РОССИЙСКАЯ ФЕДЕРАЦИЯ RU 2 491 345 C2 · 2013-08-27 · ru 2 491 345 c2 раскрыта в литературе, соответствующей предшествующему

РОССИЙСКАЯ ФЕДЕРАЦИЯ

ФЕДЕРАЛЬНАЯ СЛУЖБАПО ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ

(51) МПКC12P 1/02 (2006.01)C12P 1/04 (2006.01)C12N 1/14 (2006.01)C12N 1/20 (2006.01)C12N 9/00 (2006.01)

(19) RU (11) 2 491 345(13) C2

(12) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ПАТЕНТУ

(21)(22) Заявка: 2010137009/10, 05.02.2009

(24) Дата начала отсчета срока действия патента: 05.02.2009

Приоритет(ы):(30) Конвенционный приоритет:

06.02.2008 IN 00310/CHE/200812.01.2009 IN 00086/CHE/2009

(43) Дата публикации заявки: 20.03.2012 Бюл. № 8

(45) Опубликовано: 27.08.2013 Бюл. № 24

(56) Список документов, цитированных в отчете опоиске: Pichia Fermentation Process Guidelines, 2002,

найдено в Интернете: <http://tools.invitrogen.com/content/sfs/manuals/pichiaferm prot.pdf>. WO 2004039996 A1, 13.05.2004.WO 2007005646 A2, 11.01.2007. WO 2000056903A2, 28.09.2000. RU 2141531 C1, 20.11.1999. RU2208637 C1, 20.07.2003.

(85) Дата начала рассмотрения заявки PCT нанациональной фазе: 06.09.2010

(86) Заявка PCT:IN 2009/000078 (05.02.2009)

(87) Публикация заявки РСТ:WO 2009/113099 (17.09.2009)

Адрес для переписки:127055, Москва, а/я 11, Н.К. Попеленскому

(72) Автор(ы):ГАРГ Майянк Кумар (IN),ГАРГ Саурабх (IN),ДЖОШИ Сулекха (IN),ДЖОЭЛ Анудж (IN),ИЙЕР Хариш (IN),КУМАР Бимал (IN),КУМАР Читтналли Рамеговда Навеен (IN),ПАТАЛЕ Мукеш Бабуаппа (IN),ТИВАРИ Санджай (IN)

(73) Патентообладатель(и):Байокон Лимитид (IN)

(54) ФЕРМЕНТАЦИОННАЯ СРЕДА И СПОСОБ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ РЕКОМБИНАНТНЫХБЕЛКОВ(57) Реферат:

Изобретение относится к биотехнологии.Ферментационная среда для получениярекомбинантных белков с использованиеминдуцируемых метанолом грибов вида Pichiapastoris характеризуется поддерживаемойконцентрацией мочевины или ее производных винтервале от приблизительно 0,3 М доприблизительно 1 М. Среда содержит на литрводы основные соли в следующих количествах:

ортофосфорную кислоту (85%) от 2,67 до 133,5мл, сульфат кальция от 0,093 до 4,65 г, сульфаткалия от 1,82 до 91 г, сульфат магния-7H2Oот 1,49 до 74,5 г, гидроксид калия от 0,413до 20,65 г, глицерин от 4 до 200 г, и на литрводы микроэлементы в следующихколичествах: сульфат меди-5H2O от 0,6 до 30 г,иодид натрия от 0,008 до 0,4 г, сульфатмарганца-H2O от 0,3 до 15 г, молибдат натрия-H2O от 0,02 до 1 г, борная кислота от 0,002

Ñòð.: 1

ru

RU

2491345

C2

2C

54

31

94

2U

R

до 0,1 г, хлорид кобальта от 0,05 до 2,5 г,хлорид цинка от 2 до 100 г, сульфат железадвухвалентного-7H2O от 6,5 до 325 г, биотинот 0,02 до 1 г, серную кислоту от 0,5 до 25 мл.Способ для получения рекомбинантных белковвключает стадию размножения индуцируемыхметанолом грибов вида Pichia pastoris и стадию

экспрессии рекомбинантного белка прииспользовании указанной ферментационнойсреды, в которой осуществляют подпиткуметанолом со скоростью от приблизительно 6г/л/час до приблизительно 20 г/л/час.Изобретение обеспечивает повышенный выходцелевых продуктов. 2 н. и 9 з.п. ф-лы, 27 ил., 16пр.

Ñòð.: 2

RU

2491345

C2

2C

54

31

94

2U

R

RUSSIAN FEDERATION

FEDERAL SERVICE FOR INTELLECTUAL PROPERTY

(51) Int. Cl.C12P 1/02 (2006.01)C12P 1/04 (2006.01)C12N 1/14 (2006.01)C12N 1/20 (2006.01)C12N 9/00 (2006.01)

(19) RU (11) 2 491 345(13) C2

(12) ABSTRACT OF INVENTION

(21)(22) Application: 2010137009/10, 05.02.2009

(24) Effective date for property rights: 05.02.2009

Priority:(30) Convention priority:

06.02.2008 IN 00310/CHE/200812.01.2009 IN 00086/CHE/2009

(43) Application published: 20.03.2012 Bull. 8

(45) Date of publication: 27.08.2013 Bull. 24

(85) Commencement of national phase: 06.09.2010

(86) PCT application:IN 2009/000078 (05.02.2009)

(87) PCT publication:WO 2009/113099 (17.09.2009)

Mail address:127055, Moskva, a/ja 11, N.K. Popelenskomu

(72) Inventor(s): GARG Majjank Kumar (IN),GARG Saurabkh (IN),DZhOShI Sulekkha (IN),DZhOEhL Anudzh (IN),IJER Kharish (IN),KUMAR Bimal (IN),KUMAR Chittnalli Ramegovda Naveen (IN),PATALE Mukesh Babuappa (IN),TIVARI Sandzhaj (IN)

(73) Proprietor(s): Bajokon Limitid (IN)

(54) FERMENTATION MEDIUM AND METHOD OF PRODUCTION OF RECOMBINANT PROTEINS(57) Abstract:

FIELD: biotechnology.SUBSTANCE: fermentation medium for

production of recombinant proteins using methanolinducible fungi of species Pichia pastoris ischaracterised by maintained concentration of urea orits derivatives in the range from about 0.3 M toabout 1 M. The medium contains per liter of waterbasic salts in the following amounts: orthophosphoricacid (85%) from 2.67 to 133.5 ml, calcium sulfatefrom 0.093 to 4.65 g, potassium sulfate from 1.82 to91 g, magnesium sulfate-7H2O from 1.49 to 74.5 g,potassium hydroxide from 0.413 to 20.65 g, glycerolfrom 4 to 200 g, and microelements per liter of waterin the following amounts: copper sulfate-5H2O from

0.6 to 30 g, sodium iodide from 0.008 to 0.4 g,manganese sulfate-H2O from 0.3 to 15 g, sodiummolybdate-H2O from 0.02 to 1 g, boric acid from0.002 to 0.1 g, cobalt chloride from 0.05 to 2.5 g,zinc chloride from 2 to 100 g, sulphate divalent iron-7H2O from 6.5 to 325 g, biotin from 0.02 to 1 g,sulfuric acid from 0.5 to 25 ml. The method forproduction of recombinant proteins comprises thestage of reproduction of methanol inducible fungi ofspecies Pichia pastoris, and the stage of recombinantprotein expression using the said fermentationmedium in which feeding with methanol is carriedout at a rate of about 6 g/l/hr to about 20 g/l/hr.

EFFECT: increased yield of target products.11 cl, 27 dwg, 16 ex

Ñòð.: 3

en

RU

2491345

C2

2C

54

31

94

2U

R

RU 2 491 345 C2

Область техники, к которой относится изобретениеНастоящее изобретение относится к применению амидов карбоновых кислот, таких

как мочевина или ее производные, карбаматы, карбодиимиды и тиокарбамиды, вкачестве азотных добавок в ферментационные среды для получения рекомбинантныхбелков с целью достижения повышенных уровней биоконверсии, и пептидов,подобных инсулину и аналогам инсулина, экстендина и ферментов, таких как липаза,с использованием индуцируемых метанолом грибных экспрессирующих систем, такихкак Pichia. Существенные аспекты изобретения, в частности, относятся кэкспериментальному процессу ферментации с использованием оптимизированныхпараметров питательных сред, отвечающих за более высокий выход продукта втечение более коротких периодов образования. Принцип настоящего изобретенияможно также применить для продукции широкого круга белков и вторичныхметаболитов посредством ферментации подходящего экспрессирующего организма.

Уровень техникиЭкспрессирующие системы на основе дрожжей, таких как Pichia pastoris, обычно

используют для экспрессии рекомбинантных белков, см. статью Cregg, J.М. et al.,в Dev. Ind. Microbiol. 29: 33-41; 1988. Экспрессирующая система P. pastoris используетиндуцируемый метанолом промотор алкогольоксидазы (АО1), который контролируетген, который кодирует экспрессию алкогольоксидазы, фермента, которыйкатализирует первую стадию метаболизма метанола (см. статью Cregg J М. et al.в Bio/Technology 11: 905-910; 1993). P. pastoris обладает потенциалом высоких уровнейэкспрессии, эффективной секреции внеклеточного белка, посттрансляционныхмодификаций, таких как гликозилирование, и роста до высоких значений густотыклеток на минимальной среде в биореакторных культурах.

Способ периодической ферментации с подпиткой с использованием Pichia pastorisописан в "Pichia fermentation Process Guidelines" (Руководство по процессуферментации Pichia) фирмы Invitrogen Co. (San Diego, СА), далее его обозначают какконтроль. Для получения рекомбинантных белков трансформированную Pichiapastoris выращивают до требуемой биомассы, соответствующей высокой густотеклеток, на глицерине в качестве источника углерода. Фазу образования продуктаинициируют подпиткой метанолом, который служит индуктором и единственнымисточником углерода для культуры. Во время образования биомассы и фазыобразования продукта аммиак, который служит источником азота, используют дляконтроля pH.

