생체시료 분석법 validation

생체시료분석법 Validation

Bioanalytical Method Validation

생체시료분석법 Validation

Bioanalytical Method Validation

발 간 등 록 번 호

11-1470129-000073-01

머 리 말

생물학적동등성시험결과의 신뢰성을 확보하기 위해서는

생체시료분석에 이용된 분석법을 적절하게 Validation하는 절차가

필수적입니다. 미국 FDA의 의약품평가센터 (CDER)에서도 생체시료

분석법 Validation을 위한 일반적인 권장사항을 가이드로 제공하고

있으며, 생물학적동등성시험기관은 이 권장사항 중의 시험항목과

기준을 분석법 Validation을 위한 필수적 사항으로 채택하고, 철저하게

관리하고 있는 실정입니다.

이에 국립독성연구원 의약품동등성평가과에서는 미국 FDA의

가이드와 기타자료 등을 참조하여, 생체시료 분석법 Validation에

필수적인 항목을 대상으로 현실성있고 가장 적절한 운영 방안을

가이드로 제시하게 되었습니다. 본 가이드에는 생체시료 분석법의

Validation 항목과 허용기준 뿐만 아니라, 분석법 Validation시 유의할

사항 및 서류작성 방법 등에 대하여 자세하게 권장사항으로 기술하고

있습니다. 본 가이드를 활용하여 생체시료 분석법의 Validation 절차를

거침으로써 국내 생물학적동등성시험결과의 국제적 인정을 도모할 수

있으리라 사료됩니다.

끝으로 연구소 및 산업체에서는 본 가이드를 많이 활용하여 주시기

를 바라며, 생물학적동등성 업무에 대하여 관련 전문가들께서도 끊임

없는 관심과 협조를 해 주실 것을 부탁드립니다.

2003. 5.

국립독성연구원장 길광섭

목 차

1. 서론 ······································································································1

2. 분석법 Validation의 배경 및 종류 ··················································1

가. 전체 Validation ················································································2

나. 부분 Validation ················································································2

3. 표준품 ··································································································4

4. 분석법 개발 : 화학적 시험 ·······························································5

가. 특이성 ································································································5

나. 정확성, 정밀성과 회수율 ·······························································6

다. 검량선 ································································································7

라. 안정성 ································································································8

마. 분석법 Validation시 유의할 사항 ··············································10

바. 분석법 Validation에 관한 특별 권장사항 ································12

5. Validation된 분석법의 적용 ····························································15

분석 과정의 적합 기준 ·····································································17

6. 서류 ······································································································19

가. 요약 정보 ························································································19

나. 분석법 확립에 관한 문서작성 ····················································20

다. 일상적인 약물 분석에의 적용 ····················································21

라. 기타 정보 ························································································22

용어해설 ···································································································23

별첨 1. 부분 Validation시 요구되는 시험항목 예시 ····················27

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본 가이드는 미국 FDA CDER에서 2001년도 5월에 발표한

『Guidance for Industry : Bioanalytical Method Validation』

을 토대로 작성된 것이다.

1. 서론

본 가이드는 임상시험용의약품, 신약 및 후발의약품 등의 허가신

청을 위하여 인체를 대상으로 한 임상약리시험, 생체이용률시험, 생

물학적동등성시험시 사용된 생체시료 분석법의 Validation 절차 및

방법에 관한 정보를 제공한다.

본 가이드의 정보는 일반적으로 가스크로마토그래피 (Gas

Chromatography; GC), 고속액체크로마토그래피 (High-Pressure

Liquid Chromatography; LC), GC 혹은 LC와 질량분석기 (Mass

Spectrometer; MS)의 조합, 예를 들어 LC-MS, LC-MS-MS, GC-MS

그리고 GC-MS-MS에 의한 전혈, 혈청, 혈장 또는 뇨와 같은 생체시

료 중의 약물이나 그 대사체를 정량하는 생체시료 분석과정에 적용

된다.

본 가이드는 생체시료 분석법 Validation을 위한 일반적인 권장사

항이며, 권장사항은 사용되는 분석법의 형태에 따라 변형될 수 있다.

2. 분석법 Validation의 배경 및 종류

약물과 대사체를 정량 평가하기 위한 선택적이고 감도가 우수한

분석법을 확립하는 것은 전임상시험과 생물약제학적 그리고 임상약리

학적 연구를 성공적으로 수행하는 데 중요하다. 생체시료 분석법

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Validation은 전혈, 혈장, 혈청 혹은 뇨와 같은 생체시료중의 분석물질

을 정량 분석하는 데에 사용되는 특정 방법이, 믿을만하고 재현성이

있다는 것을 증명하는 모든 과정을 포함한다. 이러한 Validation을 위

한 기본적인 요소 (Parameters)로는 정확성, 정밀성, 선택성, 감도, 재

현성과 안정성이 포함된다. 분석법 Validation은 특정 실험실에서, 특

정 분석법이 적합하고 신뢰할 만하다는 것을 문서화하는 과정을 포함

하며, 분석결과를 채택하기 위해서는 분석법 Validation 기준에 적합해

야 한다.

공인된 분석방법은 실제 시험을 수행시 실험실의 특성에 적합하도

록 종종 변경되고, 이러한 변경된 분석법이 적합하다는 것을 보증하

기 위하여 Validation되어야 한다. 이미 Validation된 분석법을 변경

하는 경우 분석자는 부가적인 Validation이 어느 정도로 필요한 지

를 판단하여야 한다. 약물을 개발하는 과정에서 설정된 생체시료 분

석법은 수차례 변경되는데, 이러한 변경 이력과 여러 수준의 분석법

Validation을 통해 시험의 타당성이 입증된다. Validation의 종류와

수준은 다음과 같이 분류되어진다.

가. 전체 Validation

전체 Validation은 다음과 같은 경우에 실시한다.

생체시료 분석법 최초 개발시

신약 개발시

약물 대사체에 대한 분석이 이미 Validation된 정량시험법에 추

가되는 경우

나. 부분 Validation

부분 Validation은 이미 Validation되어진 생체시료 분석법을 변경한

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경우에 실시한다. 부분 Validation은 단지 일내 정확성 및 정밀성 시

험만 필요한 경우에서 거의 전체 Validation까지 필요한 경우가 있

다. 다음과 같은 경우 부분 Validation을 실시하나, 이에 한정되는

것은 아니다.

