ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP TRƯỜNG NGHIÊN …thuvienso.bvu.edu.vn › ... › 1 › NCKHSV-Pham-Thi-Kim-Hai.pdfbỘ giÁo dỤc vÀ ĐÀo tẠo trƯỜng ĐẠi

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÀ RỊA-VŨNG TÀU

BÁO CÁO

ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP TRƯỜNG

NGHIÊN CỨU CHIẾT TÁCH CAO NEEM TỪ LÁ CÂY NEEM

ẤN ĐỘ BẰNG CÁC HỆ DUNG MÔI KHÁC NHAU VÀ BƯỚC

ĐẦU NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG TRONG THUỐC BẢO VỆ

THỰC VẬT

Chủ nhiệm: Phạm Thị Kim Hai

Hướng dẫn khoa học: TS. Tống Thị Minh Thu

Bà Rịa - Vũng Tàu, năm 2019

MỤC LỤC

DANH MỤC VIẾT TẮT ........................................................................................... i

DANH MỤC BẢNG ................................................................................................. ii

DANH MỤC HÌNH ................................................................................................ iii

DANH MỤC SƠ ĐỒ ................................................................................................ iv

LỜI MỞ ĐẦU ...................................................................................................................... 1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN LÝ THUYẾT ...................................................................... 4

1.1. Giới thiệu về cây Neem .............................................................................. 4

1.1.1. Định danh .............................................................................................. 4

1.1.2. Đặc điểm hình thái ................................................................................ 4

1.1.3. Nguồn gốc và sự phân bố. ..................................................................... 5

1.1.4. Giá trị và công dụng .............................................................................. 5

1.2. Các chất có hoạt tính sinh học trong cây Neem ...................................... 7

1.2.1. Diterpenoid ............................................................................................ 8

1.2.2. Triterpenoid (limonvgoid) ..................................................................... 8

1.3. Tác động của các hoạt chất trong cây Neem đối với các loài dịch hại ....

.................................................................................................................... 11

1.4. Cơ sở hóa học thuốc bảo vệ thực vật và công nghệ sản xuất thuốc bảo

vệ thực vật ................................................................................................... 12

1.4.1. Hoạt chất.............................................................................................. 12

1.4.2. Chất mang............................................................................................ 12

1.4.3. Chất hoạt động bề mặt ......................................................................... 12

1.4.4. Các chất phù trợ .................................................................................. 13

1.4.5. Các dạng thuốc bảo vệ thực vật .......................................................... 13

1.4.6. Phân loại thuốc bảo vệ thực vật .......................................................... 14

1.5. Công trình nghiên cứu, phương pháp chiết tách và phối phẩm .......... 15

1.5.1. Trên thế giới ........................................................................................ 15

1.5.2. Trong nước .......................................................................................... 17

1.6. Phương pháp thử hoạt tính khuẩn ......................................................... 18

1.6.1. Staphylococcus aureus (Gr +) ............................................................. 18

1.6.2. Pseudomonas aeruginosa (Gr -) .......................................................... 21

1.7. Một số phương pháp chiết cao Neem ..................................................... 23

1.7.1. Các phương pháp truyền thống ........................................................... 23

1.7.2. Các phương pháp hiện đại ................................................................... 24

1.8. Hoạt tính kháng oxi hóa của cao Neem [21] ............................................ 25

1.9. Một số phương pháp định tính, định lượng cao Neem ......................... 25

1.9.1. Phương pháp định tính bằng các phản ứng và thuốc thử .................... 25

1.9.2. Phương pháp phân tích trọng lượng .................................................... 28

1.9.3. Phương pháp sắc ký khí ghép khối phổ (GC – MS) ........................... 29

1.9.4. Phương pháp sắc ký lỏng ghép đầu dò khối phổ (LC – MS) .............. 30

CHƯƠNG 2: THỰC NGHIỆM ....................................................................................... 32

2.1. Địa điểm và nguyên vật liệu....................................................................... 32

2.1.1. Địa điểm nghiên cứu ............................................................................ 32

2.1.2. Đối tượng nghiên cứu .......................................................................... 32

2.1.3. Dụng cụ - thiết bị và hóa chất .............................................................. 32

2.2. Phương pháp nghiên cứu ......................................................................... 33

2.2.1. Lý thuyết.............................................................................................. 34

2.2.2. Thực nghiệm ........................................................................................ 34

2.2.3. Quy trình chiết tách dịch chiết lá Neem .............................................. 34

2.3. Mô hình chiết tách thực nghiệm tại phòng thí nghiệm ........................ 37

2.3.1. Ngâm dầm ........................................................................................... 37

2.3.2. Soxhlet ................................................................................................. 37

2.4. Phương pháp cô quay chân không tuần hoàn ....................................... 37

2.5. Xác định thành phần hóa học từ cao lá Neem bằng phương pháp

GC/MS, LC/MS .......................................................................................... 38

2.6. Khảo sát các điều kiện ảnh hưởng đến quá trình chiết ........................ 38

2.6.1. Xác định ảnh hưởng của thời gian chiết .............................................. 38

2.6.2. Xác định ảnh hưởng của tỉ lệ dung môi/nguyên liệu .......................... 39

2.7. Định tính một số hợp chất có trong lá Neem ......................................... 39

2.7.1. Định tính Flavonoid ............................................................................ 39

2.7.2. Định tính Alkaloid ............................................................................... 39

2.7.3. Định tính saponin ................................................................................ 40

2.7.4. Định tính Cacbonhyđrat ...................................................................... 40

2.7.5. Định tính Steroid – triterpenoid .......................................................... 40

2.8. Đánh giá khả năng kháng khuẩn của cao chiết lá Neem ..................... 41

2.9. Xác định hoạt tính kháng oxi hóa của cao Neem .................................. 43

2.10. Cách pha thuốc trừ sâu ......................................................................... 44

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ................................................................... 45

3.1. Kết quả khối lượng cao Nem khi chiết bằng các hệ dung môi khác nhau.

........................................................................................................................ 45

3.1.1. Cao Neem được chiết bằng dung môi Hexan ...................................... 45

3.1.2. Cao Neem được chiết bằng dung môi Chloroform ............................. 46

3.1.3. Cao Neem được chiết bằng dung môi Ethanol 96o .............................. 47

3.1.4. Cao Neem được chiết bằng dung môi Methanol ................................. 47

3.1.5. Cao Neem được chiết bằng dung môi Ethyl acetat ............................. 48

3.1.6. Cao Neem được chiết bằng dung môi Nước ..................................... 49

3.1.7.So sánh khối lượng cao Neem khi chiết với các hệ dung môi khác nhau

...................................................................................................................... 50

3.2. Kết quả định tính các nhóm chất có trong cao Neem ........................ 51

3.2.1. Cao Neem được chiết bằng dung môi Hexan ...................................... 51




3.2.5. Cao Neem được chiết bằng dung môi Ethyl Axetat ............................ 55

3.2.6. Nước .................................................................................................... 55

3.3. Hoạt tính chống oxi hóa của cao Neem .................................................. 57

3.4. Kết quả kháng khuẩn của cao Neem ...................................................... 58

3.4.1. Cao Neem được chiết bằng dung môi Hexan...................................... 58




3.4.5. Cao Neem được chiết bằng dung môi Ethyl acetate ............................ 66

3.4.6. Cao Neem được chiết bằng dung môi Nước ..................................... 69

3.5. Thành phần hóa học có trong cao chiết ................................................. 70

3.5.1. Xác định thành phần hóa học có trong cao lá Neem chiết với n – hexan

........................................................................................................................ 70

3.5.2. Xác định thành phần hóa học có trong cao chiết Ethanol 96o ............. 73

3.5.3. Xác định thành phần hóa học có trong cao lá Neem chiết với Methanol

........................................................................................................................ 76

3.6. Kết quả thử nghiệm trên sâu .................................................................. 78

CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ................................................................... 79

4.1. Kết luận ..................................................................................................... 79

4.2. Kiến nghị ................................................................................................... 80

TÀI LIỆU THAM KHẢO................................................................................................. 81

i

DANH MỤC VIẾT TẮT

Am: thuốc kháng sinh Amipicillin

DK: Đường kính

DMSO: Dimethyl sulfoxide - Hợp chất hữu cơ lưu huỳnh với công thức (CH3)2SO

DNA: Acid deoxyribonucleic - Phân tử mang thông tin di truyền mã hóa cho hoạt động

sinh trưởng, phát triển, chuyên hóa chức năng và sinh sản của các sinh vật và nhiều loài

virus

MHA: Mueller Hinton Agar - Môi trường thạch Mueller Hinton

MYP Mannitol Egg Yolk Polymixin

NB: Nutrient Agar

PDA: Potato Dextrose Agar Môi trường dinh dưỡng PDA

rpm: tốc độ vòng/ phút

RNA: Acid ribonucleic

Te: thuốc kháng sinh Tetracycline

TSB: Tryptone Soy Broth - Môi trường dinh dưỡng TSB

TT: Thuốc thử

ii

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1. 1: Hoạt tính dược liệu các chất trong Neem ...................................................... 6

Bảng 1.2: Các thương phẩm thuốc trừ sâu từ Neem đang lưu hành trên thị trường Việt

Nam ............................................................................................................................... 14

Bảng 2.1: Độ phân cực và nhiệt độ sôi của các hệ dung môi khác nhau ......................... 47

Bảng 3. 1: Khối lượng cao Neem khi chiết tách với Hexan bằng 2 phương pháp khác

nhau ............................................................................................................................... 45

Bảng 3.2: Khối lượng cao Neem khi chiết tách với Chloroform bằng 2 phương pháp

khác nhau ....................................................................................................................... 46

Bảng 3.3: Khối lượng cao Neem khi chiết tách với Ethanol 96o bằng 2 phương pháp

khác nhau ....................................................................................................................... 47

Bảng 3.4: Khối lượng cao Neem khi chiết tách với Methanol bằng 2 phương pháp khác

nhau ............................................................................................................................... 48

Bảng 3.5: Khối lượng cao Neem khi chiết tách với Ethyl acetat bằng 2 phương pháp

khác nhau ....................................................................................................................... 49

Bảng 3.6: Khối lượng cao Neem khi chiết tách với Nước bằng 2 phương pháp khác nhau

....................................................................................................................................... 49

Bảng 3.7: Khối lượng cao Neem khi chiết tách với các hệ dung môi khác nhau ......... 50

Bảng 3.8: Kết quả định tính các nhóm chất có trong cao Neem khi chiết với Hexan .. 51

Bảng 3.9: Kết quả định tính các nhóm chất có trong cao Neem khi chiết với Chloroform

....................................................................................................................................... 52

Bảng 3.10: Kết quả định tính các nhóm chất có trong cao Neem khi chiết với Ethanol

96o .................................................................................................................................. 53

Bảng 3.11: Kết quả định tính các nhóm chất có trong cao Neem khi chiết với Methanol

....................................................................................................................................... 54

Bảng 3.12: Kết quả định tính các nhóm chất có trong cao Neem khi chiết với Ethyl

acetate ............................................................................................................................ 55

Bảng 3.13: Kết quả định tính các nhóm chất có trong cao Neem khi chiết với Nước . 55

Bảng 3.14: Định tính các nhóm chất trong cao Neem khi chiết với 6 dung môi khác

nhau ............................................................................................................................... 56

Bảng 3.15: Mật độ quang của đường chuẩn axit galic ................................................. 57

ii

Bảng 3.16: Kết quả hoạt tính chống oxi hóa của cao Neem ......................................... 57

Bảng 3.17: Đuờng kính vòng kháng khuẩn của cao Neem với dung môi Hexan (mm)

....................................................................................................................................... 59

Bảng 3.18: Đuờng kính vòng kháng khuẩn của cao Neem với dung môi Chloroform

(mm) .............................................................................................................................. 61

Bảng 3.19: đuờng kính vòng kháng khuẩn của cao Neem với dung môi Ethanol 96o

(mm) .............................................................................................................................. 63

Bảng 3.20: Đuờng kính vòng kháng khuẩn của cao Neem với dung môi Methanol (mm)

....................................................................................................................................... 65

Bảng 3.21: Đuờng kính vòng kháng khuẩn của cao Neem với dung môi Ethyl acetate

(mm) .............................................................................................................................. 67

Bảng 3.22: Đường kính vòng kháng khuẩn của cao Neem với dung môi Nước (mm) 69

Bảng 3.23: bảng định danh một số cấu tử trong cao chiết n – Hexan từ lá Neem ....... 71

Bảng 3.24: Bảng định danh một số cấu tử trong cao chiết Ethanol 96o từ lá Neem .... 74

Bảng 3.25: Bảng định danh một số cấu tử trong cao chiết Ethanol 96o từ lá Neem .... 77

iii

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1: Bộ phận của cây Neem ................................................................................... 4

Hình 1.2: Neem tricyclic diterpene ................................................................................. 8

Hình 1.3: Nhóm protomelicin ......................................................................................... 9

Hình 1.4: Limonoid với 4 vòng nguyên và chuỗi bên γ – hydroxybutenolid ................ 9

Hình 1.5: Azadirone ..................................................................................................... 10

Hình 1.6: Gedunin và dẫn xuất ..................................................................................... 10

Hình 1.7: Salannin ........................................................................................................ 10

Hình 1.8: Nimbin .......................................................................................................... 11

Hình 1.9: Azadirachtin A .............................................................................................. 11

Hình 1.10: Vi khuẩn Staphylococus trên kính hiển vi .................................................. 20

Hình 1.11: Vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa trên kính hiển vi ................................ 22

Hình 2.1: Lá Neem tươi ................................................................................................................ 32

Hình 2.2: Lá Neem khô ................................................................................................ 37

Hình 2.3: Mô hình ngâm dầm ....................................................................................... 37

Hình 2.4: Mô hình chiết tách tại phòng thí nghiệm ...................................................... 37

Hình 2.5: Thiết bị cô quay chân không tuần hoàn ........................................................ 38

Hình 2.6. Mô tả vòng kháng khuẩn .............................................................................. 43

Hình 3.1: Biểu đồ khối lượng cao Neem khi chiết tách với Hexan bằng 2 phương pháp

khác nhau ....................................................................................................................... 45

Hình 3.2: Biểu đồ khối lượng cao Neem khi chiết tách với Chloroform bằng 2 phương

pháp khác nhau .............................................................................................................. 46

Hình 3.3: Biểu đồ khối lượng cao Neem khi chiết tách với Ethanol 96o bằng 2 phương

pháp khác nhau .............................................................................................................. 47

Hình 3.4: Biểu đồ khối lượng cao Neem khi chiết tách với Methanol bằng 2 phương

pháp khác nhau .............................................................................................................. 48

Hình 3.5: Biểu đồ khối lượng cao Neem khi chiết tách với Ethyl acetat bằng 2 phương

pháp khác nhau .............................................................................................................. 49

Hình 3.6: Biểu đồ khối lượng cao Neem khi chiết tách với Nước bằng 2 phương pháp

khác nhau ....................................................................................................................... 50

iii

Hình 3.7: Định tính các nhóm chất có trong cao Neem khi chiết với Hexan ............... 52

Hình 3.8: Định tính các nhóm chất có trong cao Neem khi chiết với Chloroform ...... 53

Hình 3.9: Định tính các nhóm chất có trong cao Neem khi chiết với Ethanol 96o ...... 53

Hình 3.10: Định tính các nhóm chất có trong cao Neem khi chiết với Methanol ........ 54

Hình 3.11: Định tính các nhóm chất có trong cao Neem khi chiết với Ethyl acetate .. 55

Hình 3.12: Định tính các nhóm chất có trong cao Neem khi chiết với Nước .............. 56

Hình 3.13: Biểu đồ phương trình đường chuẩn Acid gallic ......................................... 57

Hình 3.14: Biểu đồ thể hiện hoạt tính chống oxi hóa của cao Neem ........................... 58

Hình 3.15: Khả năng kháng S. aureus và P.aeruginosa của cao Neem ngâm với Hexan

....................................................................................................................................... 60

Hình 3.16: Khả năng kháng S. aureus và P.aeruginosa của cao Neem chiết với Hexan

....................................................................................................................................... 60

Hình 3.17: Khả năng kháng S. aureus và P.aeruginosa của cao Neem ngâm với

Chloroform .................................................................................................................... 62

Hình 3.18: Khả năng kháng S. aureus và P.aeruginosa của cao Neem chiết với

Chloroform .................................................................................................................... 62

Hình 3.19: Khả năng kháng S. aureus và P.aeruginosa của cao Neem ngâm với Ethanol

96o .................................................................................................................................. 64

Hình 3.20: Khả năng kháng S. aureus và P.aeruginosa của cao Neem chiết với Ethanol

96o .................................................................................................................................. 64


Methanol ........................................................................................................................ 66


Methanol ........................................................................................................................ 66

Hình 3.23: Khả năng kháng S. aureus và P.aeruginosa của cao Neem ngâm với Ethyl

acetate ............................................................................................................................ 68

Hình 3.24: Khả năng kháng S. aureus và P.aeruginosa của cao Neem chiết với Ethyl

acetate ............................................................................................................................ 68

Hình 3.25: Khả năng kháng S. aureus và P.aeruginosa của cao Neem ngâm với Nước

Chiết 6 giờ ..................................................................................................................... 70

Hình 3.26: Khả năng kháng S. aureus và P.aeruginosa của cao Neem chiết với Nước

....................................................................................................................................... 70

iii

Hình 3.27: sắc ký đồ GC – MS của cao chiết n – Hexan từ lá Neem .......................... 71

Hình 3.28: Sắc ký đồ GC – MS của cao chiết Ethanol 96o từ lá Neem ....................... 74

Hình 3.29: Sắc ký đồ LC – MS của cao chiết Methanol từ lá Neem ........................... 77

Hình 3.30. Lá cải nhúng thuốc ...................................................................................... 78

Hình 3.31. Phun trực tiếp .............................................................................................. 78

iv

DANH MỤC SƠ ĐỒ

Sơ đồ 2.1: Quy trình chiết cao từ lá Neem bằng phương pháp ngâm dầm .............................. 35

Sơ đồ 2.2: Quy trình chiết cao từ lá Neem bằng Soxhlet.............................................. 36

Trường Đại học Bà Rịa Vũng Tàu

Viện Kỹ Thuật – Kinh Tế Biển, Ngành CNKTHH Báo cáo đề tài khoa học và công nghệ cấp trường

Chủ nhiệm: Phạm Thị Kim Hai 1 Hướng dẫn khoa học: ThS Tống Thị Minh Thu

LỜI MỞ ĐẦU

1. Tính cấp thiết của đề tài

Nông nghiệp là ngành chiếm tỷ trọng lớn đối với nền kinh tế nước ta. Nền sản xuất

nông nghiệp ở nước ta đang đối đầu với những thách thức và áp lực từ bên trong lẫn bên

ngoài. Nông nghiệp Việt Nam muốn phát triển bền vững, cần phải có những thay đổi

trong cả tư duy lẫn hành động. Hiện nay, nền nông nghiệp phát triển theo chiều rộng là

chính, năng suất thấp, hiệu quả kém. Nguyên nhân là do sự lạc hậu, thiếu sự chuyên

môn hóa trong quá trình canh tác và sản xuất dẫn đến những sản phẩm kém chất lượng,

làm giảm sự cạnh tranh trên thị trường quốc tế. Trên thực tế, nền nông nghiệp nước ta

phải đối mặt với nhiều loài sâu, bọ hại cây trồng nên việc sử dụng thuốc bảo vệ thực vật

là không thể tránh khỏi. Theo thống kê của tổ chức lương thực thế giới (FAO) cho thấy:

các loại cây trồng trên đồng ruộng đang phải chống đỡ với hơn 100.000 loài sâu hại

khác nhau, 10.000 loài nấm, 200 loài vi khuẩn, 600 loài tuyến trùng và 600 loài virus

gây bệnh. Lượng lương thực bị mất do vấn nạn này ngày càng tăng lên. Để khắc phục

tình trạng trên, con người đã tích cực tìm kiếm các biện pháp phòng chống các tác nhân

gây hại, nhiều biện pháp khác nhau đã được sử dụng, trong đó thuốc trừ sâu hóa học

được sử dụng nhiều nhất. Chúng đóng vai trò quan trọng trong hệ thống canh tác nông

nghiệp trong một thời gian dài và mang lại hiệu quả cao với phạm vi sử dụng rộng lớn.

Có thể nói, không một biện pháp nào bảo vệ mùa màng tốt hơn thuốc trừ sâu hóa học cả

về mặt qui mô lẫn hiệu quả.

Tuy nhiên, các biện pháp hóa học ngày càng bộc lộ những khuyết điểm của nó. Do

dư lượng thải ra môi trường ngày càng lớn nên nó đang gây vấn nạn đến môi trường,

đầu độc con người, gây mất cân bằng hệ sinh thái. Điều nghiêm trọng hơn là do tình

trạng sử dụng quá liều lượng, không đúng thời gian sử dụng thuốc và thời gian thu hoạch

đã tạo nên dư lượng thuốc không cho phép trong hoa màu và nông sản. Những thông tin

như bị ép giá, bị trả lại hàng, không loạt qua được khâu kiểm định nghiêm ngặt khi nhập

khẩu vào các nước tiên tiến đã quá quen thuộc trên các mặt báo. Đây cũng là nguyên

nhân gây nhiễm độc cho khoảng 1,5 triệu người mỗi năm trên toàn thế giới, trong đó có

25 nghìn người bị tử vong (WHO-1998).