Несмотря на различные преимущества, даваемые дрожжевыми экспрессирующимисистемами, еще имеется необходимость в оптимизации испытывающей влияниепитательных компонентов физико-химической среды для эффективной имаксимальной продукции белка в биореакторах. Весьма необходимым являетсядостижение высокой специфической продуктивности. Она может быть получена путемоптимизации исходного состава среды, стратегии подпитки метанолом и физико-химических параметров процесса. Имеются публикации, в которых сульфат аммония,фосфат аммония, диаммоний фосфат, нитрат калия, мочевину, кукурузный сироп,соевую муку, хлопковую муку, мелассы сахарного тростника и свеклы, пептоны,мучные гидролизаты и т.п. используют в качестве источника азота для выращиваниябактерий, дрожжей и грибов. Использование различных источников углерода и азотадля "роста" микроорганизмов представляет собой предшествующий уровень техники.

Однако оптимальная комбинация специально определенных источников углерода иазота для эффективной продукции рекомбинантных белков, пептидов и ферментов не

Ñòð.: 4

DE

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

RU 2 491 345 C2

раскрыта в литературе, соответствующей предшествующему уровню техники.Например, заявка WO/2007/005646 раскрывает продукцию этанола по сути путемкультивирования рекомбинантных дрожжей на комплексной среде для роста,содержащей сложные углеводы, а также ряд более дешевых источников азота, такихкак кукурузный сироп, кукурузный экстракт, дрожжевой автолизат и мочевина. Крометого, в данном способе не используют индуцируемый метанолом механизм для ростаили продукции в отличие от разработанного в настоящем изобретении способаполучения рекомбинантных белков. Аналогично патент США 4288554 описываетнепрерывный способ ферментации только для роста не-ГМО(негенномодифицированного) вида Candida с использованием мочевины в комбинациис другими источниками азота и основной солевой среды. В данном случае отсутствуеткакое-либо предположение или описание того, где мочевина может бытьиспользована во время процесса ферментации (периодической, периодической сподпиткой, непрерывной) с использованием индуцируемой метанолом ГМО Pichiapastoris для эффективной продукции рекомбинантных белков и пептидов, например,человеческого инсулина и его аналогов или ферментов, подобных липазе.

Неожиданно обнаружено, что использование описанной ферментационной среды,характеризующейся контролируемым добавлением некоторых богатых и легкорастворимых источников азота, таких как мочевина, дополнительно воптимизированных концентрациях относительно остаточных концентраций мочевины,а также остаточных концентраций аммиака, генерированных при гидролиземочевины, дает повышенное образование продукта, продуктивность и, такимобразом, уменьшенное время продукции.

Продукция рекомбинантных белков с использованием Е. coli давно известна, иэкспрессирующая система хорошо изучена и понята. Экспрессирующую систему наоснове Е. coli широко используют для получения таких молекул, как Г-КСФ(гранулоцитарный колониестимулирующий фактор), ГРЧ (человеческий гормонроста), стрептокиназа и многих других биологических продуктов. Для получениярекомбинантных белков трансформированную Е. coli выращивают до требуемойбиомассы высокой густоты клеток на декстрозе в качестве источника углерода. Фазуобразования продукта инициируют путем индукции с использованием требуемогоиндуктора и затем культуру только поддерживают с помощью минимальногодобавления питательных веществ до конца ферментации.

Многие годы культуры грибов используют для получения ценных биомолекул,например, ферментов, и других полезных молекул. Грибные культуры, например,Rhizopus, Aspergillus, Penicillium и т.п., используют в классической ферментации,предназначенной для получения широкого круга ферментов, например, липаз, амилаз,декстраназ и т.п., которые используют в пищевой, текстильной, кожевенной и другихподобных отраслях промышленности. Актиномицеты, известные как основныекомпоненты для получения антибиотиков, широко используют для получения рядавторичных метаболитов, полезных для человека. Одним из ключевых свойств грибов иактиномицетов является свойство "биоконверсии", например, гидроксилирования,эстерификации и т.п. Основное преимущество состоит в том, что биоконверсияспецифична в отношении мишени, и можно получить продукты относительно высокойчистоты. Классическим примером является конверсия компактина в правастатин.

Методологические усовершенствования, известные в области техники, включаютмеры, относящиеся к технологии ферментации, такие как перемешивание илиснабжение кислородом, либо модификацию, относящуюся к составу питательных сред,

Ñòð.: 5

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

RU 2 491 345 C2

такую как модификация концентраций Сахаров во время ферментации, измененияобработки походу процесса или изменения, относящиеся к природным свойствамсамого микроорганизма и т.п.

Неожиданно обнаружено, что использование ферментационной среды,характеризующейся контролируемым добавлением некоторых богатых и легкорастворимых источников азота, таких как мочевина, дает повышеннуюпродуктивность и/или повышенный уровень биоконверсии и, таким образом,уменьшенное время продукции.

Раскрытие изобретенияГлавной целью настоящего изобретения является получение ферментационной

среды для продукции рекомбинантных белков, их производных или аналогов путемферментации с использованием индуцируемых метанолом видов грибов.

Другой главной целью настоящего изобретения является получениеферментационной среды для продукции рекомбинантных белков, их производных илианалогов путем ферментации с использованием с использованием микроорганизмов.

Кроме того, другой главной целью настоящего изобретения является получениеферментационной среды для продукции вторичных метаболитов путем ферментации сиспользованием микроорганизмов.

Еще одной главной целью настоящего изобретения является разработка способаполучения рекомбинантных или нерекомбинантных продуктов, их производных илианалогов.

Еще одной главной целью настоящего изобретения является разработка способаполучения вторичных метаболитов.

Еще одной главной целью настоящего изобретения является разработка способабиоконверсии компактина в правастатин.

Еще одной главной целью настоящего изобретения является получениярекомбинантного белкового продукта.

Соответственно, настоящее изобретение относится кферментационной среде,предназначенной для получения рекомбинантных белков, их производных и аналоговпутем ферментации с использованием индуцируемых метанолом видов грибов, причемуказанная среда отличается тем, что содержит эффективную концентрацию амидаугольной кислоты; ферментационной среде, предназначенной для получениярекомбинантных белков, их производных и их аналогов путем ферментации сиспользованием микроорганизмов, причем указанная среда отличается тем, чтосодержит эффективную концентрацию амида угольной кислоты; ферментационнойсреде, предназначенной для получения вторичных метаболитов путем ферментации сиспользованием микроорганизмов, причем указанная среда отличается тем, чтосодержит эффективную концентрацию амида угольной кислоты; способу получениярекомбинантных белков, их производных или их аналогов, который предусматриваетразмножение индуцируемых метанолом видов грибов, экспрессирующих инсулин, вферментационной среде, причем указанная среда отличается тем, что содержитэффективную концентрацию амида угольной кислоты; способу получениярекомбинантных или нерекомбинантных белковых продуктов, их производных или иханалогов, который предусматриваетразмножение индуцируемого илинеиндуцируемого микроорганизма, экспрессирующего белок в ферментационнойсреде, причем указанная среда отличается тем, что содержит эффективнуюконцентрацию амида угольной кислоты; способу получения вторичных метаболитов,который предусматривает размножение микроорганизма в ферментационной среде,

Ñòð.: 6

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

RU 2 491 345 C2

причем указанная среда отличается тем, что содержит эффективную концентрациюамида угольной кислоты; способу биоконверсии компактина в правастатин, причемуказанную конверсию осуществляют в среде, отличающейся тем, что указанная средасодержит эффективную концентрацию амида угольной кислоты; и рекомбинантныйбелковый продукт, полученный как заявлено в любом из предшествующих пунктовформулы изобретения.

Настоящее изобретение относится к ферментационной среде для получениярекомбинантных белков, их производных или их аналогов посредством ферментации сиспользованием индуцируемых метанолом видов грибов, причем указанная средаотличается тем, что содержит эффективную концентрацию амида угольной кислоты.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения амид угольной кислотывыбран из группы, содержащей мочевину или ее производные, такие какдиметилмочевина, диэтилмочевина, N-ацетилфенилмочевина,изопропилпилидинмочевина, фенилмочевина, или их комбинацию.

В еще одном варианте осуществления настоящего изобретения амид угольнойкислоты представляет собой мочевину.

В еще одном варианте осуществления настоящего изобретения амид угольнойкислоты добавляют в форме жидкости, спрея, порошка или гранул.

В еще одном варианте осуществления настоящего изобретения остаточнаяконцентрация амида угольной кислоты составляет до 1 М.

В еще одном варианте осуществления настоящего изобретения концентрацииосновных солей и микроэлементов варьируют от 0,1X до 5X от контрольной среды,сохраняя остаточную концентрацию амида угольной кислоты до 1 М.

В еще одном варианте осуществления настоящего изобретения повышенопотребление фосфата.

В еще одном варианте осуществления настоящего изобретения индуцируемыеметанолом виды грибов, экспрессирующие рекомбинантный продукт инсулина,выбраны из группы, включающей Pichia pastoris, Pichia sp., Saccharomyces sp.,Saccharomyces cerevisiae, Kluyveromyces sp. и Hansenula polymorpha.

Настоящее изобретение относится к ферментационной среде для получениярекомбинантных белков, их производных и их аналогов путем ферментации сиспользованием микроорганизмов, причем указанная среда отличается тем, чтосодержит эффективную концентрацию амида угольной кислоты.

Настоящее изобретение относится к ферментационной среде для получениявторичных метаболитов путем ферментации с использованием микроорганизмов,причем указанная среда отличается тем, что содержит эффективную концентрациюамида угольной кислоты.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения амид угольной кислотывыбран из группы, включающей мочевину или ее производные, такие какдиметилмочевина, диэтилмочевина, N-ацетилфенилмочевина,изопропилпилидинмочевина, фенилмочевина, или их комбинацию.

В еще одном варианте осуществления настоящего изобретения амид угольнойкислоты представляет собой мочевину.

В еще одном варианте осуществления настоящего изобретения амид угольнойкислоты добавляют в форме жидкости, спрея, порошка или гранул.

В еще одном варианте осуществления настоящего изобретения остаточнаяконцентрация амида угольной кислоты составляет до 10 г/л.

В еще одном варианте осуществления настоящего изобретения микроорганизм

Ñòð.: 7

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

RU 2 491 345 C2

выбран из группы, содержащей E.coli, Streptomyces sp, Aspergillus sp, Rhizopus sp,Penillium sp и Rhizomucor sp.