실험실 또는 시험자의 변경

분석법의 변경 (예. 검출기 변경)

생체시료 채취시 항응고제의 변경

같은 종에서 생체시료의 변경 (예. 사람 혈장에서 사람 뇨로 변

경)

시료의 전처리 과정의 변경

같은 생체시료의 종간 변경 (예. 랫드 혈장에서 마우스 혈장으로

변경)

해당 농도 범위의 변경

기기 혹은 소프트웨어 제어장치의 변경

시료 용량이 제한된 경우 (예. 소아과 연구)

희귀한 생체시료인 경우

타 약물의 공존시 분석물질의 특이성을 증명하는 경우

특정 타 대사체의 존재하에 분석물질의 특이성을 증명하는 경우

분석법이 변경되는 경우 변경 정도를 고려하여 분석법 Validation

수준을 결정해야 한다. 변경 정도에 따라 요구되는 분석법

Validation 수준의 예시는 본 가이드의 별첨 1에 수록하였으므로 참

고한다. 사람의 생체이용률, 생물학적동등성, 약물동태학 그리고 약

물 상호작용시험을 위한 생체시료 분석법은 생물학적동등성시험기준

등에 적합해야한다. 분석 실험실에는 완벽한 품질관리와 보증 체계

를 입증하기 위해 표준작업지침서 (Standard Operating Procedure;

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SOP)을 비치해야 한다. SOP에는 시료가 채취되어 실험실에 도착할

때부터 분석 결과가 보고될 때까지의 모든 내용이 수록되어야 한다.

SOP에는 또한 기록보존, 시료 보안 및 보관과정, 시료 전처리와 분

석 기법이 포함되어야 한다. 분석 기법이란 분석방법, 용매, 장비, 기

기, 품질관리 및 결과 확인 절차 등을 말한다.

특정 생체시료분석법을 개발하고 Validation한 후 일상적인 시료

분석에 이용하는 과정은 다음 세 가지로 나누어 볼 수 있다. (1) 표

준액 조제과정, (2) 생체시료분석법의 개발과 수행과정의 확립, (3)

Validation된 생체시료분석법을 일상적인 약물 분석과 분석배치

(Analytical Run or Batch)에 대한 적합 기준에 적용. 이 세 가지의

과정은 다음 장에서 기술하기로 한다.

3. 표준품

생체시료중의 약물과 그 대사체 분석시 검량선용 표준물질을 가한

시료 (Calibration Standards)와 품질관리시료 (Quality Control

Samples; QC 시료)를 이용하여 분석한다. 표준물질을 첨가한 생체시

료 (Spiked Samples)를 만드는데 사용하는 표준물질의 순도는 시험

결과에 영향을 미치므로, 동일성과 순도가 인증된 표준품을 가지고

기지 농도의 표준액을 조제해야 한다. 가능하다면 표준품이 분석물

질 (Analyte)과 동일해야 한다. 이것이 불가능하면 순도가 확인된 화

학 형태 (산․염기가 제거된 형태, 염 혹은 에스테르 형태)를 사용할

수 있다. 일반적으로 세 가지 종류의 표준물질이 사용된다. (1) 공인

된 표준물질 (예. USP 표준물질), (2) 평판 좋은 회사로부터 구입한

시판되는 표준물질, (3) 분석시험실 혹은 다른 비영리 단체에 의해

주문 합성된 순도가 입증된 기타 물질. 각 표준물질마다 제조원, 제

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조번호, 유효기한, 가능한 경우 성적서, 그리고 (혹은) 내부적 혹은

외부적으로 입증된 확인시험 및 순도시험자료가 구비되어야 한다.

4. 분석법 개발 : 화학적 시험

생체시료의 분석법 Validation을 위한 기본적인 요소들로는 정확

성, 정밀성, 특이성, 감도, 재현성, 그리고 안정성이다. 생체시료내 분

석물질별 측정 방법이 Validation되어야 한다. 또한, 생체시료내 분

석물질의 안정성이 평가되어야 한다. 생체시료 분석법을 개발하고

확립하는 과정에서 일반적으로 다음과 같은 사항에 대한 평가가 포

함된다. (1) 특이성, (2) 정확성, 정밀성, 회수율, (3) 검량선, (4) 시료

내 분석물질의 안정성.

가. 특이성

특이성은 생체시료내 다른 물질의 공존시 해당 분석물질을 분리하

고 정량하는 분석 능력을 말한다. 특이성 평가시 적당한 생체시료

(혈장, 뇨 등)의 공시료 분석을 최소 6가지 서로 다른 기원의 생체시

료 (예. 여섯 사람에서 채취한 생체시료)를 이용하여 수행하여야 한

다. 각 공시료에 대해서는 간섭시험을 수행하여야 하며, 특이성 평가

는 최저정량한계에서 수행되어야 한다.

생체시료내 존재 가능한 간섭물질로는 내인성물질, 대사체, 분해산

물 등이 있으며, 실제 연구시에는 병용투여 약물과 다른 외인성물질

등도 존재할 수 있다. 만약 해당 분석법이 한가지 이상의 분석물질

을 정량하고자 하는 경우 각 분석물질별로 간섭물질이 없음을 입증

하여야 한다.

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나. 정확성, 정밀성과 회수율

분석법의 정확성은 분석물질의 참값 (농도)에 대한, 분석법에 의해

얻어진 평균 시험결과의 근접성을 의미한다. 정확성은 기지량의 분

석물질을 함유한 시료를 반복적으로 분석함으로써 구해진다. 정확성

평가시 각 농도에 대해 최소 5번의 시험을 실시해야 한다. 예측 농

도 범위 내에서 최소 3가지 농도에 대해 시험하도록 권장한다. 평균

값은 최저정량한계를 제외하고는 실측값의 15%이내여야 하고, 최저

정량한계에서도 20%를 넘어서는 안된다. 참값으로부터의 평균치의

오차 정도로서 정확성을 평가한다.

분석법의 정밀성은 하나의 균질화된 생체시료로부터 취한 여러 개

의 등분체 (Aliquots)로 반복 분석하였을 때 분석물질에 대한 개개

측정치의 근접성을 의미한다. 정밀성 평가시 각 농도마다 최소 5번

의 시험을 실시해야 한다. 예측 농도 범위 내에서 최소 3가지 농도

에 대해 시험하도록 권장된다. 각 농도별로 측정된 정밀도는 변동계

수 (Coefficient of Variation; CV)가 15%를 초과해서는 안되며, 최저

정량한계에서는 CV가 20%를 넘지 않도록 한다. 정밀성은 더욱 세분

화되어 한 분석배치 시험시 정밀성을 평가하기 위한 시험내

(Within-run), 분석배치내 (Intra-batch) 정밀성 혹은 재현성과, 시간

경과시 정밀성을 평가하기 위한 시험간 (Between-run), 분석배치간

(Inter-batch) 정밀성 혹은 재현성으로 나뉘어 진다. 이때, 다른 시험

자, 다른 장비, 다른 용매, 그리고 실험실간의 정밀성도 포함되도록

시험해야 한다.

분석물질의 회수율은 생체시료에 분석물질을 가한 후 추출하여 얻

어진 시료의 검출반응과 기지 농도의 순수 표준물질의 검출반응을

비교한 값이다. 회수율은 분석법의 추출효율과도 관계된다. 회수율이

100%가 될 필요는 없지만 분석물질과 내부표준물질의 회수율은 일

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정하고 정밀하고 재현성이 있어야 한다. 회수율 시험은 세 가지 농

도 (저, 중, 고농도)에서 추출한 시료의 분석결과와 100% 회수를 의

미하는 추출하지 않은 표준물질과를 비교하여 수행한다.

