis threshold/cut off dan nilai Ct lebih kecil atau sama dengan
LoD.
- semakin cepat naik/munculnya kurva dan memotong garis
threshold/cut off menunjukkan jumlah copy DNA virus yang
semakin banyak (konsentrasinya tinggi)
- contoh uji dinyatakan negatif apabila berada dibawah garis
threshold/cut off dan nilai Ct lebih besar dari LoD dengan tingkat
kepercayaan (confident level) 95%.
b) Kuantifikasi copy virus
- Jumlah copy virus dapat dilihat pada tabel laporan kuantifikasi di
perangkat lunak komputer yang terhubung dengan mesin real-
time PCR yang digunakan.
- Kurva Standar disajikan pada gambar 1 dan tabel 3
- Berdasarkan Tabel 4 hasil pengujian dapat dianalisis sebagai
berikut :
1) contoh uji dinyatakan positif apabila konsentrasi sama atau
lebih dari nilai LoD 10 copies (B1 dan B2, C1 dan C2)
2) contoh uji dinyatakan negatif apabila nilai konsentrasi kurang
dari nilai LoD 10 copies (A1 dan A2 ).
Petunjuk Teknis Surveilan Megalocytivirus pada Ikan Hias Air Tawar dan Laut 35
Kurva Standar
Gambar 6 – Kurva standar
Petunjuk Teknis Surveilan Megalocytivirus pada Ikan Hias Air Tawar dan Laut 36
Tabel 3 - Keterangan Gambar Kurva Standar Hasil Amplifikasi Real Time
No. Colour Name Type Ct Given Conc(copies/ul)
Calc Conc(copies/ul)
% Var
1 Standar Megalocytivirus 10^4 (1) Standard 26.34 10,000.0 13,206.3 32.1%
2 Standar Megalocytivirus 10^4 (2) Standard 26.37 10,000.0 12,970.7 29.7%
3 Standar Megalocytivirus 10^3 (1) Standard 30.48 1,000.0 655.8 34.4%
4 Standar Megalocytivirus 10^3 (2) Standard 30.30 1,000.0 748.9 25.1%
5 Standar Megalocytivirus 10^2 (1) Standard 33.61 100.0 68.1 31.9%
6 Standar Megalocytivirus 10^2 (1) Standard 32.82 100.0 121.0 21.0%
7 Standar Megalocytivirus 10^1 (1) Standard 36.01 10.0 12.0 20.0%
8 Standar Megalocytivirus 10^ 1(2) Standard 36.00 10.0 12.0 20.1%
9 Sampel negatif amplifikasi (1) NTC
10 Sampel negatif amplifikasi (2) NTC
Petunjuk Teknis Surveilan Megalocytivirus pada Ikan Hias Air Tawar dan Laut 37
Kurva Hasil Pengujian Sampel
Gambar 7 – Kurva Pengujian Sampel
Petunjuk Teknis Surveilan Megalocytivirus pada Ikan Hias Air Tawar dan Laut 38
Tabel 4 - Keterangan Gambar Pengujian Sampel Hasil AmplifikasiReal Time
No. Colour Name Type CtGiven Conc
(copies/ul)
Calc Conc
(copies/ul)% Var
1 Standar Megalocytivirus 10^4 (1) Standard 26.34 10,000.0 13,206.3 32.1%
2 Standar Megalocytivirus 10^4 (2) Standard 26.37 10,000.0 12,970.7 29.7%
3 Standar Megalocytivirus 10^3 (1) Standard 30.48 1,000.0 655.8 34.4%
4 Standar Megalocytivirus 10^3 (2) Standard 30.30 1,000.0 748.9 25.1%
5 Standar Megalocytivirus 10^2 (1) Standard 33.61 100.0 68.1 31.9%
6 Standar Megalocytivirus 10^2 (1) Standard 32.82 100.0 121.0 21.0%
7 Standar Megalocytivirus 10^1 (1) Standard 36.01 10.0 12.0 20.0%
8 Standar Megalocytivirus 10^ 1(2) Standard 36.00 10.0 12.0 20.1%
9 Contoh Uji A (1) Unknown 37.48 4.1
10 Contoh Uji A (2) Unknown 37.96 2.9
11 Contoh Uji B (1) Unknown 35.41 18.5
12 Contoh Uji B (2) Unknown 35.79 14.0
13 Contoh Uji C (1) Unknown 26.44 12,284.3
14 Contoh Uji C (2) Unknown 26.11 15,646.6
15 Sampel negatif amplifikasi (1) NTC
16 Sampel negatif amplifikasi (2) NTC
17 Sampel negatif ekstraksi (1) NTC
18 Sampel negatif ekstraksi (2) NTC
Petunjuk Teknis Surveilan Megalocytivirus pada Ikan Hias Air Tawar dan Laut 39
4. Jaminan Mutu Pengujian
- Proses ekstraksi DNA dijamin kualitasnya dengan menyertakan
kontrol positif ekstraksi (positive extraction control, PEC) dan kontrol
negatif ekstraksi (NEC) dan menunjukkan hasil yang konsisten atau
dengan menggunakan reference gene.