Настоящее изобретение относится к способу получения рекомбинантных белков, ихпроизводных или их аналогов, который предусматривает размножение индуцируемыхметанолом экспрессирующих инсулин видов грибов в ферментационной среде, причемуказанная среда отличается тем, что содержит эффективную концентрацию амидаугольной кислоты.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения амид угольной кислотывыбран из группы, включающей мочевину или ее производные, такие какдиметилмочевина, диэтилмочевина, N-ацетилфенилмочевина,изопропилпилидинмочевина, фенилмочевина, или их комбинацию.

В еще одном варианте осуществления настоящего изобретения амид угольнойкислоты представляет собой мочевину.

В еще одном варианте осуществления данного изобретения полученныйрекомбинантный продукт инсулина представляет собой IN-105.

В еще одном варианте осуществления настоящего изобретения полученныйрекомбинантный продукт инсулина представляет собой предшественник инсулина,инсулин или его аналоги либо его производные.

В еще одном варианте осуществления настоящего изобретения рекомбинантныйпродукт инсулина представляет собой инсулин гларгин.

В еще одном варианте осуществления настоящего изобретения полученныйрекомбинантный белок представляет собой циклический или нециклический пептид.

В еще одном варианте осуществления настоящего изобретения рекомбинантныйпептид представляет собой эксендин.

В еще одном варианте осуществления настоящего изобретения полученныйрекомбинантный белок представляет собой фермент.

В еще одном варианте осуществления настоящего изобретения полученныйпродукт рекомбинантного фермента представляет собой липазу.

В еще одном варианте осуществления настоящего изобретения полученныйрекомбинантный белок выбран из группы, содержащей предшественник инсулина,инсулин или его аналоги либо его производные, гларгин, эксендин, карбоксипептидазуи липазу.

В еще одном варианте осуществления настоящего изобретения индуцируемыеметанолом виды грибов, экспрессирующие рекомбинантный продукт инсулина,выбраны из группы, включающей Pichia pastoris, Pichia sp., Saccharomyces sp.,Saccharomyces cerevisiae, Kluyveromyces sp. и Hansenula polymorpha.

В еще одном варианте осуществления настоящего изобретения индуцируемыйметанолом вид грибов представляет собой Pichia pastoris.

В еще одном варианте осуществления настоящего изобретения уровень подпиткиметанолом составляет до 20 г/л бульона в час.

В еще одном варианте осуществления настоящего изобретения полученныймаксимальный титр продукта превышает 0,1 г/л.

Настоящее изобретение относится к способу получения рекомбинантных илинерекомбинантных белковых продуктов, их производных или их аналогов, которыйпредусматриваетразмножение индуцируемого или неиндуцируемогоэкспрессирующего белок микроорганизма в ферментационной среде, причемуказанная среда отличается тем, что содержит эффективную концентрацию амидаугольной кислоты.

Ñòð.: 8

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

RU 2 491 345 C2

В другом варианте осуществления настоящего изобретения амид угольной кислотывыбран из группы, включающей мочевину или ее производные, такие какдиметилмочевина, диэтилмочевина, N-ацетилфенилмочевина,изопропилпилидинмочевина, фенилмочевина, или их комбинацию.

В еще одном варианте осуществления настоящего изобретения амид угольнойкислоты представляет собой мочевину.

В еще одном варианте осуществления настоящего изобретения полученныйрекомбинантный белковый продукт представляет собой Г-КСФ.

В еще одном варианте осуществления настоящего изобретения полученныйрекомбинантный продукт представляет собой стрептокиназу.

В еще одном варианте осуществления настоящего изобретения белковый продуктпредставляет собой липазу.

Настоящее изобретение относится к способу получения вторичных метаболитов,который предусматривает размножение микроорганизма в ферментационной среде,причем указанная среда отличается тем, что содержит эффективную концентрациюамида угольной кислоты.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения полученный вторичныйметаболит представляет собой правастатин.

Настоящее изобретение относится к способу биоконверсии компактина вправастатин, причем конверсию осуществляют в среде, отличающейся тем, чтоуказанная среда содержит эффективную концентрацию амида угольной кислоты.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения амид угольной кислотывыбран из группы, включающей мочевину или ее производные, такие какдиметилмочевина, диэтилмочевина, N-ацетилфенилмочевина,изопропилпилидинмочевина, фенилмочевина, или их комбинацию.

В еще одном варианте осуществления настоящего изобретения биоконверсиякомпактина в правастатин составляет по меньшей мере 35%.

Настоящее изобретение относится к рекомбинантному белковому продукту,полученному, как описано выше.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения полученныйрекомбинантный белковый продукт выбран из группы, включающей предшественникинсулина, инсулин или его аналоги либо его производные, гларгин, эксендин,карбоксипептидазу и липазу.

Изобретение предусматривает композицию питательных веществ,предназначенную для применения при разработке ферментационной среды, причемкомпозиция содержит азотные компоненты, такие как амиды угольной кислоты,например, мочевину и вышеупомянутые родственные формы или производные, вместес одним или более других компонентов ферментационной среды, которые специальнооптимизированы для получения повышенного выхода инсулина или родственныханалогов производных продуктов за сокращенные периоды времени образования.

Неожиданно обнаружено, что использование определенной ферментационнойсреды с добавлением ряда азотсодержащих источников, таких как амиды угольнойкислоты, например, мочевину и родственные формы или производные вспецифических концентрациях не действует на рост дрожжевых клеток и неспособствует повышению продуктивности.

Дополнительный азотный компонент, например, мочевину, можно добавить вформе жидкости, спрея, порошка или гранул.

Основная проблема изобретения состоит в том факте, что на продуктивность

Ñòð.: 9

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

RU 2 491 345 C2

способа ферментации инсулина или аналога инсулина с помощью Pichia sp. сильновлияет содержание мочевины в среде для культивирования. Вследствие этого выходпродукта значительно повышается, особенно при сокращенных периодах времениферментации, при добавлении азотного компонента, такого как мочевина, в среду длякультивирования.

Согласно наиболее предпочтительному варианту осуществления изобретениядобавление мочевины в ферментационную среду повышает уровень потребленияключевого ингредиента "фосфата", который, в свою очередь, повышаетпродуктивность. Обнаружено, что чем быстрее происходит потребление фосфата, темкороче время цикла ферментации и, следовательно, выше продуктивность. Такимобразом впервые показан метаболизм мочевины наряду с фосфатом, которыйповышает уровень экспрессии белка или пептида, не воздействуя на профиль роста исокращает время ферментации.

Согласно другому аспекту изобретения добавление мочевины обеспечиваетповышенный уровень выделения продукта в конце ферментации при любом pH.

Таким образом настоящее изобретение дает повышенные выходы белковогопродукта, сокращенное время цикла продукции, улучшенное использованиемпитательных веществ, вводимых в процесс, и в целом снижает капитальные затраты исебестоимость производства.

Подходящий микробный штамм для промышленного способа ферментации сиспользованием химически определенной среды может представлять собой штаммдикого типа, продуцирующий ценное соединение, представляющее интерес, приусловии, что указанный штамм дикого типа имеет хорошие характеристики роста.

Предпочтительные дрожжи для применения в качестве организма-продуцентавключают, например, Pichia pastoris, Pichia sp., Saccharomyces sp., Saccharomycescerevisiae, Kluyveromycessp.или Hansenula polymorpha.

Кроме того, подходящий микробный штамм для промышленного способаферментации с использованием химически определенной среды может представлятьсобой штамм, который получают и/или усовершенствуют тем, что родительскийштамм, представляющий интерес, подвергают классической мутагенной обработкеили трансформации рекомбинантный ДНК, также при условии, что полученный врезультате мутант или трансформированный микробный штамм имеет хорошиехарактеристики роста на химически определенной среде. Таким образом отхарактеристик роста родительского штамма на химически определенной среде будетзависеть, будут ли полученные в результате мутант или трансформированныештаммы иметь улучшенные или подобные характеристики роста на химическиопределенной среде по сравнению с характеристиками родительского штамма.

Как должен понимать компетентный специалист в области техники, оптимальнаяконцентрация добавок амида угольной кислоты будет варьировать от клона к клону,хотя во всех случаях конечным результатом является получение более высокого титраза меньшее время.

Термин "ферментационные среды" или "ферментационная среда" относится кокружающей среде, в которой проводят ферментацию, который включаетферментационные субстраты и другое сырье, используемое ферментирующимимикроорганизмами для образования специфического лекарственного продукта.

"Азотные компоненты" представляют собой субстраты, сырье или компоненты,которые являются источников ассимилируемого азота в ферментационной среде.

Согласно важному аспекту изобретения предпочтительным азотным компонентом

Ñòð.: 10

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

RU 2 491 345 C2

в ферментационной среде являются амиды угольной кислоты, такие как мочевина.Они могут включать соединения, содержащие N-CO-N или родственные группы.Настоящее изобретение предусматривает использование производных мочевины,таких как диметилмочевина, диэтилмочевина, N-ацетил-N-фенил мочевина,изопропилидинмочевина, N-фенилмочевина и т.п., или их комбинаций.

Используемый термин "эффективное количество" представляет собой такоеколичество мочевины или ее производных, введение которого, согласно изобретению,в ферментационную среду приводит к образованию существенного количества/выходабелка, кроме того, за сокращенные периоды времени без воздействия на ростдрожжевых клеток.

Термин "ферментирующий организм" относится к любому микроорганизму,подходящему для использования в требуемом ферментационном процессе. Примерыферментирующих организмов включают грибные организмы, такие как дрожжи.Примерами ферментирующих организмов в контексте настоящего изобретенияявляются Pichia pastoris, Pichia sp., Saccharomyces sp., Saccharomyces cerevisiae,Kluyveromyces sp. или Hansenula polymorpha.

Изобретение может подойти для экспрессии любого рекомбинантного пептида сиспользованием индуцируемых метанолом видов грибов, но не ограниченорекомбинантно экспрессирующимися пептидами, белками, инсулином,предшественниками инсулина, инсулиновыми производными или аналогами инсулина.

Термин "рекомбинантный", как используют в данном контексте для описания белкаили полипептида, означает полипептид, продуцируемый путем экспрессиирекомбинантного пол инуклеотида. Термин "рекомбинантный", как используют вданном контексте в отношении клеток, означает клетки, которые могут быть илибыли использованы в качестве реципиентов для рекомбинантных векторов или другойперенесенной ДНК, и включает потомство исходной клетки, которая былатрансфицирована. Следует иметь в виду, что потомство одной родительской клеткиможет быть не полностью идентичными по морфологии или по комплементугеномной либо общей ДНК исходному родительскому организму вследствиеслучайной или направленной мутации.