다. 검량선

검량선은 기기의 반응과 분석물질의 기지농도와의 관계를 나타낸

다. 검량선은 시료중의 각 분석물질에 대해 작성되어야 한다. 농도와

반응간의 상관 관계를 결정하기 위해서 충분한 수의 표준물질이 사

용되어야 한다. 검량선은 분석하고자하는 검체와 동일한 생체시료에

기지농도의 분석물질을 가한 것을 시료로 하여 작성한다. 검량선을

작성하는 데에 사용되는 표준물질의 수는 분석치의 예상 범위와 분

석물질-반응 상관관계에 따라 결정된다. 표준물질의 농도는 각각의

연구에서 예상되는 농도 범위에 근거하여 선택해야 한다. 검량선은

공시료 (내부표준물질없이 시험한 생체시료), 제로시료 (내부표준물

질만을 넣고 시험한 생체시료), 그리고 최저정량한계를 포함해서 정

량 범위이내의 6 ～ 8 가지 농도에 내부표준물질을 가한 시료로 구

성된다.

(1) 최저정량한계 (Lower Limit of Quantification ; LLOQ)

다음의 조건이 충족될 때 검량선의 최저표준농도를 정량한계로

한다.

최저정량한계에서 분석물질의 반응이 공시료의 반응과 비교할

때 최소 5배 이상이다.

분석물질의 피크(반응)는 확인 가능하고 분리되어 있으며, 20%

이내의 정밀성과 80 ～ 120%의 정확성을 가진다.

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(2) 검량선/표준곡선/농도 대 반응

검량선으로는 농도와 반응의 관계를 적절히 기술하는 가장 간단

한 모델이 사용되어야 한다. 가중치를 두거나 복잡한 회귀방정식을

사용할 때는 타당성을 입증해야 한다. 검량선을 작성할 때는 다음

조건을 충족해야 한다.

최저정량한계에서 이론치와의 편차 20%이내

최저정량한계이외의 농도에서 이론치와의 편차 15%이내

최저정량한계와 최고정량한계를 포함하여 6 개의 표준농도 중 최

소 4 개의 농도가 위 기준에 적합해야 한다. 범위를 벗어난 표준농

도 측정치를 제외하고 검량선을 작성하였을 때 그 회귀방정식이 변

경되어서는 안된다.

라. 안정성

생체시료중의 약물의 안정성은 저장조건, 약물의 화학적 특성, 생

체시료, 그리고 저장체계 등에 따라 결정된다. 특정 생체시료나 저장

체계에서 분석물질의 안정성은 그 생체시료와 저장체계에만 관련되

며, 다른 생체시료나 저장체계와는 연관시키지 않아야 한다. 안정성

시험 과정은 장기보관 (설정된 보관 온도에서 냉동)과 단기보관 (실

험대위, 실온)한 후 및 냉․해동 주기 (Freeze-Thaw Cycle)를 거친

후 시료를 채취하고 취급하는 동안 분석 물질의 안정성과 분석하는

동안 분석물질의 안정성에 대해 평가해야 한다. 안정성 시험 조건은

실제로 시료를 취급하여 분석하는 동안 발생할 수 있는 상황이 반영

되어야 한다. 또한 표준원액내 분석물질의 안정성에 대해서도 평가

되어야 한다. 안정성 평가시에는 즉시 만든 표준원액을 다른 분석물

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질과 간섭물질이 없는 생체시료에 가해서 만든 하나의 시료 세트를

사용해야 한다. 안정성 평가시 표준원액은 분석물질을 적절한 용매

로 녹여 기지 농도로 조제해야 한다.

(1) 냉․해동 안정성

분석물질 안정성은 냉동과 해동 과정을 3 차례 거친 후 결정한

다. 저농도와 고농도 각각 최소 3 개의 등분체를 설정된 저장온도

에서 24 시간동안 저장하고 실온에서 보조기구없이 해동한다. 완전

히 녹았으면, 다시 같은 조건으로 12 ～ 24 시간동안 동결한다.

냉․해동 과정을 2 회 반복한 다음 분석한다. 만약 분석물질이 설

정된 저장 온도에서 불안정한 경우 3 회의 냉․해동 과정시 -70 ℃

에서 동결한다.

(2) 단기 온도 안정성

저농도와 고농도 각각 3 개의 등분체를 실온에서 해동하고 실온

에서 4 ～ 24 시간동안 방치한 다음 분석한다. 실온에서 방치하는

시간은 해당 연구 과정에서 시료가 실온에서 방치되는 시간을 고려

하여 결정한다.

(3) 장기 안정성

장기 안정성에서의 저장 기간은 초회 시료 채취일로부터 시료 분

석 종료일까지의 기간보다 길어야 한다. 장기 안정성은 저농도와

고농도 각각 최소 3 개의 등분체를 시험시료와 동일 조건하에서 저

장하여 평가한다. 시료의 용량은 3 회 분석하는데 충분한 량이어야

한다. 안정성 시료의 농도는 장기 안정성 시험을 시작한 첫날 얻어

진 해당 농도별 측정치의 평균값과 비교한다.

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(4) 표준원액 안정성

약물과 내부표준물질의 표준원액의 안정성은 적어도 6 시간 동안

실온에서 평가한다. 만약 원액이 해당 기간동안 냉장 혹은 냉동 보

관된다면 이에 대한 안정성 평가도 문서화되어야 한다. 원하는 저

장기간이 지나면 새로 제조한 표준원액과 기기 반응을 비교하여 안

정성을 평가한다.

(5) 조제 후 안정성

자동주입기내에 있는 기간을 포함해서 전처리 시료의 안정성이

증명되어야 한다. 약물과 내부표준물질의 안정성은 분석법

Validation 시료에 대해 예상소요시간동안 시험한 후 원검량선을

토대로 농도를 계산하여 평가한다.

비록 본 가이드에는 저장시료와 새로 조제한 시료의 분석결과를

비교하는 전형적인 방법을 제시하고 있으나, 생체시료내 분석물질

의 안정성을 평가하기 위해 다른 통계학적 방법을 사용할 수도 있

다. SOP에는 사용된 통계학적 방법과 규칙이 상세하게 기술되어야

한다. 약물을 투여한 피험자로부터 채취한 시료에 관한 조사 등을

포함한 부가적 Validation이 요구될 수도 있다.

마. 분석법 Validation시 유의할 사항

생체시료 분석법 Validation시 적합성을 평가하기 위한 기본적인

요소는 정확성, 정밀성, 특이성, 감도, 재현성, 그리고 안정성이다.

생체시료 분석방법은 구체적이고 자세하게 기술되어야 한다. 이

는 프로토콜, 시험안, 보고서 혹은 SOP의 형태가 될 수 있다.

시료 채취에서 분석까지 생체시료내 분석물질을 측정하는데 영향

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을 줄 수 있는 환경적, 생체시료, 물질, 혹은 과정상의 변동요인

들의 범위를 결정하기 위하여 시험의 각 단계별로 조사되어져야

한다.

