乙乙乙乙 乙乙乙乙 YMDD YMDD 乙乙乙 乙乙乙 1896 1896 乙乙乙乙 乙乙乙乙 乙乙乙 乙乙乙
Jan 03, 2016
乙肝病毒乙肝病毒 YMDDYMDD 变变异和异和 18961896 位点变异位点变异
的检测的检测
病毒变异是生物遗传进化的基本因素之一。乙型肝炎病毒( HBV )变异是在慢性感染过程中为适应生存环境而自然发生的,也可发生于应用药物或接种疫苗后。已发现 HBV 序列的变异在基因组各个区域均可发生。
通常把病毒株分为野毒株( wide strain )和变异株( variation strain )。变异株即发生了突变、插入或缺失、移框突变等变异的病毒株。一些变异株对临床预后和病毒学反应具有重要意义 。
乙肝病毒常见的变异:乙肝病毒常见的变异:前 C/C 基因变异 :
1896 位的变异和 1899 位的变异P 基因变异 :
拉米呋啶引起 YMDD 变异X 基因的变异前 S/S 基因变异
乙肝病毒乙肝病毒 YMDDYMDD 变变异异
是由于长期使用拉米呋啶 (Lamivudine, LAM) 做抗乙肝病
毒治疗 , 使 HBV P 区编码的DNA 聚合酶基因在 739 或 741位点发生突变 , 其编码的 HBV逆转录酶活性部位 YMDD 发生了改变。
YMDDYMDD 变异通常有变异通常有 22 种形式种形式 ::
一种为 P 区 741 位鸟嘌呤被胸腺嘧啶取代 (G→T) ,则其编码的 550 位的蛋氨酸变为亮氨酸 (YMDD→YIDD);
另一种为第 739 位腺嘌呤被鸟嘌呤取代 (A→G) ,则其编码的 550 位的蛋氨酸变为缬氨酸 (YMDD→YVDD )。
YMDDYMDD 变异的意义变异的意义 ::
YMDD 结构域是 HBV 进行逆转录的生物活性部位,也恰恰是拉米夫定干扰 HBV 复制的药物结合位点,这 2 种变异均导致了拉米夫定与多聚酶亲合力的下降或消失 ,而导致对拉米夫定的耐药。体外实验证实, YMDD 变异株对拉米夫定的敏感性降低为野生株的万分之一 。
YMDDYMDD 变异的检测变异的检测
使用试剂:使用试剂: 杭州博赛基因诊断技术有限
公司的“乙型肝炎病毒核酸荧光定量检测及 YMDD 变异检测试剂盒”。于 2005 年 7 月中旬获得国家药监局授予的新药证书。国药证字 S20050052 。
该产品有以下优点该产品有以下优点1. 国内唯一一款获得批准文号的检测
YMDD 变异诊断试剂;2. 国内唯一一款实现 HBV DNA 定量与
YMDD 变异双检功能的试剂;3. 闭管检测:直接在反应管中对 PCR 扩
增产物进行荧光数据采集和分析;4. 结果判断简捷、明确:通过双色荧光
通道检测所得 Ct 值可直接分辨出是否发生 YMDD 变异;
试验原理试验原理
采用乙型肝炎病毒特异引物,利用核酸扩增、荧光标记探针,结合 Taqman MGB 技术,对人血清或血浆中乙型肝炎病毒核酸( HBV DNA )定量检测,同时对 YMDD 位点变异进行检测。
操作步骤操作步骤1.样本采集:抽取病人静脉血
2.0ml ,取血清 0.2ml送检。血清标本在 2~8℃可放置 72小时, -70 ℃可长期保存,标本不宜反复冻融。
2.样本、对照品的处理和加样3.PCR 扩增4. 结果判断
结果判断结果判断Ct 值 结果判断
A 管 Ct > 38, B 管 Ct> 38
HBVDNA阴性
A 管 Ct≤38, B 管 Ct≤38 YMDD 野生型A 管 Ct≤38, B 管 Ct >38
YMDD 变异型
结果判断结果判断
蓝 :A 管曲线 红 :B 管曲线 野生型
结果判断结果判断
蓝 :A 管曲线 红 :B 管曲线 变异型
干扰素耐药的原因干扰素耐药的原因①免疫耐受:母婴垂直传播 HBV 感染后,机体免疫系统发育阶段与 HBV 感染相伴随,误将 HBV认作自身成分,而难以发挥排斥清除反应。
②病毒基因变异:主要是第 1896 位点变异,这种变异株对干扰素治疗不敏感。
③基因整合:病毒基因整合在细胞内,难以清除,可在停药后复制、表达,造成反跳和复发。
④干扰素抗体:机体可能对外源性的干扰素产生中和抗体,降低干扰素疗效。
前前 CC 区区 18961896 位点变位点变异异
是 HBV 中最常见的变异。 1896型突变株可逃逸机体的细胞免疫,干扰素治疗不敏感 , 增强病毒基因组的包装,病毒复制增强,致病性增加。迅速及时进行 A1896 位点突变检测,可以帮助医生诊断 HBeAg阴性是由于 HBV 突变还是一种康复表现。 帮助确定干扰素的治疗。
HBV1896HBV1896 位点变异检测位点变异检测
使用杭州博赛基因诊断技术有限公司的“乙型肝炎病毒 1896位点变异荧光 PCR 检测试剂”。其原理、操作与 YMDD 变异试剂基本相同。
结果判断结果判断Ct 值 结果判断
A 管 Ct > 38, B 管 Ct> 38
HBV阴性
A 管 Ct≤38, B 管Ct≤38
1896 野生型
A 管 Ct≤38, B 管 Ct >38
1896 变异型
2006 .09
谢
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