- Hasil ekstraksi DNA mempunyai rasio A 260/ A280 berkisar 1,8 – 2,0
- Proses amplifikasi dijamin kualitasnya dengan menyertakan kontrol
positif amplifikasi (positive amplification control, PAC) dan kontrol
negatif amplifikasi (NAC) menunjukkan hasil yang konsisten.
- Efisiensi amplifikasi dinyatakan baik apabila mempunyai nilai 0,9 –1,1.
- Proses real time PCR valid bila dilihat dari kurva standar dengan nilai
koefisien determinasi (R2 ) > 0,95.
- Keterulangan (Repeatability) untuk pengujian duplo harus
mempunyai nilai standar deviasi (SD) Ct lebih kecil dari 0,5.
CATATAN Jika ditampilkan sebagai persentase variabilitas (% Var), maka
pengujian duplo harus mempunyai nilai SD Cq lebih kecil dari 50%.
Petunjuk Teknis Surveilan Megalocytivirus pada Ikan Hias Air Tawar dan Laut 40
Lampiran 4. Deteksi Megalocytivirus (RSIV, ISKNV, DGIV) Menggunakan PCR
Double Step (Nested) ( Rimmer, et al 2012)
1. Alat : Daftar Alat yang Diperlukan
- Timbangan Analitik
- Autoclave
- Glassware
- Dissecting set
- Mikropipet (0,1-3 μl, 0,5-10 μl, 10-100 μl, 20-200 μl dan 100-1000 μl)
- Hot plate and stirer
- Vortex mixer
- Thermal block atau oven incubator
- pH meter
- Laminary Air Flow Cabinet
- Deep freezer
- Refrigerator
- Mini Centrifuge
- Gel elektrophoresis chamber
- Thermal Cycler (mesin PCR)
- Gel Documentation System (UV Doc)
- PCR Cooler Block
2. Bahan : Daftar Bahan yang Diperlukan
- Bahan ekstraksi DNA
- Mikrotube (1,5 ml, 0,5 ml, 0,2 ml)
- Mikrotip (10-100 μl, 100-1000 μl, 1000 μl)
- Agarosa
- DNA Ladder (100 bp)
- Hot-StarTaq Master Mix (Qiagen)/Gotaq Green® Master mix.
- TE-buffer (Tris-EDTA Buffer)
- Nuclease-free water (NFW)
- SYBR Safe DNA Gel Stain
- Kontrol Positif Megalocytivirus
- Primer (table 5)
*Penyimpanan reagen suhu - 20°C
Petunjuk Teknis Surveilan Megalocytivirus pada Ikan Hias Air Tawar dan Laut 41
Table 5. Primer yang Digunakan pada Uji Megalocytivirus
Amplifikasi Sequence PrimerTarget Produk
PCR
First
F: C1105 (5’- GGGTTCATCGACATCTCCGCG - 3’ )
430 bp
F: C1106 (5’- AGGTCGCTGCGCATGCCAATC - 3’)
Nested
F: C1073 (5’- AATGCCGTGACCTACTTTGC - 3’)
167 bp
R: C1074 (5’- GATCTTAACACGCAGCCACA - 3’)
3. Prosedur Kerja
Ekstraksi (DNA)*
- Keringkan spesimen menggunakan tissue steril.
- Timbang sejumlah 20 miligram.
- Masukkan ke dalam tabung mikro steril berukuran 1,5 ml, lalu beri
600 μl reagen DTAB.
- Haluskan spesimen menggunakan pestle.
- Inkubasi pada 75oC selama 5 menit. Setelah selesai dinginkan
tabung mikro sampai suhu ruang.
- Tambahkan 700 mikroliter kloroform ke dalam tabung mikro.
- Vorteks selama 10 detik.