시료의 생리적인 특성 때문에 생체시료의 다양성을 고려하는 것

이 중요하다. LC-MS-MS로 분석하는 경우에는, 분석법 적용시 생

체시료로 인한 영향이 없다는 것을 보증하기 위해 적절한 작업

단계가 수행되어야 한다. 특히 생체시료가 분석법 Validation 시

험동안 사용한 생체시료와 다른 경우 더욱 그러하다.

생체시료분석법은 사용 용도에 대해서 Validation되어야 하며, 분

석법 Validation에 대한 이의 제기나 결론을 도출하는데 사용된

모든 시험 내용은 보고서에 기술되어야만 한다. (분석법

Validation 보고서)

가능한 한 분석하고자 하는 검체의 생체시료와 동일한 생체시료

를 분석법 Validation시에도 사용해야 한다. (골수와 같이 쉽게

얻기가 힘든 생체시료의 경우는 이와 생리적으로 가장 유사한 생

체시료를 대체하여 사용할 수 있다.)

시료 채취와 저장기간 동안 생체 시료내 분석물질 (약물과 대사

체)의 안정성에 대한 평가가 수행되어야 하는데 시료분석 이전에

실시하도록 권장한다.

매우 불안정한 대사체인 경우 투약한 피험자로부터 채취한 생체

시료내 분석물질의 안정성에 대해 확인해야 한다.

내인성 물질, 대사체 및 알려진 분해생성물에 대해 생체시료내

분석법의 정확성, 정밀성, 재현성, 반응함수 (Response Function)

와 특이성이 확인되어야 한다. 특이성의 경우 정량되는 물질이

분석하고자 하는 분석물질임을 증명하여야 한다.

분석물질이 검출되는 농도범위는 그 범위내 표준품의 실측치와

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표준편차를 포함하여 평가한 후 생체시료분석법 상에 기술되어

야 하며, 이를 검량선이라 한다.

농도와 반응의 상관관계를 적절하게 나타내기 위해서는 충분한

수의 표준물질이 사용되어야 한다. 농도-반응 관계가 지속적이고

재현성이 있음이 증명되어야 한다. 표준물질의 수는 농도-반응

관계의 특성과 범위에 영향을 미친다. 많은 경우, 검량선 작성시

공시료를 제외하고 6 ～ 8 가지 농도가 사용된다. 비직선성을 보

이는 경우 더 많은 수의 표준물질 농도를 사용한다.

표준 검량선의 최고한계이상의 농도를 희석하는 기술은 분석법

Validation에 있어서 정확성과 정밀성에 의해 증명된다.

다중송신 (Multiplexing), 다중컬럼 (Multicolumn), 그리고 병렬시

스템 (Parallel Systems) 등을 포함한 고속처리분석법 (High

Throughput Analyses)을 사용하는 경우 분석법이 적절하게 관리

되고 있음을 입증하기에 충분한 수의 QC 시료가 사용되어야 하

며, 그 QC 시료의 수는 시험규모에 따라 결정되어진다. 시험 중

QC 시료의 시험 순서는 합리적으로 결정한다.

생체시료분석법이 유효한 것으로 간주되기 위해서는 특정 적합

기준이 미리 결정되어야 하고, 검량선 전범위에 걸친 QC 시료

Validation시 정확성과 정밀성에 대한 적합기준에 도달해야 한

다.

바. 분석법 Validation에 관한 특별 권장사항

생체시료인 경우, 최소 6 가지 농도의 표준액 (공시료 제외)을 가

지고 농도별로 한 개 이상의 시료를 분석하여 검량선을 작성한

다. 검량선에는 예상되는 농도 전범위가 포함되어야 한다.

검량선의 핏팅 (Fitting)은 최적의 적합성 (Goodness of Fit)을 위

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해 적절한 가중치를 준 후 통계적 시험을 거쳐 농도-반응 관계를

가장 적절하게 규명할 수 있는 가장 간단한 모델에 적용함으로

써 결정된다.

최저정량한계는 허용되는 정확성과 정밀성 기준에 적합한 검량선

의 최저 농도이다. 적어도 5 개의 표준품을 이용하여 변동계수

(CV)와 적절한 신뢰구간을 정하여 최저정량한계를 설정한다. 최

저정량한계는 검량선의 최저농도를 말하며 검출한계나 저농도

QC 시료와 혼동해서는 안된다. 최고 표준물질 농도를 해당 분석

법의 최고정량한계 (ULOQ)라고 한다.

생체시료 분석법의 Validation을 위해 정확성과 정밀성은 공시료

를 제외하고 농도별로 최소 5 개의 시료를 이용하여 평가한다.

평균값은 최저정량한계를 제외하고 이론값 (참값)의 ±15%이내

이어야 하고, 최저정량한계에서는 ±20%를 넘지 않아야 한다. 평

균값에 대한 정밀성은 최저정량한계를 제외하고는 변동계수가

±15%이내이어야 하고 최저정량한계에서는 ±20%를 넘지 않아

야 한다. 정확성과 정밀성을 평가하는 다른 방법도 이러한 조건

을 만족하면 인정 가능하다.

생체시료내 기지 농도의 주성분이 정확하고 정밀하게 분석됨을

입증해야 한다. 이는 동일한 생체시료로 기지 농도의 분석시료

(QC 시료)를 수차례 분석함으로써 수행한다. 검량선 범위 전역

을 포함하는 최소 3 가지 농도에서 평가한다. (1) 최저정량한계

의 3 배 정도의 농도 (저농도 QC 시료), (2) 검량선의 중간 정도

의 농도 (중농도 QC), (3) 검량선의 최고정량한계의 농도 (고농

도 QC).

보고된 분석법 Validation 결과와 정확성 및 정밀성 평가시, 모든

이상치 (Outliers)가 포함되어야 한다. 하지만, 통계적으로 이상치

- 14 -

로 설정된 값을 제외하고 정확성 및 정밀성을 계산하여 함께 보

고할 수는 있다.

설정된 저장온도에서 생체시료내 주성분의 안정성이 확인되어야

한다. 냉․해동 과정으로 인한 영향을 조사해야 한다. (최소 2 가

지 농도에 대해 각각 3 개의 시료를 3 번의 냉․해동 과정을 거

친다.)

실온에서 생체시료내 주성분의 안정성은 일반적인 시료 조제 및

시료 처리, 그리고 분석배치 시험시 소요되는 기간과 동일한 일

정 기간동안 평가해야 한다.

기기 고장인 경우 분석배치를 재분석할 것인지를 결정하기 위해

서 재주입시의 재현성을 평가한다.