Термин 'полипептид', 'белок', 'пептид' относится к полимеру аминокислот и неотносится к специфической длине продукта; таким образом, пептиды, олигопептиды ибелки включены в определение полипептида. Данный термин также не относится кпостэкспрессионным модификациям полипептида или исключает их, хотя химическиеили постэкспрессионные модификации данных полипептидов могут быть включеныили исключены в качестве специфических вариантов осуществления. В одном вариантеосуществления молекула представляет собой полипептид или его родственныеаналоги либо их производные. Предпочтительно, когда полипептид представляетсобой циклический пептид. Согласно другому предпочтительному вариантуосуществления, полипептид представляет собой нециклический пептид. В еще одномпредпочтительном варианте осуществления полипептид выбран из группы,содержащей эксендин, эптифибатид, атосибан, ферменты, такие как липаза,карбоксипептидаза и т.п.

Инсулин представляет собой полипептид из 51 аминокислоты, которыераспределены между двумя цепями аминокислот: A-цепь из 21 аминокислоты и B-цепьиз 30 аминокислот. Цепи соединены друг с другом 2 дисульфидными мостиками. Этоопределение включает использование не только природных инсулинов, но такжеинсулиновое производных и аналогов. Соединение инсулина может, например,

Ñòð.: 11

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

RU 2 491 345 C2

представлять собой соединение инсулина млекопитающего, такое как человеческийинсулин, или производные либо аналоги соединения инсулина.

Инсулиновые производные представляют собой производные природныхинсулинов, а именно человеческого инсулина или инсулинов животных, которыеотличаются от соответствующего в других отношениях идентичного природногоинсулина заменой по меньшей мере одного природного остатка аминокислоты и/иливведением по меньшей мере одного остатка аминокислоты и/или органическогоостатка. Следует иметь в виду, что термин инсулин определяет полипептид, состоящийиз B- и A-цепи. Инсулиновое производное может быть по меньшей мере на 60%гомологичным природному инсулину. Инсулиновое производное может быть даже вбольшей степени гомологичным, например, по меньшей мере приблизительно на 75%,или по меньшей мере приблизительно на 90% гомологичным природному инсулину.Какправило, инсулиновые производные имеют несколько модифицированное действиепо сравнению с человеческим инсулином.

При получении инсулина и инсулиновых производных посредством генетическойинженерии предшественник инсулина, часто экспрессируют "проинсулин",содержащий B-, C- и A-цепи. Данный проинсулин можно превратить в инсулин илиинсулиновое производное путем ферментного или химического удаления C-цепи послесоответствующей и правильной укладки и образования дисульфидных мостиков.Проинсулиновое производное может быть по меньшей мере на 60% гомологичнымпо B- и A-цепи природному проинсулину. Однако связывающий C-пептид может бытьвыбран как полностью отличающийся от любого известного С-пептида.Проинсулиновое производное может быть даже в большей степени гомологичным,например, по меньшей мере приблизительно на 75%, или по меньшей мереприблизительно на 90% гомологичным природному проинсулину.

Согласно ряду вариантов осуществления изобретения рекомбинантный продуктинсулина представляет собой IN-105. Полученный в результате лекарственныйпродукт специфически относится к молекуле IN-105. IN-105 представляет собоймолекулу инсулина, конъюгированную по е-аминокислоте лизину в положении B29 B-цепи инсулина с амфифильным олигомером структурной формулы CH3O-(C4H2O)3-CH2-CH2-COOH. Молекула может быть моноконъюгированной по A1, B1 и B29,диконъюгированной по различным комбинациям A1, B1 и B29 илитриконъюгированной при различным комбинациям A1, B1 и B29.

Согласно другому аспекту изобретения рекомбинантный белок, полученный путемферментации с использованием ферментационной среды, соответствующейнастоящему изобретению, представляет собой циклический или нециклический пептид.

Согласно другому аспекту изобретения рекомбинантный белок, полученный путемферментации с использованием ферментационной среды, соответствующейнастоящему изобретению, представляет собой фермент.

В одном аспекте изобретения протокол ферментации может включать три фазы:загрузки, подпитки (необязательно) и фазу индукции метанолом.

Согласно наиболее существенному аспекту изобретения ферментационная среда,используемая в контексте данного изобретения, включает следующие компоненты.Кроме того, включен способ приготовления среды.

Состав среды:

Компоненты Количество (г/л)

CaSO4·2H2O 0,93

MgSO4·7H2O 29,8

Ñòð.: 12

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

RU 2 491 345 C2

K2SO4 36,4

KOH 4,13

Глицерин 40

H3PO4 (Плотность-1,7) 22,95

Мочевина 6,0

Отдельные компоненты растворяют в минимальном объеме воды в вышеуказаннойпоследовательности и стерилизуют при 121°C в течение 1 часа. Раствормикроэлементов и D-биотина (предварительно стерилизованного фильтрацией)асептически добавляют в среду, каждый со скоростью 4,35 мл/л среды (плотностьраствора микроэлементов составляет 1,05, а D-биотина - 1,0.

Состав раствора микроэлементов:

Компоненты (соли) Количество (г/л)

Сульфат меди, CuSO4·5H2O 6,0

Йодид натрия, NaI 0,08

Сульфат марганца, MnSO4·H2O 3,0

Молибдат натрия, Na2MoO4·2H2O 0,20

Борная кислота, H3BO3 0,02

Хлорид кобальта, CoCl2·6H2O 0,50

Хлорид цинка, ZnCl2 20,0

Сульфат двухвалентного железа, FeSO4·7H2O 65,0

Серная кислота, H2SO4 5,0 мл

Все соли растворяют одну за другой в питьевой воде и стерилизуют фильтрациейчерез устройство для стерилизации фильтрацией.

Приготовление раствора биотина:D-биотин 0,2 г/лБиотин растворяют в питьевой воде и стерилизуют фильтрацией через устройство

для стерилизации фильтрацией.Подпитка дрожжевым экстрактом и соевым пептоном:Кроме того, подпитку дрожжевым экстрактом и соевым пептоном также вводят во

время ферментации. Ее следует готовить следующим образом:

Компоненты Концентрация (г/л)

Соевый пептон 100

Дрожжевой экстракт 50

Компоненты растворяют и с помощью питьевой воды получают необходимыйобъем. Затем раствор стерилизуют при 121-123°C в течение 90 мин. Плотностьподпитки соевым пептоном составляет приблизительно 1,05.

Подпитка метанолом:12,0 мл раствора микроэлементов, 12 мл растворов D-биотина и 40 г мочевины

добавляют на литр метанола перед введением подпитки.Способ ферментации:Способ ферментации включает фазу роста клеток в загрузке, необязательную фазу

подпитки глицерином загрузки и фазу индукции метанолом.Фаза роста клеток в загрузкеМониторирование и контроль загрузкиПараметры продукции ферментера задают исходно и контролируют следующим

образом:

Ñòð.: 13

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

RU 2 491 345 C2

Температура: 30°±2°C

pH: 5±0,2

DO: >10%

Время проведения: 22-24 час.

Фаза индукции метанола (ФИМ)Подпитку метанолом начинают сразу после окончания фазы загрузки. Метанол

стерилизуют (в режиме загрузки) путем фильтрации с использованием коммерческидоступного стерилизующего фильтра.

В начале ФИМ, pH подводят до значения 4,0±0,1 или 6,0±0,1 или 6,3±0,1 взависимости от экспрессии белка в среду (варьирует от продукта к продукту, а такжеот клона к клону) и температуру доводят до приблизительно 18-24°C (варьирует отпродукта к продукту, а также от клона к клону).

Одновременно другую подпитку, подпитку дрожжевым экстрактом и соевымпептоном также начинают в ферментере со скоростью 0,4 г/л/час. исходного объема.

Мониторирование и контроль ФИМ

Температура: 18-30°C (варьируется от продукта к продукту, а также от клона к клону)

pH: 3,0-7,0

DO: >1% (используют для контроля концентрации метанола в бульоне)

Время проведения: 5-8 дней (варьируется от клона к клону)

Анализ pH: 1-9,5 (в зависимости от типа белка)

Согласно другому аспекту изобретения посевной материал готовят путемкультивирования лиофилизированной глицериновой исходной культуры наминимальной глицериновой среде (МГС). Основные ферментационные среды,полученные из "Control Pichia process guidelines" (Руководство по контролю процессов сиспользованием Pichia), содержат ортофосфорную кислоту, дегидратированныйсульфат кальция, сульфат калия, сульфат магния гептагидрат, гидроксид калия,глицерин, микроэлементы и D-биотин. Питательная среда для культивированиядолжна содержать также известные соединения в маленьких или следовыхколичествах, которые обычно вводят в ферментационную среду для культивирования,такие как водорастворимые соединения Ca, Mg, Mn, Fe, K, Co, Cu, Zn, B, Mo, Br и I.Могут также присутствовать другие микроэлементы. Раствор микроэлементов,соответствующий настоящему изобретению, в частности, включает сульфат медипентагидрат, йодид натрия, сульфат марганца моногидрат, молибдат натрия дигидрат,борную кислоту, хлорид кобальта гексагидрат, хлорид цинка, сульфат двухвалентногожелеза гептагидрат. Хотя концентрация каждого ингредиента среды специальнооптимизирована для каждого продукта, ниже приводят контрольные среды:

Контрольные средыФерментационная основная солевая среда:На 1 литр смешивают следующие ингредиенты:

Фосфорная кислота: 85% (26,7 мл)

Сульфат кальция: 0,93 г

Сульфат калия: 18,2 г

Сульфат магния-7H2O: 14,9 г

Гидроксид калия: 4,13 г

Глицерин: 40,0 г

Вода до 1 литра.Добавляют в ферментер с водой до соответствующего объема и стерилизуют.

Ñòð.: 14

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

RU 2 491 345 C2

Микроэлементы PTM1Смешивают следующие ингредиенты:

Сульфат меди 5H2O 6,0 г

Йодид натрия 0,08 г

Сульфат марганца-H2O 3,0 г

Молибдат натрия-2H2O 0,2 г

Борная кислота 0,02 г

Хлорид кобальта 0,5 г

Хлорид цинка 20,0 г

Сульфат двухвалентного железа-7H2O 65,0 г

Биотин 0,2 г

Серная кислота 5,0 мл

Вода до конечного объема 1 л.

Фильтруют, стерилизуют и хранят при комнатой температуре.При смешивании данных ингредиентов может появиться мутный осадок. Среды

можно профильтровать, стерилизовать и использовать.В дополнение к вышеописанной контрольной среде включают мочевину в

различных концентрациях.Согласно еще одному аспекту изобретения образование биомассы во время фазы

роста в загрузке происходит до тех пор, пока в исходной среде присутствует глицерин.Кроме того, образование биомассы не является важным фактором и егоосуществляют только в немногих случаях.

Согласно следующему аспекту изобретения после достижения требуемой биомассыкультуру индуцируют постоянной подпиткой метанолом и мочевиной. Во времяподпитки метанолом проводят также подпитку дрожжевым экстрактом и растворомпептона.

Согласно еще одному аспекту скорость подпитки метанолом составляет до 20г/л/час. Как понимает любой компетентный специалист, оптимизация скоростиподпитки для дальнейшего повышения уровней продукции предусмотрена настоящимизобретением.

Наряду с этим изобретение будет теперь описано в связи с некоторымипредпочтительными вариантами осуществления в следующих примерах, чтобы можнобыло полнее понять и оценить его аспекты. Ограничить изобретение даннымиконкретными вариантами осуществления не предусматривают. Напротив,предполагают покрыть все альтернативные варианты, модификации и эквивалентныерешения, поскольку они могут быть включены в объем изобретения, как определено вприлагаемой формуле изобретения. Таким образом, следующие примеры, которыевключают предпочтительные варианты осуществления, будут служить дляиллюстрации практической реализации данного изобретения, причем следует иметь ввиду, что показанные подробности приведены только в качестве примера и с цельюиллюстративного обсуждения предпочтительных вариантов осуществлениянастоящего изобретения и присутствуют для представления материала, которыйсчитают наиболее полезным и легко понимаемым описанием способов ферментации, атакже принципов и концептуальных аспектов изобретения.

Изобретение предусматривает питательную композицию, предназначенную дляиспользования при приготовлении ферментационной среды, причем композициясодержит азотные компоненты, такие как карбамиды, например, мочевину иродственные формы или производные, например, карбаматы, карбодиимиды,

Ñòð.: 15

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

RU 2 491 345 C2

тиокарбамиды, вместе с одним или более других компонентов ферментационных сред,которые специально оптимизированы с целью получения повышенных выходовпродукта за сокращенные периоды времени продукции.

Таким образом изобретение делает возможным получение повышенных выходоврекомбинантных белковых продуктов, таких как инсулин, гларгин IN 105, эксендин,липаза и карбоксипептидаза во время процесса ферментации (периодического,периодического с подпиткой, непрерывного) с использованием индуцируемойметанолом ГМО Pichia pastoris, обеспечиваемого добавлением мочевины безвоздействия на рост дрожжевых клеток.

Согласно одному аспекту изобретения азотный компонент, который специфическивоздействует на выходы и время продукции, представляет собой амиды угольнойкислоты, такие как мочевина и ее производные и вышеупомянутые родственныесоединения.

Согласно другому аспекту изобретения предпочтительные дрожжи дляиспользования в качестве организма-продуцента включают, например, Pichiapastoris, Pichia sp., Saccharomyces sp., Saccharomyces cerevisiae, Kluyveromyces sp.или Hansenula polymorpha.

Настоящее изобретение демонстрирует использование амидов угольной кислоты,таких как мочевина или ее производные карбаматы, кабодиимиды и тиокарбамиды, вкачестве азотных добавок в ферментационные среды для получения белков с цельюдостижения повышенного уровней биоконверсии при использовании Е. coli,Actinomycetes и грибных культур. Существенные аспекты изобретения, в частности,относятся к экспериментальному процессу ферментации с использованиемоптимизированных параметров питательных сред, отвечающих за повышеннуюпродуктивность. Принцип настоящего изобретения можно применить для продукцииширокого круга белков и вторичных метаболитов посредством ферментацииподходящего экспрессирующего организма.

Изобретение предусматривает питательную композицию, предназначенную дляиспользования при приготовлении ферментационной среды, причем композициясодержит азотные компоненты, такие как карбамиды, например, мочевину иродственные формы или производные, например, карбаматы, кабодиимиды итиокарбамиды, вместе с одним или более других компонентов ферментационнойсреды, которые специально оптимизированы с целью получения повышенныхвыходов продукта за сокращенные периоды времени продукции.

Таким образом изобретение делает возможным получение повышенных выходовбелковых продуктов, таких как Г-КСФ, стрептокиназа, ГРЧ и др. во время процессаферментации (периодической, периодической с подпиткой, непрерывной) сиспользованием индуцируемой метанолом ГМО Pichia pastoris при использованиииндуцируемой E. coli, осуществляемое посредством добавления мочевины безвоздействия на рост дрожжевых клеток.

Изобретение также делает возможным повысить уровень биоконверсии дляполучения повышенных выходов продуктов, например, способ ферментацииправастатина (периодической, периодической с подпиткой, непрерывной) сиспользованием актиномицетов и/или грибных культур

Данное изобретение, кроме того, повышает уровень продукции ферментов,например, липазы, амилаз, целлюлаз в периодических или периодических с подпиткойпроцессах при использовании грибных культур.

Согласно одному аспекту изобретения азотным компонентом, который

Ñòð.: 16

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

RU 2 491 345 C2

специфически воздействует на выходы и время продукции, являются амиды угольнойкислоты, например, мочевина или ее производные и вышеупомянутые родственныесоединения.

Согласно другому аспекту изобретения предпочтительными микроорганизмамиявляются штаммы семейства Enterobacteriaceae, предпочтительно, когда дляиспользования в качестве организма-продуцента включают, но без ограниченияперечисленным Е. coli.

Согласно другому аспекту изобретения предпочтительными микроорганизмамиявляются штаммы актиномицетов и/или семейства грибов, включая, но безограничения Streptomyces sp, Actinoplanes sp, Aspergillus sp, Rhizopus sp и Penicillium sp.

Другие объекты, свойства, преимущества и аспекты настоящего изобретения будуточевидны для компетентных специалистов из следующего описания. Однако, следуетиметь в виду, что следующее описание и специфические примеры, несмотря на то, чтоони показывают предпочтительные варианты осуществления изобретения, приведенытолько в качестве иллюстрации. Различные изменения и модификации, входящие всущность и объем раскрытого изобретения, легко станут очевидными длякомпетентных специалистов в области техники из прочтения следующего описания ииз прочтения других разделов настоящего описания.

Изобретение предусматривает питательную композицию, предназначенную дляиспользования при приготовлении ферментационной среды, причем композициясодержит азотные компоненты, такие как амиды угольной кислоты, например,мочевину и родственные формы или вышеописанные производные, вместе с однимили более других компонентов ферментационных сред, которые специальнооптимизированы с целью получения требуемого белкового продукта или вторичныхметаболитов.

Неожиданно обнаружено, что использование определенной ферментационнойсреды с добавлением ряда азотсодержащих источников, таких как амиды угольнойкислоты, например, мочевину и родственные формы или производные, вспецифических концентрациях не воздействуют на рост ферментирующего организма,но способствует повышению продуктивности.

Дополнительный азотный компонент, например мочевину, можно добавить вформе жидкости, спрея, порошка или гранул.

Подходящий микробный штамм для промышленного способа ферментации можетпредставлять собой любой штамм дикого типа, продуцирующий ценное соединение,представляющее интерес, при условии, что указанный штамм дикого типа имеетхорошие характеристики роста.

Кроме того, подходящий микробный штамм для промышленного способаферментации может представлять собой штамм, который получают и/илиусовершенствуют тем, что родительский штамм, представляющий интерес,подвергают классической мутагенной обработке ил и трансформациирекомбинантный ДНК, также при условии, что полученный в результате мутант илитрансформированный микробный штамм имеет хорошие характеристики роста.Таким образом от характеристик роста родительского штамма будет зависеть, будут ли полученный в результате мутант или трансформированные штаммы иметьулучшенные или подобные характеристики роста по сравнению с характеристикамиродительского штамма.

Способ ферментации с использованием данной ферментационной средыусовершенствован в отношении одного или более параметров, выбранных из группы,

Ñòð.: 17

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

RU 2 491 345 C2

состоящей из концентрации продукта (продукт/объем), выхода продукта(образованный продукт/потребленный источник углерода) и образование продукта(образованный продукт/объем и время), или дополнительных других параметровспособа и их комбинаций.

Как будет иметь в виду компетентный специалист в области техники, оптимальнаяконцентрация подпиток амидами угольной будет варьировать от клона к клону, хотяконечным результатом во всех случаях является получение более высоких титров заменьшее время во кислоты.

Термин "ферментационные среды" или "ферментационная среда" относится кокружающей среде, в которой проводят ферментацию, который включаетферментационные субстраты и другое сырье, используемое ферментирующимимикроорганизмами для образования специфического лекарственного продукта.

Ферментационная среда в настоящем изобретении должна содержать подходящиеуглеродные субстраты. Подходящие субстраты могут включать, но без ограниченияперечисленным, моносахариды, такие как глюкоза и фруктоза, полисахариды, такиекак крахмал или целлюлоза, либо их смеси и другие ингредиенты, кукурузный сироп,мелассу сахарной свеклы, глицерин и ячменный солод. Кроме того, углеродныйсубстрат может также представлять собой одноуглеродные субстраты, такие какдиоксид углерода, или метанол, для которого показана метаболическая конверсия включевые биохимические промежуточные продукты. Следовательнопредусматривают, что источник углерода, используемый в настоящем изобретении,может охватывать широкий круг углеродсодержащих субстратов и будет ограничентолько выбором организма. В дополнение к соответствующему источнику углеродаферментационные среды должны содержать подходящие минералы, соли, буферы идругие компоненты, известные компетентным специалистам в области техники,подходящим для роста культур и стимуляции экспрессии требуемого белка иликонечного продукта.

"Азотные компоненты" представляют собой субстраты, сырье или компоненты,которые являются источником ассимилируемого азота в ферментационной среде.

Подходящие источники азота могут включать, но без ограничения перечисленным,соевую муку, хлопковую муку, пептоны, дрожжевой экстракт, казеин, гидролизатыказеина, кукурузный сироп и неорганические соли иона аммония, нитраты и нитриты.

Согласно существенному аспекту изобретения предпочтительной добавкой вферментационную среду являются амиды угольной кислоты, такие как мочевина. Онибудут включать соединения, содержащие N-CO-N или родственные группы. Настоящееизобретение предусматривает использование производных мочевины, таких какдиметилмочевина, диэтилмочевина, N-ацетил-N-фенилмочевина,изопропилпилидинмочевина, N-фенилмочевина и т.п., или их комбинации.

Используемый термин "эффективное количество" представляет собой такоеколичество мочевины или ее производных, введение которого, согласно изобретению,в ферментационную среду приводит к образованию существенного количества/выходаобразуемого продукта, кроме того, за сокращенные периоды времени без воздействияна рост дрожжевых клеток.

Термин "ферментирующий организм" относится к любому микроорганизму,подходящему для использования в требуемом ферментационном процессе. Согласнодругому аспекту изобретения предпочтительными микроорганизмами являютсяштаммы бактерий, актиномицеты и/или виды грибов, предпочтительно дляиспользования в качестве организма-продуцента включают, но без ограничения

Ñòð.: 18

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

RU 2 491 345 C2

перечисленным, E. coli, Streptomyces sp, Actinoplanes sp, Aspergillus sp, Rhizopus sp,Penicillium sp и т.п.

Термин "рекомбинантный", как используют в данном контексте для описания белкаили полипептида, означает полипептид, продуцируемый путем экспрессиирекомбинантного пол инуклеотида. Термин "рекомбинантный", как используют вданном контексте в отношении клеток, означает клетки, которые могут быть илибыли использованы в качестве реципиентов для рекомбинантных векторов или другойперенесенной ДНК, и включает потомство исходной клетки, которая былатрансфицирована. Следует иметь в виду, что потомство одной родительской клеткиможет быть не полностью идентичным по морфологии или по комплементу геномнойлибо общей ДНК исходному родительскому организму вследствие случайной илинаправленной мутации.

Термин 'полипептид', 'белок', 'пептид' относится к полимеру аминокислот и неотносится к специфической длине продукта; таким образом, пептиды, олигопептиды ибелки включены в определение полипептида. Данный термин также не относится илиисключает постэкспрессионные модификации полипептида, хотя химические илипостэкспрессионные модификации данных полипептидов могут быть включены илиисключены в качестве специфических вариантов осуществления. В одном вариантеосуществления молекула представляет собой полипептид или его родственныеаналоги либо их производные. Предпочтительно, когда полипептид представляетсобой циклический пептид. Согласно другому предпочтительному вариантуосуществления, полипептид представляетсобой нециклический пептид. В еще одномпредпочтительном варианте осуществления рекомбинантный белок получают путемферментации с использованием ферментационной среды, соответствующейнастоящему изобретению.

Один из вариантов осуществления настоящего изобретения относится к получениюгранулоцитарного колониестимулирующего фактора. Гранулоцитарныйколониестимулирующий фактор представляет собой фармацевтически активныйбелок, который регулирует пролиферацию, дифференцировку и функциональнуюактивацию нейтрофильных гранулоцитов (см. статьи Metcalf, Blood 67: 257 (1986); Yan,etal. Blood 84(3): 795-799 (1994); Bensinger, et al. Blood 81(11): 3158-3163 (1993); Roberts, etal., Expt'l Hematology 22: 1156-1163 (1994); Neben, et al. Blood 81(7): 1960-1967 (1993)). Г-КСФ означает природный или рекомбинантный белок, предпочтительночеловеческий, как получают из традиционного источника, такого как ткани, синтезбелка, клеточная культура с природными или рекомбинантными клетками. Включаютлюбой белок, обладающий активностью Г-КСФ, например, мутеины или инымобразом модифицированные белки.

"Вторичный метаболит" представляет собой соединение, полученное из первичныхметаболитов, которые продуцирует организм, не является первичным метаболитом ине требуется для роста микроорганизма в стандартныхусловиях. Соединениявторичных метаболитов можно превратить в полезные соединения путемпоследующей химической конверсии или последующей биотрансформации. В такомслучае обеспечение повышенной доступности данных промежуточных соединенийпривело бы, кроме того, к повышенной продукции конечного полезного соединения,которое само по себе можно рассматривать в данном контексте как вторичныйметаболит.

В одном аспекте изобретения протокол ферментации может включать две фазы:периодическую и периодическую с подпиткой (необязательно).

Ñòð.: 19

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

RU 2 491 345 C2

Краткое описание чертежейФиг.1: Сравнение профиля биомассы предшественника IN-105 с добавлением/без

добавления мочевины.Фиг.2: Сравнение профиля концентрации продукта предшественника IN-105 с

добавлением/без добавления мочевины.Фиг.3: Сравнение профиля биомассы предшественника инсулина с добавлением/без

добавления мочевины.Фиг.4: Сравнение профиля концентрации продукта предшественника инсулина с

добавлением/без добавления мочевины.Фиг.5: Сравнение профиля биомассы предшественника гларгина с добавлением/без

добавления мочевины.Фиг.6: Сравнение профиля концентрации продукта предшественника гларгина с

добавлением/без добавления мочевины.Фиг.7: Сравнение профиля биомассы предшественника эксендина с

добавлением/без добавления мочевины.Фиг.8: Сравнение профиля концентрации продукта предшественника эксендина с

добавлением/без добавления мочевины.Фиг.9: Сравнение профиля концентрации продукта фермента липазы с

добавлением/без добавления мочевины.Фиг.10: Профили биомассы, полученные при различных концентрациях мочевины

во время ферментации предшественника IN-105.Фиг.11: Профили концентрации продукта, полученные при различных

концентрациях мочевины во время ферментации предшественника IN-105.Фиг.12: Профили биомассы, полученные при различных концентрациях мочевины

во время ферментации предшественника инсулина.Фиг.13: Профили концентрации продукта, полученные при различных

концентрациях мочевины во время ферментации предшественника инсулина.Фиг.14: Остаточная концентрация мочевины и максимальная концентрация

продукта для получения IN-105.Фиг.15: Профиль остаточной концентрации мочевины и максимальной

концентрации продукта для получения предшественника инсулина.Фиг.16: Сравнение профиля биомассы предшественника IN-105 при уровне

подпитки метанолом около 20 г/л/час.Фиг.17: Сравнение профиля концентрации продукта предшественника IN-105 при

уровне подпитки метанолом около 20 г/л/час.Фиг.18: Изучение соединений, отличных от мочевины, тестирование других

родственных соединений в плане из воздействия на продуктивностьферментации Pichia.

Фиг.19: Эффект мочевины на остаточную концентрацию ионов фосфата в бульоне.Эффект мочевины на метаболизм фосфата штаммом.

Фиг.20. Профиль роста культура для образования правастатина.Фиг.21. Титр правастатина при добавлении мочевины.Фиг.22. Процент превращения компактина в правастатин при добавлении

мочевины.Фиг.23. Сравнение плотности среды культуры клеток (СПК) для образования Г-

КСФ в Е. coli.Фиг.24. Эффект мочевины на специфическую продуктивность Г-КСФ.Фиг.25. Сравнение СПК для образования стрептокиназы в Е. coli.

Ñòð.: 20

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

RU 2 491 345 C2

Фиг.26. Эффект мочевины на специфическую продуктивность стрептокиназы.Фиг.27. Эффект мочевины на продукцию липазы при использовании Rhizomucor sp.Осуществление изобретенияНастоящее изобретение далее определяют в следующих примерах. Следует иметь в

виду, что данные примеры, несмотря на то, что они показывают предпочтительныеварианты осуществления, изобретения, приводят только с целью иллюстрации. Извышеприведенного обсуждения и данных примеров компетентный специалист вобласти техники может установить основные признаки данного изобретения и, невыходя из его сущности и объема, может сделать различные изменения и модификацииизобретения, чтобы адаптировать его к различным вариантам применения и условиям.Данные примеры не следует истолковывать как ограничивающие объем изобретения.Следующие примеры представляют предпочтительные варианты осуществлениянастоящего изобретения. Пример 1:

Две загрузки ферментера проводятс использованием Pichia pastoris для экспрессиипредшественника IN 105. В одной загрузке (эксперимент # 1) половину концентрацииконтрольной среды принимают за исходную среду за исключением глицерина. Послестадии загрузки вводят метанол со скоростью подпитки приблизительно 8 г/л/час.Ферментацию продолжают в течение около 8 суток. Максимальная концентрацияпродукта достигает 3,0 г/л в течение 7 суток и стабилизируется. В другой загрузке(эксперимент # 2) используют среды такого же состава и дополнительно в ферментердобавляют 0,1 М мочевину. После стадии загрузки проводят подпитку метаноломвместе с 4% масс./об. мочевиной. Ферментацию продолжают в течение 8 суток.Максимальная концентрация продукта достигает 3,5 в течение 7 суток. Существеннойразницы в отношении профиля роста клеток не наблюдают. Профили биомассы иконцентрации продукта, полученные в результате вышеописанных экспериментов,представлены на Фиг.1 и 2, соответственно.

Пример 2:Экспрессию предшественника инсулина при использовании мочевины исследуют с

использованием ферментации Pichia pastoris для определения уровня экспрессиипродукта. В данном исследовании используют состав контрольной среды и метанолс 4% мочевиной вводят на более высоком уровне 20 г/л/час. В данном исследованиимаксимальная концентрацию продукта достигает 4,21 г/л за 137 относительно 4,26 г/лза 182 часа, когда мочевину не добавляют в ферментер. Никакой разницы в профилероста клеток не наблюдают, указывая на то, что добавление мочевины в ферментерповышает уровень экспрессии продукта без воздействия на профиль роста исокращают время ферментации. Профили биомассы и концентрации продукта,полученные в результате вышеописанных экспериментов, представлены на Фиг.3 и 4,соответственно.