- Sentrifugasi pada 12 000 rpm selama 5 menit.
- Pindahkan cairan bening yang terdapat di bagian atas tabung
mikro ke dalam tabung mikro yang baru.
- Tambahkan 100 μl reagen CTAB dan 900 μl dd. H2O ke dalam
tabung mikro yang baru (poin 9).
- Vorteks selama 10 detik.
- Inkubasi pada 75oC selama 5 menit. Setelah selesai, turunkan suhu
tabung sampai suhu ruang.
- Sentrifugasi pada 12 000 rpm selama 10 menit.
Petunjuk Teknis Surveilan Megalocytivirus pada Ikan Hias Air Tawar dan Laut 42
- Buang supernatan dengan hati-hati agar pelet tidak ikut
terbuang.
- Larutkan pelet menggunakan 150 μl reagen Dissolve Solution.
- Inkubasi pada 75oC selama 5 menit. Setelah selesai, turunkan suhu
tabung mikro sampai suhu ruang.
- Sentrifugasi pada 12 000 rpm selama 5 menit.
- Pindahkan cairan bening di bagian atas tabung mikro ke dalam
tabung mikro yang baru.
- Tambahkan 300 µl Ethanol PA 95%.
- Vorteks selama 10 detik.
- Sentrifugasi pada 12 000 rpm selama 5 menit.
- Buang supernatan, lalu keringkan pelet dengan cara membalik
tabung di atas kertas tissue steril.
- Tambahkan TE Buffer sebanyak 100 µl
- Simpan pada suhu -200C sampai akan digunakan dalam
amplifikasi.
* Dapat menggunakan ekstrasi DNA lainnya.
3.1. First Step
- Buat master mix berisi campuran primer C1105(F), C1106 (R),
Go Taq Green, NFW ditambah 2 kontrol (+/-) untuk first step.
- Beri label pada microtube 0.2 ml sesuai dengan kebutuhan
sampel dan kontrol.
- Siapkan volume master mix (n+1, n= jumlah reaksi) lebih
banyak dari volume yang dibutuhkan dengan formulasi.
Komposisi reagen untuk setiap proses amplifikasi dapat di
lihat pada tabel di bawah ini :
Petunjuk Teknis Surveilan Megalocytivirus pada Ikan Hias Air Tawar dan Laut 43
Table 6. Komposisi Mastermix PCR
Komponen Volume (µl)
10µ M F 1
10µ M R 1
Go Taq Green 12.5
Template (DNA)* 4
NFW 6.5
Total Per Reaksi 25
- Distribusikan master mix pada tiap tabung reaksi @ 21
mikroliter
- Template DNA dan control negative berupa NFW
dimasukkan sebanyak 4 mikroliter/reaksi kecuali control
positive.
- Amplifikasi dalam mesin PCR sesuai profil amplifikasi first step
Megalocityvirus seperti table dibawah ini.
Tabel 7. Profil Amplifikasi First PCR
Siklus Temperature Waktu
1 950 C 15 menit
30940 C 30 detik
55 30 detik
720 C 1 menit
1 720 C 7menit
Ukuran Amplicon 430 bp
3.2. Nested
Cara Kerja
- Primer C1073 (F), C1074 (R), Go Taq Green, dan NFW
dicampurkan sama dengan jumlah pada reaksi awal.
- Beri label pada microtube 0.2 ml sesuai dengan kebutuhan
sampel dan kontrol.
Petunjuk Teknis Surveilan Megalocytivirus pada Ikan Hias Air Tawar dan Laut 44
- Master mix disiapkan dengan volume (n+1, n= jumlah reaksi)
lebih banyak dari volume yang dibutuhkan kemudian master
mix didistribusikan pada tiap tabung reaksi @ 23 µl. Komposisi
reagen pada proses amplifikasi dapat dilihat pada tabel di
bawah ini :
Tabel 8. Komposisi Mastermix Nested PCR
Komponen Volume (µl)
10µ M F 1
10µ M R 1
Go Taq Green 12.5
Template (DNA)* 2
NFW 8.5
Total Per Reaksi 25*
- Amplikon pada reaksi awal dimasukkan sebanyak @ 2µl/
reaksi.