시험 방법의 특이성은 동일한 생체시료로 최소 6 가지 서로 다른

기원의 생체시료를 이용하여 평가한다. 질량분석기를 검출기로

이용한 방법인 경우 (예. GC-MS, LC-MS) 6 가지 시료로 간섭시

험을 수행하는 것이 중요하지 않을 수도 있다. LC-MS와

LC-MS-MS로 분석하는 경우, 정밀성 및 특이성, 감도에 별다른

영향이 없음을 증명하기 위하여 생체시료의 영향을 조사하여야

한다. 분석법의 특이성은 분석법을 개발하고 Validation하는 전과

정동안 평가되어야 하고, 그 분석법을 실제 시험에 적용하는 전

과정동안 평가되어야 한다.

분석물질이 첨가된 생체시료로 만든 검량선용 표준물질과

Validation용 QC 시료의 적부 기준은 분석물질의 이론 농도를

기준으로 설정해야 한다. 특정 기준을 미리 설정하여 검량선 전

범위에서 정확성과 정밀성에 대한 기준에 도달되도록 하는 것이

더욱 바람직하다.

- 15 -

5. Validation된 분석법의 적용

생체시료내 분석물질의 모든 시료 분석은 안정성이 확보된 기간

내에 완료되어야 한다. 일반적으로 생체시료가 해당 분석법의

Validation 결과에서 확인된 바와 같이 적합한 변동범위를 가진다면

두 번 이상 분석하지 않고 단 회만 측정하여 분석할 수 있다. 이는

정밀성과 정확성의 변동범위가 통상적으로 허용한계이내인 시험과정

인 경우에 적용된다. 불안정한 분석물질을 가지고 시험하여 높은 정

밀성과 정확성의 기준에 도달하기 어려운 시험인 경우, 보다 정확한

분석치를 얻기 위해 2 회, 심지어 3 회 정도 분석해야 할 수도 있다.

각각의 분석배치내 시료를 분석하기 위해 각 분석물질별로 검량선을

작성하고 시험하는 미지 시료내 분석물질의 농도를 계산하는데 사용

되어야 한다. 표준물질을 가한 생체시료는 한 개 이상의 분석물질을

포함할 수도 있다. 분석시 시료는 다음의 세 가지로 구성된다. (1)

QC 시료, (2) 검량선용 표준물질, (3) 한 배치로서 분석될 모든 전처

리 시료, 혹은 한 연구에서 한 명 이상의 지원자로부터 채취하여 전

처리한 미지 검체로 구성된 배치. 검량선에는 최저정량한계의 검량

시료뿐만 아니라, 미지 시료의 예상농도범위를 포함해야 한다. 검량

선의 최저정량한계 이하나 최고정량한계 이상으로 외삽해서 미지의

검체 농도를 계산해서는 안된다. 그 대신 검량선을 재작성하거나, 고

농도의 시료인 경우 희석하여 다시 분석해야 한다. 모든 분석시료를

한번에 분석하는 것이 바람직하다.

일상적인 사용 목적으로 분석법이 일단 Validation되기만 하면 해

당 분석법이 만족할 정도로 수행되고 있음을 입증하기 위하여 정확

성 및 정밀성에 대해 정기적으로 검토해야 한다. 이를 위해서는 분

석시료의 총 수를 토대로 정한 여러 개의 QC 시료를 각각 조제하여

- 16 -

일정 간격으로 전처리한 시험시료와 함께 분석해야 한다. QC 시료는

각 농도당 2 개씩, 3 가지 농도 (최저정량한계 근처의 최저정량한계의

3 배 농도, 중간 농도, 최고정량한계 근처의 농도)로 준비해서 각 시

험 과정에 포함되어야 한다. QC 시료의 수는 시험과정의 총 분석시

료 수에 따라 결정한다. QC 시료의 시험 결과에 따라 그 시험의 적

합 여부가 결정된다. 6 개의 QC 시료 중 최소 4 개가 각 이론값의

15%이내여야 한다. 6 개의 QC 시료 중 2 개는 각 이론값의 15%를

벗어날 수는 있지만 동일 농도에서 모두 벗어나서는 안된다.

생체시료분석법을 일상적인 약물 분석에 적용시 다음과 같은 사항이

권장된다.

생체시료에 근거한 검량선은 공시료를 제외하고 전범위에 걸친

최소 6 가지 표준농도로 1 회 이상 분석하여 작성한다.

반응 함수 : 일반적으로 예비시험 Validation 동안에 정한 곡선

핏팅, 가중치와 최적의 적합성은 해당 실제 시험의 검량선에도

동일하게 사용되어야 한다. 반응 함수는 Validation과정동안 얻

어진 표준액의 실측치를 바탕으로 적절한 통계학적 시험을 통해

결정된다. 예비시험 Validation시와 실제 시험 Validation시 반응

함수가 달라진 경우, 시험법 상에 잠재적인 문제가 있음을 의미

한다.

QC 시료는 해당 시험의 적합 여부를 평가하는데 사용된다. 이러

한 QC 시료는 분석물질을 생체시료에 첨가한 것이다.

시스템 적합성 : 분석물질 및 분석법 별로 사용된 시스템이 최적

의 상태로 작동되고 있음을 입증하기 위한 해당 표준작업절차서

(혹은 시료)가 있어야 한다.

- 17 -

시료 희석이 필요한 경우 유사한 생체시료를 사용함으로써 본 시

험 도중 희석시 사용한 생체시료로 만든 QC 시료를 분석할 필요

가 없도록 한다.

재분석 : 재분석과 적합 기준에 대한 SOP 혹은 지침을 설정하는

것이 중요하다. 이 SOP 또는 지침에는 시료의 재분석 사유가 서

술되어 있어야 한다. 재분석 사유로는 허가와 관련된 임상 혹은

전임상 시료의 재분석, 반복 분석 결과의 불일치, 정량범위를 벗

어나는 시료, 시료 처리과정의 문제, 기기 고장, 좋지 않은 크로

마토그램, 그리고 약물동력학적 결과의 불일치 등을 들 수 있다.

시료용량이 충분하다면 재분석은 3 회 실시한다. 재분석에 대한

이론적 설명과 재분석에 대한 보고는 명확하게 문서화되어야 한

다.

시료 결과의 재적분 : 시료 결과의 재적분에 관한 SOP 혹은 지

침이 확립되어야 한다. 이 SOP 혹은 지침은 재적분 사유 및 방

법이 서술되어 있어야 한다. 재적분에 대한 이론적 설명은 명확

하게 기술되고 문서화되어야 한다. 원래의 결과와 재적분된 결과

가 모두 보고되어야 한다.

분석 과정의 적합 기준

다음과 같은 적합 기준이 분석과정의 적부 평가를 위해 고려되어

야 한다.

표준원액의 안정성과 정확성이 확인된다면, 표준액과 QC 시료는

동일한 표준원액으로부터 조제할 수 있다. 또한 특이성이 확인된

- 18 -

다면 한 가지 기원의 생체시료를 사용해서 평가해도 된다.

검량선용 표준시료와 공시료, QC 시료, 시험 검체가 시험하는 동

안 적절하게 배치되도록 고안한다.

한 분석배치내 표준시료와 QC 시료의 분석 순서는 시험하는 동

안의 분석 동향을 파악할 수 있도록 고안한다.