Trước thực trạng này, các nhà nông học đã nghiên cứu và đưa ra những phương

pháp mới trong phòng trừ và tiêu diệt các loài sâu bọ hại cây trồng. Một trong những




hướng nghiên cứu triển vọng là kiểm soát sinh học như: nghiên cứu sử dụng nấm, vi

khuẩn, ký sinh thiên địch, các hợp chất thứ cấp từ thảo mộc,….Những chế phẩm sinh

học này đang rất được quan tâm, bởi chúng ít làm ảnh hưởng đến các sinh vật sống khác,

dễ phân hủy, không làm độc cho nông phẩm và dễ sử dụng.

Cây Neem (Azadirachta indica A.Juss) là một trong những loài thảo mộc có đặc

tính kháng sâu bọ đang được sử dụng và nghiên cứu ở nước ta và nhiều nước khác.

Nhằm tìm phương pháp tối ưu hóa trong việc sử dụng cây Neem trong quá trình phòng

trừ và tiêu diệt sâu bọ nên chúng tôi thực hiện đề tài “Nghiên cứu chiết tách cao Neem

từ lá của cây Neem Ấn Độ bằng các hệ dung môi khác nhau và bước đầu nghiên cứu

ứng dụng trong Dược – Mỹ Phẩm – Thuốc bảo vệ thực vật”.

1. Mục đích nghiên cứu

- Xây dựng quy trình chiết tách các hợp chất hóa học trong lá Neem.

- Xác định tính chất và cấu trúc của các hợp chất hóa học trong lá Neem.

- Thử hoạt tính sinh học có trong lá Neem và bước đầu nghiên cứu ứng dụng trong

Dược – Mỹ Phẩm – Thuốc bảo vệ thực vật.

- Xác định hoạt tính kháng khuẩn của cao Neem theo phương pháp xác định đường

kính vòng vô khuẩn.

- Xác định lực chống oxy hóa tổng (Total Antioxydant Capacity) theo mô hình

phospho molybdenum.

2. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu

- Nguyên liệu sử dụng để chiết tách cao trong nghiên cứu này là lá Neem Ấn Độ được

mua tại Công ty thảo dược An Quốc Thái, phường 11, quận Tân Bình, Thành phố

Hồ Chí Minh.Lá Neem được trồng tại tỉnh Ninh Thuận.

- Phòng thí nghiệm Trườg Đại học Bà Rịa – Vũng Tàu (cơ sở 3), 951 Bình Giã,

phường Rạch Dừa, thành phố Vũng Tàu, tỉnh Bà Rịa – Vũng Tàu.

3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài

Ý nghĩa khoa học

Kết quả của luận án tạo ra bộ dữ liệu khoa học tương đối toàn diện về hàm lượng

các hợp chất có hoạt tính sinh học cao (định tính, định lượng) cũng như hoạt tính sinh

học (khả năng kháng oxi hóa, kháng khuẩn, trừ sâu). Các dữ liệu khoa học này là nguồn

tư liệu hữu ích cho công tác đào tạo, nghiên cứu về cây Neem ở Việt Nam.




Ý nghĩa thực tiễn

Luận án góp phần nâng cao giá trị của cây Neem ở nước ta, đồng thời góp phần

cải thiện đời sống người nông dân.

Sản phẩm của luận án chiết tách cao Neem tạo ra các sản phẩm thuốc bảo vệ thực

vật.

4. Cấu trúc bài báo cáo gồm 3 chương:

Chương 1: Tổng quan lý thuyết

Chương 2: Thực nghiệm

Chương 3: Kết quả và thảo luận

Chương 4: Kết luận và kiến nghị




CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN LÝ THUYẾT

1.1. Giới thiệu về cây Neem

1.1.1. Định danh

Ngành: Angiospermatophyta (ngành thực vật hạt kín)

Bộ: Rutales

Họ: Meliaceae (Mahogany Family)

Chi: Melieae

Giống: Azadirachtia

Tên gọi Azadirachta indica có từ tên của cây Neem trong tiếng Ba Tư Azadarakth-

in - hindi, nghĩa là “Cây tự do của Ấn Độ”. Năm 1830, nhà thực vật học Pháp Antoine

Laurent de Jussieu đặt tên cây Neem là Melia azadirachta, sau đó ông đổi thành

Azadirachta indica A. Juss. Trong tiếng Sanskrit cây Neem có tên là Aristha nghĩa là

“Cây làm giảm bệnh tật”.[25]

Trên thế giới tùy từng vùng mà cây Neem có tên gọi khác nhau. Ngay cả trong

tiếng Anh cây Neem cũng đã có nhiều tên như Neem tree, Indian lilac tree, Paradise

tree, White cedar,… nhưng “Neem tree” là tên gọi phổ biến hơn cả. Ở Việt Nam, cây

Neem thường được gọi là xoan chịu hạn để phân biệt với cây xoan ta (Melia azedarach

L.).[7]

1.1.2. Đặc điểm hình thái

Hình 1. 1: Bộ phận của cây Neem

A.Nhánh thân Neem; B. Lá Neem; C. Hạt Neem chín; D. Hạt Neem khô; E. Nhân hạt Neem.

Cây Neem thích hợp với thời tiết nóng (nhiệt độ có thể lên tới 50 oC), mọc tốt ở

đất cát cố định, đất cát pha sét.

Neem là cây xanh quanh năm, tán lá rộng, cao trung bình 13 - 20 m, cây trưởng

thành cao đến 30 m, đường kính 2.5 m, nhánh cây to có thể vươn dài đến 10 m. Cây non




mọc ở những vùng khô hạn có thể rụng lá trong một khoảng thời gian ngắn, lá non mọc

lại trong khoảng tháng 3 - 4. Trường hợp cá biệt nếu phát triển trong điều kiện thuận lợi

cây có thể cao 35 - 40 m, đường kính thân có thể đạt đến 3.5 m. Rễ cây thường ăn rất

sâu.

1.1.3. Nguồn gốc và sự phân bố.

Hiện nay, nguồn gốc của cây Neem vẫn chưa được xác định chính xác. Theo

Gamble (1902) nguồn gốc cây Neem có từ những cánh rừng ở Karnatka (Nam Ấn Độ)

hoặc vùng rừng khô hạn trong nội địa Myanmar. Những nhà nghiên cứu khác lại có

chung quan điểm là Neem bắt nguồn từ rừng ở các ngọn đồi Shivalik (chân phía Tây

của dãy Himalayas) hoặc bờ biển phía Đông miền Nam Ấn Độ. Sự đa dạng về hình dạng

của lá Neem và các đặc điểm hình thái khác đã dẫn đến thuyết của Schmutterer (1995):

A. indica xuất phát từ thượng Myanmar, sau đó lan ra các cánh rừng Trung và Tây Á.[35]

Do thích hợp với khí hậu nóng, Neem đã được di thực vào châu Phi từ những năm

đầu thế kỷ 20. Ngày nay nó được trồng rộng rãi ở các nước như Senegal, Ghana, Sudan,

Mali, Nigeria, … Trong thế kỷ 20 Neem cũng đã được di thực đến các nước Trung và

Nam Mỹ, đặc biệt được trồng rất nhiều ở Haiti, Cộng hòa Dominica, Nicaragua. Ở châu

Á, Neem được trồng ở nhiều nơi như Bangladesh, Myanmar, Cambodia, Ấn Độ, Sri

Lanka, Indonesia, Iran, Malaysia, Nepal, Pakistan, Thái Lan, Yemen, Trung Quốc. Tại

Việt Nam, cây Neem được trồng từ 1981.[7]

1.1.4. Giá trị và công dụng

Cây Neem được đánh giá cao nhờ các tính chất về sinh khối, dược lý và sát trùng.

Hàng thế kỷ nay, người nông dân Ấn Độ đã dùng tất cả các bộ phận của cây như quả,

lá, dầu, vỏ, gỗ làm thuốc chữa bệnh, thuốc trừ sâu, phân bón và gỗ. Neem cũng có tác

dụng cải tạo đất, phủ xanh đất trống và quan trọng nhất là làm trong lành môi trường.[25]

Ngoài giá trị to lớn về môi trường, cây Neem còn có giá trị kinh tế cao.

1.1.4.1. Dùng làm dược liệu

Tính dược liệu của Neem được ứng dụng từ lâu và vẫn đang được thu hút nghiên

cứu bởi các nhà khoa học trên thế giới. Nhiều báo cáo đã chứng minh rằng Neem có khả

năng kháng viêm, kháng sinh, kháng khuẩn cực tốt.[37]




Bảng 1.1: Hoạt tính dược liệu các chất trong Neem

STT Tên chất Nguồn Hoạt tính sinh học

1 Nimbidin Hạt, dầu

Chống viêm, chống viêm khớp, hạ

sốt, giảm đường huyết, chống

viêm dạ dày, chất diệt tinh trùng,

chống nấm, chống khuẩn, lợi tiểu.

2 Sodium nimbidate Hạt, dầu Chống viêm

3 Azadirachtin Hạt, dầu Chống vi khuẩn sốt rét

4 Nimbin Hạt, dầu Chất diệt tinh trùng

5 Nimbolide Hạt, dầu Chống sốt rét, chống vi khuẩn

6 Gedunin Hạt, dầu Chống sốt rét, chống nấm

7 Mahmoodin Hạt, dầu Chống vi khuẩn

8

Gallic acid, (-)

epicatrchin và

catechin

Vỏ cây Chống viêm, điều hòa hệ miễn

dịch

9

Margolone,

margolonone và

isomargolonone

Vỏ cây Chống vi khuẩn

10 Cyclic trisuphide và

cyclic tetrasulphide Lá Chống nấm

11 Polysacchrides G1A,

G1B Vỏ cây Chống ung thư

12 Polysacchrides G2A,

G3A Vỏ cây Chống viêm

13 NB-2-Peptidoglucan Vỏ cây Điều hòa hệ miễn dịch

Ngoài những công dụng trên, vỏ cây Neem còn có công dụng cầm máu, bổ gan, trị

đàm,… Neem còn được báo cáo chữa được stress và điều khiển tỷ lệ sinh đẻ,…Tại một

số vùng Andhra Pradesh, nông dân thường cho gia súc ăn lá Neem sau khi sinh con để

tăng sự tiết sữa. Ngoài ra lá Neem còn có tác dụng phòng trị bệnh giun sán cho gia súc




và kiểm soát nhiều loại tác nhân gây bệnh khác. Nhiều nơi còn dùng lá non làm rau ăn

vừa bổ sung khoáng chất, vừa có thể phòng ngừa giun sán hoặc viêm nhiễm đường ruột.

Ở Ấn Độ, dân gian thường lấy lá Neem để gần trẻ em giúp ngăn ngừa bệnh ho gà.

1.1.4.2. Dùng trong mỹ phẩm

Bởi hoạt tính kháng khuẩn tốt, có khả năng tiêu diệt các vi khuẩn trong tế bào gây

mụn nên dầu Neem đang được ưa chuộng trong việc điều trị mụn như một liệu pháp tự

nhiên. Bằng cách phối dầu Neem vào nền mỹ phẩm hay sử dụng trực tiếp có khả năng

điều trị mụn trứng cá, mụn nhọt.

Nhờ hoạt tính này, dịch chiết lá Neem còn giảm lượng vi khuẩn, mảng bám men

răng từ đó chống bị viêm răng nên có thể phối dịch chiết Neem vào kem đánh răng để

sử dụng hằng ngày.[37] Ngoài ra, Neem còn được phối vào nhiều sản phẩm mỹ phẩm

khác như dầu gội đầu, sữa tắm, xà phòng,… để tăng khả năng diệt khuẩn.

1.1.4.3. Công dụng khác.

Cùng với những hoạt tính sinh học trên, cây Neem còn có nhiều hữu ích khác như

tạo bóng mát, tạo môi trường xanh trong lành, giúp bảo vệ đất, chống xói mòn, cát

bay,…Gỗ Neem được dùng chế tạo hàng gia công mỹ nghệ có độ bền cao không bị mối

mọt làm hư hại. Ngoài ra, vỏ Neem chứa nhiều tannin phục vụ cho công nghệ thuộc da,

công nghệ nhuộm, nhựa mủ làm kẹo gum,…

1.2. Các chất có hoạt tính sinh học trong cây Neem

Từ trước đến nay, các nhà khoa học đã khảo sát tính sát trùng ở hơn 2000 loài cây,

duy nhất cây Neem cho kết quả hứa hẹn. Điều này có được do các hoạt chất trong Neem

không chỉ tác động hiệu quả lên côn trùng mà còn khá an toàn với con người và động

vật máu nóng. Tính đến năm 2000 đã có hơn 100 hoạt chất có hoạt tính sinh học từ

Neem đã xác định được công thức và cấu tạo. Những hoạt chất này chủ yếu thuộc hai

nhóm chính là isoprenoid và các hợp chất không phải isoprenoid.[35] Có thể chia chúng

thành 2 nhóm:

Isoprenoid (terpen): Gồm diterpenoid và triterpenoid như là các protomeliacin,

limonoid, azadirone và dẫn xuất của chúng, gedunin và dẫn xuất của chúng, các hợp

chất dạng vilasinin và C-secomeliacin (nimbin, salanin và azadirachtin).




Non-isoprenoid: Gồm protein, amino acid, carbohydrate, hợp chất của lưu huỳnh,

hợp chất polyphenolic như flavonoid, glycoside của chúng, dihydrochalcone, coumarin,

tannins, chất béo,…

1.2.1. Diterpenoid

Trong các loại terpene thì tricyclic diterpene được tìm thấy nhiều nhất, đặc biệt là

những chất có vòng C với nhóm chức của oxygen tại C-3 và C-7.

Hình 1.2: Neem tricyclic diterpene

Đa số các tricyclic diterpene trong Neem được báo cáo có hoạt tính sinh học cao:

chống tế bào ung thư, kháng sinh và trừ sâu cao.[26]

1.2.2. Triterpenoid (limonvgoid)

Đây là những chất đắng trong Neem, thuộc dạng tetranortriterpenoid có khung

apo-euphol (hoặc apo-tirucallol). Người ta đã tìm thấy khoảng 300 limonoid trong thực

vật, 1/3 số đó có trong Azadirachta indica và Melia azedarach. Nhóm triterpenoid này

có thể phân thành 8 nhóm nhỏ: protomeliacin, limonoid với chuỗi bên xác định,

azadirone và dẫn xuất, gedunin và dẫn xuất, vilasinin và 3 nhóm C- seco-meliacin là

azadirachtin, nimbin, và salannin.

Protomeliacin

Chứa một chuỗi bên 8 carbon tại vị trí C - 17, còn được gọi là protolimonoid hay

protomelicin hay meliane. Hợp chất đầu tiên melantriol được cô lập từ quả và dầu Neem.

Nimbocinone, nimolinone, kulactone, limocinol và limocinone là những dẫn xuất của

euphol/tirucallol. Azadirachtol, azadirachnol, azaditol thuộc chuỗi apo. Các hợp chất

limocin A và B là limocinin, đó là những tetranortriterpenoid có chuỗi bên

tetrahydrofuran bán acetan.




β

Hình 1.3: Nhóm protomelicin

Limonoid với 4 vòng nguyên và chuỗi bên γ- hydroxybutenolid

Đặc điểm của nhóm này là có chuỗi bên γ - hydroxybutenolid tại vị trí của vòng

furan và 4 vòng furan còn nguyên vẹn.

Hình 1.4: Limonoid với 4 vòng nguyên và chuỗi bên γ – hydroxybutenolid

Nhóm azadirone và các hợp chất tương tự

Nhóm này bao gồm tất cả các hợp chất có khung triterpenoid nguyên, có cầu oxy

tại vị trí C - 3 và C - 7.




Hình 1.5: Azadirone

Gedunin và các dẫn xuất

Hình 1.6: Gedunin và dẫn xuất

Nhóm C- Secomeliacin

Đây là một nhóm lớn chứa hầu hết các hợp chất quan trọng, chia làm 4 nhóm nhỏ

hơn nữa là nimbin, salannin, C - Secomeliacin với chuỗi bên γ - hydroxybutenolid và

azadirachtin.

• Nhóm salannin

Hình 1.7: Salannin

• Nhóm C- secomeliacin nimbin




Hình 1.8: Nimbin

• Nhóm azadirachtin

Đây là nhóm chính có hoạt tính gây ngán ăn cho côn trùng. Morgan và Butterworth

cô lập được azadirachtin năm 1968. Các đồng phân khác sau đó được xác định bởi

Siddiqui, Kraus, Ley và cộng sự.

Hình 1.9: Azadirachtin A

Ngoài ra trong cây Neem còn chứa các hoạt chất không phải isoprenoid như các

hợp chất polyphenolic (flavonoid, flavonoglycoside, dihydrochalcon, tannin, coumarin),

các hợp chất carbohydrat và protein, các hợp chất sulfur dễ bay hơi cũng có hoạt tính

mạnh đối với côn trùng.

1.3. Tác động của các hoạt chất trong cây Neem đối với các loài dịch hại

Các hoạt chất trong Neem tác động đến nhiều loài dịch hại theo những phương

thức sau:

Gây ngán ăn: Đây là tác dụng điển hình nhất của các hoạt chất trong Neem. Các

hoạt chất trong Neem thường làm sâu giảm ăn hoặc nhịn ăn đến chết. Saxena (1986)

nhận thấy rằng mùi vị của dầu Neem ở nồng độ 6%, 12% làm loài N. viresen bỏ ăn ngay

lập tức. Thí nghiệm với dịch chiết Neem chứa azadirachtin cũng làm cho N. viresen bỏ

ăn và chuyển sang tăng cường các hoạt động khác. Khả năng gây ngán ăn của Neem

liên quan đến một thụ quan gây ức chế quá trình hấp thụ thức ăn. Tác dụng gây ngán ăn

của Neem tùy thuộc vào giống và tuổi sâu bọ.[9; 13; 39]

Xua đuổi: Theo Saxena (1995), tác động xua đuổi côn trùng của Neem là do sự có

mặt của các hợp chất chứa lưu huỳnh dễ bay hơi trong Neem. Dầu Neem và dịch chiết

từ Neem gây xua đuổi côn trùng rất mạnh trong khi azadirachtin tinh khiết lại không có

tác động này.[13]

Diệt côn trùng: Hoạt chất trong Neem có tác dụng làm chết côn trùng qua đường

tiếp xúc và đường miệng. Tuy tác động diệt côn trùng của các chất trong Neem không




mạnh và nhanh như các thuốc hóa học khác nhưng có tác dụng kéo dài.[16]

Ức chế sự sinh trưởng và gây biến thái: Biểu hiện của tác động này là làm cho

côn trùng giảm kích thước và trọng lượng, kéo dài thời gian phát triển hoặc không phát

triển được. 1984, Heyde và cộng sự nhận thấy khi phun dịch chiết từ Neem ở nồng độ

500 ppm lên trùng non rầy xanh (Cicadellidae) thì chỉ có khoảng 10% - 28% trùng non

chuyển sang giai đoạn trưởng thành được, nếu ở nồng độ cao hơn thì tất cả các trùng

non này đều chết trước khi chuyển sang giai đoạn trưởng thành [39].

Ảnh hưởng khả năng giao phối: Các hợp chất trong Neem làm ảnh hưởng đến

quá trình sản xuất ra hormon giới tính, dẫn dụ, từ đó ảnh hưởng đến quá trình ghép đôi

giao phối của côn trùng. Saxena (1995) nhận thấy dầu Neem ở nồng độ 1, 2, 5 μg khiến

N. lugens cái sản xuất ra tín hiệu sai lạc làm cho con đực không nhận ra nó vì vậy không

ghép đôi giao phối được.[39]

Ảnh hưởng đến khả năng đẻ trứng và làm thối trứng: Các hoạt chất trong Neem

tác động lên hệ nội tiết của côn trùng làm phân hủy các tế bào nuôi dưỡng phôi tạo tế

bào trứng làm côn trùng không đẻ trứng hoặc khả năng đẻ trứng giảm. Larew và Knodel

- Montz khi phun 0,4% dịch chiết nhân hạt Neem lên Trialeurodes vaporamorum thấy

số lượng trứng giảm đi một phần tư.[13; 39]

1.4. Cơ sở hóa học thuốc bảo vệ thực vật và công nghệ sản xuất thuốc bảo vệ thực

vật

Thuốc bảo vệ thực vật là những hợp chất độc có nguồn gốc tự nhiên hoặc tổng hợp

hóa học được dùng để phòng trừ sâu bệnh, cỏ dại, chuột, nấm bệnh v.v… hại cây trồng.

[9; 10; 17] .Thuốc bảo vệ thực vật thường gồm những thành phần sau:

1.4.1. Hoạt chất

Hoạt chất là những chất có tác dụng diệt dịch hại. Hoạt chất, còn gọi là sản phẩm

kĩ thuật có nhiều dạng như dạng bột, kết tinh, lỏng nhão, khí, có các hàm lượng và độ

tinh khiết khác nhau tùy thuộc vào công nghệ sản xuất.[9; 12; 14]

1.4.2. Chất mang

Chất mang hay chất làm loãng là những chất ở dạng rắn hoặc lỏng, có tác dụng

làm loãng hoạt chất nhưng không làm giảm hoạt tính sinh học của hoạt chất, tạo dạng

thuốc an toàn và tiện lợi trong sử dụng.

1.4.3. Chất hoạt động bề mặt




Chất hoạt động bề mặt là những chất hóa học đặc biệt khi hỗn hợp với nước sẽ tạo

nên một dung dịch không đồng nhất nhưng làm giảm sức căng bề mặt, tăng tính loang

dính và thấm ướt dịch phun.[11; 29; 31]

Hàm lượng chất hoạt động bề mặt hoặc hỗn hợp của chúng trong các dạng thuốc

từ 1 – 10%.