- Amplifikasi dalam mesin PCR sesuai profil amplifikasi nested
Megalocityvirus pada tabel di bawah ini :
Tabel 9 Profil Amplifikasi nested PCR
Siklus Temperature Waktu
1 950 C 15 menit
30940 C 30 detik
55 30 detik
720 C 1 menit
1 720 C 7 menit
Ukuran Amplicon 167 bp
4. Deteksi Produk PCR
- Konsentrasi agarose 1,5% w/v dalam TAE 1x. Tambahkan
pewarna (SYBR Safe DNA /SYBR green) sebelum agar
dituang/dicetak.
- Masukkan secara beruntun marker/ladder, amplikon sampel,
dan control +/- ke dalam sumur gel sebanyak 8-15µl secara
perlahan. Volume disesuaikan dengan dalamnya lubang sumur.
Petunjuk Teknis Surveilan Megalocytivirus pada Ikan Hias Air Tawar dan Laut 45
- Elektroforesis dilakukan dengan kekuatan listrik 100-150 V selama
± 30 menit.
- Amati gel agar dibawah sinar UV untuk melihat visualisasi pita
DNA.
- Bandingkan berat molekul target dengan marker yang
digunakan.
- Dokumentasikan dengan UV Doc.
5. Intepretasi Hasil PCR
Pada First step PCR amplikon yang di elektroforesis dikatakan positif jika
terbaca atau terdapat pita tunggal pada 430 bp. Dan untuk nested
PCR dikatakan positif jika terbaca atau terdapat pita tunggal pada
167 bp.
6. Referensi :
Rimmer AE, Becker JA, Tweedie A, Whittington RJ (2012). Development
of a Quantitative Polymerase Chain Reaction (qPCR) Assay for
the Detection of Dwarf Gourami Iridoviruses (DGIV) and other
Megalocytiviruses and Comparison with the Office International
des Epizooties (OIE) Reference Protocol. Aquaculture 358-
359:155−163.
Mohr. Peter G, Nicholas J. G. Moody, Lynette M. Williams, John Hoad,
David M. Cummins, Kelly R. Davies, Mark StJ. Crane. 2015.
Molecular Confirmation of Infectious Spleen And Kidney Necrosis
Virus (ISKNV) in Farmed and Imported Ornamental Fish in
Australia. Diseases of Aquatic Organisms. Dis Aquat Org. Vol. 116:
103–110.
Petunjuk Teknis Surveilan Megalocytivirus pada Ikan Hias Air Tawar dan Laut 46
Lampiran 5. Format Laporan Surveilan Megalocytivirus
I. Judul
II. Latar Belakang
- Permasalahan terkait dengan penyakit, kerugian secara ekonomi- Perlunya dilakukan kegiatan surveilan- Target patogen- Target lokasi
III. Tujuan
IV. Output
V. Outcome
VI. Metode
- Analisa sampel- Jumlah dan cara pengambilan sampel- Analisa data- Implementasi pengambilan sampel, siapa pelaku, laboratorium
analisa, cara/prosedur data dikirimkan ke yang berkepentinganVII. Hasil dan Pembahasan
- Hasil analisa deskriptif kualitatif terkait dengan jumlah sampelmasuk, proporsi sampel, prevalensi penyakit
- Hasil analisa faktor risikoVIII. Kesimpulan dan saran
IX. Rekomendasi
- Tindak lanjut hasil surveilan- Cara pengendalian penyakit- Upaya menurunkan prevalensi dan penetapan area bebas
penyakit
47
Lampiran 6. Jadwal Pelaksanaan Surveilan Megalocytivirus
2015 2016 2017
Des Jan Feb Mart Apr Mei Jun Jul Agus Sep Okt Nov Des Jan Feb Mar Apr Mei Jun Jul Agus Sept Okt Nov
Surveilence 4 bln (2x)
E1 E2
S1 S2
survei 8 bln (2x)
E3 E3 E4 E4
S3 S4
Survei 12 bln (3 x)
E5 E5 E6 E6 E7 E7
S5 S6 S7
Survei 24 bulan (4 x)
E8 E8 E8 E9 E9 E9 E10 E10 E10
S8 S9 S10
PUSAT KARANTINA DAN KEAMANAN HAYATIJalan Medan Merdeka Timur No. 16Gedung Mina Bahari II Lantai 6 Jakarta Pusat 10110Telp.: (021)3513277, Faks.: (021) 3513275
DAN KEAMANAN HAYATI IKANJalan Medan Merdeka Timur No. 16Gedung Mina Bahari II Lantai 6 Jakarta Pusat 10110Telp.: (021)3513277, Faks.: (021) 3513275