생체시료내 검량선용 표준시료 : 검량선으로부터 역계산했을 때

최저정량한계를 제외한 검량선용 표준시료의 75% 혹은 최소 6

가지 표준시료는 이론값의 ±15%이내여야 하고(최고정량한계를

포함), 최저정량한계에서는 ±20%이어야 한다. 이러한 한도를 벗

어나는 값은 설정된 모델을 변경시키지 않는 한 제외할 수 있다.

“바. 분석법 Validation에 관한 특별 권장사항”에서 제시한 정확

성과 정밀성의 적합 기준은 일내 및 분석배치내 시험 모두에 적

용된다.

QC 시료 : QC 시료는 최소 3가지 농도 (최저정량한계의 3배 정

도 농도, 중간범위 농도, 최고정량한계 근처 농도)로 구성되며,

매 분석시마다 수차례 (최소 1 회) 이를 포함하여 분석해야 한다.

QC 시료의 분석 결과는 시험과정의 적부 평가에 대한 근거가

된다. QC 시료 중 최소 67% (6 개 중 4 개)가 예상되는 이론값

과 15%이내이어야 하고, 33%는 이론값의 ±15%를 벗어날 수 있

다. 단, 동일 농도에서 두 시료 모두 벗어나서는 안된다. 정확성

과 정밀성을 평가하기 위해 신뢰구간을 이용하는 것도 적절한

대체 방법이다.

QC 시료는 세 가지 농도가 한 세트로 구성되는데, 최소 QC 시

료의 수는 미지 검체 수의 최소 5%이거나, 총 6 개 이상이어야 한

다.

- 19 -

여러가지 분석물질이 포함된 시료에서 한 분석물질이 적합 기준

에 부적합하다고 해서 부적합으로 평가되지는 않는다.

부적합한 시험으로부터 얻은 결과는 문서화할 필요는 없지만 그

분석이 부적합으로 평가된 사실과 그 부적합 사유는 보고되어야

한다.

6. 서류

분석법의 타당성은 실험실적 연구를 통해 확립되고 증명되어야 하

며, 그 연구의 성공적 수행에 관한 문서는 분석법 Validation 보고서

의 형태로 제출되어야 한다. 공통 및 특정 SOP와 우수한 기록물 관

리 작업은 분석법 Validation 작업에 있어 필수적인 부분이다. 생체

시료 분석법 확립과정에서 발생된 결과 및 QC 시료에 대한 결과는

문서화하여 데이터 감사나 실사시 확인 가능해야 한다. 정부기관에

제출되는 문서에는 다음과 같은 사항들이 포함되어야 한다. (1) 요약

정보, (2) 분석법 개발과 확립, (3) 일상적 시료 분석에 사용된 모든

분석법의 생체시료 분석 결과, 그리고 (4) 분석법 개발과 확립 또는

일상적 시료 분석에 적용되는 기타 정보

가. 요약 정보

요약 정보에는 다음과 같은 사항을 포함해야 한다.

분석법 Validation 및 부분적 재validation 보고서를 포함한 모든

Validation 보고서 요약표. 이 표는 연대순으로 기록하고 시험법

확인 코드, 시험 형태와 새로운 방법 혹은 부가 Validation (예.

최저정량한계를 낮추는 것)에 대한 사유를 포함시킨다.

- 20 -

프로토콜별로 사용된 시험법 목록이 기재된 요약표. 이 표에는

프로토콜의 수, 프로토콜 제목, 시험 형태, 시험법 확인 코드와

생체시료분석 보고서 코드가 제시되어야 한다.

여러가지 시험법 확인 코드를 상호 참조할 수 있도록 한 요약표.

(예. 동일 시험법에 대해 시험방법, Validation보고서, 생체시료분

석보고서의 코드가 서로 다를 경우, 특히 제조처와 그 용역 실험

실이 동일 시험에 대해 서로 다른 코드를 부여하는 경우)

나. 분석법 확립에 관한 문서작성

분석법의 개발과 확립에 관한 문서에는 다음 사항이 포함되어야

한다.

분석법 작업 절차에 관한 기술

분석법 Validation 실험에 사용한 약물 표준품 및 대사체 표준품,

내부표준물질의 순도와 확인에 대한 입증 자료

안정성 연구에 관한 기술과 그 증빙 자료

정확성, 정밀성, 회수율, 특이성, 정량한계, 검량선 (방정식 및 사

용된 경우 가중치 함수 포함)을 평가하기 위해 수행된 실험에 관

한 기술과 관련 결과

일내 및 일간 시험의 정확성과 정밀성에 관한 문서화

해당되는 경우, 명확하게 주석을 기재한 크로마토그램과 질량 스

펙트로그램

SOP, 프로토콜, 혹은 GLP (해당되는 경우)에서 벗어난 경우 이

탈 사항 및 정당화 방법

- 21 -

다. 일상적인 약물 분석에의 적용

Validation된 생체시료분석법을 일상적 약물 분석에 적용시 관련

문서에는 다음과 같은 사항 등이 포함되어야 한다.

일상적 분석을 수행하는 동안 사용한 약물 표준품, 대사체 표준

품과 내부표준물질의 순도와 확인에 관한 입증 자료

시료 전처리와 보관에 관한 정보를 포함한 요약표. 이 표에는 시

료명, 채취일, 배송전 보관, 배송 로트에 관한 정보와 분석전의

보관에 관한 사항이 포함되어야 한다. 이러한 정보에는 날짜, 시

간, 시료 조건과 프로토콜에서 벗어난 이탈 사항이 포함된다.

임상 혹은 전임상 시료 분석에 관한 요약표. 이 표에는 시험법명,

분석일자, 분석시간, 시험법, 시험자, 시작과 종료시간, 기간, 장비

및 시료의 대변경, 그리고 확립된 분석법의 잠재적 문제나 이탈

사항이 포함되도록 한다.

결과를 역계산하는데 사용한 등식

시료분석에 사용한 검량선 결과표와 검량선 요약결과

분석배치 시험 과정의 적부 평가시 사용된 QC 시료의 일내/일

간 분석값과 검량선으로부터의 일내/일간 정확성과 정밀성에 관

한 데이터의 요약 정보. 기초자료와 통계처리에 대한 요약뿐만

아니라 QC 그래프 및 추이 분석에 대해 기술하도록 권장한다.

임상 혹은 전임상 시료의 분석 결과표. 이 표에는 시험법명, 시료

명, 기초자료와 역계산된 결과, 데이터 적분 확인 코드 또는 기타

보고서 확인 코드가 포함된다.

시료 분실 사유

재분석에 관한 문서화. 이 문서에는 초회 분석 결과와 재분석의

- 22 -

결과, 보고된 결과, 시험법명, 재분석 사유, 재분석 요청자, 그리

고 재분석 승인자에 관한 내용이 포함되어야 한다. 임상 혹은 전

임상 시료의 재분석은 반드시 사전에 설정된 SOP에 따라 수행되

어야 한다.