1.4.4. Các chất phù trợ

Đây là những chất phù trợ khi thêm vào để nâng cao hiệu lực của các chất độc

(hoạt chất). Vai trò của chúng là cải thiện lí tính của các hoạt chất và các hợp chất hoạt

động, bao gồm:

- Chất ổn định.

- Chất hợp lực làm tăng độ độc của thuốc.

- Chất thấm ướt tăng sự phân tán.

- Chất phân tán hấp phụ trên bề mặt của phân tử thuốc.

- Chất hóa sữa tạo độ bền nhũ tương.

- Chất hòa tan.

- Chất nâng cao hoạt tính sinh học.

- Chất chống lắng ngăn cản sự tách lớp và lắng đọng của các phần tử và giọt.

- Chất chống đóng vón.

- Chất chống đông.

- Chất tạo bọt và chất chống bọt.

- Chất bảo quản ngăn cản sự xâm nhập của vi sinh vật vào dạng gia công.

- Chất tác động phối hợp có tác dụng gia tăng tác dụng của thuốc.

- Các chất màu dùng để cảnh báo, ngăn ngừa ngộ độc thuốc hoặc để kiểm tra độ

đồng đều của thuốc trước khi xử lí.[5; 11]

1.4.5. Các dạng thuốc bảo vệ thực vật

Đối với thuốc tổng hợp hóa học, hợp chất độc được tổng hợp ra còn chứa các phụ

chất gọi là thuốc kĩ thuật. Trong đó, thành phần thuốc nguyên chất hay hoạt chất là thành

phần gây hiệu lực chính đối với sâu hại.

Thuốc kĩ thuật hay còn gọi là thuốc nguyên chất cần được gia công thành các dạng

thành phẩm (còn gọi là chế phẩm) khác nhau để sử dụng. Từ năm 1984, Hiệp hội sản

xuất thuốc bảo vệ thực vật (CIPAC: Collaborative International Pesticides Analytical




Council) quy định thống nhất tên dạng thuốc bảo vệ thực vật gồm hai chữ cái biểu thị

trạng thái vật lí và hướng sử dụng[13] Các dạng chế phẩm được dùng phổ biến là:

- Thuốc dạng hạt.

- Thuốc dạng bột thấm nước.

- Thuốc phun bột.

- Thuốc dạng bột mịn.

- Thuốc dạng dung dịch đậm đặc

- Thuốc sữa.

1.4.6. Phân loại thuốc bảo vệ thực vật

Dựa vào một số đặc điểm, thuốc bảo vệ thực vật được chia ra các nhóm sau:

- Theo con đường tác động.

- Theo phương pháp xử lí.

- Theo nguồn gốc hóa học.

- Thuốc trừ sâu gốc thảo mộc.

Bảng 1.2: Các thương phẩm thuốc trừ sâu từ Neem đang lưu hành trên thị trường Việt

Nam

Stt

Tên

hoạt

chất

Tên thương

phẩm Đối tượng phòng trừ

Tổ chức xin đăng

kí

1

Aza

dir

ach

tin

Aza 0.15 % Sâu tơ hại cải bắp Magrow Pte Ltd

2 A-Z annong,

0.03EC, 0,15EC

Rầy nâu, sâu cuốn lá hại lúa,

sâu tơ, hại bắp cải, bọ cánh

tơ hại chè

Công ty TNHH

An Nông

3 Jasper 0.3EC

Sâu cuốn lá hại lúa, sâu tơ

hại rau họ thập tự, nhện đỏ

hại cây cây có mùi, rầy bông

hại nho, rệp hại thuốc lá, rầy

xanh hại chè

Công ty TNHH

nông dược Điện

Bàn




4 Neem Bond-A,

EC (1000ppm) Sâu tơ hại bắp cải

Rangsit Agri –

Eco. Ltd

5

Neem Nim,

Xoan, Xanh

Green 0.15EC;

0.3EC

0.15EC: Ruồi đục lá cây bó

xôi, rệp sáp hại cà phê, bọ

cánh tơ hại chè, sâu tơ hại

bắp cải, sâu xanh da láng hại

cải bông.

Doanh nghiệp tư

nhân TM Tân Quy

6 Nimbicidine

0.03EC Sâu tơ hại rau

JJ – Degussa

Chemicala (S) Pte

Ltd

7 ViNeem

1500EC

Rầy xanh hại chè, rệp hại

rau

Công ty thuốc sát

trùng Việt Nam

1.5. Công trình nghiên cứu, phương pháp chiết tách và phối phẩm

1.5.1. Trên thế giới

Năm 1985, Robert O. Larson cùng cộng sự đã làm bền dịch chiết Neem để làm

thuốc trừ sâu. Hạt Neem khô xay nhỏ có kích thước 350 microns - 2 mm. Dùng ethanol

chiết trong vùng nhiệt độ khảo sát từ 60 tới 90 oC, tách thu được dịch chiết ethanol chứa

5 – 10 ppm azadirachtin. Pha loãng dịch chiết này với nước, thêm chất nhũ hóa vào để

tạo dạng nhũ có nồng độ 2 - 4 ppm azadirachtin. Kiểm tra độ pH và điểu chỉnh nó về

trong khoảng 3.5 - 6. Sản phẩm thu được duy trì được 80% chất lượng khi ở dạng nhũ

tương trong 8 tuần và hơn 50% sau 2 năm.[36]

Năm 1990, Lidert cùng các cộng sự qua nghiên cứu đã chỉ ra rằng dịch chiết từ hạt

Neem có chứa những hydrogenation có hoạt tính chống sâu bọ tốt hơn dịch chiết không

có hydrogenation. Phương pháp tiến hành: dầu Neem ban đầu được loại bỏ bớt dầu và

các acid béo (sử dụng dung môi petroleum ether, hexane hay heptane). Sau đó chiết

bằng dung môi phân cực hơn (ethanol, methanol hoặc hỗn hợp nước với các rượu này)

để thu được dịch chiết có hoạt tính sinh học. Cho dung môi ethyl acetate vào dịch chiết

này để loại đường và protein. Cuối cùng hydo hóa để thu được sản phẩm diệt côn trùng

có hiệu quả và tác động lâu dài hơn.[43]

- Dịch chiết trước khi hydrat hóa thường chứa từ 15 – 50% azadirachtin. Khi

phương pháp hydrat hóa xúc tác được sử dụng, bước hydrat hóa được giám sát và tiếp




tục cho đến khi nồng độ azadirachtin giảm xuống chuyển thành dihydroazadirachtin

hoặc tetrahydroazadirachtin. Dùng tỷ lệ 1 - 5 mol hydrogen và 1 mol azadirachtin.[43]

- Dung môi tốt nhất để chiết có thể là methanol, hỗn hợp của methanol với nước

hoặc ethyl acetate. Xúc tác tốt nhất là palladium trên carbon, platinum oxide, nickel

boride và Raney nickel. Sự hydrat hóa nên được thực hiện trong khoảng 1 - 60 atm bầu

khí quyển của hidro và nhiệt độ 10 – 50 oC. Dịch chiết sau hydrat hóa trong điều kiện

tối ưu chứa từ 1 5- 50% dihydroazadirachtin. Điều đáng ngạc hơn là dịch chiết hydrat

hóa trong phát minh này cải thiện hoạt động trừ sâu hơn so với dich chiết ban đầu. Thuốc

trừ sâu này có tác dụng phổ rộng trên nhiều loài côn trùng loài Lepidoptera như bướm

Plutella, sâu bắp cải (loại nhập khẩu), cải bắp looper, budworm thuốc lá; loài Coleoptera

như Colorado khoai bọ cánh cứng; loài Homoptera như rệp táo xanh, đào rệp màu xanh

lá cây; và Homoptera như phễu lá khoai.[43]

- Liều lượng của các chiết xuất được tính toán dựa vào nồng độ của

dihydroazadirachtin trong dịch chiết, thông thường sử dụng 5 – 200 g/ha. Công thức

thức thuốc trừ sâu được xây dựng gồm: nước, chất phân tán, dd tạo độ nhờn (oily

solutions), chất phân tán dầu, bột nhão, bột khô, bột ướt, chất làm đặc nhũ, flowables,

nhũ tương,…. Với thành phần dihydroazadirachtin hay tetrahydroazadiractin sử dụng

lượng đáng kể từ 0.0001% đến 5%, tốt nhất nên từ khoảng 0.001% đến 3%.[43]

Năm 1995, Lidert và các cộng sự đã điều chế các chất chiết có độ tinh khiết cao từ

hạt cây Neem. Ban đầu, hạt Neem xay hay bánh dầu Neem được khuấy với nước, dung

dịch chia 2 lớp, tách lấy pha nước. Cho chất hấp thụ macroporous polymeric để thu được

phân đoạn giàu azadirachtin. Giải hấp bằng dung môi để thu được azadirachtin. Quá

trình này tạo ra chiết xuất chứa hơn 15% azadirachin. Chất hấp thụ macroporous

polymeric có thể là một polymer của divinylbenzene, một copolymer của

divinylbenzene/styrene, một acrylic polymer hay một phenol/formaldehyde copolymer.

Chất được chọn là polymer của divinylbenzene. Dung môi giải hấp được chọn là ethyl

acetate.[42]

Năm 1998, ông Panchapagesa Muthuswamy Murali cùng các cộng sự đã xây dựng

quá trình tạo ra một lượng giàu azadirachtin trong thành phần thuốc trừ sâu và làm bền

sản phẩm. Nhân hạt Neem đã được xay nhuyễn được chiết ngâm tối thiểu 3 lần với dung

môi phân cực acetone/nước tỷ lệ 90:10 ở nhiệt độ tối ưu 80 oC. Thu được dịch chiết qua




lọc mà không có cặn bùn của hạt Neem. Cho dichloromethane với lượng tương đương

thể tích dịch chiết, chiết 3 lần và gom lấy dịch chiết dichloromethane. Cho Na2SO4 vào

để làm khan nước còn lẫn trong dịch chiết dichloromethane. Sau đó, chưng cất dịch chiết

trên để thu hồi dichloromethane, AZ thu được dùng cho phối chế sản phẩm.[33] [34]

- Sau quá trình tinh chế để thu được azadirachtin với nồng độ cao, hòa tan nó

trong hỗn hợp 2 dung môi ethanol: nước với các tỷ lệ 100 – 70 : 0 – 30 (v/v), để pha

loãng nồng độ từ 20 – 40 ppm xuống 1 – 20 ppm azadirachtin ( m/v). Tạo nhũ của

azadirachtin 0.2% tới 30% (v/v) với chất nhũ hóa ion và không độc - Tween 20. Thêm

20 – 50% dầu Neem vào hỗn hợp. Điều chỉnh pH của dung dịch từ 3.5 đến 6 bằng dung

dịch kiềm ammonia hydroxide.[33] [34]

Thêm 1 - 2.5% tác nhân chống nắng của para-amino benzoic acid (PABA) hay

ester của nó và 1% oleic acid. Sau đó điều chỉnh lại pH để tạo ra sản phẩm bền vững.

Sản phẩm thu được duy trì được 65% hoạt tính sau hơn 2 năm.[33] [34]

1.5.2. Trong nước

Năm 1991, giáo sư Lâm Công Định đã viết một cuốn sách nói về loài cây Neem

được nhập nội vào Việt Nam và công bố những nghiên cứu về điều kiện khí hậu, canh

tác để phát triển loài cây này trên vùng đất cát nóng Tuy Phong – Bình Thuận.[8]

Năm 1999 – 2000, Viện sinh học Nhiệt dới Thành phố Hồ Chí Minh đã tiến hành

thử nghiệm dầu Neem lên sự phát triển bọ hà khoai lang và kết quả cho thấy có hiệu lực

phòng trừ tốt. Bên cạnh đó viện đã nhân giống cây Neem bằng nuôi cấy mô.[8]

Năm 2001, Dương Anh Tuấn và cộng sự thuộc Viện Hóa Học - Trung tâm Khoa

Học Tự Nhiên và Công Nghệ Quốc Gia nghiên cứu thành công việc chiết tách và tinh

sạch azadirachtin từ nhân hạt Neem và thử nghiệm hoạt tính gây ngán ăn trên sâu

khoang. Kết quả thu được azadirachtin 92%, hiệu suất chiết tách 0.054%, với liều lượng

7.89 mg/cm3 đạt chỉ số gây ngán ăn trung bình 71.54% và đạt 87% với liều lượng 15.6

mg/cm3.[3]

Năm 2003, Vũ Văn Độ, Nguyễn Tiến Thắng đã chiết xuất, tinh sạch và xác định

hàm lượng azadirachtin và salanin trong nhân hạt Neem.

Năm 2003, Vũ Đăng Khánh đã khảo sát hoạt tính kháng một số loài nấm gây bệnh

và nấm Aspergiluss flavus sinh độc tố aflatoxins của sản phẩm chiết xuất từ cây Neem

trồng Việt Nam.[16]




Năm 2004, ThS. Lê Thị Thanh Phượng đã chiết xuất được các hoạt chất sinh học

từ hạt Neem và khảo sát tác động của chúng đối với ngài gạo (Corcyra cephalonica

St).[9]

Năm 2005, Vũ Văn Độ, Vũ Đăng Khánh và Nguyễn Tiến Thắng thuộc Viện Sinh

học Nhiệt Đới- Trung tâm Khoa Học Tự Nhiên và Công Nghệ Quốc Gia đã đánh giá

được độ độc của chế phẩm phối trộn giữa dầu Neem với Bt (Baccillus thuringiensis) đối

với sâu xanh (Heliothis armigara), sâu tơ (Plutella xylostella). Kết quả chế phẩm phối

trộn giữa dầu Neem và Bt có tác dụng mạnh hơn so với sản phẩm chỉ chứa dầu Neem

hay Bt; hiệu quả gây chết mạnh nhất và rõ ràng nhất ở nồng độ 32% dầu Neem và 10%

hay 15% Bt.[15]

1.6. Phương pháp thử hoạt tính khuẩn

Phương pháp khoanh giấy

Nguyên tắc: phương pháp thử hoạt tính ức chế vi khuẩn là phương pháp của

Hadacek et al (2000). Chủng vi khuẩn sau khi được hoạt hóa từ ống chủng gốc trên môi

trường MP đặc, một khuẩn lạc được cấy chuyển sang 5 ml môi trường TSB lỏng và lắc

qua đêm ở nhiệt độ 37 oC đĩa thử hoạt tính được chuẩn bị bằng cách cấy trải 100μl dịch

khuẩn, nồng độ tương đương 4-5 × 108 CFU/ml lên bề mặt đĩa petri có chứa môi trường

LB đặc. Chuẩn bị dịch thử bằng cách hòa tan cao trong DMSO 5% thành các nồng độ

theo yêu cầu. Đối chứng dương là dung dịch kháng sinh (Ampicilin 10 μg/ml,

Tetracyclin 30 μg/ml, Amoxilin 10 μg/ml); đối chứng âm là DMSO. Hoạt tính ức chế

khuẩn được đánh giá bằng cách đo bán kính (BK) vòng ức chế vi sinh vật bằng công

thức: BK (mm) = D – d; trong đó D = đường kính vòng vô khuẩn và d = đường kính lỗ

khoan thạch. Thí nghiệm được lặp lại ba lần và lấy giá trị bán kính trung bình.

1.6.1. Staphylococcus aureus (Gr +)

Staphylococcus aureus do Robert Koch (1843 - 1910) phát hiện vào năm 1878,

phân lập từ mủ ung nhọt và Loius Pasteur (1880) đều nghiên cứu tụ cầu khuẩn từ thời

kỳ đầu của lịch sử ngành vi sinh vật học.

Phân loại khoa học:

Giới (Kingdom): Eubacteria

Ngành (Division): Firmicutes

Lớp (Class): Bacilli




Bộ (Order): Bacillales

Họ (Family): Staphylococcaceae

Giống (Genus): Staphylococcus

Loài (Species): Staphylococcus aureus

Staphylococcus có nguồn từ tiếng Hy Lạp staphyle nghĩa là chùm nho là các cầu

khuẩn kị khí tuỳ ý. Vi khuẩn Gram dương, không di động, không sinh nha bào và thường

không có vỏ,có hình cầu, đường kính 0.8 – 1 µm, hình thức tập hợp này do vi khuẩn

phân bào theo nhiều chiều trong không gian; trong bệnh phẩm vi khuẩn có thể đứng lẻ,

từng đôi hoặc đám nhỏ.

Một số Staphylococcus được tìm thấy khắp nơi và có thể phân lập từ không khí,

bụi, thực phẩm, thường trú ở vùng da và niêm mạc của người.

Giống Staphylococcus có hơn 20 loài khác nhau, trong đó có 3 loài tụ cầu có vai

trò trong y học:

- Staphylococcus aureus (S. aureus): Tụ cầu vàng được xem là tụ cầu gây

bệnh.

- Staphylococcus epidermidis (Tụ cầu da).

- Staphylococcus saprophyticus.

Staphylococcus aureus phát triển dễ dàng ở môi trường thông thường, không thể

sinh trưởng ở nhiệt độ thấp. Theo Mc Landsborough L. (2005), nhiệt độ sinh trưởng tối

ưu của S. aureus là 18 – 40 ℃, pH = 7.2. Tuy nhiên mọc tốt nhất ở 25 ℃, hiếu khí hay

kỵ khí tuỳ ý. Ở canh thang, sau 5 – 6 giờ làm đục môi trường, sau 24 giờ làm đục rõ. Ở

môi trường đặc, khuẩn lạc tròn lồi, bóng láng, óng ánh co thể có màu vàng đậm, màu

vàng cam hoặc màu trắng, tương đối lớn sau 24 giờ. Ngoài ra S. aureus có thể sinh

trưởng được trên môi trường có hoạt độ thấp hơn các loài vi khuẩn khác hoặc môi trường

có nồng độ muối cao.

Khi phát hiện trong môi trường, tạo sắc tố vàng sau 1 - 2 ngày nuôi cấy ở nhiệt độ

phòng và đều tổng hợp enterotoxin ở nhiệt độ trên 15 ℃, nhiều nhất là khi tăng trưởng

ở 35 – 37 ℃.




Hình 1.10: Vi khuẩn Staphylococus trên kính hiển vi

Staphylococcus aureus có trong nhiều môi trường sống trước đây, thường sống ký

sinh vô hại, nhưng cũng có thể gây bệnh, đặc biệt là khi Staphylococcus aureus (SA)

xâm nhập hoặc xuyên qua da, chúng có thể gây ra nhiều loại nhiễm trùng khác nhau,

chẳng hạn như các sự nhiễm trùng da, làm loét, phỏng da hoặc các sự nhiễm trùng nặng

trong máu, phổi hoặc các mô khác.

Tính chất sinh hoá và đề kháng

Tụ cầu vàng tương đối chịu nhiệt và thuốc sát khuẩn hơn những vi khuẩn khác,

chịu độ khô và có thể sống ở môi trường nồng độ NaCl cao (9%), nhiều chủng tụ cầu

vàng đề kháng với penicillin và các kháng sinh khác.

S. aureus có phản ứng DNase, Catalase (+) (chuyển hoá hydrogen peroxit thành

nước và oxygen, phosphase (+), có khả năng lên men và sinh acid từ mannitol, trehalose,

sucrose, desoxyribonuclease là enzyme phân giải DNA. Tất cả các dòng S. aureus đều

mẫn cảm với novobiocine.

Cấu trúc kháng nguyên

Các tụ cầu có nhiều loại kháng nguyên: protein, polysaccharide, acid teichoic ở

vách tế bào.

Vách tế bào chứa kháng nguyên polysaccharide, kháng nguyên protein A ở bề mặt.

Người ta có thể căn cứ vào các kháng nguyên trên để chia tụ cầu thành nhóm, tuy nhiên

phản ứng huyết thanh không có giá trị trong chẩn đoán vi khuẩn.

Độc tố - Enzym

Khả năng gây bệnh của tụ cầu vàng là do vi khuẩn phát triển nhanh và lan tràn

rộng rãi trong mô cũng như tạo thành nhiều độc tố và enzyme. Một số chủng thuộc

loài S. aureus có khả năng sinh tổng hợp enterotoxin khi chúng nhiễm vào thực phẩm.




Độc tố: Hầu hết các dòng S. aureus có thể tổng hợp enterotoxin trong môi trường

có nhiệt độ trên 15 ℃ hơn cả vi khuẩn. Độc tố ruột enterotoxin sản xuất bởi S. aureus là

một protein ổn định nhiệt,nhiều nhất khi tăng trưởng ở nhiệt độ 35 – 37 ℃ và có thể tồn

tại nhiệt ở 100 ℃ trong vòng 30 – 700 phút.

Các enzyme ngoại bào:

- Protease phân giải protein của tế bào chủ.

- Lipase phân giải lipid.

- Deoxyribonuclease (DNase) phân giải DNA và các enzyme sửa đổi acid béo

(FAME).

1.6.2. Pseudomonas aeruginosa (Gr -)

Theo phân loại của Bergey D.G.(1984), Pseudomonas aeruginosa thuộc

giống Pseudomonas, họ Pseudomonadaceae. Căn cứ vào sự tương đồng rARN/ADN và

những đặc điểm nuôi cấy thông thường, người ta chia giống Pseudomonas thành 92 loài

khác nhau, trong đó Pseudomonas aeruginosa là một trong số 12 loài có liên quan nhiều

đến y học.

Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa) là trực khuẩn Gram âm, nhỏ, đứng

riêng lẻ, thành đôi và có khi xếp thành chuỗi. Di động nhờ một lông duy nhất ở một cực.

Có pili, không bào tử.