Пример 3:Две загрузки ферментера проводят с использованием Pichia pastoris для экспрессии

предшественника гларгина. В одной загрузке (эксперимент # 1) половинуконцентрации контрольной среды принимают за исходную среду за исключениемглицерина. После стадии загрузки вводят метанол со скоростью подпитки 8 г/л/час.Ферментацию продолжают в течение 10 суток. Максимальная концентрация продуктадостигает 1,03 г/л в течение 10 суток и стабилизируется. В другой загрузке(эксперимент #2) используют среды такого же состава и дополнительно к исходнойферментационной среде добавляют 0,1 М мочевину. После стадии загрузки проводятподпитку метанолом вместе с 4% мочевиной. Ферментацию продолжают в течение 9

Ñòð.: 21

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

RU 2 491 345 C2

суток. Максимальная концентрация продукта достигает 1,75 в течение 9 суток.Существенной разницы в отношении профиля роста клеток не наблюдают. Профилибиомассы и концентрации продукта, полученные в результате вышеописанныхэкспериментов, представлены на Фиг.5 и 6, соответственно.

Пример 4:Две загрузки ферментера проводят с использованием Pichia pastoris для экспрессии

предшественника эксендина. В одной загрузке (эксперимент #1) половинуконцентрации контрольной среды принимают за исходную среду за исключениемглицерина при подпитке глицерином. После стадии подпитки глицерином вводятметанол со скоростью подпитки 11 г/л/час. Ферментацию продолжают в течение 6суток. Максимальная концентрация продукта достигает 0,74 г/л в течение 6 суток истабилизируется. В другой загрузке (эксперимент #2) используют среды такого жесостава и дополнительно добавляют в ферментер 0,1 М мочевину. После стадиизагрузки проводят подпитку метанолом с 4% мочевиной. Ферментацию продолжают втечение 5 суток. Максимальная концентрация продукта достигает 0,78 в течение 5суток. Существенной разницы в отношении профиля роста клеток не наблюдают.Профили биомассы и концентрации продукта, полученные в результатевышеописанных экспериментов, представлены на Фиг.7 и 8, соответственно.

Пример 5:Две загрузки ферментера проводят с использованием Pichia pastoris для экспрессии

фермента липазы. В одной загрузке (эксперимент #1) половину концентрацииконтрольной среды принимают за исходную среду за исключением глицерина. Послестадии загрузки вводят метанол со скоростью подпитки приблизительно 6 г/л/час.Ферментацию продолжают в течение около 8 суток. Максимальная концентрацияпродукта достигает приблизительно 1650×106 единиц липазы в течение 7 суток истабилизируется. В другой загрузке (эксперимент #2) используют среды такого жесостава и дополнительно в ферментер добавляют 0,1 М мочевину. После стадиизагрузки проводят подпитку метанолом вместе с 4% масс./об. мочевиной.Ферментацию продолжают в течение 8 суток. Максимальное количество продуктадостигает приблизительно 2500×106 единиц липазы в течение 7 суток и затемстабилизируется. Существенной разницы в отношении профиля роста клеток ненаблюдают. Профиль общего продукта, полученный в результате вышеописанныхэкспериментов, представлен на Фиг.9.

Пример 6:Исследуют эффект концентрации мочевины в загрузках с метанолом, используемых

для получения предшественника IN 105, с 1, 2, 3 и 5% мочевины в метаноле во времязагрузки в подпиткой метанолом. Остальные параметры сохраняют такие же, как впримере 1. Максимальная концентрация продукта достигает 3,0, 3,2, 2,5, 3,3, 3,5 и 2,8г/л за 7 суток в загрузках с 0, 1, 2, 3, 4 и 5% мочевины, соответственно, в метаноле.Повышенную продуктивность наблюдают, когда используют 4% мочевину вметаноле во время фазы индукции метанолом. Профили биомассы и концентрациипродукта иллюстрируют на Фиг.10 и 11, соответственно.

Пример 7:В другом исследовании с уровнем подпитки метанолом 20 г/л/час. Концентрацию

мочевины варьируют, чтобы определить наиболее эффективную концентрациюмочевины, обеспечивающую максимальную концентрацию предшественникаинсулина. Максимальная концентрация продукта достигает 4,26, 4,03, 3,39, 4,16, 4,21и 5,31 г/л за 182, 166, 140, 164, 137 и 170 часов, соответственно, в загрузках, где

Ñòð.: 22

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

RU 2 491 345 C2

подпитку метанолом проводят с концентрацией мочевины 0, 1, 2, 3, 4 и 5%,соответственно. Профили биомассы и концентрации продукта иллюстрируют наФиг.12 и 13, соответственно. Исследование показывает, что добавление мочевиныповышает уровень продукции предшественника инсулина, уровень экспрессииявляется наиболее высоким, когда подпитку метанолом осуществляют с 5% мочевины.

Пример 8:Исследуют экспериментальные загрузки, в которых во время фазы индукции

метанолом поддерживают остаточную концентрацию мочевины на различныхуровнях 0,1, 0,3, 0,5, 0,7, 1,2 и 1,5 М в бесклеточном супернатанте, и изучают эффект напродуктивность. Берут все загрузки с параметрами и составом среды, подобнымиприведенным в примере 1. Остаточную мочевину поддерживают путем отдельнойподпитки мочевиной. Результаты показывают, что максимум продукта достигают,когда уровень мочевины поддерживают в области 1 М в бесклеточном супернатантево время ферментации на протяжении загрузки. Максимальную концентрациюпродукта 4,46 г/л достигают, когда поддерживают уровень остаточной мочевиныприблизительно 0,5 М. В данном эксперименте общая подпитка мочевинойэквивалентна 0, 0,2, 0,5, 0,9, 1,2, 1,8, 2,3 и 2,9 М конечного объема бульона висследовании, где поддерживают уровень остаточной мочевины 0, 0,1, 0,3, 0,5, 0,7,1,0, 1,2 и 1,5 М, соответственно. Результаты представляют на Фиг.14.

Пример 9:Проводят также исследование ферментации предшественника инсулина. В данном

исследовании подпитку метанолом осуществляют на уровне 20 г/л/час. В ферментациипредшественника инсулина показано, что концентрация данного продуктамаксимальна, когда поддерживают остаточную концентрацию 0,7 М. В данномисследовании общая подпитка мочевиной эквивалента 0,0, 1,6, 2,7, 3,5, 7,0, 8,8, 11,7и 13,3 М конечного объема бульона в исследовании, где поддерживают уровеньостаточной мочевины 0, 0,1, 0,3, 0,5, 0,7, 1,0, 1,2 и 1,5 М, соответственно. Результатыпоказывают, что культура может потреблять существенные количества мочевины, какпредставляют на Фиг.15.

Пример 10:Другую партию IN 105 проводят со стандартными контрольными средами и с

добавлением около 20 г/л/час. метанола с 4% мочевины. В данном исследованиидостигают концентрацию продукта 3,71 г/л за 113 часов относительно выхода 3,76 г/лза 183 часа, когда мочевину не вносят в ферментер. Результаты исследованияиллюстрируют на Фиг.16 и 17.

Пример 11:В следующей группе экспериментов мочевину заменяют различными другими

соединениями, чтобы показать их эффекты на продуктивность ферментации. Такимобразом, в отдельных загрузках тестируют тиомочевину, диимиды, карбодиимиды,тиокарбамиды в концентрации 1%. Показывают, что все из них повышаютпродуктивность относительно контроля, как показано на Фиг.18.

Пример 12:В эксперименте показывают, что подпитка мочевиной во время ферментации

повышает потребление фосфата дрожжами, приводя в результате к истощениюфосфата в среде раньше, что в загрузке, где подпитку мочевиной не проводят. Такимобразом, ускоренное фосфата и повышенная продуктивность (г/л/час.) представляютсобой результат метаболического сдвига, достигаемого путем введения мочевины встандартные или модифицированные протоколы ферментации Pichia с целью

Ñòð.: 23

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

RU 2 491 345 C2

получения пептидов и белков.Пример 13:Готовят среду для роста, содержащую соевую муку 5,0 г, декстрозу моногидрат 20,0

г, соевый пептон 5,0 г, CaCO3 1,0 г, K2HPO4 0,1 г в 1000 мл воды. pH посевной средыподводят до 6,8±0,1 с использованием раствора NaOH. Стерилизованную среду дляинокулюма инокулируют флаконом суспензии спор культуры Streptomyces sp (BICC6826) и инкубируют при 28±1°C в течение 48 часов в аэробных условиях. Затемвыросший посевной материал переносят в ферментационную среду, содержащуюсоевую муку 37,5 г, декстрозу моногидрат 22,5 г, хлопковую муку 3,75 г, кукурузныйсироп 7,5, NaCl 7,5 и пеногаситель SAG 0,5 г в 1000 мл воды (pH подводят до 7,0±0,1).Через 48 часов инкубирования добавляют стерильный раствор компактина вместе смаленькими количествами декстрозы. Через каждые 24 часа собирают одну из колб изнескольких аналогичных колб с целью проверки биоконверсии компактина вправастатин. Процедуру повторяют каждый 24 часа, пока общая подпиткакомпактином не составит 3,0 г/л.

Перед началом экспериментов с использованием модифицированнойферментационной среды в ферментационную среду добавляют различные уровнимочевины, чтобы установить уровень токсичности мочевины для организма.Концентрацию 0,0, 0,5, 1,0, 1,5, 2,0, 2,5, 3,0, 3,5 и 4,0 г/л добавляют в колбу,содержащую ферментационную среду, затем инкубируют, как описано выше. Через 48часов инкубирования мониторируют рост в каждой из колб. Данные представляют наФиг.20.

Концентрации, превышающие 3,0 г/л мочевины, показывают ингибирование ростакультуры. В повторностях исследование показывает близкие результаты. Вследствиеэтого концентрацию ниже 3,0 г/л берут для проверки эффекта мочевины набиоконверсию.

Как описано ранее, аналогичный опыт проводят со средой для образованияпродукта, содержащей мочевину в качестве дополнительного компонента.Концентрацию мочевины в среде для образования продукта поддерживают науровне 0,0, 0,5, 1,0, 1,5, 2,0, 2,5 и 3,0 г/л и добавляют ее во время инокуляции.

Через 48 часов инкубирования вносят стерильный раствор компактина вместе сподпиткой декстрозой. Биоконверсию оценивают через 24 часа путем сбора одной измножества колб, которые проводят в аналогичных условиях. Данную процедуруповторяют каждые 24 часа, пока в целом не вносят подпитку компактина 3 г/л.Биоконверсию оценивают относительно общего количества компактинапотребленного для образования правастатина. Результаты экспериментаотносительно титра и процента конверсии показаны на Фиг.21 и 22, соответственно.

Колбы с концентрацией мочевины 1,5 г/л показывают максимальный уровеньконверсии компактина в правастатин 85,4% по сравнению с контрольной колбой суровнем конверсии 59,5%.

Пример 14:Экспрессию гранулоцитарного колониестимулирующего фактора при

использовании мочевины изучают с помощью ферментации E. coli для определенияуровня экспрессии продукта. Среда, используемая в исследовании, состоит изпредпосевной среды, посевной среды и среды для образования продукта.Предпосевная среда состоит из соевого пептона 10,0 г, NaCl 10,0 г, дрожжевогоэкстракта 10,0 г в 1000 мл воды. Посевная среда состоит из 1,2 г сульфата аммония, 2,4г сульфата магния, 10 г дрожжевого экстракта, 11 г DMH, 5 г K2HPO4, 40 мл

Ñòð.: 24

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

RU 2 491 345 C2

микроэлементов в 1000 мл воды. Среда для образования продукта состоит издекстрозы моногидрата 11 г, сульфата аммония 2,4 г, сульфата магния 4,8 г,дрожжевого экстракта 20 г, K2HPO4 10 г, микроэлементы 40 мл в 1000 мл воды. pHподводят до 7,0 аммиаком. После завершения фазы загрузки биомассу в ферментереувеличивают постоянной подпиткой декстрозой и дрожжевым экстрактом. Затеминдуцируют клеточную массу и ведут процесс следующие 8 часов для полученияпродукта, представляющего интерес.

Проводят три загрузки ферментеров, чтобы установить эффект мочевины вферментационных процессах с использованием Е. coli. Первая загрузка(эксперимент #1) представляет собой контрольную загрузку без добавления какой-либо мочевины. Используемые среды описаны выше. Загрузку индуцируют приоколо 180 г/л СПК. Ферментацию продолжают до 8 час. после индукции. Достигаютмаксимума 6,6 г/л при специфической активность 0,028 г/СПК. Во второй загрузке(эксперимент #2), в ферментер добавляют 1 г/л мочевины в дополнение ввышеописанным средам. В загрузку вносят подпитку, содержащую аналогичныеколичества мочевины (1 г/л). Загрузку индуцируют при около 180 г/л СПК ипродолжают ферментацию в течение 8 часов после индукции и получают 7,4 г/лпродукта со специфической активностью 0,033 г/СПК. Третью загрузку(эксперимент #3) проводят аналогично эксперименту #2, но с добавлением 2 г/лмочевины. Достигнутый конечный продукт составляет 6,58 г/л со специфическойактивностью 0,032 г/СПК.

Как показывают результаты, не наблюдают никакой существенной разницы впрофиле роста клеток, указывающие на то, что добавление мочевины повышаетуровень образования продукта без воздействия на профиль роста. В общем получаютприблизительно 18% повышение специфической продуктивности. Профили СПК,полученные в результате проведения вышеописанных экспериментов, представленына Фиг.23, и профиль специфической продуктивности - на Фиг.24.

Пример 15:Аналогичный эксперимент проводят с использованием Е. coli в качестве

экспрессирующей системы для получения стрептокиназы. Используют такую же среду,как упомянута в примере 13, а также такую же тестируемую концентрацию мочевины.Как описано в примере 14, проводят аналогичные три загрузки с содержаниеммочевины 0 г/л, 1 г/л и 2 г/л. Контрольная загрузка без мочевины (эксперимент #1)дает конечную продуктивность 7,06 г/л через 8 часов индукции при специфическойпродуктивности 0,026 г/СПК. Максимальный титр достигают в загрузке ссодержанием 1 г/л мочевины (эксперимент #2), имеющей продуктивность 10,5 г/л испецифическую продуктивность 0,041 г/СПК. Неожиданно показано, что загрузка с 2г/л мочевины (эксперимент #3) дает только 6,56 г/л продукта со специфическойпродуктивностью 0,022 г/СПК. Для данного продукта повышение концентрациимочевины больше чем 1 г/л приводит в результате к резкому падению специфическойпродуктивности и титра.

Как в примере 2, отсутствуют существенные изменения в значениях СПК трехисследований, что ясно показывает, что повышение продуктивности являетсярезультатом повышенного уровня образования продукта и не связано с изменениямибиомассы. В общем получают приблизительно 57% повышение специфическойпродуктивности. Профили СПК, полученные в результате проведениявышеописанных экспериментов, представлены на Фиг.25. Профиль титра представленна Фиг.26.

Ñòð.: 25

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

RU 2 491 345 C2

Пример 16:Rhizomucor sp (BICC 362), который, как известно, продуцирует фермент липазу,

также показывает повышение продуктивности при добавлении мочевину в среду.Липазу, генерированную с помощью данной культуры, можно широко использоватьдля реакций биоконверсии, например, эстерификации и гидролиза. Для данногопроцесса берут две загрузки ферментера (объем 10 л), одну - без добавления мочевиныи другую - с добавлением 0,5 г/л мочевины. Проводят также исследование с болеевысокой концентрацией мочевины (1 г/л), которое приводит в результате к болеенизкой продуктивности и очень высокому уровню потребления каустической соды дляподдержания pH. Среда для роста для Rhizomucor sp (BICC 362) состоит из Maida 41,4 г,сахарозы 10 г, пептона 3,06 г, сульфата аммония 2 г, дрожжевого экстракта 2 г,фосфата калия 0,85 г, хлорида кальция, сульфата магния и хлорида натрия, по 1 гкаждого. Полную среду доводят до 1 л водой. Выращенный посевной материал (10об.%) переносят в среду для образования продукта, состоящую из декстрозы 12,5 г,соевого пептона 37,5 г, соевой муки 25, фосфата калия 2,5, сульфата магния 0,625,соевого масла 12,5 г в 1000 мл воды. pH среды подводят до 6,0 и затем поддерживаютпри 6,0 на протяжении загрузки добавлением каустической соды.

Добавление мочевины (0,5 г/л) показывает повышение уровня образования липазыпо сравнению с контрольной загрузкой. Более высокая концентрация мочевиныпоказывает более низкую продуктивность. Данные представляют на Фиг.27.

Следует иметь в виду, что данное изобретение не ограничено описаннымиконкретными способами, протоколами, клеточными линиями, видами или родами икомпонентами сред, поскольку они могут варьировать. Кроме того, следует иметь ввиду, что терминология, используемая в данном контексте, служит только для целейописания конкретных вариантов осуществления и не предназначена для ограниченияобъема настоящего изобретения, которое будет ограничено только прилагаемойформулой изобретения. Вышеприведенное описание служит для цели обученияобычного специалиста в области техники, как практически использовать настоящееизобретение, и оно не предназначено для детализации всех тех его очевидныхмодификаций и вариантов, которые будут очевидны компетентному специалисту причтении описания.

Формула изобретения1. Ферментационная среда для получения рекомбинантных белков, выбранных из

группы, включающей инсулин, предшественники инсулина и аналоги инсулина, сиспользованием индуцируемых метанолом грибов вида Pichia pastoris,характеризующаяся поддерживаемой концентрацией мочевины или ее производных винтервале от приблизительно 0,3 М до приблизительно 1 М и содержащая на литрводы основные соли в следующих количествах:

ортофосфорную кислоту (85%) от 2,67 до 133,5 мл

сульфат кальция от 0,093 до 4,65 г

сульфат калия от 1,82 до 91 г

сульфат магния-7H2O от 1,49 до 74,5 г

гидроксид калия от 0,413 до 20,65 г

глицерин от 4 до 200 г

и на литр воды микроэлементы в следующих количествах:

сульфат меди-5H2O от 0,6 до 30 г

Ñòð.: 26

CL

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

RU 2 491 345 C2

иодид натрия от 0,008 до 0,4 г

сульфат марганца-H2O от 0,3 до 15 г

молибдат натрия-H2O от 0,02 до 1 г

борная кислота от 0,002 до 0,1 г

хлорид кобальта от 0,05 до 2,5 г

хлорид цинка от 2 до 100 г

сульфат железа двухвалентного-7H2O от 6,5 до 325 г

биотин от 0,02 до 1 г

серную кислоту от 0,5 до 25 мл

2. Среда по п.1, в которой производные мочевины выбраны из группы,включающей диметилмочевину, диэтилмочевину, N-ацетилфенилмочевину,изопропилпилидинмочевину, фенилмочевину или их комбинации.

3. Среда по п.1, в которой мочевина или ее производные используются в жидкомвиде, в форме спрея, порошка или гранул.

4. Среда по п.1, в которой инсулин представляет собой инсулин IN-105.5. Среда по п.1, в которой инсулин представляет собой инсулин гларгин.6. Среда по п.1, в которой рекомбинантный белок представляет собой эксендин.7. Способ получения рекомбинантных белков, выбранных из группы, включающей

инсулин, предшественники инсулина и аналоги инсулина, включающий стадиюразмножения индуцируемых метанолом грибов вида Pichia pastoris и стадиюэкспрессии рекомбинантного белка при использовании ферментационной среды поп.1, в которой осуществляют подпитку метанолом со скоростью от приблизительно 6г/л/ч до приблизительно 20 г/л/ч.

8. Способ по п.7, в котором производные мочевины выбраны из группы,включающей диметилмочевину, диэтилмочевину, N-ацетилфенилмочевину,изопропилпилидинмочевину, фенилмочевину или их комбинации.

9. Способ по п.7, в котором получаемый инсулин представляет собой инсулин IN-105.

10. Способ по п.7, в котором получаемый инсулин представляет собой инсулингларгин.

11. Способ по п.7, в котором получаемый рекомбинантный белок представляетсобой эксендин.

Ñòð.: 27

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

RU 2 491 345 C2

Ñòð.: 28

DR

RU 2 491 345 C2

Ñòð.: 29

RU 2 491 345 C2

Ñòð.: 30

RU 2 491 345 C2

Ñòð.: 31

RU 2 491 345 C2

Ñòð.: 32

RU 2 491 345 C2

Ñòð.: 33

RU 2 491 345 C2

Ñòð.: 34

RU 2 491 345 C2

Ñòð.: 35

RU 2 491 345 C2

Ñòð.: 36

RU 2 491 345 C2

Ñòð.: 37

RU 2 491 345 C2

Ñòð.: 38

RU 2 491 345 C2

Ñòð.: 39

RU 2 491 345 C2

Ñòð.: 40

RU 2 491 345 C2

Ñòð.: 41