데이터 재적분 결과에 관한 문서화. 이 문서에는 초회 데이터 적

분 결과 및 재적분 결과, 재적분시 사용된 방법, 보고된 결과, 시

험법명, 재적분 사유, 재적분 요청자, 그리고 재적분 승인자에 관

한 내용이 포함되어야 한다. 임상 혹은 전임상 시료의 데이터 재

적분은 반드시 사전에 설정된 SOP에 따라 수행되어야 한다.

분석 프로토콜 혹은 SOP에서 이탈된 경우 그 사유 및 정당화 방

법

라. 기타 정보

분석법 개발과 확립 또는 일상적인 시료 분석에 적용되는 기타 정

보로는 다음과 같은 사항이 포함된다.

약어 및 시료 조건 코드, 데이터 적분 코드, 보고서 코드 등을 포

함한 기타 코드 목록

참고문헌 목록과 참고문헌 사본

다음과 같은 영역에 관련된 SOP 혹은 프로토콜

- 검량선용 표준물질의 적부 기준

- 검량선의 적부 기준

- QC 시료와 시험의 적부 기준

- 모든 미지 시료를 2회 분석시 보고된 결과의 적부 기준

- 임상 혹은 전임상 시료 코드와 생체시료분석용 시료 코드를

포함한 시료 코드번호 부여 체계

- 배치 분석을 위한 임상 혹은 전임상 시료의 배정 방법

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- 시료채취, 조작과정과 보관방법

- 시료의 재분석

- 시료의 데이터 재적분

용어해설

검량선 (Calibration Curve) : 실험적 반응 수치와 분석물질의 농도간

의 상관 관계

검량선용 표준물질 (Calibration Standard) : 기지 농도의 분석물질을

첨가한 생체시료. 검량선용 표준물질은 검량선을 작성하는데 사용되고,

이 검량선으로부터 QC 시료 및 미지 시료내 분석물질의 농도가 결정

된다.

검출 한계 (Limit of Detection : LOD) : 생체시료분석법과정으로 배

경 노이즈와 확실하게 구분되어지는 분석물질의 최저 농도

내부표준물질 (Internal Standard) : 목표로 하는 분석물질의 정량을

돕기 위해 기지의 일정 농도로 검량선용 표준물질과 시료에 첨가하는

시험 물질 (예. 구조적으로 유사한 유도체, 안정하다고 알려진 물질)

분석배치 (Analytical Run or Batch) : Validation을 위해 적절한 수의

표준품과 QC 시료 및 분석 검체의 완전한 한 세트. 수 개의 배치가

하루에 분석될 수도 있고, 한 배치가 수일에 걸쳐 분석될 수도 있다.

- 24 -

분석법 Validation (Validation) :

전체 Validation (Full Validation) : 분석물질별로 생체시료분석법에

대한 시료 분석시 적용되는 모든 Validation 파라메타들을 확립하는

경우 실시

부분 Validation (Partial Validation) : 이미 Validation된 생체시료분

석법에서 변형되었지만 전체 재Validation이 불필요한 경우 실시

분석물질 (Analyte) : 측정되는 특정 화학 물질로서, 생체시료내 약물

자체이거나 생분자, 유도체, 대사체, 분해산물이 될 수 있다.

생체시료 (Biological Matrix) : 재현성이 있게 시료를 채취하여 전처

리할 수 있는 생체 기원에서 분리된 물질. 예를 들면, 전혈이나 혈청,

혈장, 뇨, 변, 타액, 객담, 기타 다양한 분리 조직

생체시료영향 (Matrix Effect) : 시료내 존재하는 분석하고자 의도하지

않은 분석물질 혹은 기타 방해인자로 인해 직․간접적으로 해당 반응

이 변경되거나 방해받는 것

특이성 (Selectivity) : 존재할지도 모르는 구성성분 (대사체, 불순물,

분해산물 혹은 생체시료 구성성분)의 존재 하에 분석물질을 측정하고

구별해내는 생체시료 분석법의 능력

시료 (Sample) : 대조시료 (Control), 공시료 (Blank), 미지시료, 그리고

전처리시료 등을 포함한 일반적인 용어

공시료 (Blank) : 분석시료를 가하지 않은 생물학적 모시료로서 생

- 25 -

체시료분석법의 특이성을 평가하는데 사용

미지시료 (Unknown) : 분석대상이 되는 생물학적 시료

QC시료 (Quality Control Sample) : 생체시료에 분석물질을 첨가

한 시료로서 생체시료분석법의 성능을 검사하고 각각의 분석배치

에서 분석되는 미지시료 분석 결과의 타당성 평가에 사용

전처리시료 (Processed Sample) : 다양한 기법 (예. 추출, 희석, 농

축)으로 처리된 시료로 기기분석 전의 최종 추출물

시스템 적합성 (System Suitability) : 분석 배치를 시험하기 전에 표

준품을 분석함으로써 기기 성능 (예. 감도와 피크유지시간)을 평가

시험법 (Method) : 시료 분석에 사용한 모든 절차에 관한 포괄적인

기술

안정성 (Stability) : 주어진 기간동안 특정 조건하에서 주어진 생체시

료내 분석물질의 화학적 안정성

재현성 (Reproducibility) : 두 실험실간의 정밀성. 또한, 단기간동안

동일 조작 조건 하에서의 시험법의 정밀성으로도 표현된다.

정량범위 (Quantification Range): 농도-반응 관계를 이용해서 정확도

와 정밀도를 가지고 신뢰성있고 재현성있게 정량할 수 있는 농도 범위

로서 최고정량한계와 최저정량한계를 포함한다.

정밀성 (Precision) : 설정된 조건 하에서 균질화된 동일 시료로부터

수차례 검체 채취하여 얻은 분석 결과치 사이의 일치 정도 (분산정도)

- 26 -

정확성 (Accuracy) : 설정된 조건하에서 실측된 값이 이론값, 즉 이미

알고있는 참값에 근접한 정도

최고정량한계 (Upper Limit of Quantification, ULOQ) : 정밀성과 정

확성을 가지고 정량될 수 있는 시료내 분석물질의 최고 농도

최저정량한계 (Lower Limit of Quantification, LLOQ) : 적합한 정밀

성과 정확성으로 정량적으로 실측될 수 있는 시료내 분석물질의 최저

량

회수율 (Recovery) : 분석과정의 추출 효율로서 기지 량의 분석물질에

대해 해당 시험법의 시료 추출과 처리 과정을 모두 거친 후 얻은 분석

치의 기지량에 대한 퍼센트 (%)

□ 미국 FDA 가이드 웹사이트 - http://www.fda.gov/cder/

guidance/4252fnl.pdf

- 27 -

별첨 1.