Phân loại khoa học:

Giới (Kingdom): Bacteria

Ngành (Division): Proteobacteria

Lớp (Class): Gamma proteobacteria

Bộ (Order): Pseudomonadales

Họ (Family): Pseudomonas

Giống (Genus): Pseudomonas aeruginosa




Hình 1.11: Vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa trên kính hiển vi

Sức đề kháng

Có sức đề kháng cao với các yếu tố lý hoá.

Có khả năng đề kháng kháng sinh cao.

Kháng nguyên

Kháng nguyên liên kết với tế bào:

- Protein màng ngoài: Các protein ở màng ngoài tế bào có thể kết hợp với LPS

tạo thành những thụ thể đặc hiệu của trực khuẩn mủ xanh.

- Polysaccharide ngoại tiết: cCó 2 loại polysaccharide được tạo ra bởi những

chủng P. aeruginosacó khuẩn lạc dạng M và dạng R.

Các kháng nguyên ngoại bào: Vi khuẩn tiết ra rất nhiều chất chuyển hoá trong môi

trường (protease, elastase, exotoxin A, glycocalx, hemolysine, ...) là những yếu tố độc

lực của vi khuẩn đồng thời còn là những kháng nguyên được nghiên cứu để sử dụng chế

tạo vaccine gây miễn dịch.

Phân loại trực khuẩn mủ xanh

Việc xác định type rất có ý nghĩa trong phân loại, xác định tính phổ biến và sự

phân bố của vi khuẩn theo địa dư và các loại bệnh, để từ đó có cơ sở nghiên cứu chế tạo

ra các chế phẩm miễn dịch phòng và điều trị các nhiễm khuẩn do P. aeruginosa. Mặt

khác, các phương pháp xác định type cũng có tầm quan trọng trong điều tra dịch tễ học

quá trình lây nhiễm loài vi khuẩn này. Những phương pháp hay sử dụng nhất là serotype,

lysotype và pyocinotype; các phương pháp này cho phép xác định type của 90 – 95% số

chủng P. aeruginosa. Theo Uỷ ban phân loại Quốc tế, việc định kháng nguyên O

(serotype) chia P. aeruginosathành 16 nhóm kháng nguyên được ký hiệu từ O1 đến O16

(hoặc P1 đến P16).

Nội độc tố

Là thành phần của vách tế bào vi khuẩn. Nội độc tố bao gồm chủ yếu là LPS và

một lượng nhỏ protein. Hoạt tính sinh học của nội độc tố chủ yếu do phức hợp LPS đảm

nhiệm. LPS có vai trò quan trọng trong bệnh sinh nhiễm khuẩn huyết và sốc nhiễm

khuẩn huyết.

Ngoại độc tố

Bản chất là protein có trọng lượng phân tử 66.6 kDa. Exotoxin A hoạt động tượng




tự như cơ chế hoạt động của độc tố vi khuẩn bạch hầu. Với khả năng khuếch tán và ức

chế sự tổng hợp protein của tế bào, exotoxin A là một độc tố mạnh nhất của P.

aeruginosa. Exotoxin A gây rối loạn chức năng huyết động trung tâm, thay đổi chức

năng đông máu, rối loạn chuyển hoá lipit, gây tổn thương nhiều cơ quan, nhưng biểu

hiện rõ rệt nhất là tổn thương gan 90% số chủng P. aeruginosa sản xuất exotoxin A độc

tố này rất khác nhau tuỳ từng chủng.

1.7. Một số phương pháp chiết cao Neem

1.7.1. Các phương pháp truyền thống

Chiết là phương pháp dùng một dung môi (đơn hay hỗn hợp) để tách lấy một chất

hay một nhóm chất từ hỗn hợp cần nghiên cứu.

Chiết là phương pháp được thực hiện nhằm mục đích điều chế hay phân tích.

Phương pháp chiết là bao gồm cả việc chọn dung môi, dụng cụ chiết và cách chiết.

Một phương pháp chiết thích hợp chỉ có thể được chọn khi đã biết rõ thành phần

của các chất cần chiết. Mỗi loại hợp chất có độ tan khác nhau trong từng loại dung môi,

vì vậy không có một phương pháp chiết chung nào áp dụng cho các hợp chất thiên nhiên.

Phương pháp chiết thông dụng hiện nay là chiết nóng bằng dụng cụ chiết liên tục

hay hồi lưu. Sau mỗi lần chiết với một loại dung môi cần làm khô hợp chất thiên nhiên

rồi mới tiếp tục chiết với loại dung môi tiếp theo. Mỗi phân đoạn chiết, cất thu hồi dung

môi và tiến hành phân tích riêng.

Có hai cách chiết: Chiết ở nhiệt độ thường và chiết nóng. Mỗi cách chiết có dung

môi và thiết bị riêng.

- Chiết ở nhiệt độ thường: Có 2 cách là ngâm kiệt và ngâm phân đoạn. Phương

pháp ngâm kiệt cho kết quả tốt hơn vì chiết được nhiều hoạt chất và tiết kiệm

được dung môi.

- Chiết nóng: Thường áp dụng chiết liên tục hoặc hồi lưu đối với dung môi dễ

bay hơi.

Dung môi dùng để chiết các hợp chất khỏi hợp chất thiên nhiên rất đa dạng và thay

đổi tùy theo bản chất của mỗi loại hợp chất thiên nhiên. Vì vậy cơ sở để lựa chọn dung

môi chiết là tính phân cực của hợp chất chứa trong hợp chất thiên nhiên và của dung

môi.




Chiết soxhlet là một phương pháp chiết liên tục, được dùng để tách chất phân tích

ra khỏi mẫu vật rắn (thực vật, đất, các mẫu sinh học,… ) bằng một dung môi thích hợp.

Bộ chiết soxhlet gồm một bình cầu, một thiết bị chiết và một sinh hàn hồi lưu. Chất phân

tích chứa trong thiết bị chiết, dung môi chứa trong bình cầu. Quá trình chiết xảy ra khi

hơi nóng dung môi bốc lên bao quanh thiết bị chiết gặp sinh hàn ngưng tụ ngấm vào chất

phân tích. Với phương pháp này thì chất phân tích được chiết với dung môi nóng. Ưu

điểm của phương pháp này là có thể thu hồi dung môi trực tiếp trên thiết bị chiết và có

thể sử dụng lại cho quá trình chiết tiếp theo.

Ưu nhược điểm của phương pháp truyền thống

Trong đó, chiết ngấm kiệt có đối lưu dòng dung môi và ngâm dầm có khuấy trộn

có ưu điểm là thiết bị đơn giản, đồng thời chiết tách được một lượng mẫu lớn và có thể

đạt hiệu suất chiết tách cao đối với chất hòa tan cũng như các hoạt chất sinh học. Tuy

nhiên, lại cần nhiều thời gian, tốn dung môi, dung môi sử dụng phải tinh khiết, nồng độ

chất nghiên cứu trong dịch chiết thu được thấp, phải tốn nhiều thời gian và công sức để

loại dung môi ra khỏi dịch chiết để thu cao. Chiết bằng thiết bị soxhlet có ưu điểm tiết

kiệm dung môi hơn, ít tốn thời gian, nồng độ chất chiết trong dịch chiết tách cao. Tuy

nhiên, không thể tiến hành một lượng lớn mẫu cùng lúc và hợp chất có thể bị ảnh hưởng

do nhiệt độ cao trong quá trình trích ly.

1.7.2. Các phương pháp hiện đại

Chiết tách có sự hỗ trợ của:

- Sóng siêu âm.

- Xung điện.

- Enzyme.

- Vi sóng.

- Áp suất cao.

- Chất lỏng siêu tới hạn.

Ưu nhược điểm của phương pháp hiện đại

Các phương pháp chiết tách hiện đại sẽ rút ngắn được thời gian trích ly, giảm lượng

dung môi phải sử dụng nhưng hiệu quả thu hồi vẫn gần bằng và cao hơn so với phương

pháp chiết tách chỉ dùng nhiệt độ và dung môi đối lưu. Hiệu quả quá trình còn phụ thuộc

vào các thông số kỹ thuật đặc trưng của từng phương pháp. Tuy nhiên, nhược điểm của




các phương pháp chiết tách hiện đại là đòi hỏi phải có thiết bị phù hợp và chi phí cũng

cao hơn.

Dịch sau chiết tách được đem cô giảm áp để loại dung môi, thu cao chiết thô chứa

flavonoid. Cao này sau cùng sẽ trải qua các quá trình tinh chế để tách riêng phần

flavonoid. Có một số phương pháp khác nhau để thực hiện quá trình này, chủ yếu dựa

trên kỹ thuật chiết lỏng lỏng hoặc kỹ thuật chiết pha rắn (SPE: solid phase extraction).

Kỹ thuật chiết lỏng - lỏng đơn giản, dễ thực hiện, không đòi hỏi thiết bị nhưng có nhược

điểm là hiệu quả thu hồi thấp, dễ gây sai số, tốn thời gian và dung môi. Ngày nay, SPE

được sử dụng phổ biến vì tốn ít thời gian, cho kết quả nhanh, tiện lợi, hiệu quả về mặt

kinh tế và có thể hoàn toàn tự động.[24]

1.8. Hoạt tính kháng oxi hóa của cao Neem [21]

Một phương pháp xác định lực kháng oxy hoá tổng (total antioxydant capacity)

khác dựa theo mô hình phospho molybdenum bằng phép đo quang phổ trên cơ sở việc

khử Mo (VI) thành Mo (V) bằng chất phân tích mẫu và sự hình thành tiếp theo của phức

chất atacidic photphat/Mo (V) màu xanh lá cây. Phương pháp này đã được tối ưu hóa

và đặc trưng theo khoảng cách tuyến tính, độ lặp lại và độ tái lập và hệ số hấp thụ mol

để định lượng một số chất chống oxy hóa.

Phương pháp này phù hợp với quy mô và thiết bị của phòng thí nghiệm trường Đại

Học Bà Rịa Vũng Tàu nên chúng tôi quyết định sử dụng phương pháp này để xác định

lực kháng oxy hóa của cao Neem.

1.9. Một số phương pháp định tính, định lượng cao Neem

1.9.1. Phương pháp định tính bằng các phản ứng và thuốc thử

1.9.1.2. Định tính Steroid – triterpenoid

Đặc điểm: Steroid là những alcol thể rắn được phân bố rộng rãi trong tự nhiên, cấu

trúc tổng quát vòng cyclopentanopentanoperhyrophenantren hoặc một vài trường hợp

hiếm gặp là dạng biến đổi của hệ thống vòng nói trên. Steroid có nguồn gốc sinh tổng

hợp như triterpen với chất liệu cơ bản là pharnesyl pyrophosphat. Sterol thuộc nhóm

steroid, phân bố rộng rãi, thường có mặt song song với các alkaloid hoặc saponinsteroid.

Chúng có nguồn gốc động vật (cholesterol) hoặc thực vật (phytosterol, β – sitosterol,

ergosterol, stigmasterol,…). Sterol có mặt trong tất cả các bộ phận của cây nhưng có

nhiều nhất ở các hạt có dầu dưới dạng tự do hoặc các ester. Sterol là chất không phân




cực, rất ít tan trong nước, tan trong dầu béo, carotene. Tan nhiều trong các dung môi

không phân cực như petroleum ether, benzen, chloroform, nên thường dùng các dung

môi này để chiết sterol. Sản phẩm chiết được bằng dung môi hữu cơ thường là hỗn hợp

các ester sterol kết hợp vớ i lipid, carotene, lecitin. Phải qua giai đoạn xà phòng hóa để

tách các chất này ra khỏi sterol, sau đó chiết sterol bằng dung môi hữu cơ. Tinh chế bằng

kết tinh phân đoạn.

Một số thuốc thử nhận biết Steroid – triterpenoid:

- Thuốc thử Liebermann – Burchard:

- Anhidrid acetic 1 ml

- H2SO4 đậm đặc

Nếu xuất hiện màu lục, hồng, cam hoặc đỏ và bền là phản ứng dương tính.

Thuốc thử Salkowski: H2SO4 đậm đặc, nếu xuất hiện màu đỏ đậm, xanh, xanh tím

là phản ứng dương tính.

Phản ứng Rosenthaler để phát hiện Steroid – triterpenoid:

- Vanilin 1% ethanol 2 giọt, 10 ml nước cất.

- Hỗn hợp hai dung dịch và thêm đủ 100 ml nước cất.

Nếu có Alkaloid sẽ xuất hiện tủa trắng hoặc vàng nhạt.

1.9.1.3. Định tính Alkaloid

Đặc điểm: Alkaloid là những hợp chất hữu cơ chứa dị vòng nitơ, có tính base,

thường gặp ở nhiều loại thực vật, đôi khi còn tìm thấy trong một số loài động vật.

Alkaloid tồn tại ở hai trạng thái rắn và lỏng. Đa số chúng không tan trong nước (trừ

nicotin và coniine), hầu hết tan trong dung môi hữu cơ như benzen, ether, chloroform,…

Các alkaloid đa số không mùi và có vị đắng, một số ít có vị cay (piperine).

Đặc biệt alkaloid có hoạt tính sinh lý cao đối với cơ thể người và động vật, nhất là

đối với hệ thống thần kinh. Với một lượng nhỏ, alkaloid có thể là chất độc gây chết

người (như thuốc phiện, heroin), nhưng nó có khi lại là thần dược trị bệnh đặc hiệu hay

thành phần quan trọng trong một số thực phẩm (như cacao, cà phê,…).

Alkaloid có chứa lưu huỳnh thường có độc tính rất mạnh, có nhiều trong các loại

nấm độc.

Một số thuốc thử Alkaloid:

Thuốc thử Mayer:




- Dung dịch 1: Hòa tan 1,36 g HgCl2 trong 60 mL nước cất.

- Dung dịch 2: Hòa tan 5 g KI trong 10 ml nước cất.

- Hỗn hợp hai dung dịch và thêm đủ 100 ml nước cất.

Nếu có alkaloid sẽ xuất hiện tủa trắng hoặc vàng nhạt.

Thuốc thử Wagner:

- I2 1,27g

- KI 2 g

- H2O vừa đủ 100 ml

Nếu có alkaloid sẽ xuất hiện tủa màu nâu.

1.9.1.4. Định tính Flavonoid

Đặc điểm: Flavonoid là những hợp chất màu phenol thực vật, tạo nên rất nhiều

màu cho rau, quả, hoa,... Phần lớn chúng có màu vàng, một số ít có màu xanh, tím, đỏ

hay không màu. Một số alkaloid tan trong nước, rượu, acid vô cơ loãng và base băng.

Flavonoid có cấu trúc cơ bản là 1,3 diphenylpropan, gồm 2 vòng benzen A và B

nối với nhau qua một dây 3 carbon, nên thường gọi là C6-C3-C6. Nếu dây C3 đóng thì

đánh số bắt đầu từ dị vòng với dị nguyên tố oxygen mang số 1, rồi đánh tiếp đến vòng

A, còn vòng B đánh số phụ.

Nếu dây C3 hở, đánh số chính trên vòng B và đánh số phụ trên vòng A.

Một số thuốc thử Flavnoid:

Với dung dịch FeCl3 bão hòa: Nếu tạo thành dung dịch màu xanh đen là phản ứng

dương tính.

Với dung dịch H2SO4 đậm đặc: Xuất hiện màu vàng đậm đến cam hoặc đỏ đến

xanh dương, tùy vào loại hợp chất khác nhau mà có màu khác nhau.

1.9.1.5. Định tính saponin

Định tính khả năng tạo bọt của saponin trong môi trường acid, base:

Thuốc thử:

- HCl 0,1N

- NaOH 0,1N

Nếu ống pH = 13 cột bọt cao hơn nhiều so với ống pH = 1, có thể có saponin

steroid.

Dựa vào chỉ số tạo bọt để xác định sự hiện diện của saponin




Cơ sở phương pháp:

Chỉ số tạo bọt của saponin là độ loãng của nguyên liệu bằng nước để có chiều cao

1 cm khi lắc trong ống nghiệm có kích thước xác định, tiến hành trong điều kiện quy

định. Cách tiến hành: Cân 1 g bột nguyên liệu cho vào erlen 500 mL chứa sẵn 100 mL

nước sôi. Tiếp tục cho nước trong erlen sôi thêm 30 phút nữa. Lọc, để nguội, thêm nước

cất đến 100 mL. Lấy 10 ống nghiệm có chiều cao 16 cm, đường kính 16 mm. Cho vào

các ống nghiệm lần lượt 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 mL dịch lọc. Thêm nước cất vào mỗi

ống cho đủ 10 mL. Bịt miệng ống nghiệm rồi lắc theo chiều dọc của ống trong 15 giây.

Mỗi giây 2 lần. Để yên 15 phút, sau đó đo xác định ống nghiệm có chiều cao 1 cm. Chỉ

số tạo bọt được tính theo công thức:

CSB = 100 × 10𝑖

Trong đó:

CSB: Chỉ số tạo bọt

i: Ống nhiệm thứ i có bọt cao trên 1 cm

Nếu cột bọt trong các ống nghiệm thấp dưới 1 cm (tức chỉ số tạo bọt dưới 100) thì

coi như không có saponin.

1.9.1.6. Định tính Cacbonhyđrat

Lấy 2 ml dịch chiết được xử lý bằng 2 giọt dung dịch α – Naphthol có cồn trong

ống nghiệm và sau đó 1 ml axit sunfuric đậm đặc được thêm cẩn thận dọc theo hai bên

thành ống nghiệm.

Nếu lớp giữa xuất hiện màu tím cho thấy có sự hiện diện của Cacbonhyđrat.

1.9.2. Phương pháp phân tích trọng lượng

Phương pháp phân tích trọng lượng là phương pháp phân tích định lượng dựa vào

kết quả cân của khối lượng một chất tinh khiết hay ở dạng đơn chất có trong mẫu cần

phân tích.

Quá trình phân tích một chất theo phương pháp trọng lượng bao gồm các giai đoạn

sau:

- Chọn mẫu và gia công mẫu.

- Tách trực tiếp chất cần xác định hoặc các hợp phần của nó khỏi sản phẩm phân

tích dưới trạng thái tinh khiết hóa học. Tuy nhiên trong nhiều trường hợp việc

làm này rất khó khăn, nhiều khi không thực hiện được, do đó chất cần xác định




thường được tách ra thành kết tủa dưới dạng hợp chất có thành phần xác định.

Để làm điều đó ta thực hiện như sau: đưa mẫu vào dung dịch (phá mẫu) và tìm

cách tách chất nghiên cứu khỏi dung dịch.

- Xử lý sản phẩm đã tách bằng biện pháp thích hợp (rửa, nung, sấy,…) rồi đem cân

để tính kết quả.

- Mặc dù phải thực hiện với thời gian dài nhưng phương pháp này có độ chính xác

cao nên được dùng để xác định hàm lượng các chất như kim loại, phi kim, thành

phần của quặng, silicat, hợp chất hữu cơ,…

1.9.3. Phương pháp sắc ký khí ghép khối phổ (GC – MS)

Phương pháp sắc ký khí ghép khối phổ (GC – MS) là một trong những phương

pháp sắc ký hiện đại nhất hiện nay với độ nhạy và độ đặc hiệu cao được sử dụng trong

các nghiên cứu và phân tích kết hợp. Bản chất GC – MS là sự kết hợp của sắc ký khí và

khối phổ.

Sắc ký khí (GC) dùng để phân tích hỗn hợp các chất và tìm ra chất cần phân tích.

Thành phần hỗn hợp trong pha động tương tác với pha tĩnh theo một tỷ lệ khác nhau.

Hợp chất tương tác nhanh sẽ thoát ra khỏi cột trước và hợp chất tương tác chậm sẽ ra

khỏi cột sau. Đó là đặc trưng cơ bản của pha động và pha tĩnh. Quá trình chia tách có

thể xảy ra bởi sự thay đổi nhiệt độ của pha tĩnh hoặc là áp suất của pha động.

Khối phổ (MS) là phương pháp nghiên cứu các chất, bằng cách đo chính xác khối

lượng phân tử chất đó, dựa trên điện tích của ion, dùng thiết bị chuyên dụng là khối

phổ kế. Ưu điểm của GC – MS là chỉ cần một lượng mẫu nhỏ 1 – 5 µ với ngưỡng phát

hiện của là 1 picogram, kết quả thu được rất nhanh chóng (chỉ từ 1 – 100 phút). Vì vậy

được ứng dụng để phân tách, định lượng, nhận dạng các chất.

Cấu tạo và nguyên tắc hoạt động

Cửa tiêm mẫu (injection port): 1 microliter dung môi chứa hỗn hợp các chất sẽ

được tiêm vào hệ thống ở cửa này. Mẫu sau đó được dẫn qua hệ thống bởi khí trơ,

thường là helium. Nhiệt độ ở cửa tiêm mẫu được nâng lên 300c để mẫu trở thành dạng

khí.

Vỏ ngoài (oven): phần vỏ của hệ thống GC chính là lò nung đặc biệt. nhiệt độ của

lò này dao động từ 40 – 320 oC.

Cột (cloumn):




- Bên trong hệ thống GC là một cuộn ống nhỏ hình trụ có chiều dài 30m với mặt

trong được tráng bằng một loại polymer đặc biệt. Các chất trong hỗn hợp được

phân tách bằng cách chạy dọc theo cột này.

- Sau đó đi qua cột sắc ký khí, các hóa chất tiếp tục đi vào pha khối phổ. ở đây

chúng bị ion hóa. Sau khi khối phổ, chúng sẽ tới bộ phận lọc dựa trên khối

lượng, bộ lọc lựa chọn chỉ cho phép các hạt có khối lượng nằm trong một giới

hạn nhất định đi qua. Thiết bị cảm biến có nhiệm vụ đếm số lượng các hạt có

cùng khối lượng. Thông tin này sau đó được chuyển đến máy tính và xuất ra

kết qua gọi là khối phổ. Khối phổ là một biểu đồ phản ánh số lượng các ion

với các khối lượng khác nhau đã đi qua bộ lọc.

Máy tính: bộ phận chịu trách nhiệm tính toán các tín hiệu do bộ cảm biến cung cấp

và đưa ra kết quả khối phổ.

Ứng dụng của phương pháp sắc ký khí khối phổ

Xác định công thức phân tử, dựa vào cường độ tương đối của ion phân tử đồng vị

xuất hiện trong phổ đồ.

Xác định công thức cấu tạo:dựa vào giá trị m/e, cường độ tương đối của các ion

phân tử cũng như ion mảng.

Định lượng thành phần nguyên tố của ion cần xác định.

1.9.4. Phương pháp sắc ký lỏng ghép đầu dò khối phổ (LC – MS)

Phương pháp khối phổ (Mass Spectrometry - MS) là phương pháp nghiên cứu các

chất bằng cách đo, phân tích chính xác khối lượng phân tử của chất đó dựa trên sự

chuyển động của các ion nguyên tử hay ion phân tử trong một điện trường hoặc từ trường

nhất định. Tỉ số giữa khối lượng và điện tích (m/z) có ảnh hưởng rất lớn đối với chuyển

động này của ion. Nếu biết được điện tích của ion thì ta dễ dàng xác định được khối

lượng của ion đó.

Như vậy, trong nghiên cứu khối phổ của bất kỳ chất nào, trước tiên nó phải được

chuyển sang trạng thái bay hơi, sau đó được ion hoá bằng các phương pháp thích hợp.

Các ion tạo thành được đưa vào nghiên cứu trong bộ phân tích khối của máy khối phổ.

Tùy theo loại điện tích của ion nghiên cứu mà người ta chọn kiểu quét ion dương (+)

hoặc âm (-). Kiểu quét ion dương thường cho nhiều thông tin hơn về ion nghiên cứu nên

được dùng phổ biến hơn.




Tuy nhiên, sự phát triển của kỹ thuật hiện nay cũng đã cho phép tích hợp hai kiểu

quét này thành một nhằm tạo điều kiện thuận lợi nhất cho các nhà nghiên cứu, tuy nhiên

thường độ nhạy không cao bằng từng kiểu quét riêng lẻ.

Trong rất nhiều năm, các nhà nghiên cứu kỹ thuật sắc ký lỏng ghép khối phổ phải

đối mặt với rất nhiều khó khăn trong việc tìm cách giải quyết được sự tương thích giữa

hệ thống sắc ký lỏng và đầu dò khối phổ. Nguyên nhân là do quá trình phân tích với đầu

dò MS đòi hỏi mức độ chân không cao, nhiệt độ cao, các chất khảo sát phải ở trạng thái

khí, vận tốc dòng chảy nhỏ; trong khi hệ thống LC lại hoạt động ở áp suất cao với một

lượng dung môi tương đối lớn, nhiệt độ tương đối thấp, các chất phân tích ở thể lỏng.

Để khắc phục những khó khăn trên, cần phải có một kỹ thuật trung gian gọi là giao

diện. Rất nhiều kỹ thuật giao diện (interface technology) như chùm tia hạt (FB), bắn phá

nguyên tử nhanh dòng liên tục (CF-FAB),… đã được nghiên cứu và ứng dụng, nhưng

mãi cho đến cuối thập nhiên 80, mới có sự đột phá thật sự với kỹ thuật ion hóa tại áp

suất khí quyển (Atmospheric Pressure Ionization – API).

Ưu điểm nổi bật của API là khả năng hình thành ion tại áp suất khí quyển ngay

trong buồng ion hóa. Điều này khác biệt với các kiểu ion hóa sử dụng trước đó cho

LC/MS như bắn phá nguyên tử nhanh với dòng liên tục (continuous flow - fast atom

bombardment CF-FAB) hay như tia nhiệt (thermospray – TS) đều đòi hỏi áp suất thấp.

Một thuận lợi nữa của API là sự ion hóa mềm (soft ionization), không phá vỡ cấu trúc

của hợp chất cần phân tích nhờ đó thu được khối phổ của ion phân tử. Ngoài ra, với kỹ

thuật này, người ta có thể điều khiển được quá trình phá vỡ ion phân tử để tạo ra những

ion con tùy theo yêu cầu phân tích.

Có ba kiểu hình thành ion ứng dụng cho nguồn API trong LC/MS:

- Ion hóa tia điện (electrospray ionization – ESI).

- Ion hóa hóa học tại áp suất khí quyển (atmospheric pressure chemical

ionization – APCI).

- Ion hóa bằng photon tại áp suất khí quyển (Atmospheric Pressure

Photoionization – APPI).

Trong đó, hai kỹ thuật APCI và ESI, đặc biệt là ESI được sử dụng nhiều hơn cả.




CHƯƠNG 2: THỰC NGHIỆM

2.1. Địa điểm và nguyên vật liệu

2.1.1. Địa điểm nghiên cứu

Phòng thí nghiệm Trường Đại học Bà Rịa – Vũng Tàu (cơ sở 3), 951 Bình Giã,

phường Rạch Dừa, thành phố Vũng Tàu, tỉnh Bà Rịa – Vũng Tàu.

2.1.2. Đối tượng nghiên cứu

Nguyên liệu sử dụng để chiết dịch chiết trong nghiên cứu này là lá Neem Ấn Độ

được mua tại Công ty thảo dược An Quốc Thái, phường 11, quận Tân Bình, Thành phố

Hồ Chí Minh.

Hình 2. 1: Lá Neem tươi Hình 2.2: Lá Neem khô

2.1.3. Dụng cụ - thiết bị và hóa chất

Trong nghiên cứu này chúng tôi sử dụng các thiết bị, dụng cụ và hóa chất được liệt

kê như sau:

2.1.3.1. Dụng cụ - thiết bị

Dụng cụ

- Bộ Soxhlet.

- Bình cầu 1 cổ, 2 cổ (250ml, 500ml).

- Erlen (100ml, 250ml).

- Becher (100ml, 250ml, 500ml).

- Phiễu chiết (250ml).

- Ống đong (5ml, 10ml, 250ml, 500ml).

- Nhiệt kế.




- Pipet (2ml, 5ml, 10ml).

- Ống nghiệm.

- Đĩa petri.

- Đũa thủy tinh.

- Bình tia.

- Gía đỡ ống nghiệm.

- Bóp cao su.

Thiết bị

- Máy chiết cô chân không tuần hoàn.

- Bếp điện.

- Tủ sấy

- Máy xay nguyên liệu

- Cân phân tích, cân kĩ thuật.

- Máy quang phổ UV - Vis Perkin Elmer.

- Máy sắc khí phổ GC/MS.

- Máy sắc khí phổ LC/MS.

- Nồi hấp khử trùng.

2.1.3.2. Hóa chất

- Ethanol 96o, Trung Quốc

- Methanol, Trung Quốc

- Ethyl Acetate, Trung Quốc

- Chloroform, Trung Quốc

- Hexan, Trung Quốc

- AlCl3 10, Trung Quốc

- FeCl3, Trung Quốc

- KI, Trung Quốc

- NaOH, Trung Quốc

- Tween 80, Nhật

- Amoniac, Trung Quốc

- DMSO, Trung Quốc

2.2. Phương pháp nghiên cứu




2.2.1. Lý thuyết

Để đạt được mục đích đặt ra của đề tài, đề tài nghiên cứu dựa trên các bài báo

nghiên cứu khoa học khác, nội dung nghiên cứu như sau:

- Tiến hành quan sát, thu nhập những thông tin, dữ liệu liên quan đến cách mô tả

hình thái. Dựa trên các tài liệu đó, bước đầu xác định tên khoa học của cây Neem

- Tiến hành chiết xuất cao Neem bằng phương pháp chiết Soxhlet và ngâm dầm với

các điều kiện khảo sát là tỉ lệ dung môi/nguyên liệu và thời gian chiết.

- Tiến hành định tính thành phần hóa học chính trong cao Neem dựa trên kết quả

các bài nghiên cứu khoa học khác, nghiên cứu phương pháp sắc ký khí khối phổ

GC/MS, LC/MS.

2.2.2. Thực nghiệm

Lá Neem sau khi mua chúng tôi cắt nhỏ (kích thước 1 x 2 cm), sau đó tiến hành

chiết tách dịch chiết bằng hai phương pháp sau:

- Ngâm dầm với các điều kiện khảo sát là tỉ lệ dung môi/nguyên liệu và thời gian.

- Chiết tách bằng Soxhlet với các điều kiện khảo sát là tỉ lệ dung môi/nguyên liệu

và thời gian.

Sau khi chiết tách theo hai phương pháp trên thì thu được dung dịch chiết, đem

dịch chiết đi cô quay chân không đến khi đuổi hết dung môi sẽ thu được sản phẩm ở

dạng cao.

Gửi mẫu cao Neem đi phân tích GC/MS, LC/MS. Lấy cao Neem thử hoạt tính

kháng khuẩn, thử nghiệm trên sâu, định tính, khả năng chống oxi hóa.

2.2.3. Quy trình chiết tách dịch chiết lá Neem

Từ các công trình nghiên cứu trước đây chúng tôi tiến hành chiết tách cao lá Neem

bằng phương pháp ngâm dầm và phương pháp chiết tách bằng hệ thống soxhlet với các

hệ dung môi có độ phân cực khác nhau.

Bảng 2. 1: Độ phân cực và nhiệt độ sôi của các hệ dung môi khác nhau

Độ phân cực (δP) Nhiệt độ sôi (oC)

Hexan 0.00 69

Chloroform 1.04 61

Ethanol 96o 1.69 79




Methanol 1.70 65

Ethyyl acetate 1.78 77

Nước 1.80 100

2.2.3.1. Quy trình chiết tách lá Neem bằng phương pháp ngâm dầm

Sơ đồ 2. 1: Quy trình chiết cao từ lá Neem bằng phương pháp ngâm dầm

Thuyết minh quy trình

- Bước 1: Lá Neem cắt nhỏ rồi cân chính xác 15 g (± 0,1g). Chuyển toàn bộ nguyên

liệu đã được xử lý cho vào túi lọc (10 x 5 cm).

- Bước 2: Lấy 300 ml dung môi (Hexan, Chloroform, Ethyl acetate, Ethanol 96o,

Methanol, Nước) cho vào bình 1000 ml và ngâm trong 1 ngày, 3 ngày, 5 ngày, 7

ngày.

- Bước 3: Lọc và thu được dịch chiết đem cô quay đến khi cạn hết dung môi. Sau

đó đem bảo quản cao chiết trong lọ dung tích khoảng 5 – 10 ml, bịt kín bằng nút

cao su, bảo quản trong tủ lạnh.

- Bước 4: Lấy mẫu cao chiết đi phân tích GC/MS, LC/MS để xác định thành phần

Xử lý nguyên liệu

Dung môi Thời gian (1, 3, 5, 7 ngày)

Tỉ lệ dung môi (1/20)

Lá Neem

Bột lá Neem

Dịch lá Neem

Cao lá Neem Nước

Methanol

Hexan

Ethanol 96o

Chloroform

Ethyl acetat

Gửi mẫu phân tích

LC/MS – GC/MS

Định tính Hoạt tính

kháng khuẩn

Thử nghiệm

trên sâu

Khả năng

chống oxi hóa




Dung môi chiết

Xử lý nguyên liệu

hóa học và thử hoạt tính sinh học trên khuẩn Staphylococcus aureus và

Pseudomonas aeruginosa.

2.2.3.2. Quy trình chiết xuất lá Neem bằng hệ thống Soxhlet

Sơ đồ 2.2: Quy trình chiết cao từ lá Neem bằng Soxhlet

Thuyết minh quy trình

- Bước 1: Lá Neem cắt nhỏ rồi cân chính xác 15 g (± 0,1g). Chuyển toàn bộ nguyên

liệu đã được xử lý cho vào túi lọc (10 x 5 cm).

- Bước 2: Lấy 300 ml dung môi (Hexan, Chloroform, Ethyl acetate, Ethanol 96o,

Methanol, Nước) cho vào bình cầu 2 cổ và lắp hệ thống soxhlet. Đun nguyên liệu

trong 4 giờ, 6 giờ, 10 giờ và 12 giờ.

- Bước 3: Thu được dịch chiết đem cô quay đến khi cạn hết dung môi. Đem bảo

quản cao chiết trong lọ dung tích khoảng 5 – 10 ml, bịt kín bằng nút cao su, bảo

quản trong tủ lạnh.

- Bước 4: Lấy mẫu cao chiết đi phân tích GC/MS, LC/MS để xác định thành phần

Lá Neem

Bột lá Neem (15 g)

Dịch lá Neem

Cao lá Neem

Trích ly Thời gian (4, 6, 10, 12 giờ)

Tỉ lệ (1/20)

Chloroform

Nước

Hexan

Ethyl acetat

Methanol

Ethanol 96o

Gửi mẫu phân tích

LC/MS – GC/MS

Định tính Hoạt tính

kháng khuẩn

Thử nghiệm

trên sâu

Khả năng

chống oxi hóa




hóa học và thử hoạt tính sinh học trên khuẩn Staphylococcus aureus và

Pseudomonas aeruginosa.

2.3. Mô hình chiết tách thực nghiệm tại phòng thí nghiệm

2.3.1. Ngâm dầm

Hình 2.3: Mô hình ngâm dầm

2.3.2. Soxhlet

Hình 2.4: Mô hình chiết tách tại phòng thí nghiệm

2.4. Phương pháp cô quay chân không tuần hoàn

Quá trình hoạt động của máy cô quay chân không dựa theo nguyên tắc nhiệt độ sôi

thay đổi khi thay đổi áp suất. Dựa theo các quá trình nhiệt động, khi giảm áp suất thì




nhiệt độ sôi chất lỏng sẽ giảm (đó là nguyên nhân tại sao nấu nước trên núi cao thì nước

nhanh sôi hơn). Khi máy hoạt động, bình chứa mẫu dung dịch sẽ được để ngập trong bể

gia nhiệt. Nước trong bể sẽ được gia nhiệt đến nhiệt độ xác định. Bơm chân không sẽ

hút không khí ra khỏi bình chứa mẫu làm áp suất trong bình giảm. Khi áp suất giảm,

nhiệt độ sôi dung dịch trong bình sẽ giảm, đến khi nhiệt độ sôi thấp hơn nhiệt độ trong

bể thì dung dịch sẽ sôi. Trong quá trình hoạt động, bình chứa mẫu dung dịch được quay

tròn liên tục nhằm tăng diện tích tiếp xúc giữa dung dịch và nguồn nhiệt, để nhiệt được

phân bố đều trong dung dịch, tránh hiện tượng quá nhiệt cục bộ. Hơi dung môi bay ra

khỏi bình cầu sẽ được làm lạnh trong hệ thống sinh hàn và thu lại ở bình thu dung môi.

Hình 2.5: Thiết bị cô quay chân không tuần hoàn

2.5. Xác định thành phần hóa học từ cao lá Neem bằng phương pháp GC/MS,

LC/MS

Dịch chiết lá Neem được tiến hành thu hồi dung môi cho tới khi được chất rắn

dạng cao. Gửi mẫu rắn này đến VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ

VIỆT NAM, VIỆN CÔNG NGHỆ HÓA HỌC (01 – Mạc Đĩnh Chi – Quận 1 – Tp. Hồ

Chí Minh).

2.6. Khảo sát các điều kiện ảnh hưởng đến quá trình chiết

2.6.1. Xác định ảnh hưởng của thời gian chiết

Thời gian chiết có vai trò quyết định lượng cao Neem thu hồi. Nếu thời gian quá

ngắn thì lượng cao Neem thu được chưa hoàn toàn, ngược lại khi chiết quá lâu vừa tốn




thời gian, tổn hao năng lượng và nghiêm trọng hơn là chất lượng cao Neem bị ảnh

hưởng.

- Các dung môi: Cồn 96o, methanol, ethyl axetate, chloroform, hexan, nước.

- Tỉ lệ dung môi/nguyên liệu là 15:1.

- Khảo sát các thông số thời gian ngâm 1 ngày, 3 ngày, 5 ngày, 7 ngày. Khảo sát

thời gian chiết tách bằng soxhlet 4 giờ, 6 giờ, 10 giờ, 12 giờ.

2.6.2. Xác định ảnh hưởng của tỉ lệ dung môi/nguyên liệu

Nếu tỉ lệ dung môi/nguyên liệu không phù hợp thì lượng cao Neem thu được chưa

hoàn toàn hoặc gây tổn hao năng lượng vì dung môi quá nhiều.

Khảo sát các thông số tỉ lệ dung môi/nguyên liệu gồm 10:1; 15:1; 20:1; 25:1.

2.7. Định tính một số hợp chất có trong lá Neem

Theo Puri H. S. (1999) trong cây Neem còn chứa các hợp chất khác như: flavonoid,

coumarin saponin flavonoglycoside, dihydrochalcon, cacbonhydrat, triterpenoid và

steroid, tannin, alkaloid.[39]

2.7.1. Định tính Flavonoid

Với dung dịch FeCl3 bão hòa: nếu tạo thành dung dịch màu xanh đen là phản ứng

dương tính.

Thực nghiệm: cho vào ống nghiệm 1 ml dịch chiết lá Neem, nghiêng ống và nhỏ

từ từ từng giọt thuốc thử theo thành ống nghiệm, để yên, quan sát.

Với dung dịch H2SO4 đậm đặc: xuất hiện màu vàng đậm đến cam hoặc đỏ đến xanh

dương, tùy vào loại hợp chất khác nhau mà có màu khác nhau.

Thực nghiệm: cho vào ống nghiệm 1 ml dịch chiết lá Neem, nghiêng ống và nhỏ

từ từ từng giọt đến 1 ml H2SO4 đậm đặc, đun nóng trong 1 phút.

2.7.2. Định tính Alkaloid

Thuốc thử Mayer:

Dung dịch 1: Hòa tan 1,36 g HgCl2 trong 60 mL nước cất.

Dung dịch 2: Hòa tan 5 g KI trong 10 mL nước cất.

Hỗn hợp hai dung dịch và thêm đủ 100 mL nước cất.

Nếu có alkaloid sẽ xuất hiện tủa trắng hoặc vàng nhạt.

Thực nghiệm: cho vào ống nghiệm 1 mL dịch chiết lá Neem sau đó cho từ từ thuốc

thử theo thành ống nghiệm để yên, quan sát.




Thuốc thử Wagner:

I2 1,27g

KI 2 g

H2O vừa đủ 100 ml

Nếu có alkaloid sẽ xuất hiện tủa màu nâu.

Thực nghiệm: cho vào ống nghiệm 1 mL dịch chiết lá Neem, nghiên ống và nhỏ

từ từ từng giọt thuốc thử theo thành ống nghiệm, để yên, quan sát.

2.7.3. Định tính saponin

Định tính khả năng tạo bọt của saponin trong môi trường acid, base:

Thuốc thử

HCl 0,1N

NaOH 0,1N

- Ống 1: 5 mL HCl 0,1 N (pH = 1) và 3 giọt dịch chiết lá Neem.

- Ống 2: 5 mL NaOH 0,1 N (pH = 13) và 3 giọt dịch chiết lá Neem. Bịt miệng ống

nghiệm và lắc mạnh cả hai ống nghiệm trong 1 phút và để yên, quan sát chiều

cao cột bọt trong cả hai ống nghiệm.

- Nếu cột bọt trong cả hai ống nghiệm cao bằng nhau và cột bọt có độ bền như

nhau, có thể có saponin triterpenoid.

- Nếu ống pH = 13 cột bọt cao hơn nhiều so với ống pH = 1, có thể có saponin

steroid.

2.7.4. Định tính Cacbonhyđrat

Lấy 2 ml dịch chiết lá Neem được xử lý bằng 2 giọt dung dịch α – Naphthol có

cồn trong ống nghiệm và sau đó 1 ml axit sunfuric đậm đặc được thêm cẩn thận dọc theo

hai bên thành ống nghiệm.

Nếu lớp giữa xuất hiện màu tím cho thấy có sự hiện diện của Cacbonhyđrat.

2.7.5. Định tính Steroid – triterpenoid

Thuốc thử Liebermann – Burchard:

Anhidrid acetic 1 mL

H2SO4 đậm đặc

Nếu xuất hiện màu lục, hồng, cam hoặc đỏ và bền là phản ứng dương tính.

Thuốc thử Salkowski:




Thực nghiệm: Lấy 1 mL dịch chiết lá Neem cho vào ống nghiệm, nhỏ từ từ đến

hết 1 mL dung dịch H2SO4 đậm đặc vào ống nghiệm.

Nếu xuất hiện màu đỏ đậm, xanh, xanh tím là phản ứng dương tính.

Phản ứng Rosenthaler để phát hiện Steroid – triterpenoid:

Vanilin 1%

2 giọt ethanol

1 giọt HCl đậm đặc.

Thực nghiệm: Lấy 1 mL dịch dịch chiết lá Neem, thêm 2 giọt vaninlin 1% ethanol,

1 giọt HCl đậm đặc.

Phản ứng dương tính khi dung dịch đổi sang màu xanh tím hoặc xanh lục.

2.8. Đánh giá khả năng kháng khuẩn của cao chiết lá Neem

Khuẩn gốc được cung cấp bởi Phòng Thí Nghiệm Vi Sinh trường Đại học Công

Nghiệp Thành Phố Hồ Chí Minh.

Kỹ thuật pha chế môi trường nuôi cấy

Môi trường tăng sinh

- Công thức:

Cao thịt bò 200 g

Nước cất đủ 500 ml

- Cách pha chế: đun trong bể điều nhiệt trong 2 giờ, ở 50 oC, lọc. Sau đó hấp 15

phút ở 121 oC.

Môi trường Mueller Hinton Agar (MHA)

- Công thức:

MHA 19,5 g

Agar 7 g

- Cách pha chế: Cân đúng khối lượng các thành phần đã cho, định mức lên 500 ml.

Sau đó đun sôi hòa tan hoàn toàn các thành phần, điều chỉnh pH 7,4 – 7,6. Hấp

121 oC/15 phút, sau đó để nguội 45 – 50 oC đổ 20 ml/đĩa.

Môi trường thạch dinh dưỡng

- Công thức:

Pepton 10 g

NaCl 5g




Cao thịt 4 g

Agar 20 g

Nước cât đủ 1000 ml

Cách pha chế: đun sôi hòa tan hoàn toàn các thành phần, điều chỉnh pH 7,4 – 7,6.

Đổ mỗi ống 6 ml, hấp 121 oC/15 phút. Để nghiêng ống thạch cho thạch đông.

Độ đục chuẩn 0.5 MC Farland: Tương ứng với 108 vi khuẩn/ml, sử dụng làm

độc đục chuẩn khi pha loãng dịch vi khuẩn. Cách pha: 0.5 ml BaCl2 0.048 M + 99.5 ml

H2SO4 0.19 M.

Chuẩn bị dịch kháng khuẩn:

Cao lá Neem được pha trong dung dịch DMSO 5% vô trùng với:

- 800 mg/ml: 0.8 g cao lá Neem + 1 ml DMSO 5%;

- 400 mg/ml: 1 ml dịch nồng độ 800 mg/ml + 1 ml DMSO 5%;

- 200 mg/ml: 1 ml dịch nồng độ 400 mg/ml + 1 ml DMSO 5%;

- 100 mg/ml: 1 ml dịch nồng độ 200 mg/ml + 1 ml DMSO 5%.

Các kháng sinh được sử dụng để đối chứng dương là Ampiciline và Tetracycline

(1 mg/ml pha trong DMSO 5%), chứng âm là dung dịch DMSO 5% vô trùng.

Chuẩn bị chủng vi sinh vật thử nghiệm:

Vi khuẩn sau khi lấy về sẽ được cấy ria trên môi trường thạch dinh dưỡng MHA,

đem ủ ở 37 oC trong vòng 16 đến 24 giờ để chọn ra các khuẩn lạc đặc trưng. Khi chọn

được khuẩn lạc đặc trưng trên đĩa thạch không bị nhiễm thì đem tăng sinh chúng trong

môi trường lỏng TSB rồi ủ ở 37 oC, lắc với tốc độ 100 rpm trong 10 – 12 giờ. Môi trường

trở nên đục do có sự tăng sinh của vi sinh vật.

Huyền phù vi khuẩn sau đó được ly tâm trong 15 phút ở 5000 rpm để tách sinh

khối ra khỏi môi trường rồi rửa sinh khối vi sinh vật bằng 3 lần nước cất vô trùng và pha

loãng bằng nước cất vô trùng đến độ đục tương đương 0.5 MC Farland. Huyền phù vi

khuẩn này được dùng để khảo sát hoạt tính kháng khuẩn.

Thực nghiệm:

Dùng micropipet hút 100 µl vi khuẩn mỗi loại (mật độ tế bào 108 CFU/ml), sau

đó tiến hành cấy chang trên bề mặt đĩa thạch MHA, chờ khô bề mặt. Đánh số cho đĩa

petri từ 1 đến 7. Đĩa giấy 6 mm đã được vô trùng được thấm vào cao Neem đã được pha

theo từng nồng độ lần lượt là 800, 400, 200, 100 mg/ml và lấy ra đặt lên mặt đĩa thạch




đã cấy chang vi khuẩn (số 1: 800 mg/ml; số 2: 400 mg/ml; số 3: 200 mg/ml; số 4: 100

mg/ml), đè nhẹ để đĩa giấy cố định trên mặt thạch. Hai đối chứng dương là kháng sinh

Tetrcyline và Ampiciline được thấm vào đĩa giấy và đặt lên đĩa thạch (số 5: Tetracyline;

số 6: Ampiciline). Đĩa giấy ở giữa thấm dung dịch đối chứng âm DMSO 5% (số 7).

Sau đó đem nuôi ở 37 oC trong 16 – 18 giờ, riêng Staphylococcus aureus nuôi

trong 24 giờ. Đọc kết quả và ghi nhận đường kính vòng vô khuẩn. Đường kính vòng vô

khuẩn (D - d) được xác định bằng đường kính vòng kháng ngoài trừ đi đường kính đĩa

giấy. Mỗi nồng độ được lập lại 3 lần. Đường kính vòng kháng khuẩn được đo bằng đơn

vị mm.

Hình 2.6. Mô tả vòng kháng khuẩn

Trong đó:

d : đường kính lỗ khoan thạch

D: đường kính vòng vô khuẩn

2.9. Xác định hoạt tính kháng oxi hóa của cao Neem

Lực kháng oxy hoá tổng của các mẫu khảo sát dịch chiết lá chè được đánh giá theo

phương pháp phospho molybdenum của Prieto[11] có hiệu chỉnh cho phù hợp với mục

đích nghiên cứu như sau:

Một lượng 1 ml dung dịch mẫu nồng độ 10 𝜇g/ml chứa một loại chất khử (trong

nước, metanol, ethanol, dimethyl sulfoxide hoặc hexane) đã được kết hợp trong một ống

Eppendorf với 3 ml dung dịch thuốc thử (axit sulfuric 0,6 M; natri phosphat 28 mM; và

4 mM amoni molybdate). Các ống được đậy nắp và ủ trong bể điều nhiệt ở ở 95 °C

trong 90 phút. Sau khi các mẫu được làm lạnh đến nhiệt độ phòng, độ hấp thụ của dung

dịch nước của từng mẫu được đo ở 695 nm so với mẫu trắng. Trong mẫu trắng, dung

dịch cần phân tích được thay bằng nước cất. Lực kháng oxy hoá tổng được biểu diễn

theo độ hấp thụ của mẫu. Acid gallic được sử dụng làm chất so sánh.




Chúng tôi tiến hành khảo sát các thông số sau:

- Nồng độ dịch chiết tăng dần 10 μg/ml, 20 μg/ml, 30 μg/ml nhằm khảo sát ảnh

hưởng của nồng độ dịch chiết đến khả năng kháng oxy hóa.

- Ảnh hưởng của quá trình tách béo bằng hexan đến khả năng kháng oxy hóa.

- Ảnh hưởng của quá trình tinh chế và thời gian lưu mẫu đến khả năng kháng oxy

hóa.

2.10. Cách pha thuốc trừ sâu

Năm 1998, Nhóm tác giả Panchapagesa Muthuswamy Murali cùng các cộng sự đã

xây dựng quá trình tạo ra một lượng giàu azadirachtin trong thành phần thuốc trừ sâu và

làm bền sản phẩm là tạo nhũ cho dầu Neem 0.2% tới 30% (v/v) với chất nhũ hóa ion

Tween 20 sau đó thêm 1 - 2.5% tác nhân chống nắng para – amino benzoic acid (PABA)

và 1% oleic acid.[33, 34]

Năm 2017, Tác giả Chu Thị Hà và Trương Thị Dung đã tối ưu tỉ lệ phối trộn giữa

dầu Neem và nước là 7 : 3, tương ứng với 3 ml Tween 80.

Vì thời gian làm nghiên cứu trái mùa với mùa cây Neem ra quả nên chúng tôi dùng

cao chiết lá Neem để khảo sát và thử nghiệm trên sâu. Sau khi tham khảo hai tài liệu

trên thì chúng tôi tiến hành pha thuốc trừ sâu có hiệu chỉnh cho phù hợp với thí nghiệm

như sau:

1 g cao lá Neem chiết với Methanol + 100 ml nước + 3 ml Tween 80

Sau khi pha thuốc theo 2 cách trên, chúng tôi tiến hành xịt trên lá và nhúng trực

tiếp lá cho sâu ăn.




CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1. Kết quả khối lượng cao Nem khi chiết bằng các hệ dung môi khác nhau.

Sau khi chúng tôi chiết tách cao Neem bằng hai phương pháp ngâm dầm và Soxhlet

bằng các hệ dung môi có độ phân cực khác nhau, độ phân cực được sắp xếp theo thứ tự

tăng dần là: Hexan, Chloroform, Ethanol 96o, Methanol, Ethyl acetat và Nước, chúng

tôi thu được kết quả như sau:

3.1.1. Cao Neem được chiết bằng dung môi Hexan

Khối lượng lá Neem là 15 g và tỉ lệ lá Neem/dung môi là 1/20, chiết tách bằng 2

phương pháp khác nhau và kết quả thu được ở bảng sau:

Bảng 3. 1: Khối lượng cao Neem khi chiết tách với Hexan bằng 2 phương pháp khác

nhau

Phương pháp ngâm (Ngày) Phương pháp chiết Soxhlet (Giờ)

Thời gian 1 3 5 7 4 6 10 12

Khối lượng (g) 0.36 0.42 0.23 0.17 0.53 0.97 0.76 0.73

Hình 3. 1: Biểu đồ khối lượng cao Neem khi chiết tách với Hexan bằng 2 phương

pháp khác nhau

Nhận xét: Như kết quả thu được ở bảng này thì ta thấy rằng sau khi chiết tách

bằng phương pháp ngâm lượng cao Neem tăng dần từ 1 ngày (0.53 g) đến 3 ngày (0.97

g) nhưng khi ngâm đến 5 ngày (0.76 g), 7 ngày (0.73g) thì khối lượng cao Neem giảm

dần do sự hao hụt của dung môi. Khi chiết tách bằng Soxhlet thì lượng cao Neem tăng

0.360.42

0.230.17

0.53

0.97

0.76 0.73

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

1.2

1 ngày 3 ngày 5 ngày 7 ngày 4 giờ 6 giờ 10 giờ 12 giờ

Kh

ối

lượ

ng c

ao (

g)

Thời gian

Phương pháp ngâm Phương pháp chiết Soxhlet




dần từ 4 giờ (0.53 g) đến 6 giờ (0.97 g) và đến khi chiết tách trong 10 giờ và 12 giờ thì

lượng cao Neem giảm dần do khi chiết tách đến 10 giờ và 12 giờ thì bị cháy phần dưới

bình cầu.

3.1.2. Cao Neem được chiết bằng dung môi Chloroform



Bảng 3.2: Khối lượng cao Neem khi chiết tách với Chloroform bằng 2 phương pháp

khác nhau


Thời gian 1 3 5 7 4 6 10 12

Khối lượng (g) 0.32 1.36 0.51 0.43 0.63 0.80 0.31 0.11

Hình 3.2: Biểu đồ khối lượng cao Neem khi chiết tách với Chloroform bằng 2 phương

pháp khác nhau



g) nhưng khi ngâm đến 5 ngày (0.51 g), 7 ngày (0.43g) thì khối lượng cao Neem giảm




bình cầu.

0.32

1.36

0.510.43

0.63

0.80

0.31

0.11

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

1.2

1.4

1.6


Kh

ối

lượ

ng c

ao (

g)

Thời gian





3.1.3. Cao Neem được chiết bằng dung môi Ethanol 96o



Bảng 3.3: Khối lượng cao Neem khi chiết tách với Ethanol 96o bằng 2 phương pháp

khác nhau


Thời gian 1 3 5 7 4 6 10 12

Khối lượng (g) 1.50 2.26 1.98 1.73 2.78 2.96 2.20 1.87

Hình 3.3: Biểu đồ khối lượng cao Neem khi chiết tách với Ethanol 96o bằng 2 phương

pháp khác nhau



g) nhưng khi ngâm đến 5 ngày (1.98 g), 7 ngày (1.73 g) thì khối lượng cao Neem giảm




bình cầu.

3.1.4. Cao Neem được chiết bằng dung môi Methanol



1.50

2.261.98

1.73

2.782.96

2.20

1.87

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

3.0

3.5


Kh

ối

lượ

ng

ca

o (

g)

Thời gian





Bảng 3.4: Khối lượng cao Neem khi chiết tách với Methanol bằng 2 phương pháp

khác nhau


Thời gian 1 3 5 7 4 6 10 12

Khối lượng (g) 3.72 4.20 3.28 2.75 2.96 3.96 1.89 1.21

Hình 3.4: Biểu đồ khối lượng cao Neem khi chiết tách với Methanol bằng 2 phương

pháp khác nhau







bình cầu.

3.1.5. Cao Neem được chiết bằng dung môi Ethyl acetat



3.72

4.20

3.28

2.752.96

3.96

1.89

1.21

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

3.0

3.5

4.0

4.5


Kh

ối

lượ

ng

ca

o (

g)

Thời gian





Bảng 3.5: Khối lượng cao Neem khi chiết tách với Ethyl acetat bằng 2 phương pháp

khác nhau


Thời gian 1 3 5 7 4 6 10 12

Khối lượng (g) 0.97 1.33 1.28 1.22 0.46 1.70 1.01 1.03

Hình 3.5: Biểu đồ khối lượng cao Neem khi chiết tách với Ethyl acetat bằng 2 phương

pháp khác nhau







bình cầu.

3.1.6. Cao Neem được chiết bằng dung môi Nước



Bảng 3.6: Khối lượng cao Neem khi chiết tách với Nước bằng 2 phương pháp khác nhau


Thời gian 1 3 5 7 4 6 10 12

Khối lượng (g) 1.02 1.58 1.35 1.27 1.71 2.22 1.30 1.16

0.97

1.33 1.28 1.22

0.46

1.70

1.01 1.03

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

1.2

1.4

1.6

1.8


Kh

ối

lượ

ng

ca

o (

g)

Thời gian





Hình 3.6: Biểu đồ khối lượng cao Neem khi chiết tách với Nước bằng 2 phương pháp

khác nhau







bình cầu.

3.1.7. So sánh khối lượng cao Neem khi chiết với các hệ dung môi khác nhau

Sau khi trình bày khối lượng cao Neem khi chiết với các hệ dung môi khác nhau

ở các bảng 3.1, 3.2, 3.3, 3.4, 3.5, 3.6 thì chúng tôi đã tập hợp lại thành bảng như sau:

Bảng 3.7: Khối lượng cao Neem khi chiết tách với các hệ dung môi khác nhau



Hexan 0.53 g 0.97 g 0.76 g 0.73 g 0.36 g 0.42 g 0.23 g 0.17 g

Chloroform 0.32 g 1.36 g 0.51 g 0.43 g 0.63 g 0.8 g 0.31 g 0.11 g

Ethanol 96o 1.50 g 2.26 g 1.98 g 1.73 g 2.78 g 2.96 g 2.20 g 1.87 g

Methanol 3.72 g 4.20 g 3.28 g 2.75 g 2.96 g 3.96 g 1.89 g 1.21 g

1.02

1.58

1.35 1.27

1.71

2.22

1.301.16

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5


Kh

ối

lượ

ng

ca

o (

g)

Thời gian





Ethyl acetat 0.97 g 1.33 g 1.28 g 1.22 g 0.46 g 1.70 g 1.01 g 1.03 g

Nước 1.02 g 1.58 g 1.35 g 1.27 g 1.71 g 2.22 g 1.30 g 1.16 g

Nhận xét chung: Khi chiết tách lá Neem với các hệ dung môi có độ phân cực khác

nhau Hexan, Chloroform, Ethanol 96o, Methanol, Ethyl acetat và Nước bằng phương

pháp ngâm dầm trong thời gian 1 ngày, 3 ngày, 5 ngày, 7 ngày và phương pháp chiết

tách bằng hệ thống Soxhlet ở các thời gian khác nhau (4 giờ, 6 giờ, 10 giờ, 12 giờ) thì

lượng cao Neem thu được cao nhất là khi ngâm dầm trong 3 ngày và khi chiết tách bằng

hệ thống soxhlet trong 6 giờ. Vì vậy chúng tôi chọn mẫu cao Neem ngâm dầm trong 3

ngày và chiết tách bằng hệ thống Soxhlet trong 6 giờ để tiến hành gửi mẫu phân tích GC

– MS, LC – MS, định tính, khảo sát khả năng chống oxi hóa, khả năng kháng khuẩn và

thử nghiệm trên sâu.

Sau khi so sánh khối lượng cao Neem khi chiết với các hệ dung môi khác nhau

bằng phương pháp ngâm dầm và phương pháp chiết Soxhlet thì chúng tôi nhận thấy khi

chiết với Methanol và Ethanol 96o thì lượng cao Neem thu được nhiều nhất.

3.2. Kết quả định tính các nhóm chất có trong cao Neem

Theo Puri H. S. (1999) trong cây Neem còn chứa các hợp chất khác như: flavonoid,

alkaloid, saponin flavonoglycoside, dihydrochalcon, cacbonhydrat, triterpenoid và

steroid, tannin, coumarin.[39]

Để xác định sơ bộ thành phần các chất có trong mẫu lá Neem khảo sát, chúng tôi

tiến hành định tính một số hợp chất có trong mẫu như đã trình bày ở phần 2.6. Kết quả

ghi nhận được thể hiện ở bảng 3.8, bảng 3.9, bảng 3.10, bảng 3.11, bảng 3.12, bảng 3.13.

Trong đó: Dấu (-) cho kết quả âm tính.

Dấu (+) cho kết quả dương tính với thuốc thử, có mặt nhóm chất tương ứng

cần định tính.


Bảng 3.8: Kết quả định tính các nhóm chất có trong cao Neem khi chiết với Hexan



Flavonoid (1) - - - - - - - -

Alkaloid (2) - - - - - - - -




Saponin (3) - - - - - - - -

Cacbonhydrat

(4) + + + + + + + +

Triterpenoid

và Steroid (5) + + + + + + + +

Hình 3.7: Định tính các nhóm chất có trong cao Neem khi chiết với Hexan

Nhận xét: Chúng tôi tiến hành 10 thử nghiệm cao chiết với các thời gian chiết

khác nhau để nhận biết sự có mặt của các hợp chất. Trong đó, đối với phương pháp

ngâm và phương pháp chiết Soxhlet đều có sự hiện diện của Cacbonhydrat (Ống 4),

triterpenoid và Steroid (Ống 5).


Bảng 3.9: Kết quả định tính các nhóm chất có trong cao Neem khi chiết với Chloroform



Flavonoid (1) + + + + + + + +

Alkaloid (2) - - - - - - - -

Saponin (3) + + + + + + + +

Cacbonhydrat

(4) + + + + + + + +

Triterpenoid

và Steroid (5) + + + + + + + +

1 2 3 5 4 1 2 3 4 5

Ngâm Soxhlet




Hình 3.8: Định tính các nhóm chất có trong cao Neem khi chiết với Chloroform



ngâm và phương pháp chiết Soxhlet đều có sự hiện diện của: Flavonoid (1), Saponin

(3), Cacbonhydrat (4), Triterpenoid và Steroid (5).


Bảng 3.10: Kết quả định tính các nhóm chất có trong cao Neem khi chiết với Ethanol 96o



Flavonoid (1) - - - - - - - -

Alkaloid (2) + + + + + + + +

Saponin (3) - - - - - - - -

Cacbonhydrat

(4) + + + + + + + +

Triterpenoid

và Steroid (5) + + + + + + + +

Hình 3.9: Định tính các nhóm chất có trong cao Neem khi chiết với Ethanol 96o

1 1 2 2 3 3 4 4 5

Ngâm Soxhlet

5

1 1 2 2 3 3 4 4 5 5

Ngâm Soxhlet






ngâm và phương pháp chiết Soxhlet đều có sự hiện diện của: Alkaloid (2),

Cacbonhydrat (4), Triterpenoid và Steroid (5).


Bảng 3.11: Kết quả định tính các nhóm chất có trong cao Neem khi chiết với Methanol



Flavonoid (1) - - - - - - - -

Alkaloid (2) + + + + + + + +

Saponin (3) - - - - - - - -

Cacbonhydrat

(4) + + + + + + + +

Triterpenoid

và Steroid (5) + + + + +

+ + +

Hình 3.10: Định tính các nhóm chất có trong cao Neem khi chiết với Methanol



ngâm và phương pháp chiết Soxhlet đều có sự hiện diện của: Alkaloid (2),


1 1 2 2 3 3 4 4 5 5

Ngâm Soxhlet




3.2.5. Cao Neem được chiết bằng dung môi Ethyl Axetat

Bảng 3.12: Kết quả định tính các nhóm chất có trong cao Neem khi chiết với Ethyl

acetate



Flavonoid (1) + + + + + + + +

Alkaloid (2) - - - - - - - -

Saponin (3) - - - - - - - -

Cacbonhydrat

(4) + + + + + + + +

Triterpenoid

và Steroid (5) + + + + + + + +

Hình 3.11: Định tính các nhóm chất có trong cao Neem khi chiết với Ethyl acetate



ngâm và phương pháp chiết Soxhlet đều có sự hiện diện của: Flavonoid (1),


3.2.6. Nước

Bảng 3.13: Kết quả định tính các nhóm chất có trong cao Neem khi chiết với Nước



Flavonoid (1) + + + + + + + +

Alkaloid (2) - - - - - - - -

Saponin (3) + + + + + + + +

1 1 2 2 3 3 4 4 5 5

Ngâm Soxhlet




Cacbonhydrat

(4) + + + + + + + +

Triterpenoid

và Steroid (5) + + + + + + + +

Hình 3.12: Định tính các nhóm chất có trong cao Neem khi chiết với Nước



ngâm và phương pháp chiết Soxhlet đều có sự hiện diện của: Flavonoid (1), Saponin

(3), Cacbonhydrat (4), Triterpenoid và Steroid (5).

Bảng 3.14: Định tính các nhóm chất trong cao Neem khi chiết với 6 dung môi khác

nhau


Fla

vo

no

id

Alk

alo

id

Sap

on

in

Ste

roid

-

trit

erp

eno

id

Ca

cbo

nh

yd

rat

Fla

vo

no

id

Alk

alo

id

Sap

on

in

Ste

roid

-

trit

erp

eno

id

Ca

cbo

nh

yd

rat

Hexan - - - + + - - - + +

Chloroform + - + + + + - + + +

Ethanol 96o - + - + + - + - + +

Methanol - + - + + - + - + +

Ethyl acetat + - - + + + - - + +

Nước + - + + + + - + + +

1 1 2 2 3 3 4 4 5 5

Ngâm Soxhlet




Nhận xét chung: Qua các kết quả định tính ở bảng 3.14 thì chúng ta có thể nhận

thấy là khi chiết lá Neem với các hệ dung môi khác nhau thì các hợp chất trong cao chiết

cũng có sự xuất hiện khác nhau, tuy nhiên trong tất cả các hệ dung môi đều có sự xuất

hiện của Triterpenoid và Steroid, Cacbonhydrat.

Khi chiết với dung môi Nước thì có sự xuất hiện của nhiều nhóm chất nhất:

Flavonoid, Saponin, Cacbonhydrat, Triterpenoid và Steroid. Và khi chiết với dung môi

Hexan thì sự co mặt của các nhóm chất ít nhất: Cacbonhydrat, Triterpenoid và Steroid.

3.3. Hoạt tính chống oxi hóa của cao Neem

Áp dụng phương pháp xây dựng đường chuẩn axit gallic đã trình bày ở mục 2.8

chúng tôi xây dựng được phương trình đường chuẩn gallic như sau:

Bảng 3.15: Mật độ quang của đường chuẩn axit galic

C

(μg/ml) 0 10 20 30 40 50

Y = 0,015x

A 0.001 0.201 0.313 0.452 0.602 0.732

Hình 3.13: Biểu đồ phương trình đường chuẩn Acid gallic

Bảng 3.16: Kết quả hoạt tính chống oxi hóa của cao Neem

3 ngày 6 giờ

Hexan 2.55 5.30

Chloroform 3.81 6.23

Ethanol 96o 4.41 6.95

Methanol 6.21 7.00

y = 0.015x

R² = 0.9913

0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

0.8

0 10 20 30 40 50 60

Mật

độ q

uan

g

Nồng độ




Ethyl acetat 10.02 9.13

Nước 3.74 4.99

Hình 3.14: Biểu đồ thể hiện hoạt tính chống oxi hóa của cao Neem

Nhận xét: Khi ngâm dầm và chiết với Soxhlet với các hệ dung môi khác nhau

(Hexan, Chloroform, Ethanol 96o, Methanol, Ethyl acetate, Nước) thì khả năng chống

oxi hóa cao nhất là khi chiết với dung môi Ethyl acetate và thấp nhất là với Nước và

Methanol.

3.4. Kết quả kháng khuẩn của cao Neem

Hoạt tính kháng khuẩn của cao Neem đã đuợc nghiên cứu ở các nồng độ khác

nhau (100, 200, 400, 800 mg/ml) chống lại 2 chủng vi khuẩn gây bệnh bao gồm hai

chủng Gram âm (Pseudomonas aeruginosa) và Gram dương (Staphylococus aureus).

Khả năng kháng khuẩn duợc xác dịnh dựa trên khả năng ức chế sự phát triển của

vi khuẩn đuợc thể hiên qua duờng kính kháng khuẩn đuợc tạo ra trên đĩa Petri đuợc

trình bày ở bảng 3.17, bảng 3.18, bảng 3.19, bảng 3.20, bảng 3.21, bảng 3.22.

Trong đó:

1: 800 mg/ml

2: 400 mg/ml

3: 200 mg/ml

4: 100 mg/ml

5: chứng (+) tetracyline

6: chứng (+) Ampicilin

7: chứng (-) DMSO 5%


0.00

2.00

4.00

6.00

8.00

10.00

12.00

0 2 4 6 8

Mật

độ q

uan

g

Dung môi

3 ngày

6 giờ

Chlo Et 96o Me Ethyl Nước Hexan




Bảng 3.17: Đuờng kính vòng kháng khuẩn của cao Neem với dung môi Hexan (mm)

STT Nồng độ

(mg/ml)

3 ngày 6 giờ

S. aureus P.

aeruginosa S. aureus

P.

aeruginosa

1 800 6.5 3.0 11.5 10.0

2 400 3.0 2..0 10.5 3.0

3 200 3.0 2.0 2.5 2.0

4 100 3.0 2.0 1.5 1.5

5 Tetracycline 8.0 9.0 9.0 2.0

6 Ampicilin - - - -

7 DMSO 5% - - - -

Theo bảng 3.17 khi đánh giá sơ bộ về khả năng kháng khuẩn của cao Neem trên

từng chủng vi khuẩn, chúng tôi rút ra một số nhận xét như sau:

Ngâm 3 ngày

Trên chủng S. aureus khi khảo sát các nồng độ trên cho thấy nồng độ 800 mg/ml

và 400 mg/ml có sự chênh lệch đáng kể, kết quả lần lượt là 6.5 mm và 3.0 mm. Hai nồng

độ còn lại là 400 mg/ml và 200 mg/ml có kết quả giống nhau là 3.0 mm. Kết quả cho

thấy hoạt tính kháng khuẩn của cao lá Neem ngâm với hexan đối với chủng S. aureus

tương đối ổn định, nhận thấy cao Neem chiết với hexan có khả năng kháng chủng này

ở nồng độ cao.

Trên chủng vi khuẩn P.aeruginosa khi khảo sát ở các nồng độ nhận thấy ở các

nồng độ nồng độ 800 mg/ml và 400 mg/ml không có sự chênh lệch đáng kể, kết quả lần

lượt là 3.0 mm và 2.0 mm. Hai nồng độ còn lại là 400 mg/ml và 200 mg/ml có kết quả

giống nhau là 2.0 mm. Kết quả cho thấy hoạt tính kháng khuẩn của cao lá Neem đối với

chủng P.aeruginosa tương đối ổn định, nhận thấy cao Neem chiết với hexan có khả năng

kháng chủng này ở nồng độ cao.




Hình 3.15: Khả năng kháng S. aureus và P.aeruginosa của cao Neem ngâm với Hexan

Chiết 6 giờ


và 400 mg/ml có sự chênh lệch không đáng kể, kết quả lần lượt là 11.5 mm và 10.0 mm.

Hai nồng độ còn lại là 400 mg/ml và 200 mg/ml có kết quả lần lượt là 2.5 mm và 1.5

mm. Kết quả cho thấy hoạt tính kháng khuẩn của cao lá Neem chiết với hexan đối với

chủng S. aureus tương đối ổn định, nhận thấy cao Neem ngâm với hexan có khả năng

kháng chủng này ở nồng độ cao.


nồng độ nồng độ 800 mg/ml và 400 mg/ml có sự chênh lệch khá lớn, kết quả lần lượt là

10.0 mm và 3.0 mm. Hai nồng độ còn lại là 400 mg/ml và 200 mg/ml có kết quả lần

lượt là 2.0 mm và 1.5 mm. Kết quả cho thấy hoạt tính kháng khuẩn của cao lá Neem đối

với chủng P.aeruginosa tương đối ổn định, nhận thấy cao Neem chiết với hexan có khả

năng kháng chủng này ở nồng độ cao.

Hình 3.16: Khả năng kháng S. aureus và P.aeruginosa của cao Neem chiết với Hexan





Bảng 3.18: Đuờng kính vòng kháng khuẩn của cao Neem với dung môi Chloroform

(mm)

STT Nồng độ

(mg/ml)

3 ngày 6 giờ

S. aureus P.


P.

aeruginosa

1 800 7.0 6.0 10.0 4.0

2 400 4.5 4.5 9.0 3.0

3 200 3.5 3.5 4.0 3.0

4 100 2.0 2.0 2.0 2.0


6 Ampicilin - - - -

7 DMSO 5% - - - -



Ngâm 3 ngày


và 400 mg/ml có sự chênh lệch đáng kể, kết quả lần lượt là 7.0 mm và 4.5 mm. Hai nồng

độ còn lại là 400 mg/ml và 200 mg/ml có kết quả lần lượt là 3.5 mm và 2.0 mm. Kết quả

cho thấy hoạt tính kháng khuẩn của cao lá Neem ngâm với Chloroform đối với chủng S.

aureus tương đối ổn định, nhận thấy cao Neem ngâm với Chloroform có khả năng kháng

chủng này ở nồng độ cao.


nồng độ nồng độ 800 mg/ml và 400 mg/ml có sự chênh lệch đáng kể, kết quả lần lượt là

6.0 mm và 4.5 mm. Hai nồng độ còn lại là 400 mg/ml và 200 mg/ml có kết quả lần lượt

là 3.5 mm và 2.0 mm. Kết quả cho thấy hoạt tính kháng khuẩn của cao lá Neem đối với

chủng P.aeruginosa tương đối ổn định, nhận thấy cao Neem chiết với Chloroform có

khả năng kháng chủng này ở nồng độ cao.





Chloroform

Chiết 6 giờ



Hai nồng độ còn lại là 400 mg/ml và 200 mg/ml có kết quả lần lượt là 4.0 mm và 2.0

mm. Kết quả cho thấy hoạt tính kháng khuẩn của cao lá Neem chiết với Chloroform đối

với chủng S. aureus tương đối ổn định, nhận thấy cao Neem ngâm với Chloroform có



nồng độ nồng độ 800 mg/ml và 400 mg/ml có sự chênh lệch khá lớn, kết quả lần lượt là



chủng P.aeruginosa tương đối ổn định, nhận thấy cao Neem chiết với Chloroform có



Chloroform





Bảng 3.19: đuờng kính vòng kháng khuẩn của cao Neem với dung môi Ethanol 96o

(mm)

STT Nồng độ

(mg/ml)

3 ngày 6 giờ

S. aureus P.


P.

aeruginosa

1 800 5.0 7.0 4.0 5.0

2 400 3.5 5.0 3.5 3.0

3 200 2.5 3.5 - -

4 100 2.0 3.0 - -


6 Ampicilin - - - -

7 DMSO 5% - - - -



Ngâm 3 ngày


và 400 mg/ml kết quả lần lượt là 5.0 mm và 3.5 mm. Hai nồng độ còn lại là 400 mg/ml

và 200 mg/ml có kết quả lần lượt là 2.5 mm và 2.0 mm. Kết quả cho thấy hoạt tính kháng

khuẩn của cao lá Neem ngâm với Ethanol 96o đối với chủng S. aureus tương đối ổn định,

nhận thấy cao Neem ngâm với Ethanol 96o có khả năng kháng chủng này ở nồng độ cao.





chủng P.aeruginosa tương đối ổn định, nhận thấy cao Neem chiết với Ethanol 96o có khả






Ethanol 96o

Chiết 6 giờ



Hai nồng độ còn lại là 400 mg/ml và 200 mg/ml không kháng. Kết quả cho thấy hoạt

tính kháng khuẩn của cao lá Neem chiết với Ethanol 96o đối với chủng S. aureus tương

đối ổn định, nhận thấy cao Neem chiết với Ethanol 96o có khả năng kháng chủng này ở

nồng độ cao.


nồng độ nồng độ 800 mg/ml và 400 mg/ml kết quả lần lượt là 5.0 mm và 3.0 mm. Hai

nồng độ còn lại là 400 mg/ml và 200 mg/ml không kháng. Kết quả cho thấy hoạt tính

kháng khuẩn của cao lá Neem đối với chủng P.aeruginosa tương đối ổn định, nhận thấy

cao Neem chiết với Ethanol 96o có khả năng kháng chủng này ở nồng độ cao.


Ethanol 96o





Bảng 3.20: Đuờng kính vòng kháng khuẩn của cao Neem với dung môi Methanol

(mm)

STT Nồng độ

(mg/ml)

3 ngày 6 giờ

S. aureus P.


P.

aeruginosa

1 800 8.0 9.5 8.0 6. 5

2 400 6.5 7.0 8.0 4.5

3 200 3.0 6.0 3.0 2.5

4 100 2.0 5.0. 2.0 1.0


6 Ampicilin - - - -

7 DMSO 5% - - - -



Ngâm 3 ngày


và 400 mg/ml kết quả bằng nhau là 8 mm. Hai nồng độ còn lại là 400 mg/ml và 200

mg/ml có kết quả lần lượt là 3.0 mm và 2.0 mm. Kết quả cho thấy hoạt tính kháng khuẩn

của cao lá Neem ngâm với Methanol đối với chủng S. aureus tương đối ổn định, nhận

thấy cao Neem ngâm với Methanol có khả năng kháng chủng này ở nồng độ cao.





chủng P.aeruginosa tương đối ổn định, nhận thấy cao Neem chiết với Methanol có khả






Methanol

Chiết 6 giờ


và 400 mg/ml có kết quả bằng nhau là 8.0 mm. Hai nồng độ còn lại là 400 mg/ml và

200 mg/ml có kết quả lần lượt là 3.0 mm và 2.0 mm. Kết quả cho thấy hoạt tính kháng

khuẩn của cao lá Neem chiết với Methanol đối với chủng S. aureus tương đối ổn định,

nhận thấy cao Neem chiết với Methanol có khả năng kháng chủng này ở nồng độ cao.



nồng độ còn lại là 400 mg/ml và 200 mg/ml có kết quả lần lượt là 2.5 mm và 1.0 mm.

Kết quả cho thấy hoạt tính kháng khuẩn của cao lá Neem đối với chủng P.aeruginosa

tương đối ổn định, nhận thấy cao Neem chiết với Methanol có khả năng kháng chủng này

ở nồng độ cao.


Methanol

3.4.5. Cao Neem được chiết bằng dung môi Ethyl acetate




Bảng 3.21: Đuờng kính vòng kháng khuẩn của cao Neem với dung môi Ethyl acetate

(mm)

STT Nồng dộ

(mg/ml)

3 ngày 6 giờ

S. aureus P.


P.

aeruginosa

1 800 4.0 6.0 9.0 9.0

2 400 3.0 4.0 8.0 8.0

3 200 - 3.0 6.0 5.0

4 100 - 2.0 5.0 2.5

5 Tetracycline 6.0 8.0 6.0 -

6 Ampicilin - - - -

7 DMSO 5% - - - -



Ngâm 3 ngày



và 200 mg/ml không kháng. Kết quả cho thấy hoạt tính kháng khuẩn của cao lá Neem

ngâm với Ethyl acetate đối với chủng S. aureus tương đối ổn định, nhận thấy cao Neem

ngâm với Ethyl acetate có khả năng kháng chủng này ở nồng độ cao.





chủng P.aeruginosa tương đối ổn định, nhận thấy cao Neem chiết với Ethyl acetate có





Hình 3.23: Khả năng kháng S. aureus và P.aeruginosa của cao Neem ngâm với Ethyl

acetate

Chiết 6 giờ


và 400 mg/ml có kết lần lượt là 9.0 mm và 8.0 mm. Hai nồng độ còn lại là 400 mg/ml

và 200 mg/ml có kết quả lần lượt là 6.0 mm và 5.0 mm. Kết quả cho thấy hoạt tính kháng

khuẩn của cao lá Neem chiết với Ethyl acetate đối với chủng S. aureus tương đối ổn

định, nhận thấy cao Neem chiết với Ethyl acetate có khả năng kháng chủng này ở nồng

độ cao.



nồng độ còn lại là 400 mg/ml và 200 mg/ml có kết quả lần lượt là 5.0 mm và 2.5 mm.

Kết quả cho thấy hoạt tính kháng khuẩn của cao lá Neem đối với chủng P.aeruginosa

tương đối ổn định, nhận thấy cao Neem chiết với Ethyl acetate có khả năng kháng chủng

này ở nồng độ cao.

Hình 3.24: Khả năng kháng S. aureus và P.aeruginosa của cao Neem chiết với Ethyl

acetate




3.4.6. Cao Neem được chiết bằng dung môi Nước

Bảng 3.22: Đường kính vòng kháng khuẩn của cao Neem với dung môi Nước (mm)

STT Nồng dộ

(mg/ml)

3 ngày 6 giờ

S. aureus P.

aeruginosa

S. aureus P.

aeruginosa

1 800 6.0 2.0 3.5 2.0

2 400 4.5 1.0 3.0 2.0

3 200 3.5 - 2.5 1.0

4 100 2.5 - 2.5 1.0

5 Tetracycline 8.0 - 6.0 2.5

6 Ampicilin - - - -

7 DMSO 5% - - - -



Ngâm 3 ngày



và 200 mg/ml lần lượt là 3.5 mm và 2.5 mm. Kết quả cho thấy hoạt tính kháng khuẩn

của cao lá Neem ngâm với Nước đối với chủng S. aureus tương đối ổn định, nhận thấy

cao Neem ngâm với Nước có khả năng kháng chủng này ở nồng độ cao.



2.0 mm và 1.0 mm. Hai nồng độ còn lại là 400 mg/ml và 200 mg/ml không kháng. Kết

quả cho thấy hoạt tính kháng khuẩn của cao lá Neem đối với chủng P.aeruginosa tương

đối ổn định, nhận thấy cao Neem chiết với Nước có khả năng kháng chủng này ở nồng

độ cao.




Hình 3.25: Khả năng kháng S. aureus và P.aeruginosa của cao Neem ngâm với Nước

Chiết 6 giờ


và 400 mg/ml có kết lần lượt là 3.5 mm và 3.0 mm. Hai nồng độ còn lại là 400 mg/ml

và 200 mg/ml có kết quả bằng nhau là 2.5 mm. Kết quả cho thấy hoạt tính kháng khuẩn

của cao lá Neem chiết với Nước đối với chủng S. aureus tương đối ổn định, nhận thấy

cao Neem chiết với Nước có khả năng kháng chủng này ở nồng độ cao.


nồng độ nồng độ 800 mg/ml và 400 mg/ml kết quả bằng nhau là 2.0 mm. Hai nồng độ

còn lại là 400 mg/ml và 200 mg/ml có kết quả bằng nhau là 1.0 mm. Kết quả cho thấy

hoạt tính kháng khuẩn của cao lá Neem đối với chủng P.aeruginosa tương đối ổn định,

nhận thấy cao Neem chiết với Nước Ethyl acetate có khả năng kháng chủng này ở nồng

độ cao.

Hình 3.26: Khả năng kháng S. aureus và P.aeruginosa của cao Neem chiết với Nước

3.5. Thành phần hóa học có trong cao chiết

Sắc ký ghép khối phổ GC/MS của cao cao lá Neem được thể hiện ở hình 3.21 và

Kết quả xác định thành phần hoá học trong cao Neem ở bảng 3.23.

3.5.1. Xác định thành phần hóa học có trong cao lá Neem chiết với n – hexan




Phân tích định tính hàm lượng tương đối của các hợp chất trong mẫu cao Neem

chiết với dung môi n – hexan tại trung tâm phân tích Viện Hàn Lâm Khoa Học và Công

Nghệ Việt Nam, Viện Công Nghiệ Hóa Học, số 01 – Mạc Đĩnh Chi – Quận 1 – TP. Hồ

Chí Minh.

Điều kiên chạy GC – MS:

- Máy sắc kí khí ghép khối phổ (GC-MS) hiệu SCION SQ 456 - GC

- Cột: Rxi - 5ms hiệu RESTEK (30 m x 0.25 mm (i.d.), 0.25 µm df)

- Khí mang: Heli, tốc độ dòng không đổi: 1 mL/phút, nhiệt độ đầu phun: 250 °C,

tỷ lệ phân chia: 30

- Khối quang phổ kế:

+ Tác động điện tử (EI +), năng lượng ion hóa: 70 eV, Chế độ quét toàn bộ: 50-

500 amu, tốc độ quét 1s / lần quét, nhiệt độ nguồn ion hóa: 250 °C.

Hình 3.27: sắc ký đồ GC – MS của cao chiết n – Hexan từ lá Neem

Bảng 3.23: bảng định danh một số cấu tử trong cao chiết n – Hexan từ lá Neem




STT

Thời

gian

lưu

(phút)

Định danh Hàm

lượng (%) Công thức cấu tạo

1 4.045 Diacetone

alcohol 2.601

2 15.531 Palmitic

acid 4.857

3 17.162 Phytol 11.75

4 17.442 Linolenic acid 20.02

5 20.616

Mono – 2 –

ethylhexyl -

adipate

1.883

6 24.556 Carbonic acid,

eicosyl vinyl ester 3.273

7 25.252 Dioctyl

terephthalate 1.814

8 27.235 2-Methyleicosane 22.14

9 30.769 Heptacosane 16.04

10 32.551

3-Ethyl-3-

hydroxyandrost

an-17-one

3.534




11 33.552 Norgestrel 1.161

12 33.879 Octacosane 2.385

13 34.467 -Sitosterol 2.243

Thành phần

không định danh 6.299

Nhận xét: Từ kết quả bảng 3.23 cho thấy phương pháp GC – MS đã xác địch được

13 cấu tử trong cao Neem chiết với hexan. Các cấu tử ở những điểm peak: 4.045, 15.531,

17.162; 17.442, 27.235, 30.769 có thời gian lưu cách xa nhau và có hàm lượng tương

đối cao trong cao lá Neem, trong đó 2-Methyleicosane chiếm hàm lượng cao nhất là

(22.24%), Linolenic acid (20.02%), Heptacosane (16.04%) . Các cấu tử còn lại có cường

độ tương đối thấp nên có hàm lượng không đáng kể trong cao cao lá Neem.

Cao Neem chiết với hexan chứa một số cấu tử có nhiều tác dụng trong đời sống

như: Heptacosane có tác dụng ức chế các tế bào ung thư, ngăn ngừa sự tích béo trong

lòng động mạch, giảm nguy cơ xơ vữa động mạch. Linolenic acid có tác dụng ngăn

ngừa và phòng chống ung thư, viêm da, tiêu đường... ngoài ra Linolenic acid còn được

sử dụng trong việc sản xuất xà phòng, dầu gội.

3.5.2. Xác định thành phần hóa học có trong cao chiết Ethanol 96o


chiết với dung môi Ethanol 96o tại Chi cục Kiểm định Hải quan 04. Số 10, đường Ngô

Quyền, phường Thọ Quang, quận Sơn Trà, Tp. Đà Nẵng.

Điều kiên chạy GC – MS:

- Máy sắc kí khí ghép khối phổ (GC-MS) hiệu SCION SQ 456 - GC

- Cột: Rxi - 5ms hiệu RESTEK (30 m x 0.25 mm (i.d.), 0.25 µm df)




- Khí mang: Heli, tốc độ dòng không đổi: 1 ml/phút, nhiệt độ đầu phun: 250 °C,

tỷ lệ phân chia: 30

- Khối quang phổ kế:

+ Tác động điện tử (EI +), năng lượng ion hóa: 70 eV, Chế độ quét toàn bộ: 50-

500 amu, tốc độ quét 1s / lần quét, nhiệt độ nguồn ion hóa: 250 °C.

Hình 3.28: Sắc ký đồ GC – MS của cao chiết Ethanol 96o từ lá Neem

Bảng 3.24: Bảng định danh một số cấu tử trong cao chiết Ethanol 96o từ lá Neem

STT

Thời

gian lưu

(phút)

Định danh

Hàm

lượng

(%)

Công thức cấu tạo

1 6.1

[1,1'-

Bicyclopropyl]-

2-octanoic acid,

2'-hexyl-,

methyl ester

(C21H38O)

1.46

2 11.62

Tetradecane,

2,6,10-trimethyl

(C17H36)

0.79




3 13.483

[1,1'-

Bicyclopropyl]-

2-octanoic acid,

2'-hexyl-,

methyl ester

(C21H38O2)

0.74

4 13.710

Dodecanoic acid

(C12H24O2)

2.6

5 14.164

Octadecane, 1-

chloro

(C18H37Cl)

2.09

6 16.143 Oleic Acid

(C18H34O2) 0.52

7 16.622

7-Methyl-Z-

tetradecen-1-ol

acetate

(C17H32O2)

1.2

8 17.162

3,7,11,15-

Tetramethyl-2-

hexadecen-1-ol

(C20H40O)

30.91

9 17.848

9-Eicosyne

(C20H38)

9.72

10 19.085

Phytol

(C20H40O)

1.62




11 19.796

l-(+)-Ascorbic

acid 2,6-

dihexadecanoate

(C38H68O8)

7.18

12 20.336

n-

Hexadecanoic

acid

(C16H32O2)

35.98

13 20.735

5,8,11-

Heptadecatriyno

ic acid, methyl

ester

(C18H24O2)

5.19

Nhận xét: Mẫu cao Neem của chúng tôi đã lắc qua với n – hexan để phù hợp với

thiết bị của trung tâm phân tích cho nên kết quả này có khả năng là chưa đúng vì chỉ có

khoảng 50% cao Neem chiết với Ethanol 96o tan trong n – hexan.

Từ kết quả bảng 3.24 cho thấy phương pháp GC – MS đã xác địch được 13 cấu tử

trong cao Neem chiết với Ethanol 96o. Các cấu tử có hàm lượng tương đối cao trong

cao lá Neem là n-Hexadecanoic acid chiếm hàm lượng cao nhất là (35.95%), 3,7,11,15-

Tetramethyl-2-hexadecen-1-ol (30.91%). Các cấu tử còn lại có cường độ tương đối thấp

nên có hàm lượng không đáng kể trong cao cao lá Neem.

3.5.3. Xác định thành phần hóa học có trong cao lá Neem chiết với Methanol


chiết với dung môi Ethanol 96o tại trung tâm phân tích Viện Hàn Lâm Khoa Học và

Công Nghệ Việt Nam, Viện Công Nghiệ Hóa Học, số 01 – Mạc Đĩnh Chi – Quận 1 –

TP. Hồ Chí Minh.

Điều kiên chạy LC – MS:

- Thiết bị: UPLC- DAD (Thermo, Hoa Kỳ), nhiệt độ: 27 oC

Cột: Hypersil GOLD Dim. (mm) 150 x 2.1 Kích thước hạt: 3 𝜇




Hình 3.29: Sắc ký đồ LC – MS của cao chiết Methanol từ lá Neem

Bảng 3.25: Bảng định danh một số cấu tử trong cao chiết Ethanol 96o từ lá Neem

STT

Thời gian

lưu

(phút)

Định danh Hàm

lượng (%) Công thức cấu tạo

1 9.850 Linolenic acid

2 10.527 Palmitic

acid

Nhận xét: Đây là bảng kết quả chạy LC – MS, nhưng đây chỉ là do chúng tối dự




đoán nên kết quả này chỉ có khả năng chứ không chắc chắn bởi vì khi chạy LC – MS thì

những hợp chất trong cao chiết lá Neem không có trong thư viện phổ.

3.6. Kết quả thử nghiệm trên sâu

Thử nghiệm hiệu quả diệt sâu của cao Neem được pha theo 2 cách sau đây:


Do thời gian còn hạn hẹp và không đủ đáp ứng cho quá trình thử nghiệm nên chúng

tôi chưa khảo sát tỉ lệ pha loãng.

Mỗi đĩa petri sẽ chuẩn bị 4 con sâu và sau đó tiến hành thử nghiệm thuốc.

Sau khi phun trực tiếp lên sâu, sau 2 giờ thì chúng tôi nhận thấy số sâu chết chỉ 1

con, sau 3 giờ số sâu chết là 2 con. Khi chúng tôi nhúng lá cải vào sau đó cho sâu vào

đĩa thì sâu có hiện tượng bò ra khỏi lá đã nhúng thuốc và không ăn lá. Chúng tôi nhận

thấy nguyên nhân có thể là do tác dụng của thuốc làm sâu ngán ăn và chết sau một thời

gian phun thuốc chứ không chết ngay lập tức.

Hình 3.30. Lá cải nhúng thuốc Hình 3.31. Phun trực tiếp




CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

4.1. Kết luận

1. Bằng phương pháp ngâm dầm và phương pháp chiết soxhlet sử dụng 6 dung

môi có độ phân cực khác nhau (Hexan, chloroform, ethanol 96o, methanol, ethyl acetat)

Ngâm dầm: Tỉ lệ nguyên liệu/dung môi là 1:20 (15g lá Neem và 300 ml dung

môi) trong thời gian 1 ngày, 3 ngày, 5 ngày, 7 ngày.

Chiết soxhlet: Tỉ lệ nguyên liệu/dung môi là 1:20 (15g lá Neem và 300 ml dung

môi) trong thời gian 4 giờ, 6 giờ, 8 giờ, 12 giờ.

Sau khi so sánh khối lượng cao Neem khi chiết với các hệ dung môi khác nhau

bằng phương pháp ngâm dầm và phương pháp chiết Soxhlet thì chúng tôi nhận thấy khi

chiết với Methanol và Ethanol 96o thì lượng cao Neem thu được nhiều nhất.

2. Định tính một số chất hữu cơ trong cao Neem khi chiết với 6 dung môi khác nhau:

Hầu hết tất cả cao Neem được chiết với 6 dung môi khác nhau đều phản ứng dương

tính với cacbonhydrat, Steroid – triterpenoid. Trong đó, khi chiết với Ethanol 96o và

Methanol thì cho kết quả như nhau là đều có các hợp chất như: alkaloid, cacbonhydrat,

Steroid – triterpenoid.

Khi chiết với dung môi Nước thì có sự xuất hiện của nhiều nhóm chất nhất:

Flavonoid, Saponin, Cacbonhydrat, Triterpenoid và Steroid. Và khi chiết với dung môi

Hexan thì sự co mặt của các nhóm chất ít nhất: Cacbonhydrat, Triterpenoid và Steroid.

3. Khả năng kháng khuẩn của cao Neem khi chiết với các hệ dung môi khác nhau:

Kết quả khảo sát về hoạt tính của cao Neem đối với các chủng vi khuẩn được thử

nghiệm cho thấy ở nồng độ cao 800 mg/ml và 400 mg/ml đạt đường kính vòng kháng

khuẩn cao nhất. Và ở hai nồng độ 200 mg/ml với 100 mg/ml thì kháng ít và có khi không

kháng.

Trong các hệ dung môi thì dung môi Hexan và Methanol có khả năng kháng

khuẩn cao nhất.

4. Thử nghiệm hiệu quả diệt sâu của cao Neem


Khi chúng tôi nhúng lá cải vào sau đó cho sâu vào đĩa thì sâu có hiện tượng bò ra

khỏi lá đã nhúng thuốc và không ăn lá.




4.2. Kiến nghị

Quá trình nghiên cứu này được thực hiện trong quy mô phòng thí nghiệm và với

thời gian hạn chế. Do đó, chúng tôi xin đưa ra một số kiến nghị như sau:

- Nên nghiên cứu sử dụng thêm các phương pháp khác chiết cao Neem: sử dụng các

loại enzyme, dùng sóng siêu âm hay vi sóng,... để quá trình chiết đạt hiệu quả cao

hơn.

- Khảo sát thêm về tiềm năng kháng khuẩn của cao Neem.

- Định danh một số hợp chất khác trong lá Neem để đánh giá khả năng dược liệu của

lá.

- Tiếp tục pha thuốc trừ sâu từ cao Neem với các nồng độ khác nhau.




TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tài liệu Tiếng việt

[1]. “Cây tử đinh hương Ấn đa dụng”. Đăng ngày 14/04/2004 lúc 5 giờ 29 phút. Truy

cập ngày 15 tháng 6 năm 2019.

<http://www.agriviet.com.>

[2]. Bộ Nông Nghiệp và Phát Triển Nông Thôn, 2005. Danh mục thuốc bảo vệ thực vật

được phép sử dụng ở Việt Nam, trang 7.

[3]. D. A. Tuấn and et al, 2001. Azdirachtin- Hoạt chất gây ngán ăn mạnh đối với sâu

khoang và được phân lập từ hạt Neem (Azadirachta indica A.Juss) di thực vào Việt

Nam. Tuyển tập Hội nghị Khoa học và Công nghệ hóa hữa cơ toàn quốc lần thứ hai.,

pp. Trang 333- 337. Nhà Xuất Bản Nông Nghiệp, Hà Nội.

[4]. Đỗ Huy Bích, Đặng Quang Trung, Bùi Xuân Chương và Viện Dược liệu, 1000 cây

thuốc và động vật làm thuốc ở Việt Nam. Tập 2, Nhà xuất bản Khoa học và kỹ thuật.

Hồ Văn Chiến, 2001. Thuốc bảo vệ thực vật và kỹ thuật phun thuốc trong khảo nghiệm

ngoài đồng. Tài liệu Cục bảo vệ thực vật – Trung tâm kiểm định thuốc bảo vệ thực vật

phía Nam, trang 8 – 16.

[5]. Karumitze S. A., 1963. Cơ sở hóa học bảo vệ thực vật (Phan Cát dịch). Nhà xuất

bản Khoa học Hà Nội, trang 9 – 66, 197 – 203.

[6]. L. T. T. Phượng, 2004. Chiết xuất được các hoạt chất sinh học từ hạt Neem và khỏa

sát tác động của chúng đối với ngài gạo (Corcyra cephalonica St). Luận văn Thạc sĩ

Khoa học Nông nghiệp. Đại học Nông Lâm, tp Hồ Chí Minh.

[7]. Lâm Công Định, 1985. Xoan chịu hạn (Azadirachta indica A. Juss ) – Một loài cây

mới thích ứng với vùng nóng hạn Thuận Hải. Tạp chí Lâm nghiệp, tháng 8/1985.

[8]. Lâm Công Định, 1991. Giới thiệu cấy xoan chịu hạn (Azadirachta indica A.Juss)

nhập nội vào vùng cát nóng hạn Phan Thiết- Tuy Phong Sở Nông nghiệp Thuận Hải.

[9]. Lê Thị Thanh Phượng, 2004. Chiết xuất hoạt chất sinh học từ nhân hạt Neem

(Azadirachta indica A. Juss) và khảo sát tác động của chúng đối với ngài gạo (Corcyra

cephalonica St.). Luận văn thạc sĩ khoa học Nông nghiệp, Đại học Nông lâm Thành phố

Hồ Chí Minh, trang 4 – 26, 96 – 98.

[10]. N. T. Ý. Nhi, 2012. Nghiên cứu thành phần limonoid của lá cây Neem trồng ở

Ninh Thuận, ĐH Khoa học Tự Nhiên tp Hồ Chí Minh.




[11]. Nguyễn Trần Oánh, 2002. Công nghệ sản xuất thuốc bảo vệ thực vật. Giáo trình

cao học – Viện khoa học Nông nghiệp, trang 20 – 54.

[12]. Nguyễn Xuân Thành, 1997. Nông dược bảo quản và sử dụng, Nhà xuất bản Nông

nghiệp Hà Nội, trang 3-17, 13-24, 146-147.

[13]. Trần Kim Quy và cộng sự, 2005. Báo cáo nghiệm thu giai đoạn 1 đề tài: Hoàn

thiện quy trình trích ly limonoid trên quy mô pilot từ cây Neem và điều chế các phụ gia

thích hợp để làm nguyên liệu pha chế thuốc trừ sâu bảo vệ thực vật, 75 trang.

[14]. Trần Quang Hùng, 1999. Thuốc bảo vệ thực vật. Nhà xuất bản nông nghiệp Hà

Nội, trang 7-13, 56-62, 114-117.

[15]. V. Đ. K. Vũ Văn Độ, Nguyễn Tiến Thắng, "Đánh giá được độ độc của chế phẩm

phối trộn giữa dầu Neem với Bt (Baccillus thuringiensis) đối với sâu xanh (Heliothis

armigara), sâu tơ (Plutella xylostella)," Viện Sinh học Nhiệt Đới- Trung tâm Khoa Học

Tự Nhiên và Công Nghệ Quốc Gia 2005.

[16]. V. Đ. Khánh, 2004. Khảo sát hoạt tính kháng một số loài nấm gây bệnh và nấm

Aspergiluss flavus sinh độc tố aflatoxins của sản phẩm chiết xuất từ cây Neem trồng

ở Việt Nam. Luận văn Thạc sĩ. Đại học Khoa Học Tự Nhiên tp Hồ Chí Minh.

[17]. V. N. Phượng, P. Đ. Trí, T. X. Du, and N. V. Uyển, 1999- 2000. Nhân giống in

vitro cây xoan Ấn Độ (Azadirachta indica A.Juss), Tuyển tập công trình nghiên cứu

khoa học công nghệ, Viện Sinh học Nhiệt đới, 2001. Nhà xuất bản Nông nghiệp.

[18]. V. V. Đ. Nguyễn Tiến Thắng, Đỗ Thị Tuyến, Lê Thị Thanh Phượng, Vũ Đăng

Khánh, 2003. Xây dựng qui trình chiết xuất hoạt chất sinh học từ hạt Neem trồng tại

Việt Nam và khảo sát ảnh hưởng của dịch chiết lên sự phát triển của nấm gây bệnh thực

vật (Fusarium oxysporum, Alternaria sp.) và Ngài Gạo (Corcyra cephalonica st.). Báo

cáo đề tài cấp cơ sở- Viện Sinh học Nhiệt đới.

Tài liệu Tiếng anh

[19]. A. V. B. Sankaram et al., "Pesticidal dry powder formulation enriched in

azadirachtin up to 88% an emulsifiable concentrate enriched up to 30% of azadirachtin

and a process for preparing such formulation and concentrate from Neem seed/kernel,"

ed: Google Patents, 1999.

[20]. B. Hicks, "Developments in the world of Neem," Pesticide Outlook, vol. 14, no. 3,

pp. 102-103, 2003.




[21]. Baptista, J., Lima, E., Paiva, L., Castro, A.R. (2014), Value of off-season fresh

camellia sinensis leaves. Antiradical activity, total phenolics content and catechin

profiles, Food science and technology, 59, pp. 1152-1158.

[22]. D. Mongkholkhajornsilp, S. Douglas, P. L. Douglas, A. Elkamel, W. Teppaitoon,

and S. Pongamphai, "Supercritical CO 2 extraction of nimbin from Neem seeds – a

modelling study," Journal of Food Engineering, vol. 71, no. 4, pp. 331-340, 2005.

[23]. E. Melwita and Y.-H. Ju, "Separation of azadirachtin and other limonoids from

crude Neem oil via solvent precipitation," Separation and Purification Technology, vol.

74, no. 2, pp. 219-224, 2010.

[24]. G. Jadeja, R. Maheshwari, and S. Naik, "Extraction of natural insecticide

azadirachtin from Neem (Azadirachta indica A. Juss) seed kernels using pressurized

hot solvent," The Journal of Supercritical Fluids, vol. 56, no. 3, pp. 253-258, 2011.

[25]. Gupta B. N. and Sharma K. K., 1998. Neem – A Wonder Tree. Indian council of

forestry research and education, Dehra Dun, India.

http://www.nysipm.cornell.edu/publication/eiq/files/EIQ_values04.pdf

[26]. I. Ara, B. S. Siddiqui, S. Faizi, and S. Siddiqui, "Tricyclic diterpenoids from the

stem bark of Azadirachta indica," Journal of Natural Products, vol. 51, no. 6, pp. 1054-

1061, 1988.

[27]. J. D. Stark and J. F. Walter, "Neem oil and Neem oil components affect the efficacy

of commercial Neem insecticides," Journal of Agricultural and Food Chemistry, vol.

43, no. 2, pp. 507-512, 1995.

[28]. Kelkar C. M., 1996. Chap.28, Commercialization, Neem. Society of Pesticide

Science, India. (ED by N. S. Randhawa and B. S. Parmar) New age international limited

publish, pages 319 – 323.

[29]. Kenneth and J. Lissant, 1974. Emulsions and emulsions technology. Marcel

Dekker Inc, New York, USA, pages 71 – 111.

[30]. Kovach J., Petzoldt C., Pegni J., Tette J., 2005. Method for measure the

environment impact of pesticides.

[31]. Lindner Paul L., 1974. Chap. 4, Agricultural Emulsions. In Emulsions and

Emulsions technology. ED by Kenneth and J. Lissant, Marcel Dekker Inc, New York,

USA, pages 191 – 209.

http://www.nysipm.cornell.edu/publication/eiq/files/EIQ_values04.pdf




[32]. N. R. Council, Neem: a tree for solving global problems. The Minerva Group, Inc.,

2002.

[33]. P. M. Murali, "Process of preparing purified azadirachtin in powder form from

Neem seeds and storage stable aqueous composition containing azadirachtin," ed:

Google Patents, 2001.

[34]. P. Murali, "Process for preparing purified Azadirachtin in powder form from Neem

seeds and storage stable aqueous composition containing Azadirachtin," ed: Google

Patents, 1998.

[35]. Puri H. S., 1999. Neem A Divine Tree Azadirachta indica. Harwood Academic

Publishers, England.

[36]. R. O. Larson, "Stable anti-pest Neem seed extract," ed: Google Patents, 1985.

[37]. S. Pankaj, T. Lokeshwar, B. Mukesh, and B. Vishnu, "Review on Neem

(Azadirachta indica): thousand problems one solution," Int. Res. J. Pharm, vol. 2, no.

12, pp. 97-102, 2011.

[38]. S. R. Damarla, S. Sridhar, and M. C. Gopinathan, "Compositions containing Neem

seed extracts and saccharide," ed: Google Patents, 2002.

[39]. Saxena R. C., 1995. Homoteria: leaf and planthoppers, aphids, psyllids, whiteflies

and scale insect. In The Neem tree Azadirachta indica A. Juss and Other Meliaceous

Plants, (ED by H. Schmutterer) VCH Publishers Inc, New York, USA, pages 269 – 281.

[40]. V. Vijayan, S. Aafreen, S. Sakthivel, and K. R. Reddy, "Formulation and

characterization of solid lipid nanoparticles loaded Neem oil for topical treatment of

acne," Journal of Acute Disease, vol. 2, no. 4, pp. 282-286, 2013.

[41]. Vankenburg W. V., 1973. Pesticide Formulations, Marcel Dekker Inc, New York,

USA, pages 65 – 110.

[42]. Völlinger M., 1986. The possible development of resistance against Neem seed

kernel extract and deltamethrin in Plutella xylostella. In Natural pesticides from the

Neem tree Azadirachta indica A. Juss and other tropical plants. Proc.3rd inter. Neem

conf., Nairobi, Kenya, pages 543 – 554.

[43]. Z. Lidert, C. G. Overberger, and J. S. Clovis, "Preparation of high purity Neem

seed extracts," ed: Google Patents, 1995.

ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP TRƯỜNG NGHIÊN …thuvienso.bvu.edu.vn › ... › 1 › NCKHSV-Pham-Thi-Kim-Hai.pdfbỘ giÁo dỤc vÀ ĐÀo tẠo trƯỜng ĐẠi

Documents