РОССИЙСКАЯ ФЕДЕРАЦИЯ RU 2 509 570 C2presentation of foreign epitopes // J Biotechnol., 1996, Jan 26;, 44(1-3). LONDONO L.P. et al. Immunisation of mice using Salmonella

РОССИЙСКАЯ ФЕДЕРАЦИЯ

ФЕДЕРАЛЬНАЯ СЛУЖБАПО ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ

(51) МПКA61K 39/12 (2006.01)A61K 39/29 (2006.01)A61P 31/12 (2006.01)A61P 37/04 (2006.01)

(19) RU (11) 2 509 570(13) C2

(12) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ПАТЕНТУ

(21)(22) Заявка: 2010154605/15, 09.06.2009

(24) Дата начала отсчета срока действия патента: 09.06.2009

Приоритет(ы):(30) Конвенционный приоритет:

09.06.2008 IN 1404/CNE/2008

(43) Дата публикации заявки: 20.07.2012 Бюл. № 20

(45) Опубликовано: 20.03.2014 Бюл. № 8

(56) Список документов, цитированных в отчете опоиске: TINDLE RW et al. Chimeric hepatitis B core

antigen particles containing B- and Th-epitopesof human papillomavirus type 16 E7 protein inducespecific antibody and T-helper responses inimmunised mice // Virology., 1994, May 1; 200(2):547-57. WO 0117550 A2, 15.03.2001. SCHODELF. Hybrid hepatitis В virus core antigen as avaccine carrier moiety: I. (см. прод.)

(85) Дата начала рассмотрения заявки PCT нанациональной фазе: 11.01.2011

(86) Заявка PCT:IN 2009/000333 (09.06.2009)

(87) Публикация заявки РСТ:WO 2010/001409 (07.01.2010)

Адрес для переписки:129090, Москва, ул. Б.Спасская, 25, стр.3,ООО "Юридическая фирма Городисский иПартнеры", пат.пов. А.В.Мицу, рег.№ 364

(72) Автор(ы):ЭЛЛА Кришна Муртхи (IN),СУМАТХИ Кандасвами (IN)

(73) Патентообладатель(и):БХАРАТ БАЙОТЕК ИНТЕРНЭШНЛЛИМИТЕД (IN)

(54) ВАКЦИННАЯ КОМПОЗИЦИЯ, ПРИГОДНАЯ ПРИ ИНФЕКЦИЯХ HPV И ВИРУСОМГЕПАТИТА В, И СПОСОБ ЕЕ ПОЛУЧЕНИЯ(57) Реферат:

Изобретение относится к областимедицины, а именно к биофармацевтики, иможет быть использовано для приготовленияхимерной вакцины для профилактикипапилломавируса человека (HPV) и инфекции,вызываемой гепатитом B у человека. Для этоговакцина содержит антигенную композицию,

которая состоит из химерных слитых молекулполипептидов или эпитопов капсидных белков-антигенов L1 и L2 HPV с поверхностнымантигеном гепатита B (HbsAg), как раскрытов SEQ ID NO:3 по SEQ ID NO:13. Разработкахимерной вакцины позволяет увеличитьплотность L1 или L2 нейтрализующихэпитопов на поверхности вирусоподобной

Ñòð.: 1

ru

RU

2509570

C2

2C

07

59

05

2U

R

частицы HbsAg, при этом химерная слитаяконструкция экспрессируется в видевирусоподобной частицы, обеспечивая защиту

от любого известного серотипа HPV и отгепатита В посредством введения одногобелка. 9 з.п. ф-лы, 7 пр., 11 ил.

(56) (продолжение):presentation of foreign epitopes // J Biotechnol., 1996, Jan 26;, 44(1-3). LONDONO L.P. et al. Immunisationof mice using Salmonella typhimurium expressing human papillomavirus type 16 E7 epitopes inserted intohepatitis В virus core antigen // Vaccine., 1996, Apr; 14(6).

Ñòð.: 2

RU

2509570

C2

2C

07

59

05

2U

R

RUSSIAN FEDERATION

FEDERAL SERVICE FOR INTELLECTUAL PROPERTY

(51) Int. Cl.A61K 39/12 (2006.01)A61K 39/29 (2006.01)A61P 31/12 (2006.01)A61P 37/04 (2006.01)

(19) RU (11) 2 509 570(13) C2

(12) ABSTRACT OF INVENTION

(21)(22) Application: 2010154605/15, 09.06.2009

(24) Effective date for property rights: 09.06.2009

Priority:(30) Convention priority:

09.06.2008 IN 1404/CNE/2008

(43) Application published: 20.07.2012 Bull. 20

(45) Date of publication: 20.03.2014 Bull. 8

(85) Commencement of national phase: 11.01.2011

(86) PCT application:IN 2009/000333 (09.06.2009)

(87) PCT publication:WO 2010/001409 (07.01.2010)

Mail address:129090, Moskva, ul. B.Spasskaja, 25, str.3, OOO"Juridicheskaja firma Gorodisskij i Partnery",pat.pov. A.V.Mitsu, reg.№ 364

(72) Inventor(s): EhLLA Krishna Murtkhi (IN),SUMATKhI Kandasvami (IN)

(73) Proprietor(s): BKhARAT BAJOTEK INTERNEhShNLLIMITED (IN)

(54) VACCINE COMPOSITION APPLICABLE IN HPV AND HEPATITIS VIRUS INFECTIONS, ANDMETHOD FOR PREPARING IT(57) Abstract:

FIELD: medicine, pharmaceutics.SUBSTANCE: invention refers to medicine,

namely to biopharmaceutics, and may be used forpreparing a chimeric vaccine for preventing humanpapilloma virus (HPV) and an infection caused byhepatitis B in a human. For this purpose, the vaccinecontains an antigenic composition consisting ofchimeric fusion molecules of polypeptides or epitopesof L1 and L2 HPV capsid antigen proteins with ahepatitis B surface antigen (HbsAg) as disclosed in

SEQ ID NO: 3 to SEQ ID NO: 13.EFFECT: developing the chimeric vaccine

enables thickening the L1 or L2 neutralisationepitopes on the surface of the virus-like HbsAgparticle; the chimeric fusion construct is expressedin the form of the virus-like particle therebyproviding protection against the known HPV serotypeand against hepatitis B by administering the onlyprotein.

7 ex, 11 dwg

Ñòð.: 3

en

RU

2509570

C2

2C

07

59

05

2U

R

RU 2 509 570 C2

ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯНастоящее изобретение относится к композициям антигенов папилломавируса

человека (HPV) и полипептидов, происходящих из них, используемым по отдельностиили в комбинациях и также в качестве химерных молекул, слитых с бактериальнымиили вирусными антигенами, для профилактики и/или медикаментозного леченияинфекции HPV, а также вирусом гепатита B, у млекопитающих, в частности у человека.

Настоящее изобретение относится к фармацевтическому составу, способномувызывать защитный ответ антител и цитотоксических T-клеток против инфекциипапилломавирусом человека (HPV). Иммуногенный состав содержит очищенныерекомбинантные антигены HPV в стабильном составе. Обсуждается способ индукциизащитных ответов антител и цитотоксических T-клеток с использованиемодновалентных, двухвалентных и поливалентных химерных вакцин. Иммунногеннуюкомпозицию изготавливают для введения человеку in vivo.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИПапилломавирусы человека (HPV) представляют собой двухцепочечные ДНК-

вирусы, которые инфицируют плоский и слизистый эпителий. Злокачественныеэпителиальные новообразования, вызываемые типами HPV "высокого риска" илионкогенными типами HPV, могут прогрессировать в злокачественную карциномушейки матки (Bosch and de Sanjose, 2003). Персистирующая инфекция HPV взначительной степени коррелирует с инвазивной карциномой. Генотипы "высокогориска" могут постепенно прогрессировать от LSIL (низкозлокачественныхвнутриэпителиальных повреждений плоского эпителия) до злокачественной опухоли.(Schlecht et al. 2003). HPV является главным этиологическим фактором для рака шейкиматки, поскольку выявлено, что практически в 99,7% случаев рака шейки маткиимеются персистирующие инфекции HPV (Walboomers et al. 1999). Встречаемостьинфекции HPV является частой среди молодых женщин с половой активностью, иоказалось, что свыше 95% встречающихся инфекций самопроизвольно разрешаются стечением времени. Инвазивная карцинома шейки матки развивается менее чем у 5%женщин, инфицированных HPV16 (Schlecht et al. 2003).