부분 Validation시 요구되는 시험 항목 예시

1. 절차

시약 : 변경수준

1. 시약의 pH 변경 4

2. 유기용매 조성 변경 4

3. 재용해 용매 변경 4

4. 재용해 용매량 변경 1

5. 표준원액 제조시 사용된 용매 변경 a

6. 상용 표준액 (working standard) 조제시 사용 용매 변경 4a

7. 내부표준액의 농도나 첨가량 변경 4

8. 시약 조제 방법 변경 1b

9. 시약농도 변경 4

10. 고체상 추출카트리지의 활성화액, 세척액, 용출액의 변경 4a. 정확성 안정성을 입증할 것b. 해당 분석법에서 중요한 변경으로 지정되지 않는 경우

방법 :

1. 질소 증발 건고 방법 변경 1

2. 질소와 진공 증발건고 방법간의 변경 3

3. 증발 건고 온도 변경 3

4. 혼합 방법 변경 (흔듦, 진탕혼합, 회전 등) 3

5. 상분리를 위한 원심분리 속도 (설정치의 80% 이내) 1

6. 상분리를 위한 원심분리 속도 (설정치의 80%미만 또는 120%이상) 3

7. 원심분리 온도 (±5℃ 이내) 1

8. 원심분리 온도 (±5℃ 이상) 3

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방법 : 변경수준

9. 고체상 추출카트리지의 용출 방법 변경 3

10. 유도화제를 중성화하거나 제거 4

11. 수동 및 자동 절차간의 변경 4

12. 추출전 검체의 원심분리 추가 3

13. 주입전 추출액을 원심분리하거나 여과하는 과정 추가 3

14. 액상 추출 (액체-액체)과 고체상추출 간의 변경 5

시간 :

1. 증발 건고 시간 3

2. 추출 (혼합) 시간 3

3. 원심분리 시간 3

* 해당 시험법에서 특별한 지정이 없는 한 모든 시간은 최소 시간으로

고려되어야만 한다. 시험법 변경은 설정 시간을 감소할 필요가 있다

면, 시간 축소에 따른 영향을 평가하기 위한 특정 조치가 뒤따라야만

한다.

2. 시스템

기기 :

1. 검출기 변경 5

2. 분석기기 변경 (예. LC에서 GC로의 변경) 5

3. 측정 파라메타 변경 2～4

4. 기기나 부품 제조업체 변경 3

5. 주입량 변경 2

6. 실린지 세척액 변경 3c

7. 주입포트 라이너/처리/septum 2

8. 분석 시간 변경 1C. 공시료를 칼리브레이션 고농도 표준액 다음에 사용해야만 한다.

- 29 -

컬럼 : 변경수준

1. 유속변경 (액체 또는 기체) 2

2. 이동상변경 2～3

3. 캐리어가스 변경 4

4. 용출시 컬럼 온도나 온도 램프 파라메타의 변경 4

5. 컬럼충진물 변경 5

6. 동일 형태의 컬럼에 대한 제조처 변경 4

7. 컬럼 직경 변경 4

8. 입자크기 변경 4

9. 필름두께 변경 4

데이터 처리 (인식) :

1. 질량분석기에 대한 데이터인식 파라메타 변경 4

2. 크로마토그래프에 대한 데이터인식 파라메타 변경 2

3. 데이터처리 하드웨어나 소프트웨어 변경 3

3. 규격

1. 칼리브레이션 범위 변경 5

2. 회귀분석법 변경 결과 재계산

3. 내부표준물질-외부표준물질 상호간 변경* 결과 재계산

4. 면적-높이 상호간 변경 결과 재계산

5. 다분석대상물질-단독분석대상물질 상호간 변경 1

6. 환경요소 (빛, 온도 등) 안정성 고려

* 내부표준물질을 사용하도록 한 분석법이 Validation된 이후 외부표

준물질 모드에서 정량하도록 하는 결정이 내려졌다면, 내부표준물질

을 첨가하는 작업은 해당 시험법의 한 단계로 계속 유지되어야만

한다.

- 30 -

4. 생체시료

기원 : 변경수준

1. 공급업체 변경 시료 스크리닝

2. 종 변경 (예. 사람에서 랫트) 4

3. 형태 변경 (혈장, 혈청, 뇨 등) 4

4. 유사생체시료 변경 4

처리 :

1. 보존제 변경 4

2. 항혈액응고제 4

3. 항혈액응고제에 대한 카운터 이온 변경(헤파린나트륨에서 헤파린리튬)

1

4. 채취 방법 변경 1

5. 채취 용기 변경 1

6. 보관 용기 변경 1

7. 보관 온도를 높게 변경 안정성 입증

8. 보관 온도를 낮게 변경 1

9. 열처리 안정성 입증

5. 시약 및 재료

1. 시약 제조처 변경 1

2. 시약 등급 품질의 상향 변경 1

3. 시약 등급 품질의 하향 변경 3

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시약 및 재료 : 변경수준

4. 내부표준물질 변경 5

5. 표준물질의 출처 변경 4d

6. 시험법에 사용된 마개의 변경 (즉, 플러그 대 스크류) 1

7. 시험관의 크기 1

8. 튜브 구성성분의 변경 (플라스틱 대 유리) 4

9. 초자류 관리방법 변경 3

10. 고체상추출카트리지 (SPC)의 로트번호 변경 1

11. SPC의 제조처 변경 4

12. SPC의 정지상 변경 5

13. SPC에 충전물질의 량 변경 4

d. 부분 Validation시 분석대상의 간섭 시험을 포함하여야 한다.

※ 변경수준별 요구되는 Validation 수준 및 평가 파라메타

변경수준 시험법Validation 수준 평가 파라메타

1시험 불필요Not Required

-

2시스템 적합성 평가

System Suitability

단회 혹은 연속적인 분석을 시작하

기 전에 크로마토그래프 시스템과

결과의 적합성을 평가하기 위해 시

스템 적합성 평가용 표준품으로 분

석. 유지시간, 감도, 분리도, 피크형태

등과 같은 파라미터를 평가

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변경수준시험법

Validation 수준평가 파라메타

3성능 적격성 평가

Performance

Qualification

성능 적격성은 특이성, 직선성 및

QC 시료(농도별 최소 2개 이상)를

각각 1회씩 평가

4부분 ValidationPartial Validation

부분 Validation시 분석법의 특이성,

직선성 및 QC 시료(농도별 최소 2개

이상)를 각각 2회씩 평가한다. 기타

변경 사항별로 요구되는 추가 시험

을 수행

5전체 Validation

Full Validation

전체 Validation시 분석법의 특이성,

직선성, 일내/일간 시험의 정확성 및

정밀성, 감도, 회수율, 안정성 등 모

든 Validation 파라메타에 대해 평가

†동일한 분석법에 대해서 시험자나 실험실이 변경되는 경우, 한 개

생체시료에서의 특이성, 직선성 및 일내/일간 시험의 정확성과 정

밀성을 평가한다.

생체시료 분석법 Validation

발행년월일 2003년 5월

발 행 처 국립독성연구원 의약품동등성평가과

발 행 인 길 광 섭

김주일 정수연 최선옥 박기숙

백민선 정성희 윤경은

연락처 : 의약품동등성평가과 TEL : 02) 380 - 1414～5

FAX : 02) 380 - 1589