Среди почти 100 типов HPV, молекулярно идентифицированных до настоящеговремени, и более 35 типов HPV, идентифицированных в половых путях, HPV16составляет 50-60% случаев рака шейки матки в большинстве стран, за которымследуют HPV18 (10-20%), и HPV31 и 45 (4-5% каждый). Таким образом, HPV16 являетсянаиболее распространенным типом во всех географических областях, рядом скоторым следует HPV18, в частности, являясь более распространенным в Юго-Восточной Азии. Хотя эта картина является общей для плоскоклеточного рака (SCC)по всему миру, HPV18 является наиболее преобладающим в случаеаденокарцином (ADC), а за ним следует HPV16 (Clifford et al. 2003).Эпидемиологические исследования выявили смешанную инфекцию HPV несколькихгенотипов.

Данные других исследований показывают, что HPV16 является болееперсистирующим (Richardson et al. 2003; Londesborough et al. 1996), а также с большейвероятностью прогрессирует в CIN3, чем другие генотипы HPV высокого риска. Такимобразом, в программах скрининга шейки матки на основе HPV, генотипированиеможет иметь диагностическую пользу при отделении случаев LSIL, положительныхпо HPV16 (и, возможно, HPV18 и другим генотипам), для которых требуется наиболеестрогое наблюдение, от случаев LSIL, инфицированных другими генотипами высокогориска (Clifford et al. 2005).

Ñòð.: 4

DE

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

RU 2 509 570 C2

Стратегии вакцинации, основанные на доступных эпидемиологических данных охарактерном распределении инфекции HPV по возрасту и типу, могут формироватьоснову для разработки эффективной вакцины для контроля и устранения инфекциипапилломавирусом человека. Для эффективной вакцинации должна рассматриватьсястратегия вакцин-кандидатов, которая обеспечивает широкую защитнуюэффективность против множества генотипов. Доступные вакцины с использованиемкапсидных белков L1 являются типоспецифическими для HPV16, HPV18, HPV6 и HPV11и обеспечивают недостаточную защиту от инфекции, вызываемой другимигенотипами, такими как HPV31, HPV35, HPV52, HPV58 и т.д., которые такжеассоциированы с прогрессией в карциному шейки матки. В настоящее времяотсутствуют доступные вакцины против HPV, которые обеспечивают перекрестнуюзащиту против нескольких генотипов HPV.

Были выданы лицензии на две профилактические вакцины, содержащиерекомбинантные вирусоподобные частицы L1 HPV (VLP). Они нацелены только надва из приблизительно 15 известных онкогенных типов HPV. Хотяприблизительно 70% случаев рака шейки матки свойственны этим двум типам,существуют данные о некоторой степени защиты "Ciption of tross" против другихблизкородственных типов. Однако текущая стоимость этих вакцин исключаетнепрерывную доставку по всему миру, в частности, в треть стран мира, гдевстречаемость инфекции HPV является высокой.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ РИСУНКОВНа фиг.1 представлена амплификация посредством ПЦР гена малого антигена

гепатита B (HepBsAg). Дорожка 1:~700 п.н. гена HbsAg; дорожка 2: лестничная ДНКпо 100 п.н.

На фиг.2 представлена амплификация посредством ПЦР мультиэпитопныхпоследовательностей синтетического фрагмента гена E6 и E7 для конструированияхимеры HbsAg-HPV. Дорожка 1:мультиэпитопный фрагмент гена размером ~150 п.н.,содержащий мультиэпитопную последовательность размером 129 п.н.; дорожка 2:лестничная ДНК по 100 п.н.

На фиг.3 представлена амплификация посредством ПЦР фрагмента гена HPV16L2размером ~530 п.н., содержащего ген HPV16L2 размером 510 п.н., для полученияхимерной последовательности HbsAg-HPV; дорожка 2: лестничная ДНК по 100 п.н.

На фиг.4 представлена амплификация посредством ПЦР фрагмента HPV16L2,соответствующего аминокислотам 100-220 гена L2, для получения фрагмента ПЦРразмером ~380 п.н., который содержит конкретную последовательность размером 360п.н.

На фиг.5 проиллюстрирована амплификация посредством ПЦР фрагментагена HPV16L1 размером 99 п.н., амплифицированного посредством ПЦР, сполучением фрагмента размером ~120 п.н., соответствующего аминокислотам 100-220гена L2, для получения фрагмента ПЦР размером ~380 п.н., который содержитконкретную последовательность размером 360 п.н.

На фиг.6 проиллюстрировано, что амплификация посредством ПЦР гена HPV18L1приводит к фрагменту размером ~140 п.н., содержащему последовательность HPV18L1размером 117 п.н.

На фиг.7 показано, что амплификация посредством ПЦР гена HPV18L1 приводит кфрагменту размером ~500 п.н., содержащему фрагмент HPV18L1 размером 480 п.н.

На фиг.8 представлен уровень экспрессии химерного белка HbsAg-HPV,выявленный посредством ELISA по содержанию HbsAg и взятый в качестве показателя

Ñòð.: 5

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

RU 2 509 570 C2

экспрессии химерного белка в индуцируемых культурах Pichia pastoris.На фиг.9 представлен уровень экспрессии химерного белка HbsAg-HPV,

выявленный посредством ELISA по содержанию антигена HPV в индуцируемыхкультурах Pichia pastoris.

На фиг.10 представлена иммуногенность химерных белков, выявленных сиспользованием специфичного к HPV ELISA с использованием первичного антитела,индуцированного против коммерчески доступной четырехвалентной вакцины, иантисыворотки кролика против HPV16L2, индуцированной против очищенного белка.

На фиг.11 представлена иммуногенность химерных белков, выявленных сиспользованием специфичного к HbsAg ELISA с использованием коммерческидоступного набора. Титр антител против конструкции, содержащей белок HPV16L2,оценивали с использованием антисыворотки кролика, индуцированной противочищенного белка L2.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯТаким образом, настоящее изобретение относится к вакцинным композициям,

содержащим химерные белки антигенов HPV, слитые с вирусными илибактериальными белками, обеспечивающим усиленную иммуногенность, полезнуюпри инфекциях вирусом гепатита B, а также при инфекциях папилломавирусомчеловека (HPV).

Антигены HPV могут быть выбраны из группы, включающей, но неограничивающейся ими, HPV16, HPV18, HPV6, HPV11, HPV31, HPV33, HPV35, HPV39,HPV45, HPV51, HPV52, HPV56, HPV58, HPV59, HPV68.

Антигенная композиция, содержащая полные/неполныепоследовательности/мутанты/варианты антигенов HPV, может быть выбрана изсписка, включающего антигены L1, L2, E2, E5, E6 и E7, или конкретные T-клеточныеили B-клеточные эпитопы указанных антигенов, либо в качестве отдельнойпоследовательности, либо в тандемных повторах в химерных молекулах, слитых сбактериальными/вирусными белками, способными индуцировать сильныйантительный ответ при введении хозяину.

Вирусные и бактериальные белки могут быть выбраны из списка, включающего, ноне ограничивающегося ими, антигены вируса гепатита B, такие как ядерный антигенвируса гепатита B, малый антиген вируса гепатита B, инактивированный столбнячныйтоксоид, дифтерийный токсоид, термолабильный токсин E.coli, холерный токсин,экзотоксин A Pseudomonas, шига-токсин, листериолизин, либо отдельно, либо вкомбинациях, или эпитопы, полученные из указанных выше белков.

Антигенная композиция состоит из химерных молекул антигенов HPV, слитых смалым антигеном гепатита B (HbsAg).

Антиген HPV содержит либо полные, либо неполные последовательности/эпитопыкапсидных белков, таких как L1 и L2, или полипептидов, полученных из L1 и/или L2,слитые с HbsAg, такие как в с SEQ ID NO: 3 по SEQ ID NO: 13.

Антигены HPV содержат полную/неполную последовательность/мутанты/варианты/эпитопы ранних белков HPV, таких как E2, E5, E6 и E7, либоотдельно, либо в их комбинациях, таких как в SEQ ID NO: 1 и 2.

Антигены HPV подвергают слиянию с N-концом, с C-концом или с любой областьюв открытой рамке считывания малого антигена гепатита B с добавлением линкернойпоследовательности между двумя последовательностями или без ее добавления.

Согласно другому аспекту этого изобретения предусматривается способ экспрессииуказанных выше химерных антигенов HPV и HPV-HBsAg по п.1, включающий

Ñòð.: 6

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

RU 2 509 570 C2

культивирование клетки-хозяина, трансформированной антигеном/слитым антигеномпо п.1, выделения и очистки из них рекомбинантных белков.

Рекомбинантная экспрессия указанных выше антигенов HPV может происходить вхозяине либо в качестве внутриклеточных белков, либо в качестве секреторныхбелков, причем хозяином является либо прокариотическая, либо эукариотическаяэкспрессирующая система, предпочтительно дрожжи.

Фармацевтическая композиция содержит антигенные композиции, описанные внастоящем документе выше, в эффективном количестве, подлежащие применению ввакцине, и фармацевтически приемлемый носитель.

Антигены используют в диапазоне 10 мкг - 1000 мкг белка на дозу,предпочтительно от 10 мкг до 200 мкг и наиболее предпочтительно от 10 мкг до 100мкг.

Кроме того, фармацевтическая композиция содержит пригодный адъювант, причемадъювант выбран по меньшей мере из одного из следующих: гидроксид алюминия,фосфат алюминия, монофосфориллипид A, другие органические липофильныесоединения, содержащие CpG и не содержащие CpG олигонуклеотиды, цитокины.

Способ индукции защитного ответа антител на антигенную композицию и/илиответа цитотоксических T-клеток согласно любому из предшествующих пунктов,включает введение указанной композиции субъекту, нуждающемуся в таком лечении,по меньшей мере одним из путей, таким как пероральный путь, путь через слизистуюоболочку или парентеральный путь введения. Указанные выше антигенныекомпозиции заключают в фармацевтически приемлемые биодеградируемые полимеры.

Указанные выше антигенные составы применяют для профилактики илимедикаментозного лечения инфекций папилломавирусом и ассоциированного с нимириска злокачественной опухоли у млекопитающих, в частности у человека.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯИзобретение относится к разработке профилактических или терапевтических

вакцин-кандидатов для человека от инфекций папилломавирусом человека. Из уровнятехники известно, что основной капсидный белок HPV, белок L1, может собираться ввирусоподобную частицу (VLP), либо отдельно, либо в комбинации с минорнымкапсидным белком L2, при экспрессии в качестве рекомбинантных белков in vitro. Этивирусоподобные частицы являются иммуногенными и их используют в качествевакцин для профилактики инфекций HPV у людей. Карцинома шейки маткивызывается несколькими "онкогенными" типами HPV, включающими HPV16, HPV18,HPV31, HPV33, HPV35, HPV39, HPV45, HPV51, HPV52, HPV56, HPV58, HPV59, HPV68 ит.д. VLP, содержащие капсидные белки L1, являются хорошими вакцинами-кандидатами, однако антитела, которые распознают конкретные структурныеэпитопы на VLP, являются специфичными к генотипу, и антитела против одноготипа VLP демонстрируют небольшую перекрестную реактивность в отношениидругих генотипов HPV, или демонстрируют ее отсутствие. Однако являетсяраспространенной смешанная инфекция HPV нескольких генотипов.

В объем настоящего изобретения входит разработка универсальных вакцин,которые могут обеспечить защитный иммунитет против основных типов HPV,которые ассоциированы с риском карциномы шейки матки. Минорный капсидныйбелок HPV L2 обеспечивает потенциально широкую нейтрализующую активностьпротив нескольких генотипов вируса вследствие более высокой консервативностипоследовательностей в белке L2. Однако в отличие от структурных эпитопов L1,которые являются высоко антигенными, белок L2 является относительно

Ñòð.: 7

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

RU 2 509 570 C2

слабоиммуногенным. Его низкое содержание в природных капсидах -приблизительно 12-72 молекул на 360 копий L1, ограничивает егоиммуногенность (Pereira et al. 2009). Возможным подходом для расширенияиммунитета при более низких затратах является рассмотрение вакцинации против L2.Вакцины против L2 можно получать при относительно низких затратах и они такжеимеют перспективу обеспечения значительно более широкого защитного иммунитетаперекрестного типа, чем в случае, наблюдаемом при иммунизации VLP L1 (Kanda andKondo 2009). Минорный капсидный белок L2 HPV, который играет важную роль впроникновении вируса в клетки, локализации вирусных компонентов в ядре, всвязывании ДНК, образовании и стабильности капсида, индуцирует антитела, которыеявляются более перекрестно-реактивными среди типов HPV, чем в случае основногокапсидного белка L1, делая его привлекательной потенциальной мишенью длясубъединичных вакцин против инфекций HPV нового поколения с более широкойзащитой.

Задачей изобретения является повышение иммуногенности вакцины-кандидата(вакцин-кандидатов), позволяя представление множества копий антигенныхэпитопов для усиления иммуногенности, посредством химерного слияния с вируснымии бактериальными белками. До настоящего времени отсутствует коммерческоепроизводство мультиэпитопной вакцины против инфекции HPV. Мультиэпитопныевакцины обеспечивают преимущество широкой защитной активности вследствиевысокой консервативности последовательностей антигенных эпитопов капсидных иранних белков среди различных генотипов вируса.

Вирусоподобные частицы, образованные малым антигеном гепатита B (HbsAg),представляют собой мультимерную структуру, которая является высокоиммуногенной при введении в качестве вакцины против инфекции вирусом гепатита B.Структура VLP позволяет встраивание гетерологичных последовательностей издругих белков в его открытую рамку считывания в различных областях, позволяяприменение химерных слитых белков с HbsAg в качестве потенциальных вакцин-кандидатов. Антигены HPV включают капсидные белки L1 и L2, и ранние белки, такиекак E1, E2, E5, E6 и E7. Эти белки могут состоять из полной/неполнойпоследовательности/мутантов/вариантов/эпитопов белков L1, L2, E1, E2, E5, E6 и E7HPV, либо по отдельности, либо в сочетаниях. T-клеточные или B-клеточные эпитопыэтих белков-кандидатов используют либо по отдельности, либо в тандемныхповторах, и подвергают слиянию с HbsAg для применения в качестве вакцин-кандидатов для вакцинации против HPV. Антигены HPV подвергают слиянию либос N-концом или C-концом, либо с любой областью в открытой рамке считываниямалого антигена гепатита B с добавлением линкерной последовательности междудвумя антигенами, или без ее добавления.

Химерная молекула капсидных белков HPV, слитая с HbsAg, не была описана донастоящего времени. Химера минорного капсидного белка L2 HPV с HbsAg являетсяпривлекательной в качестве кандидата для вакцины, поскольку белок L2, хотя иобеспечивает широкую нейтрализующую активность против множества генотиповвируса, сам по себе является слабым антигеном, как и его линейный полипептид.Предоставление областей L2, ответственных за его широкую нейтрализующуюактивность против множества генотипов вируса HPV в качестве мультимерных копийна VLP HbsAg, повышает его иммуногенность посредством предоставлениямножества копий VLP, по сравнению с тем, когда они представлены в виде однойкопии. Области белков L1 HPV16 и HPV18, выбранные для создания химерных

Ñòð.: 8

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

RU 2 509 570 C2

конструкций с HbsAg, также представляют собой области, которые обладают широкойнейтрализующей активностью против других генотипов, и потенциально могутобеспечить перекрестную защиту. Авторы настоящего изобретения исследовалиуниверсальность HbsAg, самосборка которого в вирусоподобные частицы все ещепозволяет химерное слияние с гетерологичными последовательностями других белков.Авторы настоящего изобретения изготовили химеру из HbsAg с B-клеточными и T-клеточными эпитопами белков E6 и E7 HPV, которые предоставлены в тандеме, дляповышения их иммуногенного потенциала, а также с белками L1 и L2 HPV16 и HPV18.Была описана химерная конструкция различных областей E7 HPV с белком HbsAg.Авторы настоящего изобретения использовали множество T- и B-клеточных эпитопов,происходящих из белков E6 и E7 HPV, поскольку присутствие этихпоследовательностей в тандеме приводит к более высокой иммуногенности, чем когдаони присутствуют в качестве единичной копии. Их предоставление намультимерной VLP из HbsAg в свою очередь увеличивает количество копий, которыеоказываются на VLP, что дополнительно повышает их иммуногенность иобеспечивает превосходный кандидат для вакцины. Известно, что B- и T-клеточныеэпитопы вызывают сильные цитотоксические T-клеточные ответы, обеспечивающиеперспективу хорошей терапевтической вакцины против инфекций HPV.

Специалисты в данной области смогли установить, что также в сходной стратегии вкачестве химерных последовательностей с антигенами HPV для повышениявакцинного потенциала можно использовать следующие кандидаты. Списоккандидатов включает, но не ограничивается ими, ядерный антиген вируса гепатита B,инактивированный столбнячный токсоид, дифтерийный токсоид, термолабильныйтоксин E.coli, холерный токсин, экзотоксин A Pseudomonas, шига-токсин,листериолизин, белки теплового шока, кальретикулин или эпитопы, происходящие изуказанных выше эпитопов.

Указанные выше белки можно экспрессировать либо в прокариотических, либо вэукариотических экспрессирующих системах, в качестве внутриклеточных илисекреторных белков. Pichia pastoris в качестве экспрессирующей системы являютсяпреимущественными в промышленном масштабе, поскольку они являютсяэкономически выгодными, и несколько белков, которые экспрессированы и очищеныиз Pichia pastoris успешно выпустили в серийное производство, поскольку былоопределено, что они являются безопасными для применения у человека. Эта системаможет быть применима к дрожжам любого рода или вида. Химерная слитая молекулаантигенов HPV с секреторной сигнальной последовательностью HSA (сывороточногоальбумина человека) для повышения синтеза и секреции белка в культуральную среду,обеспечивает не только высокий уровень экспрессии, но также простоту очистки белкав масштабе промышленной ферментации. Последовательность HSA на его N-концесовместима с высоким уровнем синтеза и эффективной секрецией в Pichia pastoris.Очистка вирусных антигенов с использованием запатентованной технологии HimaxTM

упрощает выделение химерных антигенов HbsAg-HPV, в частности, VLP, вэкономически выгодном способе, который является безопасным для применения учеловека и экономичным в промышленном масштабе, по сравнению с общепринятымультрацентрифугированием в градиенте плотности на хлориде цезия. Это позволитпродукцию недорогой вакцины, которая является безвредной для окружающей средывследствие избегания применения тяжелых металлов, таких как хлорид цезия.

Белки экспрессируются в качестве VLP, капсомеров, полипептидов или химерныхполипептидов, содержащих HPV и бактериальные/вирусные антигены. Указанные

Ñòð.: 9

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

RU 2 509 570 C2

антигены включены либо в качестве единичной последовательности, либо в видетандемных повторов, поскольку химерные слитые молекулы сбактериальными/вирусными белками способны индуцировать сильный ответ антителили ответ цитотоксических T-клеток при введении хозяину. Субъединичныеиммуногены, содержащие копии T- и B-клеточных эпитопов в тандеме, потенциальноявляются более иммуногенными, чем когда они встречаются в виде единичной копии.Химерные конструкции с эпитопами E6 и E7, а также с белками L2 и L1, индуцируютсильный ответ антител как против эпитопов HbsAg, так и против эпитопов HPV, приопределении посредством ELISA. Это обеспечивает вакцину для двойного применения,как против гепатита B, так и против множества генотипов вируса HPV.

Антигенные композиции указанных выше беков изготавливают в фармацевтическиприемлемом носителе для иммунизации у человека. Антигенные составы можновводить любо отдельно, либо с адъювантом, выбранным из списка, которыйвключает, но не ограничивается ими: гидроксид алюминия, фосфат алюминия,монофосфориллипид A, другие органические липофильные соединения,содержащие CpG и не содержащие CpG олигонуклеотиды, цитокины и т.д.Альтернативно антигенный состав может содержать два или более очищенныхантигена, которые смешаны in vitro в пригодном составе, и он может использоваться вкачестве вакцины. Антигенные составы можно доставлять одним из несколькихспособов пероральным путем, путем через слизистую оболочку или парентеральнымпутем у млекопитающих, предпочтительно у человека, для того, чтобы вызватьзащитный ответ антител и/или цитотоксических T-клеток. Также антигены можнодоставлять в фармацевтически приемлемых биодеградируемых полимерах. Указанныевыше составы можно использовать для профилактики или медикаментозного леченияинфекций папилломавирусом и связанного с ними риска злокачественной опухоли умлекопитающих.

HPV проникает в организм через слизистые клетки и не распространяется системно.Таким образом, вакцина против HPV возможно будет индуцировать сильный идлительный иммунный ответ в слизистых оболочках половых путей. В связи с этим,исследования назальной и пероральной иммунизации у животных показали, что VLPиндуцирует антитела в слизистой половых путей. Вакцины, обеспечивающиеиммунитет слизистых оболочек против антигенов HPV, являются преимущественнымидля профилактики инфекции HPV. Составы, пригодные для доставки вакцин черезслизистую оболочку, могут быть протестированы. Для применения на слизистуюоболочку не существует таких коммерчески доступных вакцин против HPV.

Кроме того, изобретение иллюстрируется следующими примерами. Однако ихможно использовать только для цели иллюстрации, и они не подразумевают объемохраны.

Примеры:201. Пример 1: Стратегия клонированияa) Стратегия 1: Химерная молекула мультиэпитопов, происходящих из ранних

белков, слитых с HbsAg:Эта последовательность состоит из малого антигена вируса гепатита B, слитого с

мультиэпитопом, происходящим из белков E7 HPV16 и HPV18, которые расположенытандемно, с последующим химерным слиянием молекулы мультиэпитопа с C-концоми N-концом белка HbsAg. (последовательность белка HbsAg:

Ñòð.: 10

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

RU 2 509 570 C2

Следующие эпитопы, происходящие из белков E7 и/или E6, располагают тандемнодля получения: 5'-EYMLDLQPETTEEDEIDGPAGQAEPDRAHYNIDEIDGVNHQHL-3'-43аминокислоты (129 нуклеотидов). Этот главный эпитоп представляет собойследующую комбинацию и он выбран из списка T- и B-клеточных эпитопов: T-клеточный эпитоп E7 HPV16: а.к. 20-29: TDLYCYEQLN; а.к. 45-54 AEPDRAHYNI; B-клеточные эпитопы: а.к. 10-20: EYMLDLQPETT; а.к. 35-49 EEDEIDGPAGQAEPDR;слитых с B-клеточным эпитопом E7 HPV18 DEIDGVNHQHL, который представляетсобой иммунодоминантный эпитоп E7 HPV18, с получением следующей химернойслитой молекулы, обозначенной как SEQ ID NO: 1. Сходная химерная слитая молекуламультиэпитопа, слитого на N-конце с HbsAg, представляет собой последовательность,предоставленную в SEQ ID NO: 2. Для инициации трансляции на 5'-конецмультиэпитопа помещали инициирующий метионин для трансляции.

b) Стратегия 2: Химерная слитая молекула минорного капсидного белка L2 и HbsAg.N-концевую область минорного капсидного белка L2 подвергали слиянию с HbsAg

на C-конце HbsAg. Амплифицированные области L2 представляют собой 171аминокислоту со следующей последовательностью (инициирующий метионинвстраивали для обеспечения трансляции), слитой с C-концом HbsAg

SEO ID NO: 4:Последовательность минорного белка капсида L2, содержащую 171 аминокислоту

со следующей последовательностью, подвергают слиянию на ее C-конце с N-концом HbsAg с получением SEQ ID NO: 4. Для трансляции добавляют инициирующий

Ñòð.: 11

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

RU 2 509 570 C2

метионин.

c) Стратегия No.3:Химерная слитая молекула фрагмента L2 с гнездовыми делециями с HbsAg.N-концевую область минорного капсидного белка L2 подвергали слиянию с HbsAg

на C-конце HbsAg. Амплифицированная область L2 составляет приблизительно 120а.к. (360 п.н.) со следующей последовательностью:

Ее лигируют с C-концом HbsAg с получением SEQ ID No: 5:

SEO ID No: 6:Последовательность минорного капсидного белка L2, содержащую следующую

последовательность из 120 аминокислот:

подвергают химерному слиянию на ее C-конце с N-концом HbsAg с получением SEQID NO: 6. Для трансляции добавляли инициирующий метионин.

d) Стратегия No. 4: Химерная слитая молекула области L1 HPV16 с HbsAg:Получали химерную слитую молекулу области L1 белка HPV16 на C-конце HbsAg,

состоящей из 33 аминокислот, происходящих из области L1 белка HPV16 (99 п.н.) споследовательностью: NTVIQDGDMVDTGFGAMDFTLQANKSEVPLDI

Химерную слитую молекулу области L1 белка HPV16, состоящей из 33аминокислот, происходящих из области L1 HPV16 последовательности:NTVIQDGDMVDTGFGAMDFTTLQANKSEVPLDI с N-концом HbsAg для полученияхимерной последовательности SEQ ID NO: 8. Для трансляции добавлялиинициирующий метионин.

Ñòð.: 12

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

RU 2 509 570 C2

e) Стратегия No. 5:Химерная слитая молекула области HPV18 L1 с HbsAg:Химерную слитую молекулу области белка L1 HPV18 (39 аминокислот; 117 п.н.) со

следующей последовательностью

подвергали слиянию с C-концом последовательности HbsAg для полученияследующей химерной последовательности:

Ее подвергают слиянию с N-концом белка HbsAg с получением SEQ ID NO: 10, гдедля трансляции добавляли инициирующий метионин.

f) Стратегия No. 6: Химерное слияние более крупного полипептида области L1HPV18 с HbsAg:

Химерная слитая молекула более крупного фрагмента HPV18 состоит из следующейпоследовательности

и подвергают слиянию на ее N-конце с C-концом HbsAg с получением химернойпоследовательности:

Химерная слитая молекула более крупного фрагмента HPV18 состояла изследующей последовательности:

и ее подвергали слиянию на ее C-конце с N-концом HbsAg с получением химернойпоследовательности SEQ ID 12:

Ñòð.: 13

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

RU 2 509 570 C2

Стратегия No. 7:Химерная слитая молекула полноразмерной последовательности белка L1 HPV16

на ее N-конце с сигнальной последовательностью из 24 аминокислот сывороточногоальбумина человека для секреторной экспрессии в pichia pastoris с получением SEQ IDNO: 13

SEQ ID NO: 14:Химерная слитая молекула полноразмерной последовательности белка L2 HPV16

на ее N-конце с сигнальной последовательностью из 24 аминокислот сывороточногоальбумина человека для секреторной экспрессии в pichia pastoris с получением SEQ IDNO: 14

SEQ ID NO: 15:Химерная слитая полноразмерная последовательность белка L1 HPV18 на его N-

конце с сигнальной последовательностью из 24 аминокислот сывороточногоальбумина человека для секреторной экспрессии в pichia pastoris с получением SEQ IDNO: 15:

2. Пример 2: Клонирование гена и конструирование химер антигена HbsAg-HPV:Ген гепатита B, кодирующий полноразмерный белок HbsAg, амплифицировали

посредством ПЦР с N-концевыми и C-концевыми праймерами, содержащими участкирестрикции EcoRI и BamHI, соответственно, с получением фрагмента ПЦРразмером ~700 п.н. (См. фиг. 1). Праймеры, использованные для амплификациипосредством ПЦР гена HbsAg, представляют собой:

HBNTERM: 5' CACGAATTCACCATGGAGAACACAACATCAGG 3'HBCTERM: 5' TCAGGATCCAATGTATGCCCAAAGACAACAGG 3'

Ñòð.: 14

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

RU 2 509 570 C2

Условия амплификации посредством ПЦР представляли собой денатурацию при94°С в течение 45 секунд, отжиг при 65°С в течение 40 секунд и удлинение при 72°С втечение 1,5 минут в течение 30 циклов с последующим конечным удлинением при 72°Св течение 10 минут. 10 нг плазмидной ДНК, содержащей ген HbsAg, клонированныйв pBluescript SKII+, использовали в качестве матрицы для реакции ПЦР. Реакциясостояла из 1x буфера для ДНК-полимеразы Taq, 0,25 мМ dNTPS, 20 пикомолькаждого праймера и 1,5 Ед ДНК-полимеразы Taq. Все реагенты были от BangaloreGenei. Фрагмент ПЦР очищали из геля и расщепляли BamHI. Расщепленный BamHIфрагмент ПЦР HbsAg использовали для лигирования с различными антигенами HPVдля получения химерных конструкций. Для конструирования химерных конструкций,которые несли ген HbsAg на C-конце и антигены HPV на N-конце, HbsAgамплифицировали с помощью ПЦР с C-концевым праймером, содержащимучасток NotI, и N-концевым праймером, который содержал участок BamHI. Вконструкциях, использованных для амплификации посредством ПЦР, гдеантигены HPV находятся на N-конце и HbsAg находится на C-конце, праймеры ПЦРдля антигенов HPV содержали участок EcoRI на их N-конце и участок BamHI на их C-конце. В обоих случаях, получали химерные слитые молекулы гена HbsAg и гена HPVпосредством лигирования на BamHI-конце обеих последовательностей. Участок BamHIвносил две аминокислоты "GS" (глицин-серин) в область соединенияпоследовательностей HbsAg-HPV. Все описанные в данном описании химерныеслияния (с SEQ ID No: 1 по SEQ ID No: 15) проводили на нуклеотидном уровне сиспользованием полимеразной цепной реакции (ПЦР) и лигированияамплифицированных посредством ПЦР генов.

Следующие фрагменты генов HPV амплифицировали посредством ПЦР длялигирования.

Клонирование мультиэпитопной последовательностиEYMLDLQPETTEEDEIDGPAGQAEPDRAHYNIDEIDGVNHQHL - 43

аминокислоты (129 нуклеотидов). Синтетический фрагмент гена, кодирующийуказанную выше последовательность, синтезировали в GenScript Corporation. Фрагментгена амплифицировали с помощью следующих праймеров, которые вносилиучасток BamHI на N-конце и участок NotI на C-конце. Реакция ПЦР представляласобой денатурацию при 94°С в течение 45 секунд, отжиг при 62°С в течение 45 секунд иудлинение при 72°С в течение 30 секунд в 33 циклах с получением фрагмента ПЦРразмером ~140 п.н., содержащего эпитопную последовательность размером 129 п.н.

Праймер MENTERM: 5'-ATAGGATCCGAGTACATGTTGGATTTG-3'Праймер MECTERM 5'-ATCGCGGCCGCTTATCACAAATGTTGGTGGTTG-3'Фрагмент ПЦР размером 129 п.н. (см. фиг. 2) с использованием указанных выше

праймеров очищали из геля и расщепляли BamHI. Расщепленный BamHI фрагментПЦР лигировали в расщепленный BamHI ген HbsAg в течение ночи с использованиемДНК-лигазы T4 для получения химерного фрагмента размером ~840 п.н.,транслированная последовательность которого обозначена как SEQ ID NO: 1.Лигированный фрагмент правильного размера (~840 п.н.) очищали из геля, ирасщепляли EcoRI и NotI для клонирования в дрожжевой вектор pPIC3.5K. Дляполучения SEQ ID NO: 2, где мультиэпитопная последовательность лигирована на 5'-конце гена HbsAg, изготавливали праймеры со сходными последовательностями, заисключением того, что C-концевой праймер содержал участок BamHI вместоучастка NotI, и в N-концевом праймере участок BamHI был заменен участком EcoRI.Продукт ПЦР размером ~140 п.н. расщепляли BamHI и лигировали с

Ñòð.: 15

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

RU 2 509 570 C2

расщепленным BamHI HbsAg в течение ночи с ДНК-лигазой T4. Лигированныйфрагмент размером ~840 п.н., обозначенный как SEQ ID NO: 2, очищали из геля ирасщепляли EcoRI и NotI для клонировали в дрожжевой экспрессирующийвектор pPIC3.5K.

Химерное слияние фрагмента L2 HPV16 на C-конце HbsAgN-концевую область минорного капсидного белка L2 подвергали слиянию с HbsAg

на C-конце HbsAg. Ген L2 HPV16 синтезировали в GenScript Corp. Амплифицированныеобласти L2 соответствовали аминокислотам 50-220 (510 п.н.) и их лигировали на C-конце HbsAg с получением SEQ ID NO: 3. Для лигирования фрагмента гена L2 с C-концом гена HbsAg, ген, кодирующий белок L2, амплифицировали посредством ПЦРсо сходным N-концевым праймером, содержащим участок BamHI, и C-концевымпраймером, содержащим участок NotI. Амплифицированный посредством ПЦРфрагмент размером ~530 п.н. расщепляли BamHI и лигировали с расщепленным BamHIHbsAg, который содержал участок BamHI на его C-конце. Лигированный фрагментразмером ~1230 п.н. очищали из геля и расщепляли EcoRI и NotI для клонирования вдрожжевой вектор pPIC3.5K.

Для получения химерной конструкции HPV-HbsAg, ген L2 (положениеаминокислот 50-220 п.н.) амплифицировали с праймерами со сходнойпоследовательностью, за исключением того, что N-концевой праймер содержалучасток EcoRI вместо участка BamHI и C-концевой праймер содержал участок BamHIвместо участка NotI. Амплификация посредством ПЦР и расщепления были такими,как описано выше, с получением SEQ ED NO: 4.

Химерное слияние фрагмента L2 HPV16 с гнездовыми делециями на C-конце HbsAgN-концевую область минорного капсидного белка L2 подвергали слиянию с HbsAg

на C-конце HbsAg. Амплифицированные области L2 представляли собой 100-220аминокислот (120 а.к.; 360 п.н.). Праймеры, использованные для амплификациипосредством ПЦР фрагмента гена L2, представляют собой:

6P2CFNTERM: 5'-ACCGGATCCGATCCATCTATCGTTTC-3'6P2CFCTERM: 5'-ATCGCGGCCGCTTATCATCTTGAACCTGGAATTG-3'Реакцию ПЦР проводили в объеме 50 мкл, содержавшем 1x буфер для ДНК-

полимеразы Taq, 0,25 мМ dNTP и 20 пикомоль каждого праймера и 1,5 Е ДНК-полимеразы Taq. Условия ПЦР представляли собой денатурацию при 94°С втечение 45 секунд, 64°С в течение 40 секунд и удлинение при 72°С в течение 1 мин в 30циклах.

Фрагмент ПЦР размером ~380 п.н., содержавший 360 п.н. последовательности L2,очищали из геля, расщепляли BamHI и лигировали в расщепленный BamHI ген HbsAg сполучением химеры HbsAg-HPV размером ~1060 п.н., обозначенной как SEQ ID NO: 5.Для получения химерной последовательности HPV-HbsAg, где фрагмент гена L2лигирован с N-концом гена HbsAg, N-концевые и C-концевые праймеры для L2содержали участки рестрикции EcoRI и BamHI. Лигирование проводили междурасщепленным BamHI фрагментом гена L2 и расщепленным BamHI HbsAg сполучением химерной последовательности из 1060 п.н., обозначенной как SEQ ID NO:6.

Получение химерной последовательности с областью L1 HPV16 и HbsAgПолучение химерной последовательности, состоящей из 33 аминокислот,

происходящих из области L1 белка HPV16 (99 п.н.) последовательности:NTVIQDGDMVDTGFGAMDFTTLQANKSEVPLDI с геном HbsAg. Указанную областьгена L1 HPV16 (ген, синтезированный в GenScript Corporation), амплифицированную

Ñòð.: 16

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

RU 2 509 570 C2

посредством ПЦР с получением фрагмента ПЦР размером ~120 п.н., содержащего 99п.н. указанной выше последовательности, амплифицировали с использованиемследующих праймеров для ПЦР:

6P1CFNTERM: 5'-ATCGGATCCAACACCGTTATCCAAGACGG-3'6P1CFCTERM: 5'-ACTGCGGCCGCTTATCAAATATCCAATGGAACTTC-3'Реакцию ПЦР проводили в объеме 50 мкл, содержавшем 1x буфер для ДНК-

полимеразы Taq, 0,25 мМ dNTP и 20 пикомоль каждого праймера и 1,5 Ед ДНК-полимеразы Taq (все реагенты были получены от Bangalore Genei). Цикл ПЦР состоялиз денатурации при 94°С в течение 45 секунд, отжиг при 65°C в течение 40 секунд иудлинение при 72°C в течение 45 секунд в 30 циклах. Фрагмент ПЦР размером ~120п.н. очищали из геля, расщепляли BamHI и лигировали в расщепленный BamHIген HbsAg в течение ночи с ДНК-лигазой T4 с получением химернойпоследовательности размером ~810 п.н., обозначенной как SEQ ID NO: 7, в которойфрагмент L1 HPV16 является C-концевым для гена HbsAg. Для получения HPV-HbsAg,где указанный выше фрагмент лигирован с N-концом гена HbsAg, фрагмент L1 HPV16амплифицировали посредством ПЦР с праймерами со сходной последовательностью,содержавшей участок EcoRI в N-концевом праймере и последовательность BamHI в С-концевом праймере вместо NotI. Фрагмент ПЦР со сходным фрагментомрасщепляли BamHI и лигировали в расщепленный BamHI HbsAg, как описано выше, сполучением последовательности, обозначенной как SEQ ID NO: 8.

Получение химерной последовательности с областью L1 HPV18 и HbsAgПолучение химерной последовательности белка L1 HPV18 (39 аминокислот; 117

п.н.) со следующейпоследовательностью PPLELKNTVLEDGDMVDTGYGAMDFSTLQDTKCEVPLDI,лигированной с C-концом последовательности HbsAg посредством ПЦР.Синтетический ген L1 HPV18 подвергали оптимизации кодонов для экспрессии в Pichiapastoris и синтезировали в GenScript Corporation. Последовательность L1 HPV18,указанную выше, подвергали амплификации посредством ПЦР со следующимипраймерами для ПЦР:

8PICFNTERM: 5'-GATGGATCCCCTCCTTTGGAATTGAAG-3'8PICFCTERM: 5'-AGTGCGGCCGCTTATCAGTAATCTGGATATTTGC-3'Реакцию ПЦР проводили в объеме 50 мкл, содержавшем 1x буфер для ДНК-

полимеразы Taq, 0,25 мМ dNTP и 20 пикомоль каждого праймера и 1,5 Ед ДНК-полимеразы Taq. Реакция ПЦР состояла из денатурации при 94°C в течение 45 секунд,отжига 65°C в течение 30 секунд и удлинения при 72°C в течение 40 секунд в 30 циклах.Фрагмент ПЦР размером ~135 п.н. очищали из геля, расщепляли BamHI и лигировалив расщепленный BamHI ген с получением химерной последовательности HbsAg-HPV,где последовательность L1 HPV18 лигирована с C-концом HbsAg для получения SEQ IDNO: 9. Для получения химерной последовательности HPV-HbsAg праймеры для ПЦРсодержали участок EcoRI в N-концевом праймере и участок BamHI в C-концевомпраймере. После расщепления BamHI, фрагмент лигировали в HbsAg, которыйсодержал BamHI на N'-конце с получением SEQ ID NO: 10. Оба лигированныхфрагмента ПЦР расщепляли EcoRI и NotI для клонирования в дрожжевойэкспрессирующий вектор pPIC3.5K.

Получение химерной последовательности более крупного фрагмента L1 HPV18с HbsAg

Химерную последовательность более крупного фрагмента L1 HPV18, состоящего изследующей последовательности:

Ñòð.: 17

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

RU 2 509 570 C2

лигировали с C-концом HbsAg посредством ПЦР. Фрагмент L1 амплифицировалипосредством ПЦР с помощью следующих праймеров для ПЦР:

8P1CFLFNTERM:5'-TCTGGATCCGCTACATCTAATGTCTC-3'8P1CFLFCTERM:5'-ATTGCGGCCGCTTATCAGGATGGACTGTAAACG-3'Реакционная смесь объемом 50 мкл содержала 1x буфер для ДНК-полимеразы Taq,

0,25 мМ dNTP и 20 пикомоль каждого праймера и 1,5 Ед ДНК-полимеразы Taq.Реакция ПЦР состояла из денатурации при 94°C в течение 30 секунд, отжига 64°C втечение 40 секунд и удлинения при 72°C в течение 1 мин в 30 циклах. Фрагмент ПЦРочищали из геля, расщепляли BamHI и лигировали с С-концом расщепленного BamHIHbsAg с получением химерного фрагмента SEQ ID NO: 11. Для лигированияуказанного выше фрагмента гена L1 HPV18 с N'-концом последовательности HbsAg,праймеры для ПЦР содержали участок EcoRI в N-концевом праймере и участок BamHIв C-концевом праймере. Расщепленный BamHI фрагмент лигировали врасщепленный BamHI HbsAg с получением химерной последовательности, в которойфрагмент L1 HPV18 является N-концевым для гена HbsAg с получением SEQ ID NO: 12.Обе указанных выше химерных последовательности расщепляли посредством EcoRIи NotI и лигировали с расщепленным EcoRI и NotI дрожжевым экспрессирующимвектором pPIC3.5K для клонирования в Pichia pastoris.

Получение химерных последовательностей антигенов HPV c сигнальнойпоследовательностью гена сывороточного альбумина человека для секреторнойэкспрессии антигенов HPV в Pichia pastoris

Сигнальную последовательность гена сывороточного альбумина человека из 24аминокислот амплифицировали посредством ПЦР со следующими праймерами:

HASSNTERM: 5'-CCTGAATTCACCATGAAGTGGGTAACCTTTATTTC-3'HASSCTERM: 5'-ATTGGATCCTCGACGAAACACACCCCTG-3'с получением фрагмента размером 72 п.н., который очищали из геля,

расщепляли BamHI и лигировали с 5' концом полноразмерных генов L1 HPV16, L2HPV16 и L1 HPV18, которые содержали участок BamHI на 5'-конце с получениемпоследовательностей SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14 и SEQ ID NO: 15, соответственно.

Пример 3: Клонирование и экспрессия в Pichia PastorisВсе химерные последовательности проверяли секвенированием обеих цепей ДНК в

отношении правильности химерной последовательности и рамки считывания передпроведением трансформации дрожжей. Все химерные последовательности,упомянутые в предшествующих разделах, после расщепления EcoRI и NotI очищали изгеля и лигировали в расщепленный EcoRI и NotI вектор pPIC3.5K (Invitrogen Corporation,Carlsbad, USA) и лигировали в течение ночи с ДНК-лигазой T4. Смесь для лигированиятрансформировали в компетентные клетки E.coli DH5a и высевали на планшет сагаром LB, содержащим 100 мкг/мл ампициллина. Плазмидную ДНК выделяли изтрансформированных клонов для каждой из конструкций в крупном масштабе,очищали и расщепляли BglII для линеаризации плазмиды для трансформации дрожжей.

В основном линеаризованную плазмидную ДНК, кодирующую химерныепоследовательности из с SEQ ID NO: 1 по SEQ ID NO: 15, трансформировали в PichiaPastoris GS115 согласно протоколам изготовителей (Invitrogen) и как описано в ихруководстве. Все химерные последовательности клонировали в локус AOX1 и

Ñòð.: 18

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

RU 2 509 570 C2

экспрессировали под промотором AOX1 посредством индукции метанолом.Клонирование, скрининг, выделение рекомбинантных штаммов Pichia и индукциюклонированного гена метанолом проводили согласно руководству пользователя "AManual of Methods for Expression of Recombinant Proteins in Pichia pastoris" Version M Jan2002, набора для экспрессии в Pichia, каталожный # K1710-01, Invitrogen Corporation,Carlsbad, USA).

Пример 4: очистка химерных антигенов HbsAg-HPVКлетки после инкубации с метанолом собирали и лизировали обработкой

ультразвуком и/или с помощью стеклянных гранул. Лизат обрабатывали PEG6000 вконцентрации 7,5% и NaCl в концентрации вплоть до 3%. Суспензию клетокцентрифугировали при 8000 × g в течение 10 мин. Супернатант преципитировалиобработкой солью (запатентованная смесь) и преципитировали. Белок элюировали изпреципитата с солью буфером Tris-HCl, pH 8,5. Элюат концентрировали и подвергалидиафильтрации 50 мМ Tris-HCl, pH 8,5 и наносили на катионную колонку,уравновешенную тем же буфером. Белок элюировали NaCl в различной концентрациидля различных антигенных белков. Чистоту препарата проверяли на 12% SDS-PAGE сокрашиванием серебром. Затем точный молекулярный размер различных химерныхбелков подтверждали вестерн-блоттингом.

Пример 5: ELISA химерных белков HPV-HbsAgЭкспрессию химерных белков выявляли посредством ELISA для определения

содержания малого антигена гепатита B с помощью набора MONOLISA Anti-Hbs3.0(продукт # 72400; Bio-Rad) в точности согласно протоколу, описанному в руководственабора, и выражали в нг/мл. 100 мкл клеточного лизата после индукции использовалидля оценки содержания HbsAg. Оценку антигенов HPV в химерных белках в клеточномлизате после индукции также проводили посредством ELISA. 1 мкг очищенных белковв 200 мкл наносили на 96-луночный микропланшет для титрования в присутствиибуфера для нанесения (карбонатный буфер, pH 9,6) и инкубировали в течение ночипри 4°C. Содержание лунок удаляли, а затем планшетом постукивали по бумажномуполотенцу для удаления остаточного буфера в лунках. Лунки блокировали 225мкл/лунка блокирующего раствора (1 x PBST, содержащий 0,5% BSA) и инкубировалипри 37°C в течение 1 часа.

Лунки промывали три раза буфером для промывания (200 мкл/лунка, 30 секунд напромывание). После каждого промывания планшеты постукивали до сухогосостояния по бумажному полотенцу для удаления из лунок остаточного буфера.Лунки промывали в 1x PBST (фосфатный буфер, содержащий 0,5% tween 20) пять раздля удаления не связавшихся белков. Антитело к полноразмерному L1 HPV6, L2 HPV16

и L1 HPV18, индуцированное у кролика, использовали в качестве первичногоантитела. После добавления первичного антитела в разведении 1:1000, планшетыинкубировали при комнатной температуре в течение одного часа при встряхивании.Содержимое лунок удаляли и промывали пять раз буфером для промывания,содержавшим 1x PBST. Добавляли конъюгат вторичного антитела против IgGкролика с HRP в разведении 1:2000 в 10 мМ фосфатно-солевом буфере и инкубировалипри комнатной температуре в течение одного часа при встряхивании. Содержимоелунок удаляли и планшеты постукивали по сухому бумажному полотенцу дляудаления остаточного буфера из лунок. 200 мкл свежеполученного раствора длясубстрата OPD (дигидрохлорид ортофенилендиамина) и пероксида водородадобавляли на лунку и инкубировали при комнатной температуре в течение 30 мин.Реакцию останавливали добавлением 75 мкл буфера для остановки и поглощение

Ñòð.: 19

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

RU 2 509 570 C2

при 490 нм считывали в устройстве для считывания планшетов ELISA.Пример 6: вестерн-блоттингХимерные белки, как описано в предшествующих разделах, разделяли на 12% геле

для SDS-PAGE, подвергали электроблоттингу на мембране PVDF (Hybond-P, GEHealthcare) и блокировали в растворе, содержавшем 10 мМ фосфатный буфер, pH 7,4,содержавший 3% порошок обезжиренного молока. После блокирования в течениеночи блокирующим раствором, блокирующий раствор удаляли, и проводилипромывание 3×5 минут в PBST. Блот инкубировали при 37°C с первичнойантисывороткой кролика в разведении 1:500, индуцированной коммерчески доступнойчетырехвалентной вакциной. После инкубации с первичным антителом в течениеодного часа, блот промывали пять раз и инкубировали с вторичным антителом вразведении 1:2000 в PBST, т.е. конъюгатом IgG против антител кролика с HRPO, иинкубировали при RT в течение одного часа при встряхивании. Добавляли субстратдиаминобензиден (DAB) и пероксид водорода и цвет проявляли до достижениятребуемой интенсивности цвета. Реакцию останавливали удалением растворасубстрата и промыванием WFI.

Вестерн-блоттинг выявил в химерных последовательностях L1 HPV16 и L1 HPV18 спомощью антисыворотки, индуцированной против коммерчески доступнойчетырехвалентной вакцины против HPV.

Пример 7: Иммуногенность химерных белков10 мышей BALB/C (15-20 г) в каждой тестируемой группе иммунизировали 50 мкг

очищенного белка каждого из химерных антигенов, заключенных в геле изгидроксида алюминия, и вводили внутримышечно. Вспомогательную дозу даваличерез 21 сутки после первой дозы 1, и вторую дозу вводили через 45 суток после 1дозы. Титр антител измеряли посредством непрямого ELISA для всех клонов,содержавших SEQ ID NO: 3-12, как описано в предыдущем разделе. Титр антителоценивали как для антигена HbsAg, так и для антигена HPV, у мышей,иммунизированных химерными антигенами. Первичное антитело для оценки L1 HPV16

и L1 HPV18 представляло собой антисыворотку кролика, индуцированную противкоммерчески доступной четырехвалентной вакцины, за исключением клонов,экспрессирующих белок L2 HPV16, который измеряли с помощью антисывороткикролика против L2 HPV16, индуцированной против очищенного белка L2 HPV16. Титрантител против антигенов HPV измеряли посредством непрямого ELISA вобъединенной сыворотке от каждой группы мышей. Вторичное антителопредставляло собой конъюгат антител кролика против IgG с HRPO. Экспериментповторяли, где эквивалентные количества антигенов в алгеле вводили с 50 мкголигонуклеотидов CpG на дозу. Титр антител у всех мышей оценивали на 60-65 суткипосле введения первоначальной дозы антигена. Для оценки титра антителпротив HbsAg у иммунизированных мышей, оценку проводили с помощьюнабора Monolisa Anti HBs 3.0 Kit от Bio-Rad laboratories, в точности согласноинструкциям изготовителя. Значения регистрировали при 490 нм и наносили на график.

Ñòð.: 20

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

RU 2 509 570 C2

Ñòð.: 21

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

RU 2 509 570 C2

Формула изобретения1. Вакцинная композиция для профилактики и лечения любого известного серотипа

папилломавируса человека (HPV) и инфекции, вызываемой вирусом гепатита B учеловека, содержащая антигенную композицию, которая состоит из химерных слитыхмолекул полипептидов или эпитопов капсидных белков-антигенов L1 и L2 HPV споверхностным антигеном гепатита В (HbsAg), как раскрыто в SEQ ID NO:3 по SEQ IDNO:13.

2. Вакцинная композиция по п.1, где антигены HPV содержат полипептиды илиэпитопы ранних белков HPV, таких как E2, E5, E6 и E7, либо отдельно, либо вкомбинациях, таких как раскрыты в SEQ ID NO:1 и 2.

3. Вакцинная композиция по п.1, где антигенная композиция содержит полные илинеполные последовательности или мутанты или варианты антигенов HPV, выбранныхиз антигенов L1, L2, E2, E5, E6 и E7, или специфичные T-клеточные или B-клеточныеэпитопы указанных антигенов, либо в качестве отдельной последовательности, либо втандемных повторах в химерных слитых молекулах с поверхностным антигеномгепатита В, способные индуцировать достаточный титр антител, требующийся дляпрофилактики инфекции, вызываемой любым известным серотипом папилломавирусачеловека (HPV) и инфекции, вызываемой вирусом гепатита В, при введении человеку.

4. Вакцинная композиция по п.1, где антигены HPV выбраны из группы,включающей HPV16, HPV18, HPV6, HPV11, HPV31, HPV33, HPV35, HPV39, HPV45,HPV51, HPV52, HPV56, HPV58, HPV59, HPV68.

5. Вакцинная композиция по п.1, где антигены HPV подвергнуты слиянию с N-концом или с C-концом или с любой областью в открытой рамке считыванияповерхностного антигена гепатита B с добавлением линкерной последовательности

Ñòð.: 22

CL

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

RU 2 509 570 C2

между двумя последовательностями, или без ее добавления.6. Вакцинная композиция по п.1, где химерные слитые молекулы полипептидов или

эпитопов капсидных белков-антигенов L1 и L2 HPV с поверхностным антигеномгепатита В (HbsAg), как раскрыто в SEQ ID NO:3 по SEQ ID NO:13, полученыпосредством рекомбинантной экспрессии в хозяине, включающей следующие этапы:культивирование клетки-хозяина, трансформированной химерными слитымимолекулами антигенной композиции по п.1, с применением вектора pPIC3.5K,выделение и очистку из них рекомбинантных белков.

7. Вакцинная композиция по п.6, где рекомбинантная экспрессия указанных вышеантигенов HPV осуществляется либо в качестве внутриклеточных белков, либо вкачестве секреторных белков в хозяине, причем хозяин представляет собойдрожжевую экспрессирующую систему Pichia pastoris.

8. Вакцинная композиция, содержащая антигенную композицию по любому из пп.1-4, дополнительно содержащая фармацевтически приемлемый носитель.

9. Вакцинная композиция по п.1, где антигены используются в диапазоне 10-1000мкг белка на дозу вакцинной композиции.

10. Вакцинная композиция по п.8 или 9, дополнительно содержащая пригодныйадъювант, причем адъювант выбран по меньшей мере из одного из следующих:гидроксид алюминия, фосфат алюминия, монофосфориллипид A, содержащие CpG ине содержащие CpG олигонуклеотиды, цитокины.

Ñòð.: 23

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

RU 2 509 570 C2

Ñòð.: 24

DR

RU 2 509 570 C2

Ñòð.: 25

RU 2 509 570 C2

Ñòð.: 26

RU 2 509 570 C2

Ñòð.: 27

RU 2 509 570 C2

Ñòð.: 28

RU 2 509 570 C2

Ñòð.: 29

RU 2 509 570 C2

Ñòð.: 30

RU 2 509 570 C2

Ñòð